山羊 lmcd1 基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了山羊LMCD1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒，以包含LMCD1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，PCR扩增山羊LMCD1基因，然后进行SSCP多态性的检测。其基因多态性位点包括：在山羊的LMCD1基因第681位为A或G的碱基多态性；在山羊的LMCD1基因第2825位为C或T的碱基多态性。本发明提供了一种简单、快速、低成本、精确度高的检测方法，便于推广应用在DNA水平上筛查和检测与山羊生长性状密切相关的遗传标记，可用于山羊的辅助选择和分子育种。
【专利说明】山羊LMCD1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试 剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因单核苷酸多态性（SNP)的检测，特别涉及山羊LMCD1基因单核苷 酸多态性位点的检测。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性（SNP)指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/G)的替换而 引起的多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型变异的SNPs约占2/3， 其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其 中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。
[0003] 根据对遗传性状的影响，基因多态性又可分为两种：一种是同义突变多态性，即 SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱 基的"含义"相同；另一种是非同义突变多态性，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改 变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非 同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更 可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重 要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的 研究中也具有重要意义。
[0004] 近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多 态技术（SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等。SSCP可以发现靶DNA片段中未知位置的碱 基突变。Takao经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他 认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚 丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方 法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的 仪器。
[0005] LM结构域蛋白是细胞调控结构的主要成分，对细胞生长、细胞命运决定、细胞分 化以及细胞骨架的形成有重要作用。LIM结构域是一个锌指结构，存在于多种类型的蛋白 中，包括同源结构域转录因子，激酶以及由几个LIM结构域组成的蛋白。该结构域蛋白对肌 肉相关基因的调控起作用，LIM基因突变或者缺陷导致肌肉、神经、心血管以及垂体等组织 细胞的分化与发育障碍。LMCD1基因属于LIM结构域蛋白基因，在骨骼肌中丰度表达，表明 该基因可能参与骨骼肌蛋白质相互作用。LMCD1基因是对心脏肥大以及纤维症起作用的关 键性信号分子。LMCD1使得神经钙蛋白活化，活化的神经钙蛋白直接与活化的T细胞核因 子（NFAT)结合，导致NFAT脱磷酸化以及核转运，钙调神经磷酸酶调节蛋白l(MCIPl)是心 肌症calcineurin/NFAT信号转导的直接转录目标，NFAT与MCIP1结合，并促进导致心脏肥 大的基因表达。
[0006] 目前，关于LMCD1基因在病理学上研究主要是心脏肥大与压力负荷过大诱导的心 脏纤维症，以及该基因变异引起的肝细胞癌中细胞迁移和瘤转移。关于LMCD1基因在家畜 上的研究表明该基因的变异与猪的背膘、瘦肉率以及肥肉率显著相关，有利于育种选择。山 羊LMCD1基因多态性及其生长性状相关性的研究迄今没有报道。目前亟需提供一种检测方 法为LMCD1基因SNP与体尺性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国山羊生长性状的标 记辅助选择（MAS)，快速建立遗传资源优良的山羊种群。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种山羊LMCD1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及 检测试剂盒，以加快良种选育速度和提高种群品质。
[0008] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0009] 山羊LMCD1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，包括以下步骤：
[0010] ⑴以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1或引物对P2为引物，PCR扩增 山羊LMCD1基因中对应包含第681位的部分序列或包含2825位的部分序列；
[0011] 所述的引物对pis:
[0012] 上游引物 Pla(SEQ. ID. NO. 1) :5' CCTTCAGGAGCGTTTGGACT 3'
[0013] 下游引物 Plb (SEQ. ID. NO. 2) : 5' GCACAACTGGGCITTGGAIT 3'
[0014] 所述的引物对P2为：
[0015] 上游引物 P2a (SEQ. ID. NO. 3) : 5 ' GGTCCTCACCTCATCACAGC 3 '
[0016] 下游引物 P2b (SEQ. ID. NO. 4) : 5' ACTTCAGTCCTCACAACTCCCT 3'
[0017] (2)对PCR扩增产物进行SSCP检测：PCR扩增产物经变性剂变性处理后进行聚丙 烯酰胺凝胶电泳，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定多态性位点的基因型，所述多态 性位点为：
[0018] 在山羊的LMCD1基因第681位为A或G的碱基多态性位点，表现为AA以及AG两 种基因型；
[0019] 在山羊的LMCD1基因第2825位为C或T的碱基多态性位点，表现为CC以及CT两 种基因型。
[0020] 所述的PCR扩增的反应程序为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，58°C退火40s， 72°C延伸40-60s，35个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0021] 所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的聚丙烯酰胺凝胶。
[0022] 山羊LMCD1基因单核苷酸多态性位点的试剂盒，包括引物对P1或引物对P2,所述 的引物对P1为：
[0023] 上游引物 Pla(SEQ. ID. NO. 1) : 5' CCTTCAGGAGCGTTTGGACT 3'
[0024] 下游引物 Plb (SEQ. ID. NO. 2) : 5' GCACAACTGGGCITTGGAIT 3'
[0025] 所述的引物对P2为：
[0026] 上游引物 P2a (SEQ. ID. NO. 3) : 5，GGTCCTCACCTCATCACAGC 3 '
[0027] 下游引物 P2b (SEQ. ID. NO. 4) : 5' ACTTCAGTCCTCACAACTCCCT 3'
[0028]
[0029] 与现有技术相比，本发明提供了一种简单、快速、低成本、精确度高的山羊LMCD1 基因多态性位点检测方法，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与山羊生长性状密切 相关的遗传标记，可用于山羊的辅助选择和分子育种，以加快良种选育速度和提高种群品 质。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1是引物P1扩增不同山羊个体（山羊LMCD1基因第681位多态位点）PCR产物 琼脂糖凝胶电泳图；
[0031] 图2是引物P2扩增不同山羊个体（山羊LMCD1基因第2825位多态位点）PCR产 物琼脂糖凝胶电泳图；
[0032] 图3是本发明中PCR产物混合测序筛查到的山羊LMCD1基因序列第681位A-G突 变测序结果图；
[0033] 图4是本发明中PCR产物混合测序筛查到的山羊LMCD1基因序列第2825位C-T 突变测序结果图；
[0034] 图5是本发明山羊LMCD1基因第681位多态位点聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0035] 图6是本发明山羊LMCD1基因第2825位多态位点聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
[0037] 本发明首先根据LMCD1基因的保守序列设计引物，分别以4个山羊群体的基因组 DNA为模板，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列 比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体 中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和体尺性状的关联分析，筛选出与山羊体尺性 状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0038] (一）、山羊LMCD1基因部分DNA序列的扩增及其多态性的检测
[0039] 1、山羊样品的采集及处理
[0040] 本发明采用了 4种山羊品种共计315个个体，具体为：（1)波尔山羊血液样品72 份，采自江苏省徐州市丰县合作种羊场；（2)徐淮白山羊血液样品81份，采自江苏省徐州市 铜山县吕梁乡；（3)海门山羊血液样品116份，采自江苏省南通海门；（4)波尔山羊X徐淮 白山羊耳组织样品46份，采自江苏省徐州市丰县梁寨合作种羊场。取山羊血样10mL，加入 0. 5mol/L的EDTA500 y L抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80°C保存备用。取耳组织样，在 70%乙醇保存，冰盒低温带回实验室，-80°C保存备用。
[0041] 2、基因组DNA的提取
[0042] (1)将冷冻血样室温解冻，转移500iiL至1. 5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓 冲液，充分混勻，12000r/min离心10min(4°C )，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、 沉淀呈淡黄色。
[0043] (2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500iiL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管 壁，37°C水浴lh。DNA抽提缓冲液的配制：0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超纯水500mL，灭菌、调pH至8. 0,4°C保存备用。
[0044] (3)加蛋白酶K 3iiL(20mg/mL)并混匀，55°C过夜至澄清，尚未澄清者，可补加 1 U L蛋白酶K混匀继续消化至澄清。
[0045] (4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500iiL，温和摇动离心管20min，使其充 分混匀，4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另一 1. 5mL离心管中，重复一次。
[0046] (5)加氯仿500iiL，充分混匀20min，4°C，12000r/min离心lOmin，将上清液转入另 一 1. 5mL离心管中。
[0047] (6)加0. 1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管 直至白色的絮状沉淀析出，_20°C保存30?60min。
[0048] (7) 4°C，12000r/min离心lOmin，弃上清，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
[0049] (8)4°C，12000r/min离心lOmin，弃上清，室温下使乙醇挥发干净。
[0050] (9)干燥后的DNA溶于80?100 y L的TE-缓冲液或超纯水，4°C保存直至DNA完 全溶解，0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80°C保存。
[0051] 耳组织DNA的提取参考文献Sambrocketal(2002)方法。
[0052] 3、扩增引物设计
[0053] 由于GenBank中没有山羊LMCD1基因序列，所以，本发明以牛（GenBank : NC_007320. 4)序列为参考，利用Primer 5. 0设计能够扩增包含山羊LMCD1基因第5内含子 和第5外显子的PCR引物。
[0054] 扩增第5内含子的引物为：
[0055] 上游引物：5 ' CCTTCAGGAGCGITTGGACT 3 '
[0056] 下游引物：5 ' GCACAACTGGGCITTGGAIT 3 '
[0057] 扩增第5外显子的引物为：
[0058] 上游引物：5 ' GGTCCTCACCTCATCACAGC 3 '
[0059] 下游引物：5 ' ACTTCAGTCCTCACAACTCCCT 3 '
[0060] 以上述引物对扩增了山羊LMCD1基因第5内含子，第5外显子部分区域及一部分 内含子区域。
[0061] 4、PCR 扩增
[0062] 分别以4个山羊品种的DNA为模版，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反 应体系为15 U L，见表1 ;PCR总反应程序，见表2。
[0063] 表1本发明的PCR反应体系
[0064]
【权利要求】
1. 山羊LMCD1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1或引物对P2为引物，PCR扩增山羊 LMCD1基因中对应包含第681位的部分序列或包含2825位的部分序列； 所述的引物对P1为： 上游引物 Pla: 5' CCTTCAGGAGCGITTGGACT 3' 下游引物 Plb: 5 ' GCACAACTGGGCITTGGAIT 3 ' 所述的引物对P2为： 上游引物 P2a: 5 ' GGTCCTCACCTCATCACAGC 3 ' 下游引物 P2b: 5 ' ACTTCAGTCCTCACAACTCCCT 3 ' (2) 对PCR扩增产物进行SSCP检测：PCR扩增产物经变性剂变性处理后进行聚丙烯酰 胺凝胶电泳，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定多态性位点的基因型，所述多态性位 点为： 在山羊的LMCD1基因第681位为A或G的碱基多态性位点，表现为AA以及AG两种基 因型； 在山羊的LMCD1基因第2825位为C或T的碱基多态性位点，表现为CC以及CT两种基 因型。
2. 如权利要求1所述山羊LMCD1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增的反应程序为：94 °C预变性5min ;94 °C变性30s，58 °C退火40s，72 °C延伸 40-60s，35个循环；最后72°C延伸lOmin。
3. 如权利要求1所述山羊LMCD1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10%的聚丙烯酰胺凝胶。
4. 山羊LMCD1基因单核苷酸多态性位点的试剂盒，其特征在于：包括引物对P1或引物 对P2,所述的引物对P1为： 上游引物 Pla: 5' CCTTCAGGAGCGITTGGACT 3' 下游引物 Plb: 5 ' GCACAACTGGGCITTGGAIT 3 ' 所述的引物对P2为： 上游引物 P2a: 5 ' GGTCCTCACCTCATCACAGC 3 ' 下游引物 P2b: 5 ' ACTTCAGTCCTCACAACTCCCT 3 '。
【文档编号】C12Q1/68GK104450934SQ201410812130
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】陈宏 , 房兴堂, 刘宣宣, 张春雷, 金晶, 王艳红 申请人:江苏师范大学