Wdr63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法

Wdr63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法
【专利摘要】本发明公开了一种WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法，通过细胞培养、染色质免疫沉淀反应及数据分析、质粒构建与病毒转染、蛋白质印迹分析、细胞增殖能力测定、碱性磷酸酶和茜素红染色、裸鼠皮下进行细胞回植；发现WDR63基因在间充质干细胞骨向/牙向分化过程中的调控作用，以及在促进牙组织再生中的作用。本发明采用涉及组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化对间充质干细胞的基因活化和功能的调节作用、WDR63基因在间充质干细胞骨向/牙向分化过程中的调控作用、涉及WDR63基因在促进牙组织再生中的作用，得到WDR63可能在根尖牙乳头干细胞成骨分化中起促进作用。
【专利说明】WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控 方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，尤其涉及一种WDR63基因在间充质干细胞骨向和 牙向分化过程中的调控方法。

【背景技术】
[0002] 牙病是人类最常见的疾病之一，而牙齿的缺失极大的影响了人们的健康和生活质 量。现有的义齿修复手段虽已成熟，但由于其不具备生物活性，难以与天然牙齿相媲美，无 法实现人类拥有"第三副牙"的愿景。为此，各国试图利用干细胞和组织工程技术来实现牙 齿的重建。如何研制出一种具有生物学活性与功能并且能够在颌骨中重建牙周关系的牙齿 修复缺失牙，是临床牙科医生和科研工作者共同期望解决的重大课题。随着口腔发育生物 学以及组织工程技术的进展，牙齿再生研究各个层面的工作均已展开，而全牙组织工程的 最佳策略是采用自体细胞，将牙齿及其周围组织（包括牙齿、牙周膜、牙槽骨等）同时进行 构建，然后植入颌骨缺损区，以获得具有一定活力的牙齿。在牙再生研究领域中，干细胞是 其重要的组成部分，干细胞是一类未分化的细胞，具有自我复制能力及向多分化潜能。目前 主要用于牙齿组织工程的牙源性干细胞有成人牙髓干细胞、乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细 胞、根尖乳头干细胞、牙囊细胞。其中根尖牙乳头干细胞（SCAP)存在于牙齿根尖孔的牙乳 头组织中，具有多向分化潜能，在体外可以诱导分化为成牙本质细胞、脂肪细胞及软骨细胞 等，在体内可以形成牙髓-牙本质复合体样结构，SCAP在根部牙本质形成过程中发挥重要 作用，是一种较好的牙齿组织工程种子细胞，可用于牙髓牙本质和生物学牙根的再生，具有 良好且广阔的临床应用前景。同时牙髓中存在牙髓干细胞（DPSC)，牙髓干细胞能再生出牙 髓牙本质样复合体，其中的矿化基质与其中的牙本质小管及包含血管的纤维组织按照正 常人体的牙髓-牙本质复合体层次排列。并且细胞具有显著自我更新能力和多方向分化能 力，能在体内异位形成牙本质，还可分化成脂肪样细胞和神经样细胞。2003年Miura等首次 发现并报道了从人的脱落乳牙中分离到的一种具有多分化潜能的干细胞。并将该干细胞命 名为乳牙牙髓干细胞（SHED)。这类细胞同样具有高度增殖能力、一定的多向分化潜能和自 我更新能力等生物学特性，可以向成牙本质细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向分 化。牙周膜干细胞是来源于牙周膜的成体干细胞，能产生不同种类的具有特定表型和功能 的成熟细胞，能够维持牙周膜功能的稳定，发挥生理性细胞更新和修复组织损伤的作用，牙 周膜干细胞不仅能分化为成牙骨质细胞样细胞和成骨细胞样细胞，形成牙骨质样和骨样组 织；而且还可分化为成纤维样细胞，形成类似天然牙周膜样的结缔组织，能形成组织形态、 空间排列上类似于天然牙周膜牙骨质复合体的结构，提示这是一种可用于牙再生医学的有 效骨再生的自体干细胞。牙囊是包绕成釉器周围的疏松结缔组织，起源于外胚间充质，在牙 齿萌出过程中发挥着重要的作用。牙根形成时期，牙周组织（如牙骨质、牙周膜和牙槽骨） 由牙囊前体细胞形成，牙囊干细胞可以分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、脂肪细胞。在找到 可能的种子细胞之后，间充质干细胞定向分化的分子机制仍不清楚，这也限制了间充质干 细胞的潜在应用。
[0003] 在干细胞分化过程中建立特殊的基因表达模式可以详尽描述控制其过程的大量 基因的表达与沉默。组蛋白共价修饰在调节染色质动力及功能方面起重要作用。甲基化， 一种组蛋白的修饰类型，同时发生在赖氨酸和精氨酸残基上。这种类型的组蛋白修饰涉及 各种生物进程，以及转录调节。目前，干细胞分化过程中与基因表达模式紧密联系的组蛋白 修饰的图谱，仍未被广泛的研究。目前，一种体内组蛋白修饰的基因组作图的技术方法正 发展起来，使得研究者关于组蛋白修饰的分布可以遵循一个广泛观点。这种方法是"CHIP on chip"，基于染色质免疫沉淀试验，利用感兴趣的基因组区域相一致的探针通过基因芯 片杂交识别富DNA片段。
[0004] 最近，研究者发现三甲基化H3K4与间充质干细胞的基因活化和功能有关，尤其是 骨向分化。研究的目的是通过使用CHIP-on-chip的方法研究间充质干细胞骨向分化过程 中基因启动子区域三甲基化H3K4修饰对基因组的改变。在的研究中，通过比较分化与未分 化根尖牙乳头干细胞（SCAP)基因启动子区域三甲基化H3K4图谱，来研究三甲基化H3K4在 根尖牙乳头干细胞骨向分化潜能中的功能。


【发明内容】

[0005] 本发明实施例的目的在于提供一种WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化 过程中的调控方法，旨在解决现有技术没有涉及TOR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分 化过程中调控的问题。
[0006] 本发明实施例是这样实现的，一种WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过 程中的调控方法，该WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法包括：
[0007] 步骤一，细胞培养，智齿在用75%酒精消毒后再用磷酸盐缓冲盐水冲洗，分离和培 养鉴定根尖牙乳头干细胞；
[0008] 步骤二，染色质免疫沉淀反应及数据分析，细胞于1 %甲醛溶液中孵育15分钟， 2X 106个细胞以及抗组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化抗体用于此染色质免疫沉淀反应， 所有产生的沉淀DNA样本采用实时定量per进行量化，数据表示为DNA的百分比；
[0009] 步骤三，质粒构建与病毒转染，标准方法进行质粒的构建，设计TOR63的SiRNA，将 其插入慢病毒的shRNA载体上，测序鉴定，最终构建成WDR63shRNA的质粒；设计WDR63基因 全长的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全长将其连接到逆转录病毒的表达载体上，测 序鉴定，最终构建成质粒；然后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰 箱；病毒转染，对根尖牙乳头干细胞进行电镀过夜，然后感染逆转录病毒或慢的聚凝胺达 6个小时，48小时后，用不同的抗生素筛选被转染的细胞；
[0010] 步骤四，蛋白质印迹分析，RIPA裂解液溶解细胞，样本用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 分离并利用半干转移膜装置转移到聚乙二烯二氟化物中，膜上涂抹5%脱水牛奶放置2h， 然后用一抗孵育一夜；免疫复合物与兔或小鼠免疫球蛋白G抗体一同孵育并用化学发光底 物试剂使其可视化；针对WDR63是抗WDR63多克隆抗体；
[0011] 步骤五，细胞增殖能力测定，根尖牙乳头干细胞密1.0X104个细胞密度铺板于 60nm培养皿；并在细胞培养3、5、7天进行计数，细胞计数采用自动细胞计数仪并在细胞悬 液中加入台盼蓝排除死细胞；进行3个独立实验取平均值；
[0012] 步骤六，碱性磷酸酶和茜素红染色，矿化诱导液诱导根尖牙乳头干细胞，碱性磷酸 酶活性检测根据碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明进行分析，为检测矿化能力，细胞诱导2-3 周后，用70%乙醇固定，2%茜素红染色；定量测定钙离子浓度，用10%的氯化十六烷吡啶 溶于磷酸钠在室温下使茜素红退色30分钟；钙离子浓度是通过测量562nm的吸光度决定， 并用标准曲线换算；
[0013] 步骤七，裸鼠皮下进行细胞回植，将4. OX 106个细胞与40毫克的羟基磷灰石/磷 酸三钙陶瓷颗粒混合，然后移植到5只10周龄裸鼠背部皮下，在每一个裸鼠，空白根尖牙乳 头干细胞移植到左侧背表面皮下，而WDR63根尖牙乳头细胞移植到右侧背表面皮下；依照 动物协议批准规范进行；移植后第八周，获取移植细胞用10%福尔马林固定，10% EDTA脱 钙，pH值8. 0,石蜡包埋，HE染色，定性测量组织矿化量。
[0014] 进一步，步骤一的具体方法：轻轻剥离根尖牙乳头组织，用磷酸盐缓冲盐水反复清 洗，剪碎，置于含I型胶原酶3g/L和分散酶4g/L的消化液，37°C下消化1小时，过70 i! m细 胞筛收集细胞，l〇〇〇rpm离心lOmin，用培养液重新悬浮成单细胞悬液；将细胞接种于25cm2 细胞培养瓶中，在培养基含15%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 y g/ml 链霉素中37°C、5% C02培养，每2?3天换液1次；每天在倒置显微镜下观察细胞生长状 况；当细胞生长至80%汇合状态时，用0. 25%胰蛋白酶按1 : 2消化传代；2-4代的干细胞 被用于之后的实验。
[0015] 进一步，在步骤二中，信号必须标准化以进行对比实验；L0WESS程序被用来衡量 不同染色质免疫沉淀反应数组之间的可变性，为了确定组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化， 不同条件下的根尖牙乳头干细胞存在差异甲基化，因此定义2倍变化为组蛋白3第4位赖 氨酸的三甲基化显著变化的阈值；同样，假定值阈值〇. 05也用来区分基因改变；双通道图 像数据比使用L0WESS方法规范化，并假定值计算是使用相同的方法实现的表达分析。
[0016] 进一步，在步骤三中，shRNA的目标序列为：
[0017] WDR63shRNA:5， -AAACCCAGGGCTGCCTTGGAAAAG-3，。
[0018] 进一步，该TOR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法中 WDR63增强其碱性磷酸酶活性及矿化能力，WDR63能够激活两个关键转录因子0SX和RUNX2 的表达；WDR63是成骨分化的一个关键的增强剂；WDR63促进体外细胞增殖能力支持WDR63 具有增强组织再生的潜能；WDR63启动子的组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化能够增强根 尖牙乳头干细胞的成骨分化潜能。
[0019] 本发明实施例提供的WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控 方法，通过一系列试验发现WDR63基因在间充质干细胞骨向/牙向分化过程中的调控作用， 以及在促进牙组织再生中的作用。本发明采用涉及组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化对间 充质干细胞的基因活化和功能的调节作用、WDR63基因在间充质干细胞骨向/牙向分化过 程中的调控作用、涉及WDR63基因在促进牙组织再生中的作用，得到WDR63可能在根尖牙乳 头干细胞成骨分化中起促进作用。

【专利附图】

【附图说明】
[0020] 图1是本发明实施例提供的成骨培养在WDR63，TREX1，F0X024，ARNT这些启动子中 促进组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化，诱导WDR63及ARNTL表达；并且在F0XP4, TMEM106B 这些启动子中抑制组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化，抑制F0XP4表达示意图；
[0021] 图2是本发明实施例提供的WDR63的过表达增强根尖牙乳头干细胞的骨向分化能 力示意图；
[0022] 图3是本发明实施例提供的WDR63的过表达增加体内矿化组织形成量示意图；
[0023] 图4是本发明实施例提供的WDR63的低表达可抑制根尖牙乳头干细胞增殖和骨向 分化能力示意图；
[0024] 图5是本发明实施例提供的WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的 调控方法流程图。

【具体实施方式】
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0026] 如图5所示，本发明实施例的WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中 的调控方法包括以下步骤：
[0027] S501 :细胞培养，智齿在用75%酒精消毒后再用磷酸盐缓冲盐水冲洗，分离和培 养鉴定根尖牙乳头干细胞；
[0028] S502:染色质免疫沉淀反应及数据分析，细胞于1 %甲醒溶液中孵育15分钟， 2X 106个细胞以及抗组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化抗体用于此染色质免疫沉淀反应， 所有产生的沉淀DNA样本采用实时定量per进行量化，数据表示为DNA的百分比；
[0029] S503:设计WDR63的SiRNA，将其插入慢病毒的shRNA载体上，测序鉴定，最终构 建成WDR63shRNA的质粒；设计WDR63基因全长的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全 长将其连接到逆转录病毒的表达载体上，测序鉴定，最终构建成质粒；
[0030] S504 :然后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱；病毒转 染，对根尖牙乳头干细胞进行电镀过夜，然后感染逆转录病毒或慢的聚凝胺达6个小时，48 小时后，用不同的抗生素筛选被转染的细胞；
[0031] S505 :RIPA裂解液溶解细胞，样本用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶分离并利用半干转 移膜装置转移到聚乙二烯二氟化物中，膜上涂抹5%脱水牛奶放置2h，然后用一抗孵育一 夜；免疫复合物与兔或小鼠免疫球蛋白G抗体一同孵育并用化学发光底物试剂使其可视 化；
[0032] S506:细胞增殖能力测定，根尖牙乳头干细胞密1.OX104个细胞密度铺板于60nm 培养皿；并在细胞培养3、5、7天进行计数，细胞计数采用自动细胞计数仪并在细胞悬液中 加入台盼蓝排除死细胞；进行3个独立实验取其平均值；
[0033] S507:矿化诱导液诱导根尖牙乳头干细胞，碱性磷酸酶活性检测根据碱性磷酸酶 活性检测试剂盒说明进行分析，细胞诱导2-3周后，用70%乙醇固定，2%茜素红染色；定量 测定钙离子浓度，用10%的氯化十六烷吡啶溶于磷酸钠在室温下使茜素红退色30分钟；钙 离子浓度是通过测量562nm的吸光度决定，并用标准曲线换算；
[0034] S508:将4.OX106个细胞与40毫克的羟基磷灰石/磷酸三钙陶瓷颗粒混合，然 后将其移植到5只10周龄裸鼠背部皮下，在每一个裸鼠，空白根尖牙乳头干细胞移植到左 侧背表面皮下，而WDR63根尖牙乳头细胞移植到右侧背表面皮下；这些程序依照动物协议 批准规范进行；移植后第八周，获取移植细胞用10%福尔马林固定，10% EDTA脱钙（pH值 8. 0)，石蜡包埋，HE染色，定性测量组织矿化量。
[0035] 下面结合实施例对本发明做进一步详细说明；
[0036] 一、细胞培养
[0037] 本发明所涉及的所有干细胞均遵守人类胚胎干细胞研究的行为指南，人体组织 的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准，志愿者均知情同意术前签订知情同意书；智 齿在用75%酒精消毒后再用磷酸盐缓冲盐水冲洗，分离和培养鉴定根尖牙乳头干细胞，简 述如下：轻轻剥离根尖牙乳头组织，用磷酸盐缓冲盐水反复清洗，剪碎，置于含I型胶原酶 (3g/L)和分散酶（4g/L)的消化液，37°C下消化1小时，过70iim细胞筛收集细胞，lOOOrpm 离心lOmin，用培养液重新悬浮成单细胞悬液；将细胞接种于25cm 2细胞培养瓶中，在培养 基（含15%胎牛血清、2111111〇1/1谷氨酰胺、10(^/1111青霉素和10011 §/1111链霉素）中371：、 5% C02培养，每2?3天换液1次；每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况；当细胞生长至 80%汇合状态时，用0. 25%胰蛋白酶按1 : 2消化传代；2-4代的干细胞被用于之后的实 验；
[0038] 二、染色质免疫沉淀反应及数据分析：
[0039] 染色质免疫沉淀反应按照制造商的产品说明进行并使用人类启动子1. OR阵列分 析；细胞于1 %甲醛溶液中孵育15分钟，2X 106个细胞以及抗组蛋白3第4位赖氨酸的三 甲基化抗体用于此染色质免疫沉淀反应，所有产生的沉淀DNA样本采用实时定量per进行 量化，数据表示为DNA的百分比；引物如补充表1所示；由于实验和技术变化，信号必须标 准化以进行适当的对比实验；L0WESS程序被用来衡量不同染色质免疫沉淀反应数组之间 的可变性，为了确定组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化，不同条件下的根尖牙乳头干细胞存 在差异甲基化，因此定义2倍变化为组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化显著变化的阈值；同 样，假定值阈值〇. 05也用来区分基因改变；简略的，双通道图像数据比使用L0WESS方法规 范化，并假定值计算是使用相同的方法实现的表达分析；
[0040] 三、质粒构建与病毒转染：
[0041] 标准方法进行质粒的构建；所有结构都通过适当的限制消化和/或测序加以 验证；设计WDR63的SiRNA，将其插入慢病毒的shRNA载体上，测序鉴定，最终构建成 WDR63shRNA的质粒；设计WDR63基因全长的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全长将 其连接到逆转录病毒的表达载体上，测序鉴定，最终构建成质粒；然后进行病毒包装、收集， 病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱；病毒转染，对根尖牙乳头干细胞进行电镀过夜， 然后感染逆转录病毒或慢的聚凝胺达6个小时，48小时后，用不同的抗生素筛选被转染的 细胞；
[0042] shRNA的目标序列为：
[0043] WDR63shRNA:5， -AAACCCAGGGCTGCCTTGGAAAAG-3，；
[0044] 四、蛋白质印迹分析：
[0045] RIPA裂解液溶解细胞，样本用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶分离并利用半干转移膜 装置转移到聚乙二烯二氟化物（PVDF)中，膜上涂抹5%脱水牛奶放置2h，然后用一抗孵育 一夜；免疫复合物与兔或小鼠免疫球蛋白G抗体一同孵育并用化学发光底物试剂使其可视 化；主要针对WDR63是抗WDR63多克隆抗体；
[0046] 五、细胞增殖能力测定：
[0047] 根尖牙乳头干细胞密1. OX 104个细胞密度铺板于60nm培养皿；并在细胞培养3、 5、7天进行计数，细胞计数采用自动细胞计数仪并在细胞悬液中加入台盼蓝排除死细胞； 进行3个独立实验取其平均值；
[0048] 六、碱性磷酸酶和茜素红染色：
[0049] 矿化诱导液诱导根尖牙乳头干细胞，碱性磷酸酶活性检测根据碱性磷酸酶活性检 测试剂盒说明进行分析，为检测其矿化能力，细胞诱导2-3周后，用70%乙醇固定，2%茜素 红染色；定量测定钙离子浓度，用10%的氯化十六烷吡啶溶于磷酸钠在室温下使茜素红退 色30分钟；钙离子浓度是通过测量562nm的吸光度决定，并用标准曲线换算；
[0050] 七、裸鼠皮下进行细胞回植：
[0051] 本发明通过首都医科大学北京口腔医院动物关怀和使用委员会允许；将约 4. 0 X 106个细胞与40毫克的羟基磷灰石/磷酸三钙陶瓷颗粒混合，然后按先前所述将其移 植到5只10周龄裸鼠背部皮下，在每一个裸鼠，空白根尖牙乳头干细胞移植到左侧背表面 皮下，而WDR63根尖牙乳头细胞移植到右侧背表面皮下；这些程序依照动物协议批准规范 进行；移植后第八周，获取移植细胞用10%福尔马林固定，10% EDTA脱钙（pH值8.0)，石蜡 包埋，HE染色，定性测量组织矿化量；
[0052] 八、实验结果：
[0053] 使用染色质免疫沉淀反应生成基因启动子区域组蛋白修饰基因图谱：
[0054] 试图检测根尖牙乳头干细胞成骨分化时启动子区域分布的组蛋白3第4位赖氨 酸的三甲基化的全基因组基因；分别用成骨培养基和普通培养基培养根尖牙乳头干细胞7 天，使用抗组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化抗体与差异标记的浓缩芯片共杂交进行染色 质免疫沉淀反应；染色质免疫沉淀反应数据显示，在成骨诱导后基因启动子富含三甲基化 的组蛋白3第4位赖氨酸；此外，在比较未分化和分化根尖牙乳头干细胞基因启动子区域三 甲基化的组蛋白3第4位赖氨酸基因图谱发现，119个基因启动子展现出在三甲基化的组 蛋白3第4位赖氨酸大于两倍的增长，21个基因启动子展现出在三甲基化的组蛋白3第4 位赖氨酸大于两倍的降低；为了证实染色质免疫沉淀反应实验数据，WDR63，TREX1，F0X024， ARNTL，F0XP4, TMEM106B这些基因验证芯片分析；结果表明相对于普通培养基，成骨诱导时 在WDR63, TREX1，F0X024, ARNTL这些启动子中三甲基化的组蛋白3第4位赖氨酸显著增 力口，而在F0XP4，TMEM106B这些启动子中三甲基化的组蛋白3第4位赖氨酸显著降低（图片 la-f);另外，实时定量PCR结果显示在根尖牙乳头干细胞分化过程中，WDR63，ARNTL呈现大 于两倍的高表达，而F0XP4则为地表达（图片lg-i);然而TREX1，F0X024，TMEM106B在分化 与未分化根尖牙乳头干细胞中的表达无明显差异；总的来说，这些数据让推测WDR63可能 在根尖牙乳头干细胞成骨分化中起促进作用；
[0055] WDR63过表达增强根尖牙乳头干细胞的成骨分化潜能
[0056] 进一步证实WDR63在根尖牙乳头干细胞中的功能，将WDR63序列插入一个逆转录 病毒载体；这种构造通过逆转录病毒感染结合到根尖牙乳头干细胞时过量表达WDR63 ;也 通过蛋白质印迹实验验证WDR63的过量表达（图片2a);接下来，结合后的根尖牙乳头干细 胞进行成骨诱导以检测其成骨分化潜能，结果表明，WDR63的过度表达增加了碱性磷酸酶活 性（图片2b);因此，通过茜素红染色和钙离子定量测量，过量表达WDR63的根尖牙乳头干 细胞相对于空白载体的根尖牙乳头干细胞其矿化能力增强（图片2c-d);实时定量PCR结 果也显示，在过量表达WDR63的根尖牙乳头干细胞诱导的第7天和第14天，骨涎蛋白的表 达显著增高（图片2e);接下来，检测了调节成骨分化的关键转录因子的表达，包括RUNX2 和OSX ;RUNX2和OSX的RNA水平显著增高在过量表达WDR63的根尖牙乳头干细胞中相对 于空白载体的根尖牙乳头干细胞（图片2f-g);接下来，研究是否添加WDR63会影响根尖牙 乳头干细胞在体内的骨生成；SCA空载根尖牙乳头干细胞和载WDR63根尖牙乳头干细胞移 植到裸鼠皮下；在移植后第8周，HE染色显示，在获取的载WDR63根尖牙乳头干细胞移植体 中有更多的骨样矿化组织相比空白组（图片3a);定性测量矿化组织显示骨样矿化组织量 在载WDR63根尖牙乳头干细胞移植体中要高于空白组（图片3b);因此，体内移植实验表明 载WDR63根尖牙乳头干细胞产生更多的骨样矿化组织相比空载根尖牙乳头干细胞；综上所 述，这些结果表明，WDR63表达大大触发的根尖牙乳头干细胞成骨分化；
[0057] WDR63的减少抑制根尖牙乳头干细胞的骨向分化
[0058] 为了进一步阐明WDR63在根尖牙乳头干细胞中的功能，设计了一个短发卡RNA目 标在于抑制WDR63表达式并将其通过慢病毒转染引入根尖牙乳头干细胞；选择后，用免疫 印迹分析检测减低的效能（图片4a);接下来，检测是否WDR63在本质上影响了根尖牙乳头 干细胞的成骨能力；根尖牙乳头干细胞在成骨培养基中培养，发现抑制WDR63的根尖牙乳 头干细胞其碱性磷酸酶活性显著低于空白根尖牙乳头干细胞（图片4b);成骨诱导后通过 茜素红染色和钙离子定量测量，抑制WDR63的根尖牙乳头干细胞相对于空白根尖牙乳头干 细胞其矿化能力明显降低（图片4c-d);此外，在细胞培养7天后进行细胞增殖能力检测 显示，抑制WDR63的根尖牙乳头干细胞相对于空白根尖牙乳头干细胞其增殖能力明显降低 (图片4e);
[0059] 九、结论
[0060] TOR63是一种未知功能的WD重复蛋白，研究在根尖牙乳头干细胞分化过程中 WDR63的功能，发现在根尖牙乳头干细胞体内外分化过程中，WDR63增强其碱性磷酸酶活性 及矿化能力，这表明WDR63可能是控制间充质干细胞成骨分化潜能的一个关键因素；间充 质干细胞向成骨细胞系分化要求其他细胞系分化间的协调与抑制，多个转录因子的激活与 间充质干细胞分化有关，两个关键的转录因子，RUNX2和0SX是成骨分化所必需的；研究结 果表明，WDR63能够激活两个关键转录因子0SX和RUNX2的表达；接下来，检测了骨涎蛋白 的mRNA水平，其为骨基质的主要结构蛋白；研究结果显示，WDR63诱导骨涎蛋白基因的表 达；这些结果表明WDR63是成骨分化的一个关键的增强剂；此外，细胞生长曲线表明抑制 WDR63会抑制根尖牙乳头干细胞的增殖；间充质干细胞的生长、增殖和生存能力的体外检 测能够准确预测体内间充质干细胞功能；这些发现显著表明增强间充质干细胞的生长，增 殖，生存能力可能提高他们的血管和组织再生潜力；在目前的研究中，研究结果对于WDR63 促进体外细胞增殖能力支持WDR63具有增强组织再生的潜能；
[0061] 总之，结果代表着国际性观点即三甲基化的组蛋白3第4位赖氨酸的修饰与根尖 牙乳头干细胞骨向分化的功能性联系，并表明通过改变三甲基化的组蛋白3第4位赖氨酸 控制基因激活和沉默对间充质干细胞的成骨分化至关重要；还发现了一个关键的成骨分化 增强剂-WDR63, WDR63启动子的组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化能够增强根尖牙乳头干 细胞的成骨分化潜能。
[0062] 补充图表1 :进行染色质免疫沉淀反应实时定量PCR的引物
[0063]

【权利要求】
1. 一种WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法，其特征在于， 该WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法包括： 步骤一，细胞培养，智齿在用75%酒精消毒后再用磷酸盐缓冲盐水冲洗，分离和培养鉴 定根尖牙乳头干细胞； 步骤二，染色质免疫沉淀反应及数据分析，细胞于1 %甲醛溶液中孵育15分钟，2 X 106个细胞以及抗组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化抗体用于此染色质免疫沉淀反应，所有产 生的沉淀DNA样本采用实时定量per进行量化，数据表示为DNA的百分比； 步骤三，质粒构建与病毒转染，标准方法进行质粒的构建，设计TOR63的SiRNA，将其插 入慢病毒的shRNA载体上，测序鉴定，最终构建成WDR63shRNA的质粒；设计WDR63基因全 长的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全长将其连接到逆转录病毒的表达载体上，测 序鉴定，最终构建成质粒；然后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰 箱；病毒转染，对根尖牙乳头干细胞进行电镀过夜，然后感染逆转录病毒或慢的聚凝胺达6 个小时,48小时后，用不同的抗生素筛选被转染的细胞； 步骤四，蛋白质印迹分析，RIPA裂解液溶解细胞，样本用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶分离 并利用半干转移膜装置转移到聚乙二烯二氟化物中，膜上涂抹5 %脱水牛奶放置2h，然后 用一抗孵育一夜；免疫复合物与兔或小鼠免疫球蛋白G抗体一同孵育并用化学发光底物试 剂使其可视化；针对WDR63是抗WDR63多克隆抗体； 步骤五，细胞增殖能力测定，根尖牙乳头干细胞密1. 0 X 104个细胞密度铺板于60nm培 养皿；并在细胞培养3、5、7天进行计数，细胞计数采用自动细胞计数仪并在细胞悬液中加 入台盼蓝排除死细胞；进行3个独立实验取平均值； 步骤六，碱性磷酸酶和茜素红染色，矿化诱导液诱导根尖牙乳头干细胞，碱性磷酸酶活 性检测根据碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明进行分析，为检测矿化能力，细胞诱导2-3周 后，用70%乙醇固定，2%茜素红染色；定量测定钙离子浓度，用10%的氯化十六烷吡啶溶 于磷酸钠在室温下使茜素红退色30分钟；钙离子浓度是通过测量562nm的吸光度决定，并 用标准曲线换算； 步骤七，裸鼠皮下进行细胞回植，将4. 0 X 106个细胞与40毫克的羟基磷灰石/磷酸三 钙陶瓷颗粒混合，然后移植到5只10周龄裸鼠背部皮下，在每一个裸鼠，空白根尖牙乳头干 细胞移植到左侧背表面皮下，而WDR63根尖牙乳头细胞移植到右侧背表面皮下；依照动物 协议批准规范进行；移植后第八周，获取移植细胞用10%福尔马林固定，10% EDTA脱钙，pH 值8. 0,石蜡包埋，HE染色，定性测量组织矿化量。
2. 如权利要求1所述的TOR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方 法，其特征在于，步骤一的具体方法：轻轻剥离根尖牙乳头组织，用磷酸盐缓冲盐水反复清 洗，剪碎，置于含I型胶原酶3g/L和分散酶4g/L的消化液，37°C下消化1小时，过70 y m细 胞筛收集细胞，l〇〇〇rpm离心lOmin，用培养液重新悬浮成单细胞悬液；将细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，在培养基含15%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 y g/ml 链霉素中37°C、5% C02培养，每2?3天换液1次；每天在倒置显微镜下观察细胞生长状 况；当细胞生长至80%汇合状态时，用0. 25%胰蛋白酶按1 : 2消化传代；2-4代的干细胞 被用于之后的实验。
3. 如权利要求1所述的TOR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方 法，其特征在于，在步骤二中，信号必须标准化以进行对比实验；LOWESS程序被用来衡量不 同染色质免疫沉淀反应数组之间的可变性，为了确定组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化，不 同条件下的根尖牙乳头干细胞存在差异甲基化，因此定义2倍变化为组蛋白3第4位赖氨 酸的三甲基化显著变化的阈值；同样，假定值阈值〇. 05也用来区分基因改变；双通道图像 数据比使用LOWESS方法规范化，并假定值计算是使用相同的方法实现的表达分析。
4. 如权利要求1所述的TOR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方 法，其特征在于，在步骤三中，shRNA的目标序列为： WDR63shRNA:5, -AAACCCAGGGCTGCCTTGGAAAAG-3,。
5. 如权利要求1所述的TOR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方 法，其特征在于，该TOR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法中WDR63 增强其碱性磷酸酶活性及矿化能力，WDR63能够激活两个关键转录因子0SX和RUNX2的表 达；WDR63是成骨分化的一个关键的增强剂；WDR63促进体外细胞增殖能力支持WDR63具有 增强组织再生的潜能；WDR63启动子的组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化能够增强根尖牙 乳头干细胞的成骨分化潜能。
【文档编号】C12N15/867GK104450621SQ201410550443
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】范志朋, 刁树, 杨东梅, 王松灵 申请人:首都医科大学附属北京口腔医院