专利名称：外源基因总dna转化后的分子检测方法
技术领域：
本发明涉及一种外源基因总DNA转化后的分子检测方法花粉管导入外源基因总DNA培育作物新品种，这种方法在小麦、玉米、水稻、棉花等重要农作物的分子育种工作中，得到了广泛的应用，但是转基因植物中外源基因的检测都一直没有得到解决。
外源单基因导入的检测，已经有成熟的方法，而外源基因总DNA导入后的检测，由于无法确定是那种外源DNA已经导入，同时在导入中使用是植物细胞核总DNA分子量大，涉及的基因组多，因而检测十分困难，目前应用的分子生物学方法如RFLP方法，RAPD方法等，都是一些间接的检测方法，需要大量资料的积累，众多的分子探针，同时时间长，劳动强度大。
本发明目的在于，提供一种直接的外源基因总DNA转化的分子检测方法，该方法以外源基因总DNA为探针，对供体(外源DNA提供者)，受体(转化对象)和转化体(转化外源基因后所获得的植株)进行分子杂交，通过杂交后的放射性自显影图片进行观测和比较，即可得出外源基因是否导入的结论，该方法运用于远缘或近缘植物总DNA外源DNA供体导入受体植物后获得具有变异性的转化体，转化体中外源基因的检测。
本发明涉及一种外源基因总DNA转化后的分子检测方法，该方法首先是供体、受体及转化体植物总DNA的提取，然后制备DNA探针再进行杂交膜的制备，最后进行杂交；供体、受体及转化体植物总DNA的提取，首先是将被提取的植物材料经液氮研磨，SDS-Tris HCl缓冲液抽提，用酚氯仿萃取，再用RNase酶处理，乙醇沉淀获得总DNA；制备总DNA探针将所获得的供体总DNA经限制性内切酶酶切超声波处理，获得一定长度的DNA分子，长度范围0.1-10kb之间，然后将处理后的DNA通过缺口标记标上同位素，再经分离纯化获得带有放射性标记的DNA分子即为总DNA探针；杂交膜的制备将所获得的总DNA经限制性内切酶，琼酯糖凝胶电泳、印渍转移至硝酸纤维素薄膜；杂交，首先对所获得的转印的硝酸纤维素薄膜进行予杂交，然后用受体总DNA对予杂交的硝酸纤维素薄膜进行掩盖DNA的用量为探针的0.5-100倍，最后用探针对掩盖后的硝酸纤维素薄膜进行杂交，再将杂交后的放射显影一冲印获得杂交图片。
实施例首先提取总DNA，将小麦、大赖草对花培小麦761经液氯研磨，SDS、Tris HCl缓冲液抽提，用酚氯仿萃取，再用RNase酶处理即得总DNA，然后将总DNA经限制性内切酶酶切超声波处理，获得长度0.1-10kbDNA分子，然后将处理后的DNA通过缺口标记标上同位素，再经分离纯化获得带有放射性标记的DNA分子探针；再将所获得的总DNA经限制性内切酶，琼酯糖凝胶电泳、印渍转移至硝酸纤维素薄膜进行杂交；用受体总DNA对予杂交的硝酸纤维素薄膜进行掩盖，其用量为探针的0.5-100倍，最后用探针对掩盖后的硝酸纤维素薄膜进行杂交检测。
权利要求
1．一种外源基因总DNA转化后的分子检测方法。其特征在于。该方法首先是供外、受体及转化体植物总DNA的提取。然后制备DNA探针，再进行杂交膜的制备，最后进行杂交。
2.根据权利要求1所述的外源基因总DNA转化后的分子检测方法。其特征在于。供体、受体及转化体植物总DNA的提取。首先是将被提取的植物材料经液氮研磨，SDS-Tris HCl缓冲液抽提，用酚氯仿萃取，再用RNasp酶处理，乙醇沉淀获得总DNA 。
3.根据权利要求1所述的外源基因总DNA转化后的分子检测方法，其特征在于，制备总DNA探针将所获得的供体总DNA经限制性内切酶酶切超声波处理，获得一定长度的DNA分子。长度范围0.1-10kb之间，然后将处理后的DNA通过缺口标记标上同位素，再经分离纯化获得带有放射性标记的DNA分子即为总DNA探针。
4.根据权利要求1所述的外源基因总DNA转化后的分子检测方法，其特征在于，杂交膜的制备将所获得的总DNA经限制性内切酶，琼酯糖凝胶电泳、印渍转移至硝酸纤维素薄膜。
5.根据权利要求1所述的外源基因总DNA转化后的分子检测方法，其特征在于，杂交，首先对所获得的转印的硝酸纤维素薄膜进行予杂交，然后用受体总DNA对予杂交的硝酸纤维素薄膜进行掩盖，其用量为探针的0.5-100倍，最后用探针对掩盖后的硝酸纤维素薄膜进行杂交，再将杂交后的放射于显影一冲印获得杂交图片。
全文摘要
本发明涉及一种外源基因DNA转化后的分子检测方法,该方法以外源基因总DNA为探针,对供体、受体、转化体进行分子杂交,转印后的硝酸纤维素膜经预杂交受体总DNA掩盖,然后通过杂交后的放射性自显影图片进行检测比较,即可得出外源基因是否导入的检测结果。
文档编号C12Q1/68GK1219591SQ97118788
公开日1999年6月16日 申请日期1997年12月10日 优先权日1997年12月10日
发明者赵民安, 刘敏, 李维琪 申请人:中国科学院新疆化学研究所