D-阿洛酬糖为首的稀少糖的接近砂糖味道的甜味料组合物。另 夕F，本发明由于是不仅物性方面而且性价比优异的制造方法，因此，可W提供能够廉价且安 全地利用于医药品或准医药品、口腔用组合物、化妆品W及食品、食品添加物中的甜味剂。 进一步，本发明品由于是比异构化糖或砂糖本身味道和功能性更优异的甜味剂，因此，能够 具有对于饮食物品作为抗肥胖剂、摄食抑制剂、膜岛素抵抗性改善剂或者低热量甜味剂的 特质。
【附图说明】
[0050] 图1是表示将砂糖作为原料的含有稀少糖的甜味料的制造流程。
[0051] 图2是表示使人摄取本发明的各甜味料组合物时的血糖值曲线下面积。
[0052]图3是表示使人摄取本发明的各甜味料组合物时的膜岛素浓度曲线下面积。
[0053] 符号的说明
[0054] 1砂糖溶解罐 阳05引 2水解罐和中和罐
[0056] 3转化酶固定化柱
[0057] 4异构化罐
[0058] 5差向异构酶固定化罐
[0059] 6精制装置
[0060] 7分离装置
【具体实施方式】
[00W] 本发明由将砂糖作为原料，成为W特定的组成比例含有砂糖、D-葡萄糖、D-果糖、 稀少糖值-阿洛酬糖等）等的甜味料组合物及其制造方法W及其用途构成。
[0062] 通过成为原料的砂糖的水解反应的程度，能够调节最终得到的甜味料者中的砂糖 的含量，进一步，通过第二工序的异构化反应的程度，可W调节最终得到的甜味料组合物中 的稀少糖的含量，但为了得到本发明的味道上的效果，最终甜味料组合物中的砂糖优选为 3~80%，优选含有D-阿洛酬糖3%W上下只要没有特别说明，％表示糖组合物（固 形物）中的质量％ )，即使比较调制成不含砂糖的甜味组合物，通过将砂糖作为原料也比将 异构化糖作为原料时成为杂味更少的甜味料组合物。
[0063] 本发明的甜味料组合物中的D-阿洛酬糖含量为3% W上时，可W得到味道上的效 果，作为砂糖分解后进行的异构化的方法，在选择后述的碱异构化时，除了 D-阿洛酬糖W 外的D-阿洛糖、D-塔格糖、D-阿卓糖等稀少糖W外，生成D-甘露糖、D-山梨糖a-山梨糖 等。如果碱异构化反应过度进行，则着色显著进行，难W进行之后的精制，因此，作为该精制 工序中不花费成本的异构化反应的程度，D-阿洛酬糖和D-阿洛糖的组成相对于最终甜味 料组合物中除去砂糖时的糖质量分别优选为0. 5~17. 0% (优选为1~15% )和0. 2~ 10. 0% (优选为0. 4~8% )，通过设定为该组成，可W得到兼顾本发明的味道上的效果和 降低精制工序的成本的甜味料组合物。另外，除去砂糖，与其它生成稀少糖一并在最终甜味 料组合物中所含的D-阿洛酬糖和D-阿洛糖分别为2. 3% W上和1. 3% W上时，本发明的甜 味料组合物显示能够用作抗肥胖剂、摄食抑制剂、W及膜岛素抵抗性改善剂的特性，此外， 稀少糖含量越多，则热量越低，因此，也可W用作低热量甜味剂。 W64][原料砂糖]
[0065] 本发明中的作为原料的砂糖只要含有D-葡萄糖（葡萄糖）和D-果糖（果糖） 结合而成的糖即可，没有限定为来自甘薦或甜菜等原料来源，对于离屯、糖（centri化gal sugar)或非离屯、糖（non-centrifugal sugar)等制法的差异或白砂糖（white granulated sugar)、粗晶中绵白糖（coarse ciystal medium soft sugar)、细砂糖（granulated sugar)、上等白糖、金黄幼砂糖（soft brown sugar)、转化糖、方糖、冰糖、黑糖、红糖、W 及和=盆糖等产品分类也没有限定，另外，砂糖的精制过程中的任何糖液都可W，是指包 含砂糖的全部糖。进一步，在本发明中，作为成为原料的砂糖，也可W利用包含砂糖的= 糖W上的寡糖（低聚果糖、禪合糖、低聚乳果糖化actosucrose)、6-0-a -D-化喃葡萄糖 基-a -D- [I比喃葡萄糖基 P -D-巧喃果糖巧（Theanderose，6-0- a -D-Glucopyranos}d-曰-D-glucopyranosylP -D-fructofuranoside))。
[0066] 关于将上述列举的原料的用于制造砂糖时的浓度，如果考虑到事后的浓缩工序的 简化，则原料糖液浓度越高越优选，但由于原料砂糖液的浓度越低则越能够提高稀少糖的 收率，因此，如果同时考虑生产效率，则原料砂糖液的浓度可W为3~80%，优选为10~ 60 %，进一步优选为20~40 %。
[0067] 另一方面，从防止固定化酶的载体树脂和精制中使用的树脂的悬浮的观点出发， 更加优选为3~40 %左右。 W側另外，通过调节糖浓度也可W得到生成组成物比不同的混合糖，例如，相对于糖浓 度为100%的原料、即粉体，喷雾酸或碱也能够生产。
[0069][原料砂糖的水解]
[0070] 原料砂糖的水解工序通过使用了酸和/或酶的分解来进行。为了将原料糖水解， 可W使用酸（酸性溶液）。使用了酸的分解可W将无机酸、横酸或簇酸用作酸性溶液来进 行。更详细地说，在本发明中，作为酸性溶液，可W适当使用无机酸类（盐酸、硫酸、硝酸、氨 漠酸、次氯酸、高氯酸、憐酸、棚酸、氣横酸等）、横酸类、簇酸类（乙酸、巧樣酸、甲酸、葡萄糖 酸、乳酸、草酸、酒石酸等）等，但从安全性和费用的方面出发，优选为盐酸。最适宜的酸的 浓度受反应时间和溫度影响，通常优选在原料砂糖溶液中含有0. 01~5moVI左右。另外， 酸分解的反应溫度优选为20°C W上，进一步优选为30°C~100°C。
[0071] 作为将砂糖水解的方法，不通过上述酸的分解，也可W使用酶进行分解。使用了酶 的分解可W使用转化酶（invertase)来进行。更详细地说，作为酶，可W列举薦糖酶、转化 酶（IUPAC-IUB系统名称为P-D-巧喃果糖巧酶巧.C. 3. 2. 1. 26))，菌株来源没有特别地限 定。
[0072] 关于酶浓度，根据底物浓度和反应时间而不同，通常优选W相对于底物为 0. 00075~0.003% (w/w)来使用lOOunit/mg的酶，也可W根据酶的反应条件或酶的固定 化条件来适当变更。另外，酶的反应溫度优选为20°CW上，进一步优选为30°C~100°C。最 佳在60°C附近。
[0073]转化酶的固定化通过将市售转化酶溶解于缓冲液（pH7)，对于柱填充树脂在4°C 下使之通液，从而得到使转化酶蛋白质结合于离子交换树脂的固定化转化酶。
[0074] 如上所述，原料砂糖的水解可W通过使用了酸或转化酶的分解的任一种来进行， 通常可W根据所要得到的生成物的组成分别使用，可W仅使用任一种，也可W并用。 阳0巧][砂糖水解物的异构化]
[0076]将砂糖水解物异构化的工序通过碱异构化、使用了巧离子的催化作用的异构化和 /或酶异构化来进行。
[0077] 首先，对酶异构化进行说明。 W78] 将作为原料的砂糖水解之后，为了自果糖生成D-阿洛酬糖，可W选择塔格 糖-3-差向异构酶或阿洛酬糖-3-差向异构酶运样的异构化（差向异构化）酶的方法。作 为运些异构化酶的塔格糖-3-差向异构酶或阿洛酬糖-3-差向异构酶的获取源的微生物的 菌株来源没有特别地限定，但为也可W用于食品中的安全的菌种。
[0079] 从承认制造食品时使用的现有添加物名单清单列表中收录的菌种并且几乎没有 毒性的菌种中，优选为产生W高收率对由D-果糖异构化为D-阿洛酬糖进行催化的新型的 酬糖3-差向异构酶的节杆菌(Arthrobacter)属的菌种（专利文献5)，进一步优选为节杆 菌属球形种，尤其优选为球形节杆菌M30(保藏号为NITEBP-1111)。关于酶浓度，根据底物 浓度和反应时间而适宜的范围不同，在酶的固定化时，优选具有1000U/湿重树脂（g)左右 的活性。
[0080] 作为进行酶异构化的反应溫度，优选为20°CW上，进一步优选为30°c~80°C。实 用上优选为45°C附近。
[0081] 对于上述的球形节杆菌进行说明。本发明中能够使用的酬糖-3-差向异构酶 可W通过培养属于节杆菌(Arthrobacter)属并且具有酬糖-3-差向异构酶生产能力 的微生物，从培养液中繁殖的菌体中采取酬糖-3-差向异构酶来进行调制。作为属于 节杆菌(Arthrobacter)属的微生物，可W有利地利用例如球形节杆菌(Art虹obacter globiformis)M30(保藏号为NITEBP-1111)株W及运些的突变株等。M30株的酬糖-3-差 向异构酶的生产能力比较高，在得到本发明的酶上优选。M30株在日本独立行政法人制品评 价技术基础机构专利生物保藏中屯、（日本千叶县木更津市东上总镶足2-5-8)由2011年6 月22日原保藏的NITEP-1111基于布达佩斯条约在2012年5月2日请求保藏的移管，保 藏号为NITEBP-1111进行了国际保藏。
[0082]目P，本发明中能够使用的优选的酬糖-3-差向异构酶可W由属于节杆菌属的微生 物得到，并且是具有下述（A)、度）的底物特异性的酬糖-3-差向异构酶。 W83] (A)将D-酬糖或k酬糖的3位差向异构体化，生成对应的D-酬糖或k酬糖；
[0084] 度）在D-酬糖或k酬糖中相对于D-果糖和D-阿洛酬糖的底物特异性最高。 W85] 来自球形节杆菌M30 (保藏号NITE BP-1111)的酬糖-3-差向异构酶通过 SDS-PAGE的亚基的分子量约32kDa，通过凝胶过滤法的分子量为120kDa，并且为亚基的分 子量为32kDa的同源四聚体结构，具有下述的理化学性质（a)~（e)并且具有下述的底物 特异性1.~8.(参照专利文献5)。
[0086] (a)最佳抑
[0087] 在30°C下、反应30分钟、20mM的儀（Mg2+)存在下的条件下为6~11。
[0088] (b)最佳溫度
[0089] 在抑7. 5、反应30分钟、20mM的儀（Mg2+)存在的条件下为60~80°C。
[0090] (C)抑稳定性
[0091] 在4°C、保持24小时的条件下至少在抑5~11的范围内稳定。 阳〇9引 （d)热稳定性 阳09引在抑7. 5、保持1小时、4mM的儀离子（Mg2+)存在的条件下在约50°C W下稳定；在 儀离子（Mg2+)不存在的条件下在约40°C W下稳定；
[0094] (e)通过金属离子的活化
[0095] 通过二价儘离子（Mn2+)、二价钻离子（C〇2+)、巧（Ca2+)和儀离子（Mg2+)进行活化。
[0096] 1.将D-果糖作为底物时的相对活性为43. 8%;
[0097] 2.将D-阿洛酬糖作为底物时的活性为100% ;
[0098] 3.将D-山梨糖作为底物时的相对活性为1. 13% ;
[0099] 4.将D-塔格糖作为底物时的相对活性为18. 3% ;
[0100] 5.将k果糖作为底物时的相对活性为0. 97% ; 阳101] 6.将k阿洛酬糖作为底物时的相对活性为21. 2% ; 阳102] 7.将k山梨糖作为底物时的相对活性为16. 6%; 阳103] 8.将k塔格糖作为底物时的相对活性为44. 0%，
[0104] 其中，将D-阿洛酬糖的差向异构化活性作为100将相对于各酬糖的活性表示为相 对活性。 阳1〇5][异构化酶的固定化] 阳106] 另外，最实用的是将异构化酶固定化于离子交换树脂等适当的基材来使用。整体 的制造工序是由混合和加热处理构成的简便的工序，可W使用分批式或连续式的任一方 式。在连续式的情况下，W-连串的工序进行原料砂糖的水解工序和将砂糖水解物异构化 的工序，进一步，将由球形节杆菌M30(保藏号NITE BP-1111)得到的酶固定化来进行。运 样，W-连串的