专利名称：治疗化合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物载体及其应用。确切的说，涉及一种多肽(双肽)作为药物载体以化合的形式与药物相结合的新的应用，尤其是应用于水溶性较差的药物。
医药工业的进展无疑为人类及其他动物的保健带来了革命，然而在药学领域的显著发展中仍存在一些关键性的限制。例如，以药物治疗多种疾病时，如何把特定的药物传递释放到体内，尤其是对那些水溶性差的药物的传递，目前仍受到限制，某些药物在体外使用中，显示出很大的前景，可是却因其溶解性的不足，导致药物体内传递受到限制。比如用紫杉醇治疗肿瘤，特别是用于前列腺癌，既是一明显例子。
如下所述，为解决这一难题，曾有不少工艺上的尝试。但就目前来讲，尚无本发明所述药物与多肽结合的方法。
美国专利说明书US-4675381，题为“生物分解性多肽及其在药物逐渐释放中的应用”，其中以多肽天门冬酰胺和/或多肽谷氨酰胺聚合物为聚合结合。而且，这一专利主要是指导直接采用天门冬氨酸和谷氨酸的单肽聚合体，而非两种氨基酸的组合。
美国专利说明书US-5087616，题为“细胞毒性药物的结合及其在肿瘤细胞中的传递”，公开了一种用于生物分解的聚合载体，与一或多个有细胞的分子(如，红比霉素Daunomycin)结合的方法，这种聚合载体是特指单肽聚合体，如聚谷氨酸。绝未用两种氨基酸化合结合之载体。
1983年，拜伯(Piper)等人在《医学化学杂志》(J.Med.Chem)上发表题为“氨甲蝶呤(Methotrexate)与聚γ-谷氨酸(Poly(γ-glutamyl))结合的合成方法，该文提出用氨甲蝶呤(Methotrexate)与2或3个单位的氨酸相结合。该文没有提出或建议用谷氨酸/天门冬氨酸二肽之聚合体，或谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰酸、谷氨酰酸或甘氨酸之组合。
1982年，《国际癌症杂志》(INL,J,Cancer)刊载了祖尼罗(Zunino)等人题为“有关多-L-天门冬氨酸结合红比霉素(Daunorubicin)的抗肿瘤活性”一文，提出用红比霉素(Daunorubicin)与聚天门冬氨酸的单聚体结合。该文指出“将红比霉素(Daunorubicin)结合到多肽聚合体可明显减低药物毒性，然而同时也对药效略有降低。”“该红比霉素(Daunorubicin)-多-L天冬氨酸的接合体显示当红比霉素(Doxorubicin)在白血病模型中的抗肿瘤活性高于其在固体肿瘤模式中的活性。”不过，这篇文章虽阐述抗肿瘤药物与单聚天门冬氨酸的化合结合，却并未提出或建议任何多肽(双肽)多聚体，天门冬氨酸与谷氨酸，谷氨酸与丙氨酸、天门冬氨酰胺、谷氨酰胺亦或甘氨酸之应用。
李(Li)等人在1998年《肿瘤研究杂志》(Cancer Research)发表题为“应用新型水溶性聚L-谷氨酸-紫杉醇结合体可使已形成的肿瘤病状完全消退”。该文还公开了用水溶性聚-L谷氨酸-结合体可产生消减毒性的治疗效应。但是，这篇文章也没能提出采用多聚二肽的学说。
1989年《药理实验理论杂志》(J.Pharm.exp.ther)刊载汉姆沙米(Ramsammy)等人题为“聚天门冬氨酸可防止庆大霉素(Gentamicin)在老鼠体内的肾毒性”一文，此文指出“以多肽，包括多聚天门冬氨酸，可提供对在老鼠体内由氨基糖甙诱发的神经毒性的预防作用”。可是，该文仍未能提出应用新设计的多聚体，更不用说以该多聚体与药物的接合的理论。
哈雅拾(Hayashi)与伊我沙克(Iwatsuke)在1990年发表于《生物大分子(聚合物)杂志》(Biopolyner)上的“L-天门冬氨酸/谷氨酸多聚体之体内生物分解性”一文中，提出了以L-天门冬氨酸和L-谷氨酸制备多聚体的主张。该文详述了用这类多肽确定多聚体成分的效果，其顺序分布对木瓜蛋白酶(Papain)刺激下多聚体在体外的分解速率的影响。这篇论文亦未阐述与本发明类似的共聚体，即谷氨酸/天门冬氨酸聚合物之应用，以及其与药物结合方面的论述。
美国专利说明书US-4960790公开了“紫杉醇与氨基酸(如谷氨酸)的化合结合”。然而，此项专利也不涉及并提议用大分子聚合物，更无用含有谷氨酸和天门冬氨酸，或谷氨酸结合丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺，或甘氨酸等创新多肽之说。
最后，卡色(Karlsor)等人1960年在《美国化学学会杂志》(J.AM.Chen.SOC)发表的题为“聚β苯甲基-L-天门冬氨酸盐的螺旋链”一文中，也曾讨论了一系列由γ苄基-L-谷氨酸盐和β-苯甲基-L-天冬氨酸盐衍生的共聚体的特性。不过，此文没能提出体内应用这样的共聚体，更没谈到他们与抗肿瘤药物的联合。
综上所述，可见对解决药物溶解性，如抗肿瘤药方面的工艺是长期以来的需求。针对解决该问题，工艺技术采取了各式各样的尝试与努力，其中包括多肽(单聚谷氨酸或聚天门冬氨酸)的应用。本发明所述的多肽联药物可增加药物在体内的溶解度。
发明的目的在于提供一种治疗结合物，包括一种药物载体，也即提供一种解决改善药物部分溶解度的方法。也即提供了一种治疗方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下一种治疗化合物，包括药物、多肽药物载体；多肽药物载体包括占50％-90％重量比例的谷氨酸，和10％-50％重量比例的第二种氨基酸；第二种氨基酸可以是天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的任何一种组合；药物部分与载体部分化合结合。
一种提高药物溶解性的方法，将药物与多肽药物载体化合，进而构成一治疗化合物；载体部分具有重量50％-90％的谷氨酸和重量10％-50％的第二种氨基酸；第二种氨基酸可以是天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的任何一种组合。
一种治疗的方法，其特征在于包括以下步骤给予一治疗化合物的治疗有效量，该治疗化合物包括至少一部分药物和至少一部分多肽药物载体；多肽药物载体包括重量50％-90％的谷氨酸和重量10％-50％的第二种氨基酸；第二种氨基酸可以是天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的任何一种组合；药物部分与载体部分化合结合。
图1A为多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)合成示意图；图1B为多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)样本的氨基酸分解示意表；图2A为紫杉醇与多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)合成示意图；图2B为多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)的核磁共振(NMR)图谱。
图2C为未结合的紫杉醇的核磁共振(NMR)图谱；图2D为紫杉醇与多肽的结合物的核磁共振(NMR)图谱；图3A为未结合的紫杉醇的紫外扫描图谱；图3B为紫杉醇结合于多聚谷氨酸/天门冬氨酸的结合物的紫外扫描图谱；图4A为多肽结合紫杉醇(紫杉醇-多聚谷氨酸/天门冬氨酸)的紫外光扫描图谱；图4B为多肽(聚谷氨酸/天门冬氨酸)在未结合状态下的紫外扫描图谱；图5A为未经结合状态的紫杉醇紫外扫描标准曲线；图5B为紫杉醇与多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)结合物的紫外扫描图谱；图6为紫杉醇HPLC分析；图7为紫杉醇与多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)的结合物的HPLC样本分析；图8为未经结合的多肽(多聚谷氨酸/天门冬氨酸)的HPLC分析；图9A为多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)与紫杉醇的结合物与未经结合的紫杉醇混合液的HPLC分析谱；图9B为紫杉醇与多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)的结合物的HPLC三维色谱分析；图9C为未接合紫杉醇与紫杉醇多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)结合物混合剂的三维HPLC色谱；图9D为多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)与紫杉醇结合物的延续持久释放图；图9E为紫杉醇与多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)结合物生物有效期的计算式；图9F为紫杉醇及其结合体体外细胞测定图；图9G为结合体及紫杉醇对人类前列腺癌细胞(PC3)体外的细胞素毒性(IC-50)的测试图；图10为紫杉醇与多肽(谷氨酸/天门冬氨酸)结合物和未经结合的紫杉醇对鼠科卵巢肿瘤体内抗肿瘤的试验结果图；图11为紫杉醇与聚谷氨酸结合物，以及用未结合紫杉醇在体内对鼠科卵巢肿瘤体内抗肿瘤试验结果12为紫杉醇与聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)结合物和未结合紫杉醇在带有人类乳癌的裸鼠的体内抗肿瘤试验结果图；图13A为聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)与紫杉醇的结合物与未结合紫杉醇在带有人类前列腺癌裸鼠体内抗肿瘤试验结果图；图13B为用单聚谷氨酸结合紫杉醇与未结合紫杉醇在带有人类前列腺癌裸鼠的体内抗肿瘤试验结果图；图14为聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)与紫杉醇结合物，多聚谷氨酸单聚体—紫杉醇结合物，多聚天门冬氨酸单聚体—紫杉醇结合体及未经结合紫杉醇用于带有人类前列腺癌裸鼠的体内抗肿瘤试验结果图；图15A为结合聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇结合物，未经结合紫杉醇作用于带有人类乳腺癌的无胸腺裸鼠15天之后的体内抗肿瘤结果的比较图；图15B为聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)—紫杉醇结合体与未经结合紫杉醇治疗带有人类乳腺癌裸鼠后43天的体内抗肿瘤结果的比较图；图16为聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)—紫杉醇结合体与未结合的紫杉醇用于患前列腺癌的无胸腺裸鼠15天之后的体内抗肿瘤结果比较图；图17A为紫杉醇—聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)结合物，未结合紫杉醇及紫杉醇—多谷氨酸单聚体对带有人类前列腺癌裸鼠抗肿瘤结果之比较图(老鼠为治疗后48小时状态)；图17B为图17A所述的接受治疗7天后的老鼠的比较图；图17C为图17A所述的接受治疗22天后的老鼠的比较图。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明通过由聚二肽(如谷氨酸+天门冬氨酸为单体)为药物传导载体结合抗肿瘤药紫杉醇形成的结合体，与未联载体的药物或联合已知现存工艺的单聚体的聚谷氨酸和聚天门冬氨酸相比较，显示出较优越的体内生物活性及治疗性质。图2A至图17C表明，紫杉醇加本发明所述的载体模式的多聚体在治疗前列腺癌上，产生意想不到的疗效。本发明是第一例有关紫杉醇抗前列腺癌体内效用的描述。
选用紫杉醇为此方法的样本药物有如下原因一，本药物为已知抗肿瘤药物；二，具有体内溶解性的问题，亦即该药物在体内使用时有毒性，难溶解的效率问题；三，此药也曾被多次用于尝试与其他载体联合，以改进其生物用途的例证。用紫杉醇让新发明可充分展示其必要性和应用价值。
紫杉醇是作用于抗微管蛋白(Antitumin)的抗肿瘤剂。而对肿瘤治疗的改进在很大程度取决于开发对肿瘤更有特异性的医药工业和新药技术。由于一血管增生过程参与并影响肿瘤血管的密度，故抗管状蛋白剂为各类肿瘤的治疗打开新的局面并在该方面开展了大量的早期临床开发及评估。
管蛋白(Tubulin)是显微管(Microtubular)亚基的主体蛋白。显微管在细胞有某种功能时组合包装，不需时则分解成小单位，所以管蛋白是抗有丝分裂剂的细胞目标。有些这类的药物如长春花新碱(Vincristine)、长春花碱(Vinblastine)、(Rhizoxin)、(Maytansin)和表鬼臼霉素(Epipodophyllotoxin)等是在秋水仙素(Colchicine)结合点(Bindihsite)与管蛋白相互作用，为抑制管蛋白的聚合，进而造成细胞分裂中期休止。另一方面紫杉醇是起促进微管组装作用，进而形成高度稳固但无功能的管蛋白以达到阻止分裂的细胞进入有丝分裂之目的。《美国科学院通报》(PNAS)1980年的第77期第1561至1565页、《自然杂志》(伦敦版NATARE)1980年第283期第665至667页、《国家癌症研究所杂志》(J.Nati.Cancer.INST，)1990年的第82期第1247至1259页、《生物化学》(Biochimie)1998年80期第207至222页《癌症》(Cancer)1997第79期(5)第1049至1054页均有记载。
在实际应用中，紫杉醇油针被应用于治疗乳癌、卵巢癌、直肠癌及肺癌等。《癌症研究》(Cancer RES)1998年第58期第2404至2409页、《临床肿瘤学》(Clinic,Oncolo)第13期(10)第2643至2655页中均有记载。
诚然紫杉醇有一定疗效，但也表现出如粒性细胞减少和体重减轻的副作用。
《新英格兰医学杂志》(NEW ENG,J,MEL,)1995年第332期第1004至1014页中指出，在技术上，静脉注射水溶性差的紫杉醇油针剂之困难也是众所周知的。
不但如此，更重要的是在技术上，紫杉醇虽对乳癌，卵巢癌有疗效，但对治疗前列腺癌并不见效。
综上所述，选择多聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)结合紫杉醇，可以直接观察与测定新结合体(新产品)所制药物载体是否有助改良治疗的效用。也只有将紫杉醇与新发明的载体结合的结合物，才有抗前列腺癌体内效果的表达。
—种治疗化合物，包括药物、多肽药物载体；多肽药物载体包括占50％-90％重量比例的谷氨酸，和10％-50％重量比例的第二种氨基酸；第二种氨基酸可以是天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的任何一种组合；药物部分与载体部分化合结合。
一种提高药物溶解性的方法，将药物与多肽药物载体化合，进而构成一治疗化合物；载体部分具有重量50％-90％的谷氨酸和重量10％-50％的第二种氨基酸；第二种氨基酸可以是天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的任何一种组合。
一种治疗的方法，其特征在于包括以下步骤给予一治疗化合物的治疗有效量，该治疗化合物包括至少一部分药物和至少一部分多肽药物载体；多肽药物载体包括重量50％-90％的谷氨酸和重量10％-50％的第二种氨基酸；第二种氨基酸可以是天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的任何一种组合；药物部分与载体部分化合结合。
举一具体实例，第二种氨基酸为天门冬氨酸，药物部分则选自一组抗肿瘤药，心血管药，抗菌素，糖尿病，消炎药及止痛药。
药物部分采用一组由紫杉醇、表鬼臼毒素、长春花新碱、泰索帝、道诺霉素、阿霉素、米托蒽醌、羟喜树碱、博莱霉素、Gemcitabine,FluDarabine和5-FUDR。
最完美的例子是用紫杉醇为药物部分。
在另一组中，多肽药物载体是由重量比例为50-90％的谷氨酸，10％-50％的天门冬氨酸或丙氨酸、天门冬酰酸、谷氨酰胺、甘氨酸，亦或以上的不同组合。更完善的例子是由重量为60％-80％的谷氨酸、20％-40％的天门冬氨酸或丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰或甘氨酸，或上述的各种组合。最完美的一例为70％-75％的谷氨酸、25％-30％的天门冬氨酸或丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰或甘氨酸，或上述的各种组合。
另一组合中，治疗结合物是由至少两种药物部分组成。且成分比例未必相同。
另一例中，治疗结合物包括多种药物部分。
还有一例中，药物部分占大约10％-60％的重量比例。另一较好的例子是药物为20％-50％的重量比例，最好的是药物部分占治疗结合物重量的20％-40％。而且，还可用多肽药物载体部分占重量的40％-90％，或更好约50％-80％，最佳为重量为60％-80％于治疗结合物。
最佳方案是紫杉醇为聚二肽谷氨酸/天门冬氨酸载体药品部分占治疗结合物重量不超过60％(以免对溶解度及粘稠度产生负面影响到结合物的注射性能)。
另一较好的实例，药物部分是紫杉醇，载体部分则由70％谷氨酸、30％天门冬氨酸组成。紫杉醇药物部分占治疗结合物的重量之20％-40％。而治疗结合体的分子量20000到50000道尔。
在更进一步达到预计目标的前提下，我们还考虑提供为改进药物部分的溶解性，包括化合结合至少一部分药物与至少一个多肽药物载体部分之程序。这样一来，可造成一个至少一半药物、一半载体的结合体，其药物部分与载体部分化合结合，多肽药物载体部分由谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺酸、谷氨酰胺或甘氨酸或类似组合。
另一优先方案，治疗结合物的水溶性高于药物部分的水溶性。
还有一例中，药物部分是抗肿瘤药，而以紫杉醇为优。
在某一实例中，多肽药物载体部分占重量50％-90％谷氨酸，更佳为70％-75％谷氨酸，10％-50％天门冬氨酸或丙氨酸、天门冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或类似上述组合。更有倾向性的方案是后者占重量的20％-40％，最优选择为后者占重量的25％-30％。
有关丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺或甘氨酸在本发明的作用也注意到以下情况。我们认为，在使用时较优先方法是用聚二肽体的聚谷氨酸/天门冬氨酸。
在无任何局限性的意义上，我们还认为，任何类似于天门冬氨酸的氨基酸，如丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺及甘氨酸均可替代天门冬氨酸在本发明结合体的作用。尽管我们不想受到约束，我们仍认为在使用时，本品的关键是与由谷氨酸组成的骨架，只要有谷氨酸存在于多聚二肽中，天门冬氨酸即可成为另一氨基酸，也可选用与其相类似的氨基酸，如丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸等。这些氨基酸均可全部或部分代替天门冬氨酸，并可以混合使用。在复合氨基酸作为本品的多聚体时，每一单体要以有谷氨酸为前提，不然则含有天门冬氨酸或丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸及其不同组合。
在达到既定目的的同时，本项发明还提供了另一方面的应用。是关于处理在如何使用治疗有效量的治疗结合物，该结合物至少会有一种药物部分，一种多肽药载体部分，且药物部分与载体部分化合联接，多肽药物载体由谷氨酸和第二种氨基酸，包括天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸，或者是各种不同组合的天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸。
另一具体情况，是药物部分选自一组抗肿瘤药，例如，紫杉醇、表鬼臼毒素、长春花新碱、泰素帝、道诺霉素、阿霉素、米托蒽醌、羟喜树碱、博来霉素、Gemcitabim、FluDarubine和5-FUDR。
另一种情况，多肽药物载体部分与相当于重量的50％-90％的谷氨酸组成，更适者为60％-80％，最佳为70％-75％谷氨酸与10％-50％的天门冬氨酸或丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺或、氨酸，亦或以上的不同组合。一般后者以20％-40％为宜，以重量的25％-30％为最佳。
另一合适条件是将紫杉醇用于前列腺癌的治疗。
综上所述，本项发明是关于一特殊的聚二肽(由谷氨酸和天门冬氨酸组成)对药物传导，特别是溶解度差的药物，是一种出于意料之外的药物载体的发现。范例包括抗肿瘤药剂等。更详细说明，则是关于合成并使用分子量26000-30000(谷氨酸/天门冬氨酸)多肽的发明。该多肽组合为含重量70％的谷氨酸，30％的天门冬氨酸。本发明亦提出药物与多肽载体需化合组合。与载体结合的药物可以是溶解度差的亦或是抗肿瘤药物。最典型为抗肿瘤药物紫杉醇的结合。结和药物结合率大致以紫杉醇为例，总重量的20％-40％为宜。
以下详述，本发明发现，用现发明的结合体聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)，或多聚(谷氨酸/丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸)与药物化合结合，可导致意想不到之好的体内特殊性质。这些特性优于现知工艺所用一药物与另一药物之结合，如其他多聚肽，包括单聚体的聚谷氨酸或聚天门冬氨酸；特别是在一具体应用中，本项发明用紫杉醇为药物部分与多肽载体结合，对前列腺癌的治疗产生体内疗效。
而如下所示，用过去已知工艺的多肽载体与紫杉醇结合。或直接用未结合的紫杉醇，对前列腺癌的治疗均无体内疗效。当用本项发明的特殊的多肽与紫杉醇结合，则观察到最早动物前列腺癌治疗表现出疗效的例子。
有一点很明显地是在此公开的发明工艺中可有不同的替代物和改动而不失其原有的范围与初衷。
治疗(Thernpeutic)一词用于此，例如“治疗化合物(TherapenticCompound)”及“治疗有效剂量(Therapentically EffectiveAmount)指至少有某些低限度的生理效应。例一种“治疗复化合物”至少在使用于活体上应表现出一定的最小的生理效应。在应用于活体的某试剂最起码要有低程度的生理效果，如其存在会造成受体动物生理上的变化。再如给予—“治疗“抗肿瘤化合物的生理效应可以为动物肿瘤的抑制，或是减小肿瘤，或是防止肿瘤复发。而给予“治疗有效剂量”则表示使用的剂量是有生理学意义的。某一试剂具生理学意义是指该试剂的存在会导致受体动物生理上发生变化。比如在治疗癌或瘤赘生(Neoplantic)时，如使用试剂可以抑制肿瘤的生长或减小肿瘤的尺寸或是防止肿瘤的复发均可被认为是治疗有效的(Therapentically Effective)。
“抗肿瘤药”一词意指任何对抗肿瘤，引起肿瘤的疾病或癌症具有治疗效果的治疗剂。
“药”一词可指动物使用后有治疗效果的任何因素。具前用语治疗上的使用量(给予量)是足够产生应用剂的治疗效果的剂量。
“状态(Condition)”一词是指在动物机体上的任何条件，疾病状况，异常，失调及类似的病症在使用—治疗有效量的治疗化合物后，可产生效应。状态并不限于，但可以包括癌，肿大，肿瘤等。前列腺状态包括前列腺肿瘤和前列腺癌。
“治疗(Treating)”一词用于如“治疗状态Treating ACondition”意指在使用治疗有效量的治疗化合物可最起码显示出治疗效果，该词并不一定指“治愈Curing”，而又指在某具有状态的受体经治疗后对该状态有最起码的生理效应。例如治疗可包括给予某因子，且该因子的存在引起该受体动物的生理变化。
“肽”，“聚肽(多肽)”，“二肽(双肽)”，“同聚体”，“聚(谷氨酸/天门冬氨酸)”及所有其他类似的词，还有“Invertipeptide新创肽，发明肽”系指本发明的肽，后面还会有详细定义。(该肽是由谷氨酸/天门冬氨酸，二肽聚合而成，或是由谷氨酸与丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺和甘氨酸以任何组合形成的多肽)。
本发明治疗化合物(包括化合物，药，复合物等等)可用于处方并用于治疗多种状态。他们可以任何现有的传统医药方式使用，即可用于单纯的治疗活性成分，也可与以结合的方式作为部分活性的组成部分。可单独使用，也可根据医药行业标准选择途径与医药载体结合使用。
剂量取决于治疗用途，包括要治疗的状况，治疗该状况应用的药物及接受治疗的动物(使用对象)的类型(包括考虑到年龄，体重，性别等等)。这类决定是现有的技术范围之内，决不包括新造出来的技术或实习及不适当的实验。
使用剂量应是活性成分的治疗有效量，当然这是根据已知的因素而定。如该活性成分的药物动力与性质，状况及使用途径。接受者的年龄，性别，健康，体重。症状的程度与性质，同时治疗的类型，治疗频率及预期达到的效果等等。一般来说，活性成分的每日剂量(治疗有效量)可在每公斤体重用1-400毫克。通常每日每公斤体重用1-200毫克，1-50毫克更宜，效果以每日分二至四次或用持续释放的形式更佳。
适于内用的剂量处方形式(Composition)为每单位含活性成分1.0-500毫克，这种组合中，有效成分通常是占该药形式的总重量的0.05-95％。
可以用任何对所治疗状况适合的方式。包括如口服。这也是包括在该领域的一般技术水准之内的。例如，口服可用固定形式一片，囊，粉；或液体形式如酏剂，糖浆，乳剂或是悬浊液。治疗化合物(剂或其他)也可以采用作肠道的其他途径如注射、输注、鼻咽、皮肤吸收。该剂还可用于肌肉，静脉注射或塞用。
胶囊含有治疗结合物与粉状载体(填充物)如乳糖，蔗糖淀粉，纤维衍生物，硬脂酸及其他类似物。类似的稀释可用在压缩片剂中。片剂与胶囊也可制成持久释放的产品以提供一段时间的不间断性用药。压缩片剂可用糖衣或胶衣以遮住不愉快的味道，并且可以保护片剂。或用肠溶衣在消化道内选择性分解。
用于口服液的剂型中可含色素或调味剂。是服用者更易接受。一般说来，水，适当的油，葡萄糖水溶液及有关的糖溶液和甘油均为非肠道液体的合适载体。用于非肠道的溶液可含有治疗水溶性盐结合物必要时添加适量的稳定剂，缓冲剂。类似于二硫化钠，硫化钠VC等抗氧化剂，不论是单独或混合均可添加适当的稳定剂。另外还可用柠檬酸及盐，EDTA钠盐。除此之外，非肠道溶液还可含有防腐剂之类，如Benzalkonium Chloride,Melhyl-Or Propyl-Prarben And Chlorobutanol。
适当的医药载体可见。Remnngtons Pharmacentical Science，以本领域的标准参考。
另外，标准医药工业方法可用来控制效果的持续，这些都是众所周知的，包括控制释放的制备。合适的大分子如多聚体、聚酯聚氨酸、聚乙稀比咯烷酮、乙醛比咯略乙酸、甲基纤维素、羧甲基纤维素(Carboxy Methyl Cellolse)、硫酸鱼精蛋白(PootamireSmifale)大分子的浓度及掺入方法可以调节来控制释放。此外，这些分子还可以并入到聚合物的颗粒之中。如聚酯，聚氨基酸，水凝胶，聚乳酸或乙基比咯酸的共聚体。除了并到大分子之外，这些分子也可以用语TRAP(捕获)微囊中的复合物。
本项发明的结合物之使用可利用医药剂量形式说明如下胶囊胶囊的制备是把100毫克活性成分的粉剂，175毫克乳糖，24毫克的消石粉和6毫克的硬酯酸钾填入标准的二片硬胶囊中。
软胶囊先将活性成分与豆油制成混合物，再用泵均匀打入凝胶中，形成含量为100毫克活性成分的软胶囊中，之后将胶囊洗净干燥。
片剂片剂以传统方式制备，剂量为100毫克有效成分。0.2毫克二氧化硅胶体，5毫克硬脂酸钾，275毫克微晶纤维，11毫克玉米淀粉及98.8毫克乳糖。也可加上适当的外层(Coating)来增加口感或延缓吸收。
注射剂适用于注射用非肠道用途的包装形式的制法，是把有效成分重量的1.5％与体积10％的丙烯甘油和水一起搅拌而成。溶液用氯化钠配成等渗并消毒。
悬浊液口服水剂悬浊液制成每5毫升含100毫克精细分配的活性成分，200毫克羧甲基纤维素钠盐，5毫克甲酸钠1.0克U.S.P葡萄糖酸液及0.025毫克的香草醛(Vanillin)。
有关治疗结合物在本发明的具体表现，是由至少一部分药物，一部分多聚体的药物载体，二者化合相连组成。而载体是包括谷氨酸和第二种选自下组的氨基酸天门冬氨酸，丙氨酸，天门冬酰胺，谷胺酰胺，甘氨酸及其不同组合。药物部分可选自抗肿瘤药，消炎药，心血管药，糖尿病药，促代谢药，止痛药及其它类适合于用本发明设计的载体为传导的药物。药物部分可选自以下类紫杉醇、表鬼臼毒素，长春花新碱，泰索帝，道诺霉素，阿霉素，米托蒽醌，羥喜树碱，博来霉素，Gemcitabine,FluDarabine和5-FUDR。我们首选的为紫杉醇。
治疗的状态包括(但并不局限于此)前列腺癌，乳癌，卵巢癌，直肠癌，白血病(血癌)，淋巴癌，肺癌及肝癌。
还有在另一具体情况中，多肽药物载体是由约重量的50％-90％谷氨酸，占重量是10％-50％的天门冬氨酸，或丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺或甘氨酸及其各种组合而构成的，较佳的构成为与重量约10％-60％的谷氨酸，20％-50％的天门冬氨酸，或者天门冬酰胺，谷氨酰胺，甘氨酸或其不同组合。最可取的条件是用重量约70％-75％的谷氨酸，25％-30％的后者。
另一具体情况，治疗结合物可以至少二部分药物，可以不同类型组成。也可以包括多种药物部分。
在另一情况，治疗结合物的药物部分的组成，可以是占重量10％-60％，更好为20％-50％，最好为20％-40％。多肽药物载体部分可治疗结合物重量的40％-90％，或者50％-80％，最佳者为60％-80％。
在一较优情形，药物部分为紫杉醇，占治疗结合物总重量的20％-40％；载体部分为70％的谷氨酸、30％的天门冬氨酸。载体部分的分子量在20000-50000道左右。
本项发明的另一个方面是有关增进药物部分溶解度的办法。这一方法包括以下步骤药物部分至少要与一多肽药物载体化合结合形成治疗结合物。这一结合物由至少一药物部分，一多肽药物载体部分组成。多肽药物载体部分由谷氨酸与下列氨基酸合成。天门冬氨酸或丙氨酸、或天门冬酰氨、谷氨酰胺、甘氨酸或他们的不同组合。具体优点选三例显示，治疗结合物的水溶性高于药物部分。另一情况下，药物可是抗肿瘤药，最理想的是药物部分采用紫杉醇。另外，多肽药物载体部分可由重量为50％-90％的谷氨酸构成，或由60％-80％谷氨酸。最适合的占重量为70％-75％的谷氨酸，10％-50％的天门冬氨酸、或是丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺或甘氨酸及其不同的组合而成。更适合的是用重量为20％-40％的天门冬氨酸或丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺或甘氨酸及其不同组合。最优选的条件是用重量约25％-30％的天门冬氨酸，或丙氨酸或天门冬酰胺，或谷氨酰胺，或甘氨酸及其不同的组合。
还有本项发明的另一方面是有关如何可用某种状况的方法。这一方法的步骤是使用由至少一部分药物，一部分多肽药物载体，二者化合结合形成治疗结合物的治疗有效量。多肽药物载体由谷氨酸及第二种选自天门冬氨酸，丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺和甘氨酸及其不同组合的氨基酸合成。具体在药物部分可选白一组抗肿瘤药，抗炎症药，心血管药，糖尿病药，促代谢药，止痛药及任何一种可以或希望通过新创载体传导释放的药物。药物部分也可以从一组由包括紫杉醇、表鬼臼毒素、长春花新碱、泰素帝、道诺霉素、阿霉素、米托蒽醌、羥喜树碱、博来霉素、Qemcitxbine、FluDarabine和5-FUDR等药物组。具体来说，多肽药物载体部分含重量50％-90％的谷氨酸，更好的为重量的60％-80％的谷氨酸，最佳方案为重量的70％-75％的谷氨酸，加上重量10％-50％的天门冬氨酸、或丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺或甘氨酸亦或他们之间的不同组合。更恰当的为以重量20-40％的天门冬氨酸，或丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺或甘氨酸及其不同结合。最优选的条件是25％-30％的天门冬氨酸或丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺或甘氨酸及其不同的组合在实践当中，治疗的状态可为前列腺肿瘤，药物部分可以为紫杉醇。
最后，这项发明的关键所在是揭示了某一特定的多肽，该药由一双肽聚合组成，单体重复单位为谷氨酸和天门冬氨酸。当其与药物部分化合结合时，可以增加药物的溶解性，同时有加强或具特殊的生物性质。这一发现在下面以实例说明其具体表现。即紫杉醇与多聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)之结合，以及其在资料中如前列腺癌的功用。这一实例只不过是本发明的示范而已，尚未牵涉到该发明更广的应用范围。也就是说，此创新由谷氨酸/天门冬氨酸或谷氨酸/丙氨酸、谷氨酸/天门冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺、谷氨酸/甘氨酸、谷氨酸/一至多个选自丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺及甘氨酸等氨基酸的不同结合，构成的双肽多聚体可将与任何药物结合起来。
总而言之，我们认为本项发明并不仅限于任何特定的药物，相反，结合的对象是范围广泛的，具有任何生物效应的药物，无论是已知或尚且未知，水溶性好或水溶性差的药物，包括如抗肿瘤药物。其他如消炎药，心血管药，糖尿病药，增进代谢药，治疗疼痛的药及任何能够或设计通过本创新载体传导的各类药物。具体地这些不受限制的药物包括(但不局限于)紫杉醇、表鬼臼毒素、长春花新碱、泰素帝、道诺霉素、阿霉素、火托蒽醌、羟喜树碱、博莱霉素、Gemcitabine、FluDarabine和5-FUDR。
除此之外，亦无必要认为本项发明仅仅是限于使用天门冬氨酸和谷氨酸或丙氨酸/谷氨酸，天门冬酰胺/谷氨酸，谷氨酰胺/谷氨酸，甘氨酸/谷氨酸(二肽)单体重复形成多聚二肽。尽管目前我们以用谷氨酸/天门冬氨酸合成的多肽作为样本的适宜体现，这不等于说本项发明的范围受限于此。比如，我们认为本新创多聚体药物载体不需完全由聚谷氨酸/天门冬氨酸(或丙氨酸，或天门冬酰胺，或谷氨酰胺，或甘氨酸)构成，亦不说是以重复单体的多肽或是混合形式。的确，所提的氨基酸(如谷氨酸和天门冬氨酸或丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺，甘氨酸)可以是多肽载体的一定百分比。此外，载体可由除上述氨基酸以外的任何组合。条件上至少有些载体只有新创多肽的组合构成。
另外，本项发明不单单是限于在多肽中使用“天然型”的氨基酸。相反，本发明是包括任何氨基酸的结构变化，只要最终多肽具有基本相同的功能和/或结构。氨基酸可以是D型，L型氨基酸或是DL型氨基酸混合。还有，我们也不强调认为本发明提出的多肽药物载体一定要完全是由100％谷氨酸/天冬门氨酸(或丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺或甘氨酸)所组成的多肽个体。只要多肽的某一段是含有所建议的氨基酸，我们认为则不需要整个多肽，只包括所接到的氨基酸的均匀分布，尤其更不必是重复的单体。
重要的一点是，本新创多肽需含有至少建议的比例的谷氨酸的(见后，如重量的50％-90％谷氨酸，较好一些为重量60％-80％谷氨酸，最好占70％-75％重量的谷氨酸)，同时至少含有天门冬氨酸，或丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺或甘氨酸的任何组合在提议的适量比例条件下，(见上，如10％-50％之总量的天门冬氨酸，或丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺或甘氨酸，更佳为20％-40％的天门冬氨酸或丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺或甘氨酸，我们认为最宜条件为25％-30％总量的天门冬氨酸或丙氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺或甘氨酸)。本发明新创多肽提出较适的分子量在范围约20,000-50,000道。
以下详细提供了一些实例来说明本发明对溶性差的抗肿瘤药紫杉醇与新创聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)药物载体，其产物显示出独特且非常惊奇的生物活性，如在体内抗前列腺癌之例。以下还公开了合成新创多肽药载体的方法和结合样本。不言而喻，这些实例绝无限制本发明的应用范围之意图，而仅仅是用来说明发明者目前所知的某一合适条件而已。此外，实例是在本发明的范围之内的。
实施例1关于本发明所述的多肽合成，即聚谷氨酸/天门冬氨酸(或聚谷氨酸/丙氨酸、聚谷氨酸/天门冬酰胺、聚谷氨酸/谷氨酰胺、或聚谷氨酸/甘氨酸)的聚二肽及其性质，然并不仅限于上述聚二肽。一般情况下，所发明的聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)为一生物分解多聚合体。如下所述，多肽可以合成与特定药物结合的形式，以增强该药物的溶解性和其在体内的传递释放。在这类情况下，聚多肽可以被认为是一个“药物传导前载体”(Propoly Drug DelivemyVehicle)。制成粉状，经消毒液后，药物结合体可用于静脉注射。所述多聚体与药物的结合具有持续释放的作用，可延长其在血液中的循环时间，因此比未被结合的药物本身，在使用时更见效且毒性小。如上讨论，可用之与新创聚合体结合的药物有如(但不仅限于)紫杉醇，表鬼臼毒素，长春花新碱，泰素帝，道诺霉素，阿霉素，米托蒽醌，羟喜树碱，博莱霉素，Qemsitabine,FluDarabine及5-FUDR。
另一情况，新创的聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)的分子约为26000-30000道，由70％谷氨酸和30％天门冬氨酸组成，由此可见，新创的聚合体并不需要含有均一和重复的二肽，这样的二肽应包括50％谷氨酸、50％天门冬氨酸。与此同时，在这一范围内的各种变化均可，如例中谷氨酸含量为70％，天门冬氨酸为30％，不过，这种范围可延伸至50％-90％谷氨酸和10％-50％天门冬氨酸实施例2聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)合成可使用已知程序，N-羧基酐(NCAs)用光气加相应的β-苯甲基-L-天门冬酰胺和γ-苯甲基-L-谷氨酰胺制备。
《美国化学学会杂志》(J.An.Chen.Soc)1958年第80期第2387至2393页、《美国化学学会杂志》1960年第82期第2268至2278页、《生物多聚体》(Biopolymers)1972年第11期第2043至2052页、《生物多聚体》1990年第29期第549至557页、《大分子》(Macromolecules)1971年第4期第557至564页中均有记载。
光气溶液(10％W/V)吹入乙酸乙酯(150ml)，将10毫升上述溶液加入到150ml碾细的β-苯甲基-l-天门冬酰胺和γ-苯甲基-l-谷氨酰胺的乙酸乙酯溶液中。反应回流搅拌5分钟，在加入光气之前，先用氨细流除去过剩的盐酸(HCL)，这一顺序重复至不剩余任何悬浮的氨基酸盐为止，这将混合液过滤，用真空泵蒸干溶剂。产物是从乙酸乙酯晶化而来。
N-羧基酐(NCAS)由β-苯甲基-l-天门冬酰胺和γ-苯甲基-l-谷氨酰胺的溶液以二氧六环/二氯甲烷(1∶3)配制，β-苯甲基-l-天冬酰胺和γ-苯甲基-L-谷氨酰胺的重量比例为3∶7,2∶8或1∶9，聚合反应是以含三乙胺的二氯甲烷(4ml,2.5％重量比)来发生，聚合反应回流30分钟，继之二氧化碳放出。反应在大约30％摩尔转换情况下停止。形成的聚合体用含有0.1HCL(5％重量比)的水酒精沉析，合成物以酒精冲洗，低压干燥，生成8克产物(对3∶7的原料)去苯甲基是根据已知操作步骤，用HBr来完成的(记载于《美国化学学会杂志》(J.Am.Chen.)1958年第80期第2387-2393页)。HBr处理后，水溶液部分用蒸溜水透析，再以Millipore过滤，真空压水法干燥。典型的分子量约为26000-30000道(Caltons)，图1为合成示意图，类似技术被用于配制谷氨酸/丙氨酸，谷氨酸/天门冬酰胺，谷氨酸/谷氨酰胺，和谷氨酸/甘氨酸的聚合物，或者是谷氨酸与一或多个包括天门冬氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺和甘氨酸这一组的氨基酸的聚合。
氨基酸分析仪(PE/ABI420A)(福斯特市，Footer City)用来测定天门冬氨酸和谷氨酸比例的实际构成，简单说来，聚(二肽)以6个当量的盐酸150摄氏度下分解消化(水解)75分钟，水解后的产物再加样到PVDF膜，加入甲醇(30％)和盐酸(0.1N,0.2毫升)来提取氨基酸。氨基酸的浓度用Pre-Column Ceribatiation WithPhenylisothiocyanate测定，图1B表示聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)氨基酸分析。
实施例3应用聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)为药物载体，借以传递抗肿瘤药为具体体现本项发明，我们用抗肿瘤药紫杉醇与新创多肽结合作为一药物传导载体。在此显示与未结合药物或结合至原有工艺载体即均一聚谷氨酸和天门冬氨酸相比，本发明的结合物具有超常的体内生物活性及治疗作用。数据表明，此新创多肽，作为载体与抗肿瘤药紫杉醇结合，可使紫杉醇产生意想不到的治疗作用，如治疗前列腺癌。结果表明，实际应用者认为，这的确是用紫杉醇在体内表现出抗前列腺癌的第一个有效例证。
实施例4
聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)——紫杉醇结合体的合成步骤众多研究曾提出，当多聚药物结合体的分子量在20000-50000道范围，会有一定的结合体从肾脏滤过。因此，为提高紫杉醇创新载体结合体被肿瘤的吸收，我们选用了分子量在26000-30000道范围的结合体。
紫杉醇与聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)的药聚合物比例为1∶4(摩尔)，将两者溶于N,N-DMF中，DCC(Dicyclzcarbodinmine)作为联合剂。在一典型实验中，383毫克的聚二肽被溶于8毫升的DMF中，将8.5毫克的N,N-二甲胺嘧啶和209.4毫克的紫杉醇再加入152.2毫克的DCC。之后再加入上述混合液体之中。反应在室温下搅拌22小时。滤去尿素，产生的溶剂加入氯仿。产物过滤，在重新溶入碳酸氢钠用蒸溜水透析(以10000道为界)后，产物冰冻干燥并称重为620毫克。产物含26.79％紫杉醇。图2A为紫杉醇结合到聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)的合成示意图。
多聚二肽，紫杉醇及水溶性聚二肽—紫杉醇结合体的氢磁共振(HNMR)是用6E600MHA NMR测定的。图2B,2C,2D表示相应的图谱。在紫杉醇结合体可清晰见到，其C2｀点与结合体的连接。即C2｀的化学移动为4.68(d)(见图2B中紫杉醇光谱双重线)及图2K中紫杉醇结合体的化学移动为4.91(d)。
实施例5聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇结合体中紫杉醇浓度的测定为比较紫杉醇及其结合体紫外线吸收的区别，这些衍生物的紫外光扫描(紫外扫描仪为Beclsman DU-600 Fulleton(CA))记录如下(图3A,3B,4A,4B)。不同浓度的紫杉醇在甲醇中(2,6,14,18微克/毫升)的吸收率用UV232mm波长测定。得出标准曲线图5A。聚合的紫杉醇结合体先用标准曲线推断而定。(图5B)。
实施例6聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇结合体的色谱分析为证明聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇结合体的性质，我们用了高效液相色谱(HPLC)和薄层层析(TLC)做了色谱分析。在高效液相色谱中用的是Nova-PakC-18反相柱(3.9×15mm，图6、7、8、9A、9B、9C)。化合物为同一浓度，流量为1.0毫升/分钟的甲醇/水(2∶1)洗脱。薄层层析分析采用硅胶。产物以氯仿/甲醇(7∶3)洗脱。
实施例7聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇结合体的溶解度与稳定性结合体的溶解度是在25摄氏度的生理盐水(0.9％NaCl)测定。稳定性鉴定在25摄氏度磷酸盐生理盐水中进行。不同时间的样品以高效液相色谱鉴定(图9D、9E)。
实施例8体外细胞培养测定为评定紫杉醇结合体的细胞毒性和抗肿瘤细胞的能力，选用了三种人类肿瘤细胞系。前列腺(PC3)、鼻癌(KB)和乳癌(MDAMB 231)。细胞均培养于Eagle′s培养液，含5％CO2的湿度条件，温度37摄氏度，实验前48小时，细胞移至35毫米培养皿，密度每盘5×105，细胞长至80％融合。35mm培养皿中人类肿瘤细胞再与不同浓度的紫杉醇或其结合体在培养箱中一同培养72小时。成活的细胞是用MTT染剂测定。细胞蛋白含量用LOWRY法测定。可抑制50％细胞生长的药量是由此测定。在高浓度情况下(即1uM)，紫杉醇和其结合体对细胞抑制的能力没有区别。但在低浓度情况下，紫杉醇对细胞的抑制作用极为显著。(图9F)实施例9结合体在四种带肿瘤的动物模型中的评定紫杉醇对乳癌和卵巢癌具已知的抗肿瘤效果，但对前列腺癌则无。鉴此，我们选用了四种动物模型卵巢癌，乳癌及2种前列腺癌。卵巢癌由动物肿瘤细胞系诱发，其他三种肿瘤是用人类细胞系异体移植到裸鼠上形成。
实施例10患卵巢癌的动物模型卵巢癌细胞(OCA-1,500000Cells/鼠，下皮(S.C))接种到雌性C3H/KAM鼠(20-28克，N=5剂量)的后腿部。当肿瘤长到500立方毫米大时，给予老鼠紫杉醇或其结合体。为紫杉醇剂量为80mg/kg，结合物为40-160mg/kg为比较起见，亦进行了我们产品与其他水溶性紫杉醇产品的平行比较实验。聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇以40-160mg/kg的剂量给予老鼠受试体。肿瘤体积与体重记录60天。肿瘤体积的测量单位是(长×宽×高)/2。体重减轻15％视为化学诱导毒性效果。这些结果在图10和11中标出。图中显示虽然紫杉醇结合到多肽显著增强抗卵巢癌的效果，但紫杉醇结合到新创多肽，与结合到原有谷氨酸单聚体，两者并无明显区别。
实施例11乳腺癌动物模型将人类乳癌细胞(MDA435×105/细胞/老鼠，N=5/剂量皮下接种到无胸腺雌性裸鼠(NCr 5-nu/mu)的乳腺脂肪垫上。15-20天后，肿瘤体积在250立方毫米，给患人类乳瘤癌老鼠剂量为60-100mg/kg的紫杉醇结合体，60mg/kg的紫杉醇。每天记录肿瘤体积及体重60天。肿瘤体积测量为(长×宽×高)/2。体重减轻15％视为化学诱导毒性效应。以上结果如图12所示。其中未结合之紫杉醇，结合于原有工艺的聚谷氨酸单聚体及本发明的多肽的紫杉醇均显示出对人类乳腺癌细胞的体内活性。
实施例12前列腺癌的动物模型两种人类前列腺癌细胞(A10和PC3，每只老鼠用10细胞，N=5/剂量)被接种到无胸腺雄性裸鼠乳腺脂肪垫内。两品系细胞均来自德州州立大学，M.D安德森癌症中心，泌尿生殖肿瘤科。A10细胞系表达PSA和雄性激素受体为阴性(22)。PC3细胞系表达PSA和雄激素受体为阴性。15-20天和肿瘤体积至500立方毫米后，患人类前列腺癌的裸鼠给予剂量为60-120mg/kg(结合体)，或60mg/kg(紫杉醇)。图13A示出，紫杉醇与多聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)的结合体具有抗前列腺癌的效果，而未结合之紫杉醇无效。
为比较起见，亦进行了一组平行实验，用新创紫杉醇结合体与其他水溶性紫杉醇产品进行比较，包括结合到原有工艺的聚谷氨酸的紫杉醇。老鼠给予剂量为120毫克/公斤的聚谷氨酸单聚体紫杉醇。该结合体是用已知程序配制的(记载于《癌症研究》(CancerRes)1998年第58期第2404-2409页)。肿瘤体积及体重记录至60天，肿瘤体积测量为(长×宽×高)/2。体重降低15％被认为是化学诱导毒性作用。如图13B所示，紫杉醇结合到多聚谷氨酸对体内抗前列腺癌无效。
实施例13治疗后瘤组织的组织病理学经紫杉醇或其结合体治疗后，肿瘤组织(前列腺)做切片及用福尔马林浸泡。肿瘤组织用Paraffin固定，再用伊红(Eosin)或Hematoxycilin染色。紫杉醇或结合体造成的肿瘤消亡过程在显微镜下观察并记录。
实施例14聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)-紫杉醇结合体的合成分子量在26000-30000范围的聚(谷氨酸/天门冬氨酸)先行配制。由氨基酸分析仪确定的聚二肽含70％谷氨酸、30％天门冬氨酸(图1把紫杉醇结合到聚<谷氨酸/天门冬氨酸>)上是以药的聚合体比例1∶4(摩尔)在N,N-DMF溶液中进行的。图3和4表示紫杉醇、结合体及聚二肽的紫外光扫描。图5表示标准曲线，典型的紫杉醇浓度在20％-40％之间。
实施例15
聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇结合体的色谱分析对产物进行高效液相色谱分析发现，紫杉醇结合体及聚合体的滞留时间分别为4.2分钟、1.0分钟和1.0分钟(见图6-8)。虽然在接合体和聚合物之间并未反映出不同，结合体的吸收率明显高于聚合体本身。当把已知量的紫杉醇混入，则注意到不同的滞留时间(见图9A,9B,9C)。薄层分析中，紫杉醇与结合体的Rf值分别为0.8和0.1。
实施例16聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇结合体的溶解度与稳定性结合体的溶解度测定为大于20mg/ml生理盐水，这比紫杉醇(本身的溶解度)高出差不多500倍。稳定性的测定表明结合体的半衰期在磷酸生理盐水(PH7.4)25摄氏度时为18天(见图9D,9E)。
实施例17体外细胞培养测定紫杉醇的细胞毒性(IC50)在PC3细胞系内被测定为20倍于结合体，(图9G)。这一不同也许是由于紫杉醇在结合体上需持续释放的原故。
实施例18体内抗肿瘤活性研究在四种动物模型的实验中，聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇结合体的抗肿瘤活性比紫杉醇为好(见图10、12-14)。聚(谷氨酸)紫杉醇结合体与聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)结合体相比具类似的抗肿瘤效果(图10和11)。不过聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇结合体在动物前列腺模型中证实更有说服力(见图13A,13B,14)。尽管事实上聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇结合体可提供较高的负荷剂量，但聚二肽(谷/天)紫杉醇结合体并未改变体重说明，其毒性要比紫杉醇为小。在图15、15B、16、17、17B、17C中，聚二肽(谷氨酸/天门冬氨酸)紫杉醇结合体对带人类肿瘤中动物模型的肿瘤缩小程度比聚(谷氨酸)紫杉醇或单独用紫杉醇更为显著。
实施例19经治疗后的肿瘤组织的组织病理学由显微镜观察发现，经紫杉醇或其结合体治疗后造成的肿瘤消亡过程结合体更为明显于紫杉醇本身。
总上，我们开发出的一种新型的聚二肽水溶性的紫杉醇。使溶解性增加到每毫升20mg。在磷酸缓冲剂(PH7.4)体外稳定半衰期达18天。这一产品易于大量生产制备成稳定的药粉。与紫杉醇相比，没有明显的毒性且可以静脉使用较大的负荷剂量。产品在卵巢癌，乳癌与前列腺癌的动物模型中表现出明显的抗肿瘤效应。在患人类前列腺癌的裸鼠中，该产品与聚(谷氨酸)紫杉醇结合体以及未结合的紫杉醇相反，表达了抗前列腺癌的治疗效果。
本说明书中提及的专利及出版物系本发明所属工艺的象征性技术水平。在此引用的每一专利与文献仅供作为本发明的参考资料。熟悉工艺者即会意识到本发明已完全适用于解决具体目的，达到预计的结果与优势，以及解决其他类似的问题。这里描述的方法，步骤，处理，分子及特定的化合物乃较优的具体体现及例证，并无限制本发明范围的意思在内。故此，变更及其他用途将都属于本发明所有权定义范围。
权利要求
1.一种治疗化合物，包括药物，其特征在还包括多肽药物载体；多肽药物载体包括占50％-90％重量比例的谷氨酸，和10％-50％重量比例的第二种氨基酸；第二种氨基酸可以是天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的任何一种组合；药物部分与载体部分化合结合。
2.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的药物载体部分的分子量约为20000-50000道。
3.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的第二种氨基酸为天门冬氨酸。
4.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的第二种氨基酸包括天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的两两或多者的组合。
5.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的药物部分为一种抗肿瘤药物。
6.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的药物部分是选自紫杉醇、表鬼臼毒素、长春花新碱、泰帝素、道诺霉素、阿霉素、米托蒽醌、羟喜树碱、博莱霉素、Gemcitabine、FluDarabine或5-FUDR。
7.根据权利要求1所述治疗化合物，其特征是所述药物部分为紫杉醇(Paclitaxel)。
8.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的多肽药物载体包括60％-80％重量比例的谷氨酸、20％-40％重量比例的第二种氨基酸。
9.根据权利要求8所述的治疗化合物，其特征是所述的第二种氨基酸为天门冬氨酸。
10.根据权利要求8所述的治疗化合物，其特征是所述的第二种氨基酸包括天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺及甘氨酸的两两或多者组合。
11.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的多肽药物载体包括70％-75％重量比例的谷氨酸、25％-30％重量比例的第二种氨基酸构成。
12.根据权利要求11所述的治疗化合物，其特征是所述的第二种氨基酸为天门冬氨酸。
13.根据权利要求11所述的治疗化合物，其特征是所述的第二种氨基酸包括天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的两两或多者的组合。
14.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特是包括至少两种不同的药物。
15.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是包括多种药物。
16.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的药物部分是治疗化合物重量的10％-60％。
17.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的多肽药载体是治疗化合物重量的40％-90％。
18.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的药物部分占治疗化合物总重量的20％-50％。
19.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的药物部分是治疗化合物重量的20％-40％。
20.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的氨基酸可以是L型或D型，或消旋混合的L型和D型。
21.根据权利要求1所述的治疗化合物，其特征是所述的药物部分为紫杉醇，占治疗化合物重量24％-30％；载体部分由70％谷氨酸、30％天门冬氨酸组成，治疗化合物的分子量约为26,000到30,000道。
22.一种提高药物溶解性的方法，其特征在于将药物与多肽药物载体化合，进而构成一治疗化合物；载体部分具有重量50％-90％的谷氨酸和重量10％-50％的第二种氨基酸；第二种氨基酸可以是天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的任一种组合。
23.根据权利要求22所述的提高药物溶解性的方法，其特征是所述的药物载体部分的分子量约为20000-50000道。
24.根据权利要求22所述的提高药物溶解性的方法，其特征是所述的第二种氨基酸为天门冬氨酸。
25.根据权利要求22所述的提高药物溶解性的方法，其特征是所述的第二种氨基酸包括天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的两两或多者的组合。
26.根据权利要求22所述的提高药物溶解性的方法，其特征是所述的治疗化合物的水溶性大于药物部分的水溶性。
27.根据权利要求22所述的提高药物溶解性的方法，其特征是所述的药物部分为一抗肿瘤药。
28.根据权利要求22所述的提高药物溶解性的方法，其特征是所述的药物部分为紫杉醇及其衍生物。
29.根据权利要求22所述的提高药物溶解性的方法，其特征是所述的多肽药物载体部分由重量的60％-80％谷氨酸，20％-40％的第二种氨基酸组成。
30.一种治疗的方法，其特征在于包括以下步骤给予一治疗化合物的治疗有效量，该治疗化合物包括至少一部分药物和至少一部分多肽药物载体；多肽药物载体包括重量50％-90％的谷氨酸和重量10％-50％的第二种氨基酸；第二种氨基酸可以是天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的任何一种组合；药物部分与载体部分化合结合。
31.根据权利要求30所述的治疗方法，其特征是所述的药物载体部分的分子量在20000-50000道。
32.根据权利要求30所述的治疗方法，其特征是所述的第二种氨基酸为天门冬氨酸。
33.根据权利要求30所述的治疗方法，其特征是所述的第二种氨基酸是天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的任一种。
34.根据权利要求30所述的治疗方法，其特征是所述的药物部分为一抗肿瘤药。
35.根据权利要求30所述的治疗方法，其特征是所述的药物部分为紫杉醇，可治疗前列腺癌、乳房癌、卵巢癌、直肠癌、血癌、淋巴癌、肺癌和肝癌。
36.根据权利要求30所述的治疗方法，其特征是可治疗前列腺癌，药物部分为紫杉醇。
全文摘要
一种治疗化合物,包括药物、多肽药物载体;多肽药物载体包括占50%－90%重量比例的谷氨酸,和10%－50%重量比例的第二种氨基酸;第二种氨基酸可以是天门冬氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸的任一种组合;药物部分与载体部分化合结合。即提供一种解决改善药物部分溶解度的方法。也即提供了一种治疗方法。
文档编号A61K31/475GK1310025SQ0010562
公开日2001年8月29日 申请日期2000年4月12日 优先权日1999年4月13日
发明者许静亚 申请人:美国芬尼生物科学有限公司