OsMSH4蛋白及其编码基因在调控植物花粉育性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种OsMSH4蛋白及其编码基因在调控植物花粉育性中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质(OsMSH4蛋白)或其编码基因(OsMSH4基因)在调控植物花粉育性中的应用。实验证明，在水稻的发育过程中，通过RNA干扰技术将水稻中OsMSH4蛋白表达水平下调，可导致水稻表现出与野生型水稻种子相比，花粉育性降低。结合采用组织特异性抑制基因表达的方法，OsMSH4基因可以用于水稻杂交种子生产和育性控制，因此本发明在水稻育种上具有重要意义，可以为增加水稻产量、提高水稻品质提供重要生物资源。
【专利说明】0sMSH4蛋白及其编码基因在调控植物花粉育性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物学【技术领域】，涉及一种水稻〇sMSH4蛋白及其编码基因 在调控水稻花粉育性中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是人类最重要的粮食作物之一，世界上近一半的人口，包括东亚和东南亚的 绝大部分人口，都以大米为食。水稻更是我国的第一大粮食作物，因此如何提高水稻的产量 是我国农业生产上的关键问题。从二十世纪六十年代开始，随着半矮品种的推广，水稻和小 麦的产量得到了突破性的增长。在推广绿色革命的11个国家中，水稻单产80年代末比70 年代初提高了 63%。因此，这次矮化育种被称为近代谷物生产的一次"绿色革命"。在我国， 二十世纪七十年代由袁隆平研究出的三系法杂交水稻也是"绿色革命"杰出代表。杂交水稻 的推广极大的提高了水稻的单产，缓解了我国人口迅速增长与粮食短缺的矛盾。三系法杂 交水稻中的三系是指雄性不育系，保持系和恢复系。水稻雄性不育系是杂交水稻制种的关 键，不育系水稻雌蕊发育正常，但本身没有花粉或者花粉败育，即不能正常的自交结实。将 恢复系的花粉授给不育系植株即可生产出杂交种子。杂交种后代雄蕊育性恢复正常，可以 自交结实。选育出有增产优势或品质优良的杂交种即可用于大规模生产。保持系水稻雌雄 蕊都正常，用它的花粉给不育系授粉，最终仍然得到雄性不育的植株，从而保证了不育系的 繁殖。
[0003] 虽然，雄性不育系的利用在杂交水稻的制备和选育过程中起到了至关重要的作 用，但是自然界里的自发雄性不育植株极少，鉴定困难，需耗费大量人力物力。因此，通过基 因工程途径获得雄性不育水稻成为一个上好的选择。水稻花粉形成的过程也就是雄配子体 的发生过程。植物雄配子体花粉的形成包括小孢子的发生和雄配子的形成两个过程。小孢 子的发生这一过程都在幼小的花药中进行，包括小孢子母细胞的形成，减数分裂过程以及 四分体的分散过程。雄配子体即花粉粒是小孢子经过两次有丝分裂形成的，其中包含被称 作雄配子的精细胞。在花粉发育的这一系列过程中涉及到众多相关基因，只有他们按照一 定的时空顺序正常表达，才能保证可育花粉的形成。
[0004] 通常生物的生活周期由二倍体时期与单倍体时期的交替组成。二倍体细胞经由减 数分裂进程形成染色体数目减半的单倍体细胞即雌雄配子或卵细胞和精子；而单倍体的细 胞通过受精作用，也就是核融合形成新的二倍体细胞。减数分裂在整个生活周期中起着至 关重要的作用，使每种生物代代都能够保持二倍体的染色体数目。在减数分裂过程中，同源 染色体间通过重组发生部分交换产生交叉，结果使配子的遗传基础多样化，使后代对环境 条件的变化有更大的适应性，促进了生物物种的进化。早在19世纪，生物学家们根据对不 同生物的研究提出了一系列重要成果。孟德尔通过对豌豆的观察，提出了遗传学的两个基 本定律-分离定律和自由组合定律。而摩尔根则是以果蝇为模式生物阐明了遗传学的第三 大定律-连锁交换定律。在这些发现中，模式生物都起到了重要作用。水稻不但是重要的 粮食作物，也是单子叶植物研究中的模式生物。近些年来，科学家以水稻为研究对象对减数 分裂过程进行了研究，获得了许多控制减数分裂的基因。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种水稻0sMSH4蛋白及其编码基因在调控水稻花粉育性中 的应用。
[0006] 本发明所提供的应用，具体为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质 (命名为0sMSH4蛋白）或其编码基因（命名为0sMSH4基因）在调控植物花粉育性中的应 用。
[0007] 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质（0sMSH4蛋白）或其编码基因 (0sMSH4基因）在培育花粉育性降低的植物品种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0008] 本发明的再一个目的是提供一种培育花粉育性降低的转基因植物的方法。
[0009] 本发明所提供的培育花粉育性降低的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤： [0010] a)在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基 因进行抑制表达，得到转基因植物；
[0011] b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，花粉育性降低的转基 因植物。
[0012] 在本发明中，所述花粉育性的降低，除了花粉形态学外，还体现为减数分裂过程中 所形成的交叉的数目越少。
[0013] 在上述应用或方法中，所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质 (0sMSH4蛋白）的编码基因（0sMSH4基因）是如下（1)至（4)中任一所述的DNA分子：
[0014] (1)序列表中序列2的第137-2533位所示的DNA分子；
[0015] ⑵序列表中序列2所示的DNA分子；
[0016] (3)在严格条件下与（1)或⑵所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0017] (4)与⑴或（2)或⑶所限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表 中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0018] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1 % SDS 和 1 X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0019] 其中，序列2由2853个核苷酸组成，其中第137-2533位为所述0sMSH4基因的编 码序列（0RF);序列2的0RF编码序列表中序列1所示的蛋白质，序列1由798个氨基酸残 基组成。
[0020] 在上述方法中，所述在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的编码基因进行抑制表达，可为任何可降低所述目的植物中所述0sMSH4基因的表 达的方法。
[0021] 在本发明中，所述在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋 白质的编码基因进行抑制表达，具体是通过将如下式（I)所示的DNA片段转入所述目的植 物中实现的：
[0022] SEQ反向-X_SEQm ⑴
[0023] 所述SEQM是序列表中序列3的第666-1079位核苷酸；
[0024] 所述SEQ_的序列与所述SEQtt的序列反向互补；
[0025] 所述X是所述SEQ^g与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ 正向及所述SEQ反向均不互补。
[0026] 在本发明中，所述式（I)所示的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中的序列3 的第19-1079位。
[0027] 序列3由1097个核苷酸组成。其中，第666-1079位为所述0sMSH4基因的一个片 段的正向序列（对应上述式（I)中的，与序列表中序列2的第698-1111位一致），第 433-665位（第450-648位为GA20内含子核苷酸序列）对应上述式（I)中的X，第19-432 位为所述0sMSH4基因的一个片段的反向序列（对应上述式（I)中的SEQ &@，为序列表中序 列2的第698-1111位的反向互补序列）。
[0028] 进一步，所述式（I)所示的DNA片段是通过RNA干扰表达载体的形式转入所述目 的植物中的；所述RNA干扰表达载体上启动所述式（I)所示的DNA片段转录的启动子是 Actin启动子。具体的，所述RNA干扰表达载体为在pCAMBIA2300-Actin载体的多克隆位 点处插入所述0sMSH4基因的RNA干扰序列（序列3)后得到的重组质粒；更为具体的，所述 RNA干扰表达载体是按照包括如下步骤的方法制备得到的：用Pst I酶切序列表中序列3所 示的DNA片段，胶回收后与经过Pst I酶切的pCAMBIA2300-Actin载体骨架大片段相连，得 到所述RNA干扰表达载体。
[0029] 在上述培育转基因植物的方法中，将携带有所述0sMSH4基因的所述重组表达载 体或所述0sMSH4基因的所述RNA干扰表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti 质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方 法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0030] 在上述各应用或各方法中，所述植物即可为单子叶植物，也可为双子叶植物。在本 发明中，所述植物具体为单子叶植物水稻，如粳稻品种盐稻8号。
[0031] 如下式（I)所示的DNA片段也属于本发明的保护范围：
[0032] SEQ 反向-X_SEQm ⑴
[0033] 所述SEQM是序列表中序列3的第666-1079位核苷酸；
[0034] 所述SEQ_的序列与所述SEQtt的序列反向互补；
[0035] 所述X是所述SEQ^g与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ 正向及所述SEQ反向均不互补；
[0036] 所述DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中的序列3的第19-1079位。
[0037] 含有所述DNA片段的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系也属于本发明的 保护范围。
[0038] 所述重组载体既可以为重组表达载体，也可以为重组克隆载体。在本发明的一个 实施例中，所述重组表达载体中启动所述RNA干扰序列转录的启动子为Actin启动子，具 体的，所述重组表达载体为在pCAMBIA2300-Actin载体的多克隆位点处插入所述0sMSH4 基因的RNA干扰序列（序列3)后得到的重组质粒；更为具体的，所述RNA干扰表达载体 为在pCAMBIA2300-Actin载体的多克隆位点处插入所述0sMSH4基因的RNA干扰序列（序 列3)后得到的重组质粒；更为具体的，所述重组表达载体是按照包括如下步骤的方法制 备得到的：用Pst I酶切序列表中序列3所示的DNA片段，胶回收后与经过Pst I酶切的 pCAMBIA2300-Actin载体骨架大片段相连，得到所述RNA干扰表达载体。
[0039] 实验证明，在水稻的发育过程中，通过RNA干扰技术将水稻中0sMSH4基因的表达 水平下调，可导致水稻表现出与野生型水稻种子相比，花粉育性降低。结合采用组织特异性 抑制基因表达的方法，0sMSH4基因可以用于水稻杂交种子生产和育性控制，因此本发明在 水稻育种上具有重要意义，可以为增加水稻产量、提高水稻品质提供重要生物资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1为突变体0smsh4表型分析。其中，A为抽穗期的野生型植株（左）和抽穗期 的0smsh4植株（右）；B为野生型的穗子（左）和突变体的穗子（右）；C为野生型花粉；D 为突变体的不育花粉。标尺长度，C和D中50 μ m。
[0041] 图2为0sMSH4基因结构图。
[0042] 图3为0sMSH4基因的组织特异性表达分析。
[0043] 图4为野生型中籼3037的减数分裂时期表型。其中，A为粗线期；B为终变期；C 为中期I;D为后期I。标尺长度,5μηι。
[0044] 图5为突变体0smsh4的减数分裂时期表型。其中，Α为粗线期；Β为终变期；C为 中期I，无二价体；D为中期1，2个二价体；E为中期1，3个二价体；F为后期I。标尺长度， 5 μ m〇
[0045] 图6为野生型和突变体0smsh4交叉数目统计。其中，A为野生型中期I时交叉数 目；B为突变体0smsh4中期I时交叉数目。
[0046] 图7为0sMSH4基因 RNAi水稻植株的PCR鉴定结果。其中，泳道Μ为DNA分子量 标注，各条带由大到小依次为 5000bp、3000bp、2000bp、lOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp ; 其余条带为供试植株，扩增出588bp目的条带的株系为阳性株系。
[0047] 图8为0sMSH4基因 RNAi水稻植株的荧光定量PCR鉴定结果。
[0048] 图9为野生型和0sMSH4基因 RNAi水稻植株的花粉育性表型鉴定结果。
[0049] 图10为突变体0smsh4与0sMSH4基因 RNAi水稻中期I的染色体表型。其中，A为 突变体0smsh4中期I ;B为0sMSH4基因 RNAi水稻中期I。
【具体实施方式】
[0050] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0051] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052] pUCCRNAi 载体：参见 "Hengxiu Yu，Mo Wang，Ding Tang et al. 0sSP011-l is essential for both homologous chromosome pairing and crossover formation in rice. Chromosoma· 2010 (119) :625-636. " 一文，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研 究所获得。
[0053] pCAMBIA2300_Actin 载体：参见 "Hengxiu Yu，Mo Wang，Ding Tang et al.0sSP011-l is essential for both homologous chromosome pairing and crossover formation in rice. Chromosoma· 2010 (119) :625-636. "一文，公众可从中国科学院遗传与 发育生物学研究所获得。
[0054] PMD18-T载体：北京华奥正生科技有限公司产品，其产品目录号为6011。
[0055] 水稻品种中籼 3037 :记载于"听1叩，1(.，13叩，0.，!1〇1^，1^，父11，1.，!1皿叩，]\，1^，]\1 ,Gu, M. , Xue, Y. and Cheng, Z. (2010)DEP and AFO Regulate Reproductive Habit in Rice. Plos Genetics, 6"一文中的"Zhongxian 3037"，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研 究所获得。
[0056] 粳稻品种盐稻8号：常规的水稻栽培品种，可以从江苏省盐城市明天种业科技有 限公司购买。
[0057] 水稻品种日本晴：中国农科院作物科学研究所水稻种质资源中心保藏，库编号 I1A13071。
[0058] 实施例1、0sMSH4基因的图位克隆及其组织特异性表达分析
[0059] 一、突变体表型分析
[0060] 本发明的发明人在6°Co辐射诱导后的水稻品种中籼3037中发现一株不育突变体， 与野生型的中籼3037植株相比，突变体在营养生长及开花时间等方面均无明显差异（图1 中A)。抽穗以后突变体才表现出典型的不育表型且最终不结实（图1中B)。野生型植株的 成熟花药为黄色，花药中充满花粉，花粉用Ι 2_ΚΙ染色可变为蓝色，而突变体的成熟花药表 现为白色，花粉用Ι2_ΚΙ染色不会变蓝，且呈现典型不育花粉特征（图1中C和D)。本发明 的发明人将突变体授予野生型的花粉，发现它仍然不能正常结实，表明突变体雌性也不育， 说明该基因的突变不仅影响雄育性，还影响雌育性。
[0061] 二、突变性状的遗传分析
[0062] 为了研究该不育突变的遗传行为，本发明的发明人在分离出不育突变体的株系 中，按单株收获可育植株的种子，并将这些种子按单株进行种植。对再次分尚出不育突变体 的株系中的可育株与不育株的数目进行统计后发现，在98株的株系群体中，正常表型株为 73株，不育株为25株，卡方测验表明分离比符合3:1的分离（X 2 = 0.22 ;Ρ>0. 05)，说明不 育表型是由隐性单基因控制的。
[0063] 三、突变基因的图位克隆
[0064] 为了克隆这个控制不育表型的基因，本发明的发明人采取了图位克隆的方法。由 于这个突变体是雌雄均不育的，所以选取了分离株系中的6株正常植株（理论上包含ΑΑ和 Aa)与粳稻品种中花11进行杂交，在F2和F3群体中，共获得732株不育株以用于图位克隆。 利用已有的STS标记，将该基因初步定位在7号染色体的长臂上。通过比较粳稻与籼稻的 序列差异，本发明的发明人在此范围内又发展了 STS分子标记（表1)，最终将基因定位在两 个STS分子标记（P4和P5)之间的110Kb范围内。利用RGP网站（http://rgp.dna. affrc. go. jp)上的 RiceGAAS(Rice Genome Automated Annotation System)系统进行基因预测， 最终在这个范围内发现一个预测为含有mutS家族结构域IV的蛋白。将相应的候选基因命 名为0sMSH4,该突变体命名为0smsh4。水稻基因组注解数据库RiceGAAS信息表明，该基因 的全基因组长9995bp，含有24个外显子和23个内含子（图2)。本发明的发明人对突变体 和野生型中的该候选基因（0sMSH4基因）的全长cDNA都进行了扩增并测序，结果发现野生 型中的0sMSH4基因的全长cDNA的序列如序列表中序列2所示（编码序列表中序列1所示 的0sMSH4蛋白），而在突变体中发现一个G到A的转换（序列2的第708位的G突变为了 A)，导致编码色氨酸Trp的TGG被终止密码子TAG替换，使该蛋白的翻译提前终止。因此， 可以推断可能是功能蛋白的缺失导致了突变体不育的表型。
[0065] 表1图位克隆使用的STS引物
[0066]
【权利要求】
1. 由序列表中序列1所不的氣基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控植物花粉 育性中的应用。
2. 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在选育花粉育性 降低的植物品种中的应用。
3. 培育花粉育性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤： a) 在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进 行抑制表达，得到转基因植物； b) 从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，花粉育性降低的转基因植 物。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述由序列表中序列1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下（1)至（4)中任一所述的DNA分子： (1) 序列表中序列2的第137-2533位所示的DNA分子； (2) 序列表中序列2所示的DNA分子 (3) 在严格条件下与⑴或⑵所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列1所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子； (4) 与（1)或⑵或（3)所限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序 列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述在目的植物中对由序列表中序 列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，是通过将如下式（I)所示 的DNA片段转入所述目的植物中实现的： SEQ 反向-X-SEQm ⑴ 所述SEQ￠?是序列表中序列3的第666-1079位核苷酸； 所述SEQ_的序列与所述SEQM的序列反向互补； 所述X是所述SEQ^g与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQf向及 所述SEQ&^)均不互补。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述式（I)所示的DNA片段的核苷酸序 列为序列表中的序列3的第19-1079位。
7. 根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述式（I)所示的DNA片段是 通过RNA干扰表达载体的形式转入所述目的植物中的；所述RNA干扰表达载体上启动所述 式（I)所示的DNA片段转录的启动子是Actin启动子。
8. 根据权利要求1-7中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物 或双子叶植物。
9. 如下式⑴所示的DNA片段： SEQ 反向-X-SEQm (I) 所述SEQ￠?是序列表中序列3的第666-1079位核苷酸； 所述SEQ_的序列与所述SEQM的序列反向互补； 所述X是所述SEQ^g与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQf向及 所述SEQ&^)均不互补； 所述DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中的序列3的第19-1079位。
10.含有权利要求9所述DNA片段的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系。
【文档编号】C12N1/19GK104193810SQ201410397435
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】程祝宽, 张蕾, 唐丁, 李亚非, 沈懿, 杜桂杰 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所