一种检测或辅助检测疫霉属菌的方法
【专利摘要】本发明提供一种检测或辅助检测疫霉属菌的方法，涉及生物【技术领域】。本发明方法包括如下步骤：将疫霉菌属各菌的DNA条形码序列进行多重序列比对，找出每个种的特异性碱基位点，同时得到一致性序列；所述每个种的特异性碱基位点包括差异性碱基位点、SNP位点；将待测菌的DNA条形码序列与一致性序列进行比对，调整长度得到定位序列；将定位序列与每个种的特异性碱基位点进行比对，对待测菌与各种的碱基相似度进行打分，取最大值，待测菌隶属于最大值对应的种。本发能够鉴定疫霉属菌各菌，操作简单、准确性高、耗时短、特异性好。
【专利说明】一种检测或辅助检测疫霉属菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种检测或辅助检测疫霉属菌的方法。
【背景技术】
[0002]後霉舊iPhytophthora de Bary)是一类世界性分布的重要植物病原菌，其属 、良霉MiiPhytophthora)，Phytophthora 来自于希腊语，Phyto 意思为植物(plant),
phthora意思为破坏者(destroyer ),该属的大多数种确实都对其寄主植物具有严重的危害性和破坏性。由于疫霉菌对寄主植物的破坏性强，危害性大，往往导致农业生产的严重损失和森林生态的破坏，因而由疫霉菌所致的植物病害通常称为“疫病”。全世界，每年由疫病造成的农业损失高达数百亿美元，仅澳大利亚每年因疫病造成的损失就达20多亿美元。19世纪中叶，由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病在欧洲爱尔兰地区暴发性流行，导致马铃薯几乎绝产，造成了爱尔兰近百万人饿死，约150万人逃荒或移居他乡，成为人类史举世闻名的“爱尔兰大饥荒”。至今，由致病疫霉引起的马铃薯和番茄的晚疫病仍然是世界范围内流行的一类重要病害，每年造成的损失高达30亿美元；由大豆疫霉iPhytophthora soJae)引起的大豆疫霉根腐病是大豆上极具毁灭性的病害之一。该病1948年首次发现于美国印第安纳州和俄亥俄州，随后在许多大豆生产国相继发生。目前，大豆疫霉根腐病在亚洲、非洲、欧洲、南北美洲和大洋洲的二十多个国家的大豆主产区均有发生，每年给全球大豆生产造成的损失已达近10亿美元，是世界性重要植物检疫对象。栎树疫霉是近年来新发现的一种为害林木和观赏植物的毁灭性真菌病害，可在短期内造成寄主植物大量死亡，美国西海岸硬叶阔叶林中成千上万的栎树、石栎枯死，是近年来发生欧美地区的一种毁灭性林木病害，其对美国及欧洲的许多国家在林产品贸易上造成了巨大的经济损失，该病害在我国没有发生，也是禁止进境的检疫性有害生物。雪松疫霉则会导致树木的针叶枯黄、极易脱落，根末端呈鸡爪状，根部树皮易剥离，树干形成层变褐色，此病干旱季节很少发生，但在多雨季节，树木一旦表现出发病症状，病情发展就会非常迅速。丁香疫霉寄主范围广，主要为害柑橘、苹果、桃、梨、火棘、丁香、欧洲板栗、橡树等14个科29个属的植物，引起寄主根、莖、叶、果实多种病害，是重要的植物病原菌。另外，恶疫霉0°.cactorum Schroter)、樟备霉 iP.cinnamomi Rands)、芒麻疫霉(/I boehmeriae Sawada)和辣椒疫霉 0°.capsiciLeonian)等都是重要的植物病原菌，可引起许多重要经济作物的严重病害。在我国国家质检总局2007年发布实施的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中，一共有435种有害生物，其中仅疫霉病菌就列有10种。因此，无论在历史上，还是在当今社会，无论从经济上，还是从生态环境上来看，疫霉菌及其所引起的病害对人类都具有十分重要的影响。
[0003]对于疫霉菌的检测，目前除大豆疫病菌采用实时荧光PCR检测和土壤诱集外，其他主要采用形态学鉴定方法。但是，形态学鉴定方法耗时长、准确性不高、对培养环境要求较闻。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种检测或辅助检测疫霉属菌的方法，该方法能够鉴定疫霉属菌各菌，操作简单、准确性高、耗时短、特异性好。
[0005]本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0006]一种检测或辅助检测疫霉属菌的方法，包括如下步骤:
(1)下载已经公开的疫霉菌属菌的DNA条形码序列；
(2)将疫霉菌属各菌的DNA条形码序列进行多重序列比对，找出每个种的特异性碱基位点，同时得到一致性序列；所述每个种的特异性碱基位点包括差异性碱基位点、SNP位点，所述差异性碱基位点是指DNA条形码序列在种内相同、种间不同的碱基位点，所述SNP位点为种内各菌株DNA条形码序列分别与属内除自身菌株外其他菌株DNA条形码序列均不同的喊基位点；
(3)将待测菌的DNA条形码序列与一致性序列进行比对，在缺失位点插入调整待测菌的DNA条形码序列长度等同于一致性序列，调整长度后的序列为定位序列；
(4)将定位序列与每个种的特异性碱基位点进行比对，按照函数
【权利要求】
1.一种检测或辅助检测疫霉属菌的方法，包括如下步骤: (O下载已经公开的疫霉菌属菌的DNA条形码序列； (2)将疫霉菌属各菌的DNA条形码序列进行多重序列比对，找出每个种的特异性碱基位点，同时得到一致性序列；所述每个种的特异性碱基位点包括差异性碱基位点、SNP位点，所述差异性碱基位点是指DNA条形码序列在种内相同、种间不同的碱基位点，所述SNP位点为种内各菌株DNA条形码序列分别与属内除自身菌株外其他菌株DNA条形码序列均不同的喊基位点； (3)将待测菌的DNA条形码序列与一致性序列进行比对，在缺失位点插入调整待测菌的DNA条形码序列长度等同于一致性序列，调整长度后的序列为定位序列； (4)将定位序列与每个种的特异性碱基位点进行比对，按照函数
对待测菌与各种的碱基相似度进行打分，其中score (i)表示定位序列与i种的特异性碱基位点比对得分值，i表示疫霉菌属的某个种，j表示定位序列中的碱基位点，Pij表示定位序列在碱基位点j处的分值，当j为SNP位点时,如果定位序列在j处碱基与SNP位点碱基相同，则pij为3，否则pij为-3 ;当j为差异性碱基位点时，如果定位序列在j处碱基与差异性碱基位点碱基相同时，Pij为1，否则Pij为-1 ;当j为其他位点时，Pij为O ;所述:1py为所有碱基位点的pij分值之和； (5)取score(i)最大值,待测菌隶属于score (i)最大值对应的种。
2.根据权利要求1所述检测或辅助检测疫霉属菌的方法，其特征在于所述DNA条形码序列选自cox2编码基因或ITS编码基因；所述DNA条形码序列为28s rRNA、60S RibosomalProtein编码基因中的一种和cox2编码基因；所述DNA条形码序列为28s rRNA,60SRibosomal Protein编码基因中的一种和ITS编码基因。
3.根据权利要求1或2所述检测或辅助检测疫霉属菌的方法，其特征在于步骤(2)中所述多重序列比对采用MEGA软件。
4.根据权利要求3所述检测或辅助检测疫霉属菌的方法，其特征在于步骤(3)将待测菌的DNA条形码序列与一致性序列进行比对采用Blast软件。
【文档编号】C12R1/645GK104178576SQ201410447844
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】粟寒, 张勇, 王振华, 杨静, 缪爱斌, 李彬, 吴翠萍 申请人:江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心, 中华人民共和国南京出入境检验检疫局, 湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心