一组核苷酸序列及在单增李斯特菌鉴定中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种核苷酸序列组合及其在交叉恒温扩增反应中的应用。所述交叉恒温扩增反应可用于鉴定单增李斯特菌，具有检测简单、快速、方便、特异性强、灵敏度高的特点。
【专利说明】-组核苷酸序列及在单增李斯特菌鉴定中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及交叉恒温扩增在细菌检测中的应用，特别是在单增李斯特菌鉴别诊断 中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。
【背景技术】
[0002] 单增李斯特菌（Listeriamonocytogens，LM)是广泛存在于环境中的革兰氏阳性、 有运动能力、兼性胞内寄生短杆菌，是重要的食源性人兽共患病原菌，能够引起人类严重感 染。李斯特菌病的易感人群主要为免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生 儿和孕妇；后者为肿瘤患者、艾滋病患者和器官移植受体等。人类李斯特菌病主要临床症 状为败血症、脑膜炎、孕妇流产、死产以及发热性胃肠炎等，该菌可穿越肠道屏障、血脑屏障 和胎盘屏障。单增李斯特菌病在人类的感染率不高，但该病的死亡率极高而受到广泛的关 注，一度成为欧美国家重大公共卫生问题。国内尚无由单增李斯特菌引起食物中毒暴发的 报道，实际存在与否不明，散发病例在多个省市都有报道。因此，为了给予临床病人准确快 速的治疗和单增李斯特菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的单增李斯 特菌检测方法成为必要。
[0003]目前对于单增李斯特菌分离鉴定主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定，该方法 耗时大约5到7天，包括二次增菌，选择培养及后续的生化鉴定，耗时耗力，生化结果的判读 依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以 PCR为基础的诊断技术（如普通PCR技术，荧光PCR技术）被用于单增李斯特菌的快速诊断， 然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，较高的探针合成费用，以及熟 练的操作人员。一些基层实验室无法开展，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技 术诊断单增李斯特菌的PCR方法和real-timePCR方法，所选择的目的基因（如hly，prfA, iap)特异性差，极易出现假阳性扩增。此外PCR检测技术的灵敏度差，检测过程耗时较长， 不利于快速检测和应急检测。随着恒温技术的出现，环介导恒温扩增技术（LAMP)已经被用 于单增李斯特菌的检测，然而该技术的引物设计复杂，对目的基因的保守性要求较高，目前 报道的诊断单增李斯特菌的LAMP技术主要根据hly和prfA基因设计引物，然而这些基因 的特异性差，容易导致假阳性扩增，不利于单增李斯特菌的准确诊断。因而，急需发展一种 简单、快速、灵敏和特异的诊断技术用于单增李斯特菌检测。
[0004]交叉恒温扩增技术（Crossprimingamplification,CPA)是由XuGaolian等建 立的一种新的恒温核酸扩增技术，具有灵敏高、操作简单、不依赖于昂贵设备、产物易检测 等优点。该技术已被广泛用于分子诊断领域。CPA针对靶序列的5个特异部位设计7条引 物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，靶序列能够得以高 效扩增。7条核心引物之中2条为交叉引物，即As和Sa;2条为置换引物，即4s和5a;3条 为扩增引物，即3a、2a和Is。交叉引物As包含2a和ls，即5'-2a_ls;Sa包含Is和2a，即 5' _ls_2a〇
[0005] CPA反应分为单一交叉扩增反应（S-CPA)和双交叉扩增反应（D-CPA)。CPA反应 仅需恒温在62?66°C之间的一个温度即可，该温度是双链DNA复性及延伸的中间温度，双 链DNA在该温度范围内处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。S-CPA在链置换活性Bst DNA聚合酶的作用下，以As引物Is区段的3'末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启 动链置换DNA合成。4s引物与Is前端4s的互补序列（4a)结合，以3'末端为起点，通过 链置换活性BstDNA聚合酶的作用，首先置换出As引物合成的DNA链，同时合成自身DNA。 最终4s引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。然而由As引物先合成的DNA链被4s 引物进行链置换产生一条单链，该单链通过5'末端的3s区段和引物3a互补，启动DNA合 成；2s区段和引物2a互补，启动链置换DNA合成，释放含引物3a的DNA合成链，该合成链 能够与引物2a和As互补结合，启动第一个循环扩增。此外由引物2a互补合成的新链能 被下游的置换引物5a置换，产生的新链发生自我碱基配对，形成单一茎环状结构，启动第 二个循环扩增。CPA反应扩增的第一个循环阶段：形成的DNA短链产物处于解链与结合动态 平衡，引物能够与解离的单链结合实现扩增循环；第二个循环阶段：在哑铃状结构中，As引 物中的Is与环上单链la杂交，启动新一轮链置换反应，扩增出短链DNA，形成的短链产物同 样处于解链与结合动态平衡，引物能够与解离的单链结合实现扩增，并产生新的茎环结构， 从而实现CPA的循环扩增。S-CPA反应可以特异、高效、快速的扩增目的DNA，在1小时之内 使产物的量达到1〇9个拷贝。
[0006]D-CPA与S-CPA有相似的扩增原理，只是在反应体系中包含了两条交叉引物As和 Sa，而不含置换引物2a。对于D-CPA反应而言，扩增体系包含两条交叉引物As和Sa，两条 置换引物4s和5a，一条扩增引物3a。对于S-CPA反应而言，扩增体系包含一条交叉引物 As,两条置换引物4s和5a,两条扩增引物3a和2a。
[0007]CPA扩增之后，其产物的检测可以通过琼脂糖电泳后染色观察。较为简便的方法是 直接在产物中加入SYBRGreenI染色，呈现绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。也可以 通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断，液体浑浊，离心或有白色沉淀的为阳性反 应，无此现象的则为阴性反应。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料，阳性 反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。
[0008] 鉴于诸如PCR等常规技术在检测病原微生物时存在着灵敏性差，特异性不高的缺 点，如何运用CPA技术解决一些病原微生物在鉴别诊断中存在的这些问题已成为病原微生 物检测【技术领域】的亟待解决的需求。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种能够应用于细菌检测，特别是恒温扩增技术的检测序 列，并进一步提供恒温交叉扩增技术检测单增李斯特菌的方法，以及一种针对该病原菌的 快速、敏感和特异的核酸检测体系。
[0010]基于上述发明目的，本发明针对单增李斯特菌的种特异基因lm〇0733设计一套交 叉反应扩增引物。因此，本发明首先提供了一种核苷酸序列组合，由SEQIDN0:1、3-7组 成，其中SEQIDN0:4和7不同时存在。这些核苷酸序列作为恒温交叉扩增反应中的各种 引物使用。
[0011]在一个优选的技术方案中，所述组合由SEQIDN0:l、3-6组成。该组引物用于 S-CPA扩增。
[0012] 在一个优选的技术方案中，所述组合由SEQIDN0:l、3、5-7组成。该组引物用于 D-CPA扩增。
[0013] 本发明还提供了上述核苷酸序列组合在交叉恒温扩增反应中的应用。
[0014] 在一个优选的技术方案中，所述交叉恒温扩增反应可分为以下步骤：
[0015] (1)提取待检测样本的DNA模板；
[0016] (2)将步骤（1)获得的DNA模板放入交叉恒温扩增反应体系中扩增；
[0017] (3)检测步骤（2)获得的扩增产物。
[0018] 优选地，所述交叉恒温扩增反应为S-CPA扩增，反应体系总体积为20ii1， 其中含有：〇.3mMSEQIDN0:l，1.44mMSEQIDN0:3，1.44mMSEQIDN0:4,0.3mM SEQIDN0:5,2.4mMSEQIDN0:6，以及 20mMTris-HCl(pH8. 8)，lOmMKC1，4mM MgS04, 10mM(NH4)2S04, 0? 1%Tween20, 0? 8M甜菜碱，1. 4mMdNTPs, 1ii1ofBstDNA聚合酶 (8U/mL)，1illLoopamp荧光染料（FD)和1illDNA模板，反应温度64°C，反应时间为90分 钟。
[0019] 优选地，所述交叉恒温扩增反应为D-CPA扩增，反应体系总体积为20y1， 其中含有：〇.3mMSEQIDN0:l，1.44mMSEQIDN0:3,0.3mMSEQIDN0:5,2.4mM SEQIDN0:6,1.44mMSEQIDN0:7,以及 20mMTris-HCl(pH8. 8),lOmMKC1, 4mM MgS04, 10mM(NH4)2S04, 0? 1%Tween20, 0? 8M甜菜碱，1. 4mMdNTPs, 1ii1ofBstDNA聚合酶 (8U/mL)，1illLoopamp荧光染料（FD)和1illDNA模版，反应温度64°C，反应时间为90分 钟。
[0020] 在一个优选的技术方案中，所述步骤（3)可以为目测、浊度仪检测、或琼脂糖凝胶 电泳检测。
[0021] 在一个优选的技术方案中，所述待检测样本可以为细菌培养物、体液或人体分泌 物样本。
[0022] 本发明提供的应用上述核苷酸序列的交叉恒温扩增反应对于单增李斯特菌检测 与普通PCR比，具有显著的优点。CPA扩增反应条件简单，温度单一、反应及结果研判快速， 易于在基层实验室开展。另外，CPA扩增反应的灵敏度比普通PCR方法高10倍。在以常见 的致病菌及条件致病菌DNA(伊氏李斯特菌，伊洛克李斯特菌，威尔李斯特菌，希尔李斯特 菌，格氏李斯特菌，蜡样芽胞杆菌，肠致病性大肠杆菌，肠产毒性大肠杆菌，肠侵袭性大肠杆 菌等）为模板评价CPA反应体系的特异性的实验中，该体系在检测25种其他常见致病菌和 机会致病菌时未出现特异性扩增，说明该检测体系的特异性良好。
[0023] 以上优点显示本发明具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1、引物设计的位置和方向示意图；
[0025] 图2、S-CPA反应结果图；
[0026]图3、D-CPA反应结果图；
[0027] 图4、CPA特异性评价结果图；
[0028]图5、普通PCR检测灵敏度评价结果图；
[0029] 图6、S-CPA和D-CPA实时浊度仪检测结果图；
[0030] 图7、S-CPA检测灵敏度评价结果图；
[0031] 图8、D-CPA检测灵敏度评价结果图。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0033] 序列设计
[0034] 根据单增李斯特菌种特异性基因lmo0733(NC_003210. 1，Listeria monocytogenes,LM)设计交叉反应引物，该基因存在于单增李斯特菌所有血清型中，其特异 性好，可以将单增李斯特菌与其他密切相近的菌种（如伊氏李斯特菌，威尔李斯特菌，伊洛 克李斯特菌）和菌属（如芽孢杆菌属）区分开。利用多序列比对软件ClustalX1.83和引 物设计软件PrimerPremier5. 0设计交叉反应引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据 库中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得 优化后的一套恒温交叉反应引物。引物设计的位置和方向见图1，序列见表1。
[0035] 表1:恒温交叉反应引物序列
[0036]
【权利要求】
1. 一种核苷酸序列组合，由SEQ ID N0:l、3-7组成，其中SEQ ID N0:4和7不同时存 在。
2. 根据权利要求1所述的核苷酸序列组合，所述组合由SEQ ID NO: 1、3-6组成。
3. 根据权利要求1所述的核苷酸序列组合，所述组合由SEQ ID N0:l、3、5-7组成。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的核苷酸序列组合在交叉恒温扩增反应中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，所述交叉恒温扩增反应可分为以下步骤： (1) 提取待检测样本的DNA |旲板； (2) 将步骤（1)获得的DNA模板放入交叉恒温扩增反应体系中扩增； (3) 检测步骤（2)获得的扩增产物。
6. 根据权利要求5所述的应用，所述交叉恒温扩增反应的反应体系总体积为 20iil，其中含有：0.3mM SEQ ID N0:l，1.44mM SEQ ID N0:3，1.44mM SEQ ID N0:4， 0.3mMSEQIDN0:5,2.4mMSEQIDN0:6，#&20mMTris-HCl(pH8.8)，10mMKCl，4mM MgS04, 10mM(NH4)2S04, 0? 1% Tween 20, 0? 8M 甜菜碱，1. 4mM dNTPs, 1 ii 1 of Bst DNA 聚合酶 (8U/mL)，1 ill Loopamp荧光染料（FD)和1 ill DNA模板，反应温度64°C，反应时间为90分 钟。
7. 根据权利要求5所述的应用，所述交叉恒温扩增反应的反应体系总体积为 20iil，其中含有，0.3mM SEQ ID N0:l，1.44mM SEQ ID N0:3,0.3mM SEQ ID N0:5， 2.4mMSEQIDN0:6，1.44mMSEQIDN0:7，#&20mMTris-HCl(pH8.8)，10mMKCl，4mM MgS04, 10mM(NH4)2S04, 0? 1% Tween 20, 0? 8M 甜菜碱，1. 4mM dNTPs, 1 ii 1 of Bst DNA 聚合酶 (8U/mL)，1 ill Loopamp荧光染料（FD)和1 ill DNA模版，反应温度64°C，反应时间为90分 钟。
8. 根据权利要求5所述的应用，所述步骤（3)可以为目测、浊度仪检测、或琼脂糖凝胶 电泳检测。
9. 根据权利要求5所述的应用，所述待检测样本可以为细菌培养物、体液或人体分泌 物样本。
【文档编号】C12Q1/68GK104328113SQ201410561801
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月12日
【发明者】王毅, 王艳, 叶长芸 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所