一种用于转基因马铃薯检测的阳性标准质粒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种可作为检测转基因马铃薯的阳性标准质粒，是含有SEQIDNO:1～SEQIDNO:3分别所示的核苷酸片段，以及SEQIDNO:4所示的核苷酸片段，由以下方式获得：将SEQIDNo.1所示的抗马铃薯甲虫 cry3A 基因、SEQIDNo.2所示的胭脂碱合成酶启动子（ P-nos ）基因、SEQIDNo.3所示的抗马铃薯Y病毒 PVYCP 基因、SEQIDNo.4所示的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 UGPase 基因通过PCR技术叠加重组而成，命名为pBJGMM003。该阳性标准质粒用于转基因马铃薯的鉴定、检测与监管工作，解决了转基因马铃薯的阳性标准品匮乏等问题，保障了我国转基因马铃薯的相关工作的顺利进行。检测范围涵盖所有已批准转化体及部分在研转基因马铃薯。
【专利说明】-种用于转基因马铃薯检测的阳性标准质粒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种转基因马铃薯定性检测用标准质粒，具体涉及一种可检测转基因 马铃薯的阳性标准质粒。
【背景技术】
[0002] 转基因标准物质严重缺乏
[0003]随着转基因作物及相关产品在全世界范围内的迅速发展，其环境安全和食用安全 问题一直受到各国政府和广大消费者及相关检测机构人员的重视。对转基因作物核酸进行 监测、检测，并保证结果的准确、可靠和有效性，需要阳性标准物质的支撑。在保证转基因检 测结果的可比性、溯源性，推进转基因产品检测方法标准化等方面，转基因生物标准物质发 挥着十分重要的作用。
[0004] 目前国外研制的转基因阳性标准物质的组织或企业主要是欧洲标准物质研究院 (IRMM)和美国的油料化学学会（A0CS)。研制的种类主要包括转基因玉米、大豆、马铃薯、油 菜、棉花、甜菜等50余种。但这与190多种转基因作物种类相比，还远远不够。我国目前已 获的计量认证的转基因检测用标准物质不到10种，质粒阳性标准区区2种。因此，转基因 阳性标准物质的研制和应用成为国内外农业转基因生物安全管理体系建设的当务之急，也 是转基因检测监测的重要技术支撑之一。转基因标准物质的缺乏已成为制约转基因植物检 测技术发展和检测机构建设的瓶颈问题之一。
[0005]转基因马铃薯问题广受关注
[0006]近几年，部分媒体及网络传言，"美国的土豆削皮、切丝后变黑，可是中国已经没有 这样的土豆了。无论在云南还是北京买，土豆削皮切丝永远不会变色。基本上可以肯定，全 中国城市出售的土豆都是转基因。"虽然，长期研究马铃薯种植技术的专家明确表示，中国 没有转基因马铃薯，我国也从未批准进口转基因马铃薯，但长期以来，国内民众一直对转基 因食品心存戒备，甚至到了〃谈转基因色变〃的地步。
[0007]目前，全球共批准商业化种植的转基因马铃薯31种，即将获批的转基因马铃薯2 种，详见表1。国际上对转基因成分的检测主要是采用以核酸为基础的检测方法。关于转基 因马铃薯，我国目前尚无用于检测的阳性标准物质，因而一定程度上阻碍了我国转基因马 铃薯的检测工作进行。
[0008]转基因作物虽然多，但是绝大多数为跨国公司掌握的材料，国内检测机构很难取 得，这就给检测带来了困难。阳性标准质粒的择优采用检测靶标基因片段，构建于质粒框 架，用于转基因检测，解决了材料缺乏的问题。阳性标准质粒近几年已开始用于核酸检测领 域，且具有易于富集，快捷高效等优点。如《耐除草剂转基因大豆质粒标准分子》（中国农业 大学学报，2014)、《DAS-59122-7玉米的鉴定以及结合质粒标准品的品系特异性定量检测》 (农业生物技术学报，2013)、《转crylAb基因棉花质粒标准分子的构建与分析》（中国生物 防治学报，2013)、《转基因大豆M0N89788质粒分子》（中国专利，专利号201010106138)等 等。
[0009] 本发明针对转基因马铃薯检测中因缺乏标准物质而产生的瓶颈问题，经过科学的 调研、选择及克隆等步骤，发明了用于转基因马铃薯检测的阳性标准质粒，能筛选检测现行 批准的所有转基因马铃薯（31)种，和即将获批的转基因马铃薯2种。此阳性标准质粒检测 范围广，兼备性能稳定、易于制备、成本低等优点。
[0010] 表1国际上转基因马铃薯信息汇总表
[0011]
【权利要求】
1. 一种作为检测转基因马铃薯的阳性标准质粒，其特征是含有SEQ ID NO: 1?SEQ ID N0:4分别所示的核苷酸片段。
2. 权利要求1所述的阳性标准质粒，其特征是含有SEQ ID NO: 1?SEQ ID N0:4共4 个核苷酸片段按任意连接顺序组成的核酸片段。
3. 权利要求2所述的阳性标准质粒，其特征是所组成的核酸片段如SEQ ID N0:5所示。
4. 权利要求1?3任一所述的阳性标准质粒的构建方法，其特征是由下列4个引物对 分别对抗马铃薯甲虫基因、胭脂碱合成酶启动子、抗马铃薯Y病毒、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷 酸化酶进行特异性扩增，并将扩增子进行融合得到阳性标准质粒： 引物对 1 :SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:7 ; 引物对 2 :SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 ; 引物对 3 :SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 ; 引物对 4 :SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 13。
5. 权利要求1?3任一所述的阳性标准质粒在转基因马铃薯定性筛选、监测中的应用。
6. 权利要求5所述的应用，所述应用是作为转基因马铃薯检测用的阳性参考品、标准 物质。
【文档编号】C12N15/63GK104328188SQ201410616278
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】金芜军, 李亮, 宛煜嵩, 董美, 柳方方 申请人:中国农业科学院生物技术研究所