山羊lyrm1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒，以包含LYRM1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，PCR扩增山羊LYRM1基因部分序列，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定山羊LYRM1基因第8793位为G或T的碱基多态性。本发明提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的检测方法，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与山羊生长性状密切相关的遗传标记，可用于山羊的辅助选择和分子育种。
【专利说明】山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试 剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因单核苷酸多态性（SNP)的检测，特别涉及山羊LYRM1基因单核苷 酸多态性位点的检测。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性（SNP)指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/G)的替换而 引起的多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型变异的SNPs约占2/3， 其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其 中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。
[0003] 根据对遗传性状的影响，基因多态性又可分为两种：一种是同义突变多态性，即 SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱 基的"含义"相同；另一种是非同义突变多态性，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改 变，从而广生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非 同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更 可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重 要影响。不仅如此，在群体遗传研宄中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的 研宄中也具有重要意义。
[0004] 近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多 态技术（SSCP)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP)和直接测序技术等。SSCP 可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Takao经实验证明小于300bp的DNA片段中 的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方 法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迀移率的突变单链DNA分 离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该 方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。
[0005] 胰岛素是能量代谢中的一种合成代谢激素，在调节糖类平衡方面具有重要作用。 胰岛素可以促进葡萄糖转运。肥胖往往伴随着胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是在胰岛素起作用 的目标组织（例如肝脏、骨骼肌以及脂肪组织）中胰岛素作用减弱的一种病理学状态。胰 岛素和胰岛素受体（IR)结合，催化细胞内底物如IRS蛋白发生酪氨酰基磷酸化。IRS-1蛋 白在胰岛素代谢中具有重要作用。胰岛素受体介导的IRS磷酸化激活两种信号通路来抑制 葡萄糖转运。PI3K-蛋白激酶B (Protein kinase B，PKB/Akt)信号通路对于控制葡萄糖摄 取的胰岛素活性以及抑制葡萄糖异生起重要作用。LYRM1基因是与人类肥胖相关的易感基 因，其编码的蛋白在N端临近区域存在一高度保守的三肽基序一一LYR结构域，属于NADH 复合物元件。LYRM1通过降低PI3K和Akt的磷酸化水平来降低胰岛素刺激状态下的葡萄 糖的摄取。LYRM1基因分布较广泛，在各种组织中都有发现。肥胖群体的网膜脂肪组织中 LYRM1基因高丰度表达，在骨骼肌中的表达量也很高，研宄表明该基因能够促进前体脂肪细 胞的分化，并且抑制其细胞编程性死亡，并且可能参与线粒体的功能以及能量代谢。因此， 研宄哺乳动物LYRM1基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。
[0006] 目前，对于LYRM1基因遗传变异的研宄较少，着重在小鼠和人类肥胖症上。国内外 关于家畜LYRM1基因遗传变异的研宄，目前在山羊中还未见相关报道。由于LYRM1基因对于 维持正常体重，胰岛素敏感性以及葡萄糖代谢所必需，目前亟需提供一种检测方法为LYRM1 基因SNP与体尺性状关系的建立奠定基础，以便用于山羊生长性状的标记辅助选择（MAS)， 快速建立遗传资源优良的山羊种群。
【发明内容】
[0007] 本发明目的在于提供一种山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检 测试剂盒，以加快良种选育速度和提高种群品质。
[0008] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0009] 山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，包括以下步骤：
[0010] ⑴以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增山羊LYRM1基 因部分序列；
[0011] 所述的引物对P为：
[0012] 上游引物（SEQ. ID. NO. 1) :5' ACAGGCTTAGTTGCTCCC 3'
[0013] 下游引物（SEQ. ID. NO. 2) :5' ITCAGTCTTCTGCCCACA 3'
[0014] (2)对PCR扩增产物进行SSCP检测：PCR扩增产物经变性剂变性处理后进行聚丙 烯酰胺凝胶电泳，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果结合测序判定多态性位点的基因型， 所述多态性位点为：
[0015] 在山羊的LYRM1基因第8793位为G或T的碱基多态性位点，表现为GG、GT以及TT 三种基因型。
[0016] 所述的PCR扩增的反应程序为：94°C预变性4min ;94°C变性45s，58°C退火50s， 72°C延伸lmin，32个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0017] 所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10 %的聚丙烯酰胺凝胶。
[0018] 山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测试剂盒，包括引物对P，所述的引物对 P为：
[0019] 上游引物（SEQ. ID. NO. 1) :5' ACAGGCTTAGTTGCTCCC 3'
[0020] 下游引物（SEQ. ID. NO. 2) :5' ITCAGTCTTCTGCCCACA 3'
[0021] 与现有技术相比，本发明提供了一种简单、快速、低成本、精确度高的山羊LYRM1 基因多态性位点检测方法，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与山羊生长性状密切 相关的遗传标记，可用于山羊的辅助选择和分子育种，以加快良种选育速度和提高种群品 质。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1是引物对P扩增不同山羊个体PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0023] 图2是本发明中PCR产物混合测序筛查到的山羊LYRM1基因序列第8793位G-T 突变测序结果图；
[0024] 图3是本发明山羊LYRM1基因第8793位多态位点聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限 定。
[0026] 本发明首先根据LYRM1基因的保守序列设计引物，分别以4个山羊群体的基因组 DNA为模板，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列 比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体 中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和体尺性状的关联分析，筛选出与山羊体尺性 状密切相关的分子标记。本发明把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR-SSCP结合起来解决 了 SSCP的不稳定性，以防突变位点的漏检。
[0027] (一）、山羊LYRM1基因部分DNA序列的扩增及其多态性的检测
[0028] 1、山羊样品的采集及处理
[0029] 本发明采用了 4种山羊品种共计315个个体，具体为：（1)波尔山羊血液样品72 份，采自江苏省徐州市丰县梁寨合作种羊场；（2)徐淮白山羊血液样品81份，采自江苏省徐 州市铜山县吕梁乡；（3)海门山羊血液样品116份，采自江苏省南通海门；（4)波尔山羊X 徐淮白山羊耳组织样品46份，采自江苏省徐州市丰县梁寨合作种羊场。取山羊血样10mL， 加入0? 5mol/L的EDTA 500 y L抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80°C保存备用。取耳组织 样，在70%乙醇保存，冰盒低温带回实验室，-80°C保存备用。
[0030] 2、基因组DNA的提取
[0031] (1)将冷冻血样室温解冻，转移500 y L至1. 5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓 冲液，充分混勾，12000r/min离心10min(4°C )，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、 沉淀呈淡黄色。
[0032] (2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500 y L，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管 壁，37°C水浴lh。DNA抽提缓冲液的配制：0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超纯水500mL，灭菌、调pH至8. 0,4°C保存备用。
[0033] (3)加蛋白酶K 3yL(20mg/mL)并混匀，55°C过夜至澄清，尚未澄清者，可补加 1 y L蛋白酶K混匀继续消化至澄清。
[0034] (4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500 y L，温和摇动离心管20min，使其充 分混匀，4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 1. 5mL离心管中，重复一次。
[0035] (5)加氯仿500 y L，充分混勾20min，4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另 一 1. 5mL离心管中。
[0036] (6)加0. 1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管 直至白色的絮状沉淀析出，_20°C保存30?60min。
[0037] (7) 4°C，12000r/min离心lOmin，弃上清，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
[0038] (8)4°C，12000r/min离心10min，弃上清，室温下使乙醇挥发干净。
[0039] (9)干燥后的DNA溶于80?100 y L的TE-缓冲液或超纯水，4°C保存直至DNA完 全溶解，0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80°C保存。
[0040] 耳组织DNA的提取参考文献Sambrock et al (2002)方法。
[0041] 3、扩增引物设计
[0042] 由于GenBank中没有山羊LYRM1基因序列，所以，本发明以牛（GenBank : NC_007326. 5)序列为参考，利用Primer 5. 0设计能够扩增包含山羊LYRM1基因第3外显子 的PCR引物。
[0043] 扩增第3外显子的引物为：
[0044] 上游引物：5 'ACAGGCTTAGTTGCTCCC3 '
[0045] 下游引物：5 'ITCAGTCTTCTGCCCACA3 '
[0046] 以上述引物对扩增了山羊LYRM1基因第3外显子部分区域及一部分内含子区域。
[0047] 4、PCR 扩增
[0048] 分别以4个山羊品种的DNA为模版，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反 应体系为15 y L，见表1 ;PCR总反应程序，见表2。
[0049] 表1本发明的PCR反应体系
【权利要求】
1. 山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增山羊LYRM1基因部 分序列； 所述的引物对PS: 上游引物：5' ACAGGCTTAGITGCTCCC 3' 下游引物：5' ITCAGTCTTCTGCCCACA 3' (2) 对PCR扩增产物进行SSCP检测：PCR扩增产物经变性剂变性处理后进行聚丙烯酰 胺凝胶电泳，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果结合测序判定多态性位点的基因型，所述 多态性位点为： 在山羊的LYRM1基因第8793位为G或T的碱基多态性位点，表现为GG、GT以及TT三 种基因型。
2. 如权利要求1所述的山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于： 所述的？〇?扩增的反应程序为：94°0预变性4111111;941：变性458,581：退火5〇8,721：延伸 lmin，32个循环；最后72°C延伸lOmin。
3. 如权利要求1所述的山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于： 所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的聚丙烯酰胺凝胶。
4. 山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测试剂盒，其特征在于：包括引物对P，所 述的引物对P为： 上游引物：5' ACAGGCTTAGITGCTCCC 3' 下游引物：5' ITCAGTCTTCTGCCCACA 3'。
【文档编号】C12Q1/68GK104450933SQ201410812129
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】房兴堂, 陈宏 , 刘宣宣, 张春雷, 金晶, 王艳红 申请人:江苏师范大学