专利名称：应用TNF－α拮抗剂和LFA－1拮抗剂治疗LFA－1或TNF－α介导的疾病的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及通过给药有效剂量的LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂治疗淋巴细胞功能相关(LFA)-1介导的疾病或肿瘤坏死因子(TNF)-α介导的疾病。本发明也涉及用LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂治疗关节炎和牛皮癣。
背景技术：
TNF是与正常炎症和免疫应答有关的天然存在的细胞因子。它在类风湿性关节炎(RA)，多关节发作的青少年类风湿性关节炎(polyarticular-coursejuvenile rheumatoid arthritis，JRA)的炎症过程中和它们所导致的关节病理反应方面起着重要作用。在RA患者的滑膜液中发现TNF的水平升高。TNF的二个不同的受体(TNFRs)，即一个55kD的蛋白(p55)和一个75kD的蛋白(p75)在细胞表面作为单体以可溶形式天然存在。TNF的生物学活性依赖于它同细胞表面的任何一个TNFR的结合。P55受体(也称作TNF-R55，TNF-R I或TNFR-β)是一个55kD的糖蛋白，能够转导TNF-α的细胞毒，抗病毒和增殖活性信号。P75受体(也称为TNF-R75，TNF-R II或TNFR-α)是75kDa的糖蛋白，它也显示出转导细胞毒和增殖信号的作用，同时还转导引起GM-CSF分泌的信号。
单核细胞和巨噬细胞在对内毒素和其它刺激物反应时分泌称作肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子-β的(TNF-β；淋巴毒素)的细胞因子。TNF-α是由三个17kD的蛋白亚单位组成的可溶性同源三聚体(Smith等，生物化学杂志2626951-6954(1987))。TNF也存在26kD的膜结合前体形式(Kriegler等，细胞5345-53(1988))。关于TNF的综述参见Butler等，自然320584(1986)，Old，科学230630(1986)，和Le等，实验研究Lab.Invest.56234。除单核细胞或巨噬细胞外的其它一些细胞也可以分泌TNF-α。例如，人非-单核细胞肿瘤细胞系产生TNF(Rubin等，实验医学杂志1641350(1986)；Spriggs等，Proc.Natl.Acad.Sci USA846563(1987))。CD4-和CD8-的外周血T淋巴细胞和一些培养过的T和B细胞系(Cuturi等，实验医学杂志1651581(1987)；Sung等，实验医学杂志1681539(1988))也产生TNF-α。
TNF引起前炎性(pro-inflammatory)作用，这种作用导致组织损伤，例如诱导血管内皮细胞上的促凝血活性(Pober等，免疫学杂志1361680(1986))，增加中性粒细胞和淋巴细胞的粘附(Pober等，免疫学杂志1383319(1987))和刺激巨噬细胞，中性粒细胞和血管内皮细胞释放血小板活化因子(Camussi等，实验医学杂志1661390(1987))。TNF也与感染(Ceramj等，今日免疫学(Immunol.Today)928(1988))，免疫疾病，肿瘤病理(Oliff等，细胞50555(1987))，自身免疫病理和移植物抗宿主的病理(Piguet等，实验医学杂志1661280(1987))有关。
TNF也在包括发热，不适，厌食和恶病质的革兰氏阴性脓毒血症和内毒素休克中起重要作用(Michie等，英国外科学杂志76670-671(1989)；Debets等，Second Vienna Shock Forum，p.463-466(1989)；Simpson等，临床危重疾病护理Crit.Care Clin.527-47(1989)；Waage等，Lancet 1355-357(1987)；Hammerle等，Second Vienna Shock Forum p.715-718(1989)；Debets等，Crit.Care Med.17489-497(1989)；Calandra等，感染性疾病杂志161982-987(1990)；Revhaug等，Arch.Surg.123162-170(1988))。
TNF的多克隆小鼠抗体已由Cerami等公开(EPO专利出版0212489 1987年3月4日)。据报道这些抗体在诊断性免疫学检测和细菌感染性休克的治疗中是有用的。Rubin等(EPO专利出版1218868 1987年4月22日)公开了抗人TNF的小鼠单克隆抗体，分泌这种抗体的杂交瘤，制备这种小鼠抗体的方法和这种小鼠抗体在TNF的免疫学检测方面的应用。Yone等(EPO专利出版0288088 1988年10月26日)公开了抗TNF的小鼠抗体，包括mAbs，和它们在疾病的免疫学检测诊断，特定的Kawasaki′s病和细菌感染中的应用。据报道患有kawasaki′s病(婴儿急性发热性粘膜皮肤淋巴结综合症；kawasaki，过敏症Allergy 16178(1967)；Kawasaki，Shonica(儿科学)26935(1985))的患者的体液中TNF水平升高与疾病的进展相关(Yone等见下文)。
其它的研究显示重组人TNF特异性的啮齿动物或小鼠mAbs在体外有中和活性(Liang等(Biochem.Biophys.Res.Comm.137847-854(1986)；Meager等，杂交瘤6305-311(1987)；Fendly等，杂交瘤6359-369(1987)；bringman等杂交瘤6489-507(1987)；Hirai等，免疫学方法杂志9657-62(1987)；Moller等(细胞因子2162-169(1990)。这些单克隆抗体用来绘制人TNF的表位，进行酶免疫学检测(Fendly等，见下文；Hirai等，见下文；Moller等，见下文)和辅助重组TNF的纯化(Bringman等，见下文)。然而，由于上述mAbs具有免疫原性，缺乏特异性和/或不适宜药用，这些研究没能为用于人体内进行诊断和治疗的TNF中和抗体的制备打下基础。
已经发现TNF的中和抗血清或mAbs在哺乳动物体内而不是在人体内可消除不利的生理变化，同时可预防实验性内毒素血症和菌血症时致死性攻击后的死亡。上述作用已经得到证明，例如，在啮齿动物的致死性实验中和灵长类动物病理模型系统中(Mathison等，临床研究杂志81925-1937(1988)；Butler等，科学229869-871(1985)；Tracey等，自然330662-664(1987)；Shimamoto等，Immunol.lett.7311-318(1988)；Siiva等，感染性疾病杂志16242(1990)；Opal等，感染性疾病杂志1611148-1152(1990)；Hinshaw等，危重休克Ciric.Shock 30279-292(1990))。
推测出的与hTNF的位点结合的受体已由Eck和Sprang公开(生物化学杂志264(29)17595-17605(1989)，他们鉴定出TNF-α的受体结合位点由11-13，37-42，49-57和155-157组成。
PCT出版W09I/02078(1991)公开了可以同具有某些表位的单克隆抗体结合的TNF配体。
目前，在人体内用抗TNF小鼠mAb治疗的实验受到限制。在一个阶段，我对十四位患严重脓毒血症休克服用单一剂量0.410mg/kgd的小鼠抗TNFmAb的患者进行了研究(Exley，A.R.等，Lancet 3351275-1277(1990))。然而，十四个患者中有七个治疗后出现了人抗小鼠抗体反应，该反应是由已知问题所致，即所用小鼠抗体的重链和轻链部分的免疫原性。这种免疫原性使继续给药的有效性降低，同时使采用小鼠抗TNF抗体进行诊断或治疗的患者的治疗无效。
对患严重移植物抗宿主疾病的患者给予小鼠TNFmAb也有报道(Herve等lymphom Res.9591(1990))。
ENBREL(etanercept)是一种二聚体融合蛋白，由人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分与人IgG1的Fc部分连接组成。Etanercept的Fc成分包含CH2功能域，CH3功能域和铰链区，但不包括IgG1的CH1功能域。Etanercept有效地与肿瘤坏死因子(RNF)结合，并阻断肿瘤坏死因子与细胞表面TNF受体的相互作用。Etanercept可抑制TNF的活性，并且已显示其可对几种炎症动物模型产生影响，包括小鼠胶原诱导的关节炎。对RA一直主要以氨甲喋呤治疗。Etanercept近来才用于关节炎的治疗；这种治疗在例如Moreland等，1999，Ann.Intern.Med.130478-486中有描述。
Aderka等，Isrl J.Med.Sci.28126-130(1992)中公开了TNF受体(STNF-Rs)的可溶性形式，这种受体可特异性地与TNF结合，因而在与TNF结合时能够与细胞表面TNF受体竞争(Seckiner等，实验医学杂志1671511-1516(1988)；Engelmann，等生物化学杂志26411974-11980(1989))。对人55kD的TNF受体和该受体的可溶性形式的克隆和表达已有描述(Loetscher等，Apr.20.1990.细胞61351-359；Schall等，1990年4月20日，细胞61361-370；Nophar等，EMBO J.9(10)3269-3278(1990)。Engelmann等，生物化学杂志265(3)1531-1536(1990)，公开了TNF结合蛋白。EP 0 433 900AI公开了TNF结合蛋白(TBP-I)，它们的衍生物和类似物，编码整个人I型TNF受体或它的可溶性功能域的DNA的表达。WO 92/13095公开了通过给药治疗有效量的选自30kDa和40kDa的TNF抑制物治疗肿瘤坏死因子介导的疾病的方法。
EP 0 526 905公开了TNF受体可溶性形式的多聚体，该多聚体包括通过化学或重组方法制备的hp55 TNF受体部分，这部分用来保护哺乳动物免受TNF的有害作用。WO 92/07076公开了经过修饰的人TNF-α受体，该受体由55kDa或75kDa人TNF-α的TNF受体细胞外结合区的头三个半胱氨酸丰富的子域组成，但缺乏其第四个子域，或上述经过修饰的TNF-α受体的氨基酸序列与TNF受体序列有90％或以上的同源性。EP 0 412 486 A1公开了TNG结合蛋白I(TBP-I)的抗体和它们的片段，它们或者抑制或者模拟细胞上TNF的作用用于诊断性检测或用作药物制品。EP 0 398 327 A1公开，分离和纯化的TNF结合蛋白(TBP)对TNF的细胞毒作用有抑制活性，另外，TNF结合蛋白11和单克隆抗体也有此作用。EP 0 308 378 A2公开了TNF抑制蛋白和它的功能衍生物在拮抗TNF的有害作用上的应用。
LFA-1(由CD11a和CD18亚单位组成)与ICAM之间的相互作用对T细胞的杀伤，T辅助细胞和B细胞的反应，自然杀伤和抗体依赖的细胞毒作用来说是必需的。另外，LFA1/ICAM的相互作用还与淋巴细胞同内皮细胞，成纤维细胞和上皮细胞的粘附有关，还可促进淋巴细胞从脉管系统向炎症部位迁移(Collins.T.1995科学和医学28-37；Dustin，ML等，1991，Annual RevImmunology 927-66)。
用干扰LFA-1/ICAM之间相互作用的抗体通过阻断T细胞的活化和/或淋巴细胞的分泌可降低或抑制炎症过程。在体外，抗LFA-1或抗其配体的单克隆抗体抑制了T细胞的活性(Kuypers，T.和Roos，D..1989.免疫学研究140461-86；Springer，TA.1987，Annual Rev Immunology，5223-52)，T细胞依赖的B细胞增殖(Fischer，A.等，1986.免疫学杂志1363198-203)，靶细胞的溶解(Krensky.A.等，1983，免疫学杂志1316711-6)，和T-细胞同血管内皮的粘附(Dustin，ML.等，1988，细胞生物学杂志107321-31)。抗CD11抗体用于治疗牛皮癣已在WO 0056363中有报道。在小鼠中，抗CDI1a抗体已诱导出对蛋白抗原的耐受(Benjamin.R.等，1988，欧洲免疫学杂志181079-88Tanaka.Y.等，1995，欧洲免疫学杂志251555-8)，推迟了实验性自身免疫性脑脊髓膜炎的发作，降低了它的严重性(Gordon.EJ等，1995，神经免疫学杂志62153-60)，抑制了狼疮相关的自身抗体的产生，延长了几类组织移植物的存活时间(Cavazzana-Calco MS，Sarnacki S.Haddad E，等，移植1995；59(lui)1576-82；Nakakura EK，McCabe SM.Zheng B.Shorthouse RA.等，移植1993；55(2)412-7；Connolly MK，Kitchens EA.Chan B，et al，临床免疫学和免疫病理学1994；72(2)198-203；He Y，Mellon J，Apte R，Niederkorn J.，眼科学研究和视觉科学Investigative Ophthalmology and Visual Science 199435(8)3218-25；Isobe M，Agita H.Okumura K，Ihara A.，科学1992；2551125-7Kato Y，Yamataka A，Yagita H，等，外科学年鉴1996；223(1)94-100；Nishihara M，Gotoh M.Fukuzaki T.等，移植进展Transplantation Proceedings1995；27(1)372Talento A，Nguyen M，Blake T，等，移植199355(2)418-22；van Dijken PJ，Ghayur T，Mauch P.等，移植199049(5)882-6)。在人类的临床研究中，小鼠抗CD11a单克隆抗体显示可辅助预防骨髓移植后的移植失败(Cavazzana-Calco MS.Bordigoni P，Michel G.等，英国血液学杂志1996；93131-8；Fischer A，Friedrich W，Fasth A.，血液1991；77(2)249-56；Stoppa AM，Maraninchi D，Blaise D，Viens P.等，世界移植1991；43-7)和肾脏移植(Hourmant M，Le MauffB，Le Meur Y，等，移植1994；58(3)377-80；Hourmant M，Bedrossian J，Durand D，等，移植1996；62(11)1565-70；LeMauffB，Hourmant M，Rougier JP，等，移植1991；52(2)291-6)。
在类风湿性关节炎中，主要表现的症状是疼痛，僵直，肿胀和功能丧失(在风湿病学教科书(Kelley WN.Harris ED，Ruddy S，Sledge CB，eds.)WBSaunders，Philadelphia pp 879-886.1985中的Bennett JC.类风湿性关节炎的病因)。用于控制这些症状的药物很多，但它们似乎都不甚理想。没有一种药物能够明显地阻止关节破坏的加剧(在风湿病学教科书(Kelley，et al.，eds.)WBSaunders，Philadelphia pp 915-990，1985中的Harris ED.类风湿性关节炎临床的型谱)。
在类风湿性关节炎的发病机理中TNF-α是至关重要的。TNF-α蛋白和其mRNA存在于类风湿性关节炎的关节组织和滑膜液中(Buchan G，等，临床实验免疫学Clin.Exp.Immunol 73449-455，1988)，这提示TNF-α是局部合成的。
在OA或类风湿性关节炎中关节的正常功能减弱。在OA或RA中，关节软骨的功能不能达到最佳水平，这使关节易于遭受损害，这些损害包括在活动中施加给关节的正常水平的机械和物理损害。在OA和RA中，当关节软骨受到破坏时，其正常的修复功能也不能达到最佳程度。因而，在OA和RA中对关节的损伤经常加剧，受到损伤的透明关节软骨被不甚理想的纤维软骨替代。纤维软骨比正常关节中的正常的透明或关节软骨在物理和生物化学方面有明显不同，而且不能最佳程度地执行同样的功能。
与骨关节炎相关的退行性变开始时通常表现为表面的磨损和纤维化。基质中也出现蛋白聚糖的丢失。当表面的纤维化加剧时，缺损进一步向深层穿透，进入软骨，并且引起软骨的丢失。软骨下的骨增厚，并慢慢被暴露出来，还可能被磨光。骨节结或骨赘也通常在软骨表面的周围形成，并且有时超过邻近的侵蚀区。如果这些骨的副产物具有弥漫性，那么也可形成血管副产物，导致包含纤维软骨的组织塞的形成。
检查发现肽生长因子的应用可促进损伤软骨的修复。肽生长因子是非常有意义的软骨生长和细胞行为(即分化，迁移，分裂或基质合成或分解)的调节剂[F.S.Chen等，Am J.骨科学Orthop.26396-406(1997)]。
以前曾提出生长因子可刺激软骨的修复，具有上述作用的生长因子包括胰岛素样生长因子(IGF-1)，[Osbom，骨科学研究杂志J.Orthop.Res.735-42(1989)；Florini & Roberts，J.Gerontol.3523-30(1980)]；基本的成纤维细胞生长因子basic fibroblast growth factor(bFGF)，[Toolan等，J.Biomec.Mat.Res41244-50(1998)；Sah等，Arch.Biochem.Biophys.308137-47(1994)]骨形态形成蛋白bone morphogenetic protein(BMP)[Sato & Urist，Clin.Orthop.Relat.Res.183180-87(1984)；Chin等，类风湿性关节炎.34314-24(1991)和转化生长因子β(TGF-β)[Hill & Logan，生长因子的研究进展Prog.Growth Fac.Res.445-68(1992)Guerne等，细胞生理学杂志J.Cell Physiol158476-84(1994)；Van der Kraan等，风湿病年鉴Ann.Rheum.Dis.51643-47(1992)]。有人进一步提出胰岛素可促进软骨的合成，用胰岛素，氚标记的胸腺嘧啶和[35S]-硫酸盐处理培养的骨关节炎软骨移植物可显示后者掺入到通常的合成反应中。J.Posever等，J.Orthopaedic Res 13832-827(1995)。刺激软骨修复的其它方法包括对与软骨破坏或加重软骨破坏相关分子的拮抗和应用，例如，IL-1a和含氮氧化物。患RA的绝大多数人有与单核细胞和吞噬细胞上II类主要组织相容性复合体分子活性增加相关的遗传易感性。患极严重RA疾病的人类患者中淋巴细胞抗原DR亚型Dw4，Dw14和Dw15的高度保守性也进一步支持RA的遗传易感性。活化的单核细胞和吞噬细胞在与适当的T细胞相互作用时可刺激一种级联反应或免疫反应，导致更多单核细胞和巨噬细胞，T细胞，B细胞和内皮细胞的活化。这种活化作用增加粘附分子的合成，吸引更多的单个核细胞和多形核细胞到炎症的关节部位。上述细胞注入到炎症部位进一步导致另外的化学趋化细胞因子的分泌，导致更多的炎症细胞进入滑膜和关节周围的滑膜液中。
通常，人们相信，在免疫遗传学上对RA易感的宿主中许多不同的关节炎生成刺激物可活化免疫反应。已提示外源性感染制剂(EB病毒，风疹病毒，巨细胞病毒，疱疹病毒，人嗜T淋巴细胞病毒，支原体和其它)和内源性蛋白(胶原，蛋白聚糖，改变的免疫球蛋白)是激发不适当的宿主免疫反应的制剂。最终导致的结果是产生过强的直接指向宿主组织的(例如，直接指向II型胶原的抗体，直接指向自体同源的IgG(称为“类风湿因子”)的Fc部位的抗体)不适当的免疫反应。这进一步增强免疫反应性的软骨损伤，导致类风湿性关节炎的加重。在类风湿性关节炎中，主要存在的症状是疼痛，僵直，肿胀和功能丧失(在风湿病学的教科书中(Kellev WN，Harris ED，Ruddy S，SledgeCB.eds.)WB Saunders，Philadelphia pp 879-886.1985中的Bennett JC.类风湿性关节炎的病因)。
细胞因子IL-1a，IL-1(3，IL-4，IL-8，IL-10，TNF-a，PDGF，FGF，GM-CSF，IFN-y，TGF-ss，IL-2和IL-6可提高在滑膜，软骨细胞中的成纤维细胞样细胞和巨噬细胞的活性，所以蛋白聚糖，中性蛋白酶例如胶原酶，transin和stromeiysin的释放增加。这些因素导致破骨细胞的前体细胞的募集，最终在骨和软骨的损伤部位累积，侵入增殖的滑膜中。在生理学上，损伤的级联反应的特点是软骨层变薄，蛋白聚糖的合成减少和持重能力下降。
对几种联合治疗RA的方法已有描述。etanercept(TNFRFc融合蛋白)和氨甲喋呤(MTX)的联合应用对活动性RA进行的持续治疗发现，这种治疗方式比单独应用氨甲喋呤有更好的临床效果(Weinblatt等，Jan.28.1999，NEJM 340(4)253-259)。在另一临床实验中，抗TNF-α的嵌合小鼠-人抗体cA2(infliximabRemicade.)是和低剂量的氨甲喋呤联合给予RA患者的(Mani等，1998，关节炎和风湿病41(9)1552-1563)。实验发现如果在CIA小鼠模型中临床疾病发作之前给药抗CD4 mAb可预防胶原诱导的关节炎，但对已发作的疾病的治疗无效。联合给药抗CD4抗体和抗TNFα/β抗体可使手爪的肿胀和关节的侵蚀比单独应用抗TNF时观察到的最佳效果还要明显减轻(Williams等，1994，PNAS 912762-2766)。对于其它的在联合治疗方面的参考参见Kremer(1998).关节炎和风湿病411548-1551 and Williams(1998)，Springer Semin.Immunopathol.20165-180。
许多治疗给药后迅速产生副作用，或副反应，包括但不限于发热，头痛，呕吐，呼吸困难和血压改变。这些副反应限制了所使用的药物或治疗剂的混合物的用量，对用量的限制变为对原本用较高剂量的药物可达到的治疗效果的限制。副反应也与开始给予的直接靶向其它细胞表面分子的单克隆抗体有关。当静脉给药牛皮癣和类风湿性关节炎患者人源化的抗CD4单克隆抗体时可诱导发热，寒战，血压下降和胸闷(Isaacs，等，1997临床实验免疫学110.158-166)。这种治疗可下调CD4的表达，导致循环中的CD4阳性T细胞的数量下降。
基于上述讨论发现，对于软骨的治疗和修复，包括损伤和/或疾病导致的软骨损伤非常有必要进行有效治疗。同时也始终有必要找到在获得治疗功效的同时减轻毒性和副反应(AE)的治疗方法。本发明满足这些需要，并同时提供了其它的优点，这从以下的详细描述中可明显体现。
发明概述本发明涉及通过给药需要治疗的哺乳动物有效剂量的LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂治疗TNF-α介导的疾病和/或LFA-1介导的疾病。
在上述方法的一个实施例中，TNF-α介导的疾病和/或LFA-1介导的疾病是关节疾病。
在上述治疗方法的特定实施例中，LFA-1介导的疾病或TNF-α介导的疾病是类风湿性关节炎，青少年慢性关节炎/早期RA，牛皮癣，移植物排斥(HvGD)，移植物抗宿主疾病(GvHD)，或多发性硬化症。
本发明也涉及治疗，修复和保护软骨的方法，包括退行性软骨病和/或损伤导致的软骨损伤。更具体地，本发明涉及治疗，修复和保护关节软骨的方法，该方法包含给药有效剂量的LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂。在进一步的实施例中，本发明涉及治疗退行性软骨病导致的软骨损伤的方法，该方法包含使所述软骨与有效剂量的LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂接触。选择地，软骨是关节软骨且包含在哺乳动物体内，给药需要治疗的患者有效量是指治疗有效量。选择地，退行性软骨病是骨关节炎或类风湿性关节炎。
在另一实施例中，本发明涉及治疗损伤导致的软骨损伤的方法，该方法包含使上述软骨与有效量的LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂接触。更具体地，所治疗的损伤是微损伤或钝损伤，一种软骨的骨折，或一种骨软骨的骨折。更具体地，软骨包含在哺乳动物，包括人体内，给予药物的剂量是治疗有效量。在另一实施例中，本发明涉及治疗损伤软骨的治疗方法或预防退行性软骨病和/或损伤导致的最初的或持续的软骨损伤的方法，该方法包含使上述软骨与包含LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂的有效量的组合物接触。该组合物可能进一步包含一种载体，赋形剂或稳定剂。或者，软骨存在于哺乳动物体内，给予药物的剂量是治疗有效量。组合物可通过静脉注射或灌输，动脉内，腹膜内，肌肉内，损伤部位内，关节内或局部给予哺乳动物，且给药剂量是治疗有效量。或者，将组合物直接注射到疾病累及的软骨部位或关节内。
在另一实施例中，本发明涉及一种治疗软骨损伤的方法或预防退行性软骨病和/或损伤导致的最初的或持续的软骨损伤的方法，该方法包含给药治疗有效量的包含LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂的缓释组合物。优选，软骨存在于哺乳动物体内，给予药物的剂量是治疗有效量。更具体地，缓释组合物包含LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂，将这些拮抗剂设计包装在微胶囊，固体疏水性多聚体，一种可降解的多聚体，或一种分散剂(例如，悬浮液或乳剂)中。更具体地，固体疏水性的多聚体半透膜是多乳酸共乙醇酸(poly-lactic-co-glycolic acid)(PLGA)，可降解的多聚体是交联的透明质酸(HA)。或者，缓释组合物进一步包含水溶性的多价金属盐。更具体地，多价金属盐包括由碱土金属和无机或有机酸形成的盐。
在另一实施例中，本发明涉及治疗软骨损伤的方法或预防损伤或退行性软骨病导致的最初的或持续的软骨损伤的方法，该方法包含使软骨与有效量的同有效量的软骨生长因子结合的LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂接触。选择地，软骨存在于哺乳动物体内，给予药物的剂量是治疗有效量。更具体地，软骨生长因子可能是胰岛素样生长因子(例如，IGF-1，IGF-2)，血小板来源的生长因子(PDGF)，骨形态形成蛋白(BMPs)，c-myc或Bcl-2表达的干扰剂或下调物，反意RNA或DNA或对相关的启动子区的阻断。选择地，软骨生长因子可能是提高软骨本身的代偿反应，例如通过增强软骨细胞的实际或潜在的增殖作用(例如，基本的成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF))，或通过细胞分化细胞循环促进因子例如IGF′s，TGF-ss和上皮生长因子(EGF)的强迫性的促进作用。选择地，软骨生长因子可以是拮抗软骨分解代谢的一种制品(例如，IL-I受体拮抗剂(IL-Ira)，NO抑制物)。
在另一实施例中，本发明涉及一种治疗软骨损伤的方法或预防最初的或持续的软骨损伤的方法，该方法包含使上述软骨与有效量的同有效量的软骨分解代谢拮抗剂结合的LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂接触。选择地，软骨是关节软骨，且包含在哺乳动物体内，每种药物的给药剂量是治疗有效量。
在另一实施例中，本发明涉及损伤所致的软骨损伤的治疗方法，该方法包含将上述软骨与有效量的同有效量的软骨分解代谢拮抗剂结合的LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂接触。更具体地，所治疗的损伤是微损伤或钝损伤，软骨骨折或骨软骨骨折。更具体地，软骨包含在哺乳动物，包括人体内，每种制剂给药的量是治疗有效量。
在本发明的另一实施例中还涉及一种预防有类风湿性关节炎遗传倾向或对类风湿性关节炎易感的受试对象体内的类风湿性关节炎发生或延迟其发作的方法，该方法是通过给药受试对象有效量的LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂实现的。在特定的实施例中，RA是青少年RA，且受试对象是青少年(年龄在16岁以下)。
LFA-1拮抗剂可使TNF-α拮抗剂药物以较低剂量使用便可以获得同样或更好的功效，而临床的副反应还有所下降。所以，本发明另一方面还提供了一种降低与给予LFA-1拮抗剂药物有关的副反应的方法，该方法是通过将LFA-1拮抗剂的剂量降低到最佳剂量以下或治疗剂量以下(即比推荐的治疗有效量低)，但LFA-1拮抗剂是与TNF-α拮抗剂联合给药。该方法的优点表现在对儿科患者的治疗中。由此，这项降低了与LFA-1拮抗剂的给药有关的副反应的方法涉及给予药物TNF-α拮抗剂，并且TNF-α拮抗剂的剂量是在治疗剂量以下。这种方法也能应用于降低与给予药物TNF-α拮抗剂有关的副反应，这是通过TNF-α拮抗剂和LFA-1拮抗剂的共同给药，其中TNF-α拮抗剂的给药剂量是在治疗剂量以下来实现的。在一个具体的实施例中，LFA-1拮抗剂是抗CD11a抗体，而TNF-α拮抗剂是etanercept。抗CD11a抗体hu1124和etanercept的治疗/最佳剂量在药物的产品说明书上可以找到。
本发明另一方面还提供了一种治疗类风湿性关节炎的方法，该方法是给药需要的患者有效量的LFA-1拮抗剂，TNF-α拮抗剂和氨甲喋呤。
在本发明的所有治疗方法的优选实施例中，LFA-1拮抗剂是一种抗CD11a抗体。更优选这种抗体对淋巴细胞是不耗竭的，具体地，这种抗体是非T淋巴细胞耗竭性抗体。抗CD11a抗体hu1 124是非T淋巴细胞耗竭性的抗体。在更具体的实施例中，抗CD11a抗体是人的或人源化的抗体或它们的抗体片段，最优选，在美国专利6,037,454号中公开和授权的人源化抗体hul124。在本发明的所有治疗方法的优选实施例中，TNF-α拮抗剂是一种免疫粘附素(immunoadhesin)，优选至少是TNF-α结合蛋白的一部分和免疫球蛋白的一部分的融合，更优选是TNF-α受体-IgG的Fc融合蛋白例如etanercept。在本发明的上述所有方法的特定实施例中，关节或软骨的疾病是类风湿性关节炎。
在另一实施例中，本发明涉及一种治疗试剂盒，该试剂盒在适当的包装中包含一种LFA-1拮抗剂和一种TNF-α拮抗剂和一种载体，赋形剂和/或稳定剂(例如，一种缓冲液)。
该试剂盒优选包含LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂治疗LFA-1或TNF-α介导的疾病的使用说明。或者，上述试剂盒可能包含应用LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂治疗退行性软骨疾病，例如类风湿性关节炎的使用说明。
在另一实施例中，本发明涉及一个产品的清单，包含一种容器；容器上的使用说明；和一种组合物，该组合物包含一种包含在容器中的活性制剂，其中，上述组合物对治疗退行性软骨疾病是有效的，容器上的使用说明指出上述组合物可用于治疗LFA-1或TNF-α介导的疾病。优选，上述活性制剂是一种LFA-1拮抗剂和一种TNF-α拮抗剂。
附图简述
图1显示LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂联合治疗在降低动物体内的临床关节炎的发病率方面的效果(参见实施例1)。
图2显示单独用抗鼠CD11a抗体(M17)或单独用TNF拮抗剂(Enbrel)对DBA-IlacJ小鼠进行治疗的效果，上述治疗效果以平均临床得分来表示(参见实施例2)。用盐水的治疗作为对照。
图3显示单独用抗鼠CD11a抗体(M17)，或用盐水(对照)对DBA-IJ小鼠进行治疗的效果，上述治疗效果以平均临床得分来表示(参见实施例2)。
图4显示用LFA-1拮抗剂(抗体M17)和TNF拮抗剂(Enbrel)进行联合治疗，与分别单独使用这两种拮抗剂进行治疗相比较，在降低DBA-IlacJ小鼠临床关节炎方面的有效性(参见实施例3)。
图5显示用LFA-1拮抗剂(抗体M17)和TNF拮抗剂(Enbrel)进行联合治疗，与分别单独使用这两种拮抗剂进行治疗相比较，在降低DBA-IJ小鼠临床关节炎方面的有效性(参见实施例3)。
优选实施方案详述1.定义与一种或多种治疗制剂“联合”给药包括以任何顺序同时和连续给药。
关于LFA-1或TNF-α的“拮抗剂”是指一种化合物，该化合物能直接或间接地，中和，降低或抑制LFA-1或TNF-α的生物活性或它们的受体的活化。
″ENBREL″(etanercept)是一种二聚体融合蛋白，该蛋白是由75kD(p75)的人肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合区与人IgG1的Fc区连接构成。Etanercept的Fc成分包含CH2功能域，CH3功能域和铰链区，但不包含IgG1的Cm功能域。Etanercept同肿瘤坏死因子(TNF)特异性结合，并阻断肿瘤坏死因子同细胞表面TNF受体之间的相互作用。因而，Etanercept抑制TNF的活性。
“生物学”活性是指由固有的或自然出现的分子，例如LFA-1或TNF-α所产生的生物学功能(或是抑制性的或是刺激性的)，而不是指上述分子充当抗原，产生针对本发明中固有的或自然出现的多肽分子上存在的抗原表位的抗体的能力。与此对应地，“免疫学”活性是指充当抗原，在针对抗原分子上存在的抗原表位产生抗体方面的能力。对LFA-1或TNF-α的一些生物学活性以背景资料的形式加以描述或说明书从头至尾都有描述。
本发明所用“载体”包括可药用的载体，赋形剂或稳定剂，上述物质在所用的剂量和浓度下对所接触的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲液例如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它的有机酸缓冲液；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子多肽(少于10个残基)；蛋白，例如血清白蛋白，凝胶或免疫球蛋白；亲水性多聚体例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，双糖或其它的碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山犁醇；成盐的反离子(salt-formingcounterions)例如钠；和/或非离子的表面活性剂例如TWEEN，聚乙二醇和PLURONICSTM。
本发明的“软骨生长因子”是指除LFA-1拮抗剂或TNF拮抗剂外的制剂，该制剂可使疾病得到改善或起到保护作用，使软骨在受到损伤或退行性软骨病的破坏时免除最初的或持续的软骨损伤。这种软骨生长因子包括胰岛素样生长因子(例如，IGF-I，IGF-2)，血小板来源的生长(PDGF)，骨形态生成蛋白bone morphogemc proteins(BMPs)，c-mvc或Bcl-2表达的阻断物或下调物，反意RNA或DNA或相关的启动子区的阻断。任选，软骨生长因子可以是提高固有的软骨修复反应的制品，例如通过增强实际的或潜在的软骨的增殖作用(例如，基本成纤维细胞生长因子(bFGF))，或通过细胞分化细胞周期促进因子(cell differentiation cell cycle progression factors)例如IGF′s，TGF-ss和上皮生长因子(EGF)的强加的促进作用。属于上述“软骨生长因子”的另一亚类分子是拮抗软骨分解代谢的制品或称“软骨分解代谢拮抗剂”。抑制，减弱或阻断与软骨损伤有关或加重软骨损伤的那些分子的活性或作用的制剂可定义为软骨分解代谢拮抗剂。例如，已知IL-1a和含氮氧化物(NO)与软骨损伤有关。所以，IL-1a(例如，IL-Ira)和NO产生的抑制剂被认为是“软骨分解代谢拮抗剂”。而且，软骨细胞的分解代谢拮抗剂(例如，戊聚糖多聚硫酸钠(sodium pentosan polysulfate)也被认为是软骨分解代谢拮抗剂。
“延续很长时间的”给药是指为了使开始时的治疗效果(活性)维持较长时间以连续的方式给予治疗制剂，这和急性给药的方式相反。
“间歇性的”给药是指不连续但不中断治疗，更确确地说是循环治疗。
“条件剂量”是一个减弱或降低初始剂量的副作用的发生频率和严重程度的剂量，上述副作用与治疗用化合物的给药有关。条件剂量可能是治疗剂量，亚治疗剂量，症状剂量或亚症状剂量。治疗剂量是对患者表现出治疗效果的剂量，亚治疗剂量是对所治疗患者不产生治疗效果的剂量。症状剂量是在给药后产生至少一项副作用的剂量，亚症状剂量是不产生任何副作用的剂量。
术语“LFA-1和/或TNF-α介导的疾病”是指由淋巴细胞上的LFA-1的细胞粘附作用或由TNF-α与TNF受体之间的结合作用，或者是上述两种原因所致的病理状态。有些疾病可能既涉及LFA-1的细胞粘附作用又涉及TNF-α的结合作用，所以，这些疾病可能是LFA-1和TNF-α共同介导的疾病。
骨关节炎(OA)和类风湿性关节炎(RA)包括在“关节软骨性疾病”的范围内。OA不只定义一种疾病，但多种多样的疾病过程导致的共同的最终的结果是关节损伤。OA的特点是局部的非对称的软骨损伤，与此相对应的是关节边缘可触摸到骨肿大。OA典型地侵犯手的指间关节，第一个腕掌关节，髋关节，膝关节，脊柱关节和在midfoot中的一些关节，然而大关节，例如踝关节，肘关节和肩关节往往不被侵犯。OA有时也与代谢性疾病例如血色沉着病和emochromatosis和尿黑酸尿，发育畸形例如髋关节发育不良(髋关节先天性脱臼)，肢体长度有差异，包括外伤和炎症性关节炎性皮疹例如痛风，脓毒性关节炎和神经性关节炎。
术语“退行性软骨疾病”是一些至少部分以身体的结缔组织结构，尤其是关节相关结构，包括肌肉，粘液囊(滑膜)，肌腱和纤维组织的退行性变或以代谢紊乱为特点的疾病的总称。这些疾病进一步表现疼痛，僵直和/或受影响的身体部位的活动受限。在一个实施例中，该术语包括“关节软骨疾病”，这种疾病的特点是平滑的关节软骨表面被破坏和软骨基质降解。除此之外的病理作用包括含氮氧化物的产生和蛋白聚糖的降解增加。
进一步地，术语“退行性的软骨疾病”包括系统性红斑狼疮，ennhematosus和痛风，淀粉样变性或Felty′s综合症。另外，该术语涵盖软骨退化和与以下疾病有关的软骨破坏，这些疾病是牛皮癣性关节炎，急性炎症(例如，耶尔森氏鼠疫杆菌关节炎，焦磷酸盐关节炎，痛风性关节炎(尿酸性关节炎)，脓毒性关节炎)，与外伤，炎症性肠道疾病(例如，溃疡性结肠炎，Crohn′s病，局限性肠炎，远端回肠炎，肉芽肿性肠炎，局限性回肠炎，末端回肠炎)有关的关节炎，多发性硬化症，糖尿病(例如，胰岛素依赖性的糖尿病和非胰岛素依赖性的糖尿病)，肥胖，巨细胞性关节炎和Sjogren′s综合症。可以用本发明的方法治疗的其它免疫性和炎症性疾病的实例包括青少年慢性关节炎和spondyloarthropathies。
类风湿性关节炎(RA)是一种系统性的，慢性的自身免疫性疾病，其特点是关节的对称性的滑膜炎和典型地侵犯小和大的相似的运动关节。随着RA的进展，出现的症状可能包括发热，体重减轻，皮肤变薄，多器官的累及，巩膜炎，角膜溃疡，皮下或骨膜下结节形成甚至过早死亡。RA的症状经常在青年时期出现并包括血管炎，皮肤和肌肉萎缩，皮下结节，淋巴结病，脾肿大，淋巴细胞减少症和慢性贫血。
术语“有效量”是指LFA-1拮抗剂和TNF拮抗剂的最小浓度，在此浓度下，LFA-1拮抗剂和TNF拮抗剂能引起可发觉的或可检测的软骨损伤的改善或修复，或在分离的软骨基质标本中可检测到它们对持续性的或诱发的软骨损伤的保护作用，例如，可抑制游离蛋白聚糖从软骨组织中释放。
“治疗有效量”是指给予哺乳动物药物LFA-1拮抗剂和TNF拮抗剂的最小浓度(量)，在该浓度下，LFA-1拮抗剂和TNF拮抗剂至少可减弱LFA-1和/或TNF-α介导的疾病的病理症状(例如，引起可发觉的/可检测的疾病的改善减小了症状的严重程度，范围或持续时间)。症状可因疾病的不同会有所变化；然而，特定疾病的症状和检测症状改善的方法对这一领域中技术熟练的医师来说是熟悉的。作为实例，RA和牛皮癣的症状在以下描述。例如，治疗有效量是能引起可发觉的/可检测的关节软骨损伤的改善或修复的剂量，或是能对损伤或退行性软骨疾病所致的持续的或最初的软骨破坏起到可检测的保护作用(运动范围改善，疼痛减轻，等等)的剂量。
在治疗人类的类风湿性关节炎(RA)时，评价疾病的范围或疾病的改善方面的标准包括例如，对患者软弱和肿胀的关节数目的评估，医师全面的评估(例如，从开始治疗起的3个月和6个月)，监测僵直，疼痛，功能增加的状况(例如，通过健康评估调查表)，残疾，结构破坏，和急性期反应物。优选，与对照或安慰剂治疗的患者相比，LFA-1拮抗剂和TNF拮抗剂能有效获得上述标准中至少一个标准的至少20％的改善，更优选至少30％，甚至更优选至少40％或50％，最优选至少75％的改善。或者，获得临床得分至少一级的改善，例如，本发明中Paulus标准被认为是有效的治疗。
残疾和急性期反应物在Felson.DT等，1993，The American College ofRheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity for Rheumatoid ArthritisClinical Trials.关节炎和风湿病36(6)729-740and Felson，DT等，1995.TheAmerican College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement inRheumatoid Arthritis.Disease，关节炎和风湿病38(40)1-9中教授。结构的破坏可以通过X光照像术评估，X光照像术能在有效的X光照像术指数例如Larsen或经修饰的Sharp指数的基础上揭示疾病的减速X-光的进展情况。人们也能通过X光照像术评估确定治疗是否阻止了新的关节侵蚀或减慢了疾病的进展。其它的方法也可以使用，例如核磁共振成像，超声技术和NMR。美国风湿病学院(ACR)反应标准或Paulus标准是众所周知的用于评估治疗类风湿性关节炎的药物有效性的标准。ACR标准是基于软弱的关节数目和肿胀的关节数目基础上的标准；(1)患者疼痛的评估，(2)患者全面的评估，(3)医师全面的评估，(4)患者对残疾的自我评估，和(5)急性期反应物(ESR或CRP)。Paulus标准依赖于至少以下4项的改善软弱的关节得分；肿胀的关节得分；早晨僵直；患者对疾病严重性的评估(5分范围)；医师对疾病严重性的评估(5分范围)；和ESR。
牛皮癣是另一种LFA-1和TNF-α介导的疾病。牛皮癣治疗的有效性可通过疾病的临床体征和症状的变化，包括牛皮癣的面积和严重程度指数监测。将(PASI)得分，医师对患者的全面评估与基线状态相比较。PASI得分的降低提示有治疗效果。牛皮癣疾病的活动性也能够根据全部损伤严重程度(OLS)的范围，牛皮癣侵害的身体表面的总面积(BSA)的百分数，和牛皮癣斑块的厚度确定。对于药物对牛皮癣损伤部位的淋巴细胞的作用可以通过皮肤的活组织检查进行研究。通过活检皮肤的组织学分析可以发现上皮增厚的消退，T细胞的浸润和病理性上皮增生的逆转。通过检测细胞介导的免疫反应(迟发型超敏反应性)，破伤风抗体反应和淋巴细胞亚群(流式细胞术)方面的治疗效果可以监测免疫反应的活动性。
对于哮喘，用本发明的方法治疗时，治疗效果的一个指标是对乙酰甲胆碱(methacholine)攻击的非特异性气道超反应性的降低(基础的和过敏原接触后的)。气道超反应性可通过FEV(一秒钟内从肺中强迫排出的气体量)来检测。
对于移植或移植物的存活和功能，治疗的有效性可以得到检测，例如，通过急性移植排斥的发病率，通过移植物的功能，和移植物存活的时间长度。
术语“延长的释放”或“持续的释放”的配方在最可能广的意义上是指活性LFA-1拮抗剂或TNF拮抗剂多肽的配方，应用该配方可使活性多肽的释放或活化的时间持续或延长或至少比它们在体内以天然或未经配方的状态释放或活化的时间长。任选地，延长的释放配方的释放比率恒定和/或活性多肽的浓度是相同和/或连续的。适当的延长释放的配方可能包含微胶囊，固体疏水聚合物的半透性基质，生物所能分解的聚合物，生物所能分解的水凝胶，悬浮液或乳浊液(例如，水包油或油包水)。任选地，延长的释放配方包含多聚乳酸共乙二醇酸(PLGA)，且能够按照下文中的描述制备用作药物发送系统的生物所能分解的聚合物M.Chasin & R.Langer，Ed.(Marcel Dekker，NewYork)，pp.1-41中的Lewis.“生物活性制剂丙交酯/乙交酯聚合物形式的控制释放”。任选地，延长的释放配方是稳定的，且LFA-1拮抗剂或TNF拮抗剂的活性经过长时间储存后无任何损失。更优选，上述稳定性可通过稳定剂例如水溶性的多价金属盐的存在得到提高。
术语“免疫粘附素”是指一种嵌合分子，该分子是配体结合部分，例如受体的细胞外功能域和一种免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域的融合。
对于二价的免疫粘附素，上述融合是配体结合部分与IgG分子的Fc区的融合。在特定的优选实施例中，免疫球蛋白的融合包括IgG分子的铰链区，CH2区和CH3区或IgG分子的铰链区，CH1区，CH2区和CH3区。有关免疫球蛋白的融合制备也可参见美国专利号5,428,130。本发明中所使用的术语“免疫粘附素”是指抗体样分子，该分子既具备了异种蛋白(粘合素)的结合特异性又具备了免疫球蛋白恒定区的效应功能。在结构上，免疫粘附素包含具备所要的结合特异性的氨基酸序列，该序列并不是抗体的抗原识别和结合部位(即是异种的)，和免疫球蛋白恒定区序列的融合。免疫粘附素分子的粘合素部分典型地是相近的氨基酸序列，至少包含受体或配体的结合部位。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定功能域序列可以来自任何免疫球蛋白，例如IgG-I，IgG-2，IgG-3或IgG-4亚类，IgA(包括IRA-1和IgA-2)，IgE，IgD或IgM。
“脂质体”是一种小囊，由各种脂质，磷脂和/或有利于药物发送给哺乳动物的赋形剂。脂质体的成分通常被设计成双层形式，这与生物膜的脂质排列形式相同。
治疗所使用的“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人，家养的和农用的动物，和动物园和体育用动物，或宠物，例如狗，马，猫，牛，等。优选，哺乳动物是人。
退行性软骨疾病的“病理学”包括所有的危及患者健康的生理学现象。这包括，但不限于，软骨的破坏，软骨修复能力的减弱，异常或不能控制的细胞生长，抗体的产生，自身抗体的产生，补体的产生和活化，对邻近细胞功能的干扰，细胞因子或其它分泌性物质出现异常水平的释放，任何炎症或免疫反应的抑制或加重，炎症细胞(嗜中性粒细胞，噬酸性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞)浸润到组织间隙，等等。
本发明中定义的“小分子”其分子量在600道而顿以下，且通常是有机化合物。
“固相”是指非液态的基质，对此本发明中的化合物能粘附。包含在本发明中的固相实例包括那些部分或完全由玻璃，(例如限制了孔径的玻璃)，多糖(例如，琼脂糖)，聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯乙醇和硅树脂形成的固相。在某些实施例中，依照上下文的描述，固相可包含检测板的各孔；在另一些实施例中，它是指纯化柱(例如，亲和层析柱)。术语固相也包括不连续粒子的不连续固相，例如在美国专利4,275,149.号中所描述的那些固相。
“治疗”是基于预防疾病的发生或改变疾病的病理的目的所进行的干预。所以，“治疗”既指治疗性的处理又指预防性的措施，其目的是预防，减慢或减弱症状的严重程度，范围或持续时间，或延迟被靶向的病症或疾病的发作(例如，在由于基因修饰或其它的危险因素有产生RA倾向的受试对象体内)。“治疗”疾病，病症或细胞群包括急性短期和慢性长期基础上的治疗性和预防性处理。需要治疗的患者包括那些已经患病和那些需要预防患病的患者。如果所进行的治疗产生了可发觉的或可检测的至少一种所治疗的LFA-1和/或TNF-α介导的疾病的至少一种症状的改善，说明该治疗是成功的(与上述“治疗有效量”的定义一致)。在对退行性软骨病的治疗过程中，治疗剂可以直接降低或增加疾病的病理成分的反应强度，或通过其它的治疗剂，例如，抗生素，抗真菌，抗炎症制剂，化学疗法等，使疾病更容易受到治疗的影响。
II.实施本发明的方式A.拮抗剂适当的LFA-1拮抗剂包括任何可抑制LFA-1与它们的受体，尤其是ICAM的相互作用的化合物。例如，LFA-1拮抗剂可能是小分子，肽，蛋白，免疫粘附素，抗LFA-1抗体，或它们的片段。这些术语是指直接指向CD11a或者CD18，或者它们两者的拮抗剂。抗CD11a抗体包括，例如，MHM24[Hildreth等，欧洲免疫学杂志13202-208(1983)]，R3.1(IgGI)[R.Rothlein，Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.Inc.Ridgefield.CT]，25-3(或25.3)，IgG1可从Immunotech France获得[Olive等，in Feldmann.ed.人T细胞克隆，一种免疫的新方法Reoulation.Clifton.NJ.Humana.1986 p.173].KBA(IgG2a)[Nishimura等，细胞免疫学，10732(1987)；Nishimura等，ibid，94122(1985)]，M7/15(IgG2b)[Springer等，免疫学研究68171(1982)]，10T16[Vermot Desroches等，斯堪的那维亚免疫学杂志Scand.J.Immunol.33277-286(I991)]，SPVL7[Vermot Desroches等，同上]，和大鼠抗小鼠CD11a抗体M17(IgG2a)，可从ATCC获得。优选的抗体是美国专利6,037,454号中描述的人源化的抗CD11a抗体。通常也优选抗CD11a抗体不是T细胞耗竭性的抗体，即，给予药物抗CD11a抗体不降低循环T细胞的水平。
抗CD18抗体的实例包括MHM23[Hildreth等，同上]，M 18/2(TgG2a)[Sanches Madrid等，实验医学杂志158586(1983)]，H52[Fekete等，J.Clin.Lab Immunol.，31145-149(1990)].Mas 191c[Vermot Desroches等，同上].IOT18[Vermot Desroches等，同上].60.3[Taylor等，临床实验免疫学杂志71324-328(1988)]，和60.1[Campana等，欧洲免疫学杂志16537-542(1986)].也可参照美国专利5997867号。适当的LFA-1结合分子的其它实例，包括在以下专利中描述的抗体Hutchings等，同上WO 98/51343，WO 91/18011，WO 91/16928.WO 91/16927，加拿大专利申请号2 008 368，WO 90/15076，WO 90/10652，WO 90/13281.WO 93/06864.WO 93/21953.EP 387668，EP 379904，EP 346078，US 5932448，US 5622700，US 5597567，US 5071964，US5002869，US 5730983.澳大利亚专利申请号8815518，FR 2700471A，EP289949，EP 362526和EP 303,692.本发明中所使用的LFA-1结合抗体优选在美国专利6037454号中公开的抗体。
适当的TNF-α拮抗剂包括抑制TNF-α与它的受体，尤其是p55受体和p75受体的相互作用的任何化合物。例如，TNF-α拮抗剂可能是小分子，肽，蛋白受体细胞外功能域，免疫粘附素或抗TNF-α抗体。
TNF-α拮抗剂包括ENBREL.etanercept(Immunex/AHP)；RemicadeInfliximab.它是抗TNF嵌合Mab(Centocor/Johnson & Johnson)；抗TNFα，D2E7人Mab(Cambridge Antibody Technology)；CDP-870，它是PEG化的抗体片段(Celltech)；CDP 571，Humicade.其是人源化的Mab(Celltech)；PEG化的可溶性的TNF-α受体(Amgen)；TNF结合蛋白TBP-1(AresSerono)；抗TNF-α多克隆抗体PASSTNF-alpha(Verigen)；AGT-I(来自Advanced Biotherapy Concepts)，它是三种抗细胞因子抗体，抗IFN-α，IFN-y和TNF抗体的混合物；TNFR-Ig融合蛋白TENEFUSE.lenercept(Roche)CytoTAb(Protherics)小分子TNF-α转化酶抑制物TACE(Immunex)小分子TNFmRNA合成抑制物(Nereus)；PEG化的p75 TNFR Fc突变蛋白(Immunex)和TNF-α反义抑制物。
分子克隆已显示存在两种不同类型的TNF受体(TNFR)，它们有明显不同的分子质量55kD(1型)(Schall等，(1990)细胞61361)和75kD(2型)(Smith等，(1990)科学2481019)。上述每一种受体自然地同TNF-α和TNF-β两者结合(Loetscher等，(1990)细胞61351Shall等，(1990)细胞，61361Kohno等，1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878331)。上述两种受体的细胞外部分在自然状态下是可溶性的TNF结合蛋白(Kohno等，同上)。可以阻断TNF在各种免疫和炎症反应中的有害作用的拮抗剂已经制备出来(Peppel等，(1991)实验医学杂志1741483-1489Ulich(1993)美国病理学杂志14213351338Howard.O.M.Z..(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902335-2339Wooley，P.H.，(1993)免疫学杂志1516602-6607).上述一类拮抗剂将人55 kD1型的TNFR的细胞外功能域同人免疫球蛋白G1重链的铰链部分和Fc区结合(Werner等，(1991)细胞生物化学杂志第20次年会摘要，p.115)。上述另一类拮抗剂(Mohler等，(1993)免疫学杂志1511548-1561)将75kD 2型TNFR的细胞外功能域同人免疫球蛋白G1重链的铰链部分和Fc区结合。美国专利5,482,130号和美国专利5,514,582号描述了这些分子。这些分子中的任何一个分子都可以用作本发明的TNF-α拮抗剂。TNF-α拮抗剂的其它实例包括如下专利中公开的抗TNF-α抗体美国专利5,795,967；WO 97/29131号(此专利公开重组人抗体和用噬菌体技术制备的抗体)；美国专利5,654,407号和美国专利5,994,510号(它们公开人抗TNF-α抗体)；WO 92/11383和WO 92/16553(它们公开嵌合的，包括人源化的抗体)；美国专利5,656,272号；美国专利5,919,452号；美国专利5,698,195号(它们公开嵌合的抗体)；和Fendlev等，1987.杂交瘤6359和Bringman等，1987.杂交瘤6489(它们公开另外的抗TNF-α抗体)。适当的TNF-α拮抗剂的其它实例包括至少包含TNF-α受体的TNF-α结合部分的免疫粘附素。例如，优选的免疫粘附素在美国专利5,605,690号和美国专利5,712,155.号中公开。其它的适当的TNF-α拮抗剂在美国专利5,482,130号；美国专利5,514,582号；美国专利5,336,603号和美国专利5,565,335号中描述。
其它的适当的TNF-α拮抗剂包括能降低组织中TNF-α水平的化合物，包括在如下专利中公开的化合物美国专利5,994,510号；美国专利5,985,620号；美国专利5,981,701号；美国专利5,594,106号；美国专利5,629,285号和美国专利5,945,397号。
在另一实施例中，TNF-α拮抗剂是TNF-α受体-IgGFc融合蛋白，例如ENBREL(Immunex)和LFA-1拮抗剂是抗CD11a抗体，优选上述拮抗剂是非T细胞耗竭的抗CD11a抗体，例如hu1124(XOMA/Genentech)。LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂可以这些化合物常规使用的剂量给药。这些化合物可以大约1∶1000到大约1000∶1，或大约100∶1到大约1∶100，或大约1∶10到大约10∶1的摩尔比给药，或以大约1∶5到大约5∶1的比例，或者甚至以大约1∶1的比例给药。
B.给药可用已知方法向哺乳动物联合给药本发明的化合物，如静脉给药(例如作为大丸剂给药或通过持续输注一段时间而给药)等，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、损伤处、关节内或吸入途径(鼻内、肺内或气雾化)以及通过持续释放或延迟释放的方式给药。或者直接将所述活性化合物或制剂注射入患病软骨区或关节内。
在给药(单独或联合)LFA-1拮抗剂和TNF拮抗剂时，根据给药途径，各个化合物的剂量总量在每天10ng/kg哺乳动物体重到100mg/kg哺乳动物体重(或更多)之间，优选1μg/kg/天到10mg/kg/天。在针对各个化合物的相关文献中报道了对具体剂量以及给药方法的指导。例如，通常建议ENBREL的成人给药剂量为25mg，每周两次(至少间隔72-96小时)，皮下注射给药。在一个病例中，成人的ENBREL给药剂量达到62mg(每周两次，皮下(sc)给药，给药三周)，并且没有出现副作用(见PDR)。对于4-17岁的患有活动性多关节儿童类风湿性关节炎的儿童患者，ENBREL的建议给药剂量为0.4mg/kg(最高可达25mg每剂量)，每周两次(间隔72-96小时)，皮下注射给药。在用ENBREL治疗期间，可以继续给药氨甲蝶呤(见上述Weinblatt等，1999年1月28日；Mani等，1998)、糖皮质激素、水杨酸盐、非类固醇抗炎药(NSAIDs)、或止痛药。LFA拮抗剂人源化抗CD11a抗体hul 124的给药剂量可在0.3mg/kg到6mg/kg之间。LFA-1拮抗作用可降低TNF拮抗药的用量(反之亦然)而获得相同或更佳的疗效，而且还减少临床上的副作用，包括但不限于发烧、寒战、感染、败血症和贫血。因此，在本发明的治疗方法中，可以减少所述两个或其中一个拮抗剂的剂量，从而使任何毒副作用达到最小，这些毒副作用可在给药各个拮抗剂单独用药的正常或建议剂量时出现。例如，在本发明治疗方法中，尤其在青少年患者的治疗中(例如青少年RA)联合用药时，可以减少上述ENBREL和hul 124的剂量。
本发明化合物的合适的剂量取决于所要治疗的疾病类型(如上所述)，疾病的严重程度和病程，给药所述药物是否是为了预防或治疗，以前的治疗，患者的临床病史和对化合物的应答，以及主治医生的判断。确定给药的适当剂量或给药途径是普通医生的技术。动物实验为确定人类治疗的有效剂量提供了可靠的指导。物种间有效剂量的换算可以按Mordenti.J和Chappell.W(“毒理动力学中物种间换算的应用”，见毒理动力学和新药开发，Yacobi等，Eds.Pergamon Press，纽约，1989，pp.42-96)提出的原则进行。
可以根据任何适合于治疗所述疾病或病情的时间方案来给药所述剂量。例如，为了达到所需的治疗效果并减少毒副作用，所述剂量可以在每天、每周、每两周或每月给药。在一次或一系列的治疗中，向患者适当地给药所述化合物。可以在所述疾病发展之前、期间或之后给药所述剂量。例如，为了防止宿主对移植物或移植物对宿主的排斥反应，可以在进行移植之前、期间或之后给药最初剂量。对给药治疗性化合物有常规技术的医生，通过在本发明方法之内常规调节给药方案，可轻易的确定具体的时间方案。
给药方案可以包括给药两个或其中一个拮抗剂的初次调整(conditioning)剂量，之后再次给药拮抗剂的更高或治疗剂量，从而使哺乳动物能忍受逐渐增加的或更高剂量的所述药用化合物。该给药方案可以减少副作用(在开始给药并且随后给药药用化合物时产生的副作用)的发生率(见WO0056363)。虽然一些副作用，例如发烧、头痛、恶心、呕吐、呼吸困难、肌痛、寒战和血压变化等，仍然可以出现，但是相对于利用传统给药方案(例如每天给药相同剂量的药用化合物)给药，可以减少这些副作用的频率和严重程度。
例如，根据疾病的类型和严重程度，本发明各个化合物向患者给药(例如通过一次或多次单独给药或者连续输注)的起始候选剂量是大约1μg/kg到15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)。典型的每日给药剂量的范围可 以为lìig/kg到100mg/kg(或更多)，这取决于上文所述的因素。大约0.1-30mg/kg的优选剂量对于其本身是抗体或其片段的拮抗剂尤其有效。对于根据病情重复给药超过几天(或更长)的情况，持续所述治疗，直至产生所需的疾病症状的抑制。然而，也可以应用其它剂量方案。通过传统的技术和检测，可容易的监控该治疗的进展。所述这些化合物可以同时或先后或联合给药。例如，可以首先给药TNF-α拮抗剂，然后给药LFA-1拮抗剂。或者，首先给药LFA-1拮抗剂，然后给药TNF-α拮抗剂。在单个疗程治疗期间，可以在几天(2-4天)或几周(2-6周)的时间里每天或每隔一天给药所述化合物。如上所述，可以重复给药几个疗程，直至产生所需的疾病症状的抑制。
可以预计，不同的制剂对不同的治疗和不同的病症是有效的，而且以治疗特殊器官或组织为目的的给药，可能需要用与其它器官和组织不同的方式进行给药。ENBREL是以无菌、白色、无防腐剂、冻干的粉末形式提供，在用1ml所提供的注射用无菌抑菌水(USP，含0.9％苯甲基醇)溶解之后，用于胃肠道外给药。
在一个实施方案中，相对于单独用任何一种化合物进行的治疗，给药LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂可改善对LFA-1介导的或TNF-α介导的病症的治疗。也就是说，相对于对照，用这两种化合物联合治疗可使疾病或紊乱症状的发病率降低，例如，与用任何一种化合物单独给药时疾病或病症发病率的下降(相对于对照)相比，它的发病率更低。在对LFA-1介导或TNF-α介导的病症进行的治疗中，此提高的疗效说明本发明化合物可产生协同作用。对于LFA-1拮抗剂(例如抗CD11a抗体，其不消耗T细胞)，该协同作用尤其令人吃惊。
所述LFA-1拮抗剂和TNF-拮抗剂可以与其它治疗同时给药。例如，对于正在进行RA治疗的患者，可以将这两种化合物与传统的用于治疗RA的药物(例如氨甲蝶呤、糖皮质激素、水杨酸盐、非类固醇抗炎药(NSAIDs)、或止痛药)联合(或另外)给药。
C.组合物本发明化合物可以以药用组合物的形式给药，用于治疗LFA-1和TNF-a介导的病症。另外，也可以利用lipofections或脂质体将LFA-1拮抗剂或TNF拮抗剂传递到细胞和靶区域。
根据本发明使用的活性分子的药用制剂通过将具有所需纯度的抗体与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(雷氏药学(Remington’s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.编(1980))混合而制备，然后以冻干剂或含水剂的形式保存。可药用载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkonium chloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如吐温TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过在冻干或溶解之前或之后进行除菌滤膜过滤而轻易实现。通常将本文所述药用组合物置于具有无菌存取口的容器中，例如静脉内注射溶液袋，或具有可用皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶。
在本发明中所应用的制剂还可根据所治疗的具体情况而包含一种以上活性成分，优选具有互补活性但相互无负面影响的那些。或者(或另外)，所述组合物可进一步包括细胞毒性药、细胞因子、生长抑制剂。这些分子以对所需目的有效的总量在组合中适当地存在。
所述LFA-1拮抗剂或TNF-α拮抗剂分子也可容纳在通过凝聚技术或界面聚合作用制备的微胶囊中，如分别在羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(异丁烯酸甲酯)微胶囊。这些制剂可以通过胶体药物运送系统(如脂质体，白蛋白小球体，微乳剂，纳米颗粒及纳米胶囊)或大乳剂(macroemulsions)而给药。这些技术见雷氏药学，第16版Osol，A.编(1980)。
在需要LFA-1拮抗剂或TNF-α拮抗剂持续释放或延迟释放给药的情况下，具有与对需要这类多肽给药的任何疾病或病症进行治疗相适应的释放特性的制剂考虑了微包装(microencapsulation)。用于持续释放的重组蛋白的微包装已经在人生长激素(rhGH)、干扰素-α、-β、-γ(rhIFN-α，-β，-γ)、白介素2和MN rgp120等蛋白中成功进行。Johnson等，自然医学2795-799(1996)；Yasuda.生物医学治疗.271221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technology 8755-758(1990)；Cieland，“利用聚丙交酯聚乙交酯微球体系统设计和制备单免疫疫苗”，见疫苗设计亚单位和佐剂方法，Powell和Newman，eds.(Plenum Press纽约，1995)，pp.439-462；WO97/03692，WO 96/40072，WO 96/07399和美国专利5654010。
持续释放制剂的适当实例包括含所述活性分子的固体疏水性半渗透基质，该基质为成型的产品，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括一种或多种聚酐(例如USP 4891225；4767628)，聚酯(例如聚乙交酯)，聚丙交酯-共-乙交酯(例如USP 3773919；USP 4767628；USP 4530840；Kulkami等，Arch.Surg.93839(1996))，聚氨基酸(例如聚丝氨酸)，聚乙烯氧、聚乙烯氧丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯酯、聚酰胺、聚氨基甲酸乙酯、聚邻位酯、聚乙酰齐墩果酸、polyphosphazenes和聚酯水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、纤维素、酰基替代纤维素乙酸盐、非降解性聚氨基甲酸乙酯、聚苯乙烯、聚乙烯醇氯化物、聚乙烯醇氟化物、聚(乙烯咪唑)、chlorosulphonate聚烯烃、聚乙烯氧的多聚体或共聚体，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸盐的共聚体，非降解性乙基醋酸乙烯酯，降解性乳酸-羟乙酸共聚体(例如LUPRON DEPOTTM(含乳酸-羟乙酸共聚体和亮丙瑞林乙酸盐的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸)。虽然如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-羟乙酸等多聚体可以释放分子超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白的时间较短。可以使用的其它非生物降解性多聚体为聚乙烯，聚乙烯吡咯烷酮，乙烯乙酸乙烯酯，聚乙烯乙二醇，醋酸纤维素丁酸盐和醋酸纤维素丙酸盐。
或者，持续释放制剂可以包括降解性生物基质。由于其生物相容性、对特殊降解反应的高度应答性以及可容易地将活性药物并入所述生物基质等特点，生物降解性多聚体是诱人的药物制剂。例如，透明质酸(HA)可以被交联并用作为可膨大的用于生物物质的多聚体传递载体。USP 4957744；Valle等，Polym.Mater.Sci.Eng.62731-735(1991)。结合聚乙烯乙二醇的HA多聚体还可制备成改进的传递基质，其降低了所不希望的药物渗漏和与在生理条件下长期保存有关的药物变性。Kazuteru.M，J.Controlled Release 5977-86(1999)。可用的其它生物降解性多聚体是聚(己内酯)，聚酐，聚氨基酸，聚邻酯，聚氰基丙烯酸酯，聚(膦嗪)，聚磷酸二酯，聚酯酰胺，polydioxanone，聚乙缩醛，聚酮缩醇，聚羧酸酯，聚邻羧酸酯，降解性和非毒性聚氨基甲酸乙酯，聚羟基丁酸酯，聚羟基戊酸酯，聚亚烷基草酸酯，聚亚烷基琥珀酸酯，聚(马来酸)，甲壳质和壳聚糖。
或者，可以将生物降解性水凝胶用作为生物物质和药物的控释传递载体。通过适当的选择macromers，可以生产具有适合于各种生物分子的渗透力范围、孔径大小和降解速率的膜。
或者，用于生物物质和药物的持续释放传递系统可以包括分散剂。分散剂可以进一步分为悬浮剂或乳剂。作为传递生物物质的载体，悬浮剂是非常小的固体颗粒的混合物，其分散于(较均匀的或不均匀的)液体媒介中。所述悬浮剂固体颗粒的大小范围从几纳迷到几百微米，该固体颗粒包括微球体、微胶囊和nanosphere。另一方面，乳剂是两种或多种不相溶液体的混合物，其在少量乳化剂的作用下保持悬浮状态。乳化剂在不相溶液体之间形成界面膜，其也被称为表面活性剂或清洁剂。乳剂可以将油悬浮水中，其中当油或脂肪被分散时，水是连续相，也可以将水悬浮于油中，其中当水被分散时，油是连续相。在WO 97/25563中公开了一个适当的持续释放制剂的实例。另外，用于生物物质的乳剂包括多乳剂，巨乳剂，微滴和脂质体。微滴是单层磷脂载体，其由球型脂层和其内的油相组成。例如，USP 4622219和USP4725442。脂质体是通过将不溶于水的极性磷脂与水溶液相混合而形成的磷脂载体。
或者，可以利用聚-乳酸-共-羟乙酸(PLGA)(具有高度生物相容性和广泛的生物降解特性的多聚体)，开发LFA-1拮抗剂或TNF-A拮抗剂的持续释放制剂。PLGA的降解产物乳酸和羟乙酸可以迅速从人体中清除。而且，该多聚体的降解能力可以调节，从几个月到几年，这取决于其分子量和组成。详细内容见Lewis，“生物活性药物从乳酸/乙交酯多聚体中的控释”，Biogradable Polymers as Drug Delivery Systems，M.Chasin和R.Langeer，editors(Marcel Dekker，纽约，1990)，pp.1-41。
当包装在胶囊中的肽在体内长时间停留时，由于暴露于37℃潮湿环境中，这些多肽可能发生变性或聚集，导致生物活性丧失，并且可能改变其免疫源性。可以根据所涉及的机制设计合理的策略。例如，如果发现聚集机制是分子间S-S键形成(通过硫-二硫化物互换)，那么可以通过修饰sulfhydryl残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、应用适当的添加剂和开发特殊的多聚体机制组合物的方法，获得稳定性。
可以通过将所述多肽与“水溶性多价金属盐”(其在释放浓度和温度条件下下无毒性)制成制剂，来给药(impart)包装在胶囊中的所述多肽或延迟释放制剂中的所述多肽。“多价金属”的实例包括碱土金属(例如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+、Sn4+、Al2+和Al3+)。可与上述多价金属阳离子形成水溶性盐的阴离子的实例包括那些可形成无机酸或有机酸的阴离子。所述水溶性盐在水中的溶解度为至少20mg/ml，或者100mg/mml，或者200mg/ml。
能够用于形成“水溶性多价金属盐”的适当的无机酸实例包括盐酸、硫酸、硝酸、硫氰酸和磷酸。可应用的适当的有机酸实例包括脂肪族羧酸和芳香酸。该定义范围内的脂肪酸可以是饱和的或不饱和的C2-9羧酸(例如脂肪族一元-、二元-、三元-羧酸)。例如，在该定义范围内一元羧酸的实例包括饱和C2-9一元羧酸乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和癸酸，不饱和的C2-9一元羧酸丙烯酸、甲基丙烯酸、巴豆酸和异巴豆酸。二元羧酸的实例包括饱和的C2-9二元羧酸丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不饱和C2-9二元羧酸包括马来酸、延胡索酸、柠康酸和乌头酸。三元羧酸的实例包括饱和C2-9三元羧酸三羧酸和1，2，3-丁烷三羧酸。另外，该定义的羧酸还包括一个或两个羟基基团，以便形成羟基羧酸。羟基羧酸的实例包括羟基乙酸、乳酸、甘油酸、羟基丙二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸。该定义范围之内的芳香酸包括苯甲酸和水杨酸。
通常使用的水溶性多价金属盐(其可用来帮助稳定本发明的包装在胶囊中的多肽)包括，例如(1)卤化无机酸金属盐(如氯化锌、氯化钙)、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫氰酸盐；(2)脂肪羧酸金属盐乙酸钙、乙酸锌、丙酸钙、甘醇酸锌、乳酸钙、乳酸锌和酒石酸锌；(3)苯甲酸和水杨酸的芳香族羧酸金属盐(例如苯甲酸锌)。
D.治疗应用考虑了本发明化合物可以用于治疗LFA-1和/或TNF-α介导的各种疾病或病症，这些疾病包括退化性软骨病(例如类风湿性关节炎)，儿童慢性关节炎(例如多关节儿童类风湿性关节炎(JRA))和椎关节病。对于氨甲蝾呤耐受或不能忍受氨甲蝶呤的RA患者，也可以用本发明的LFA-1和TNF-α拮抗剂进行治疗类风湿性关节炎(RA)是慢性、全身性自身免疫炎性疾病，主要累及多关节的滑膜，导致关节软骨受损。发病机制为T淋巴细胞依赖性，并且与类风湿因子(针对自身IgG的自身抗体)的产生有关，导致免疫复合物的形成，其在关节液和血液中可达到很高水平。这些关节中的复合物可以诱导淋巴细胞和单核细胞显著浸润到滑膜中，随后引起明显的滑膜改变关节腔隙/液中被类似细胞以及中性粒细胞浸润。累及的组织主要是关节，通常为全身性。然而，也可以发生两种主要形式的关节外疾病。一种形式是关节外损伤的发展与关节疾病的持续进展，以及肺纤维化、血管炎和皮肤溃疡的典型损伤。第二种关节外疾病的形式也被称为Felty’s综合症，它在RA病程的晚期发生，有时在关节疾病的静止期发生，该综合症还出现中性粒细胞减少、血小板减少和脾肿大等症状。其可伴随发生多器官的血管炎并可形成梗死、皮肤溃疡和坏疽。通常在患者的膜皮下组织中可形成类风湿小结，覆盖受累关节；在后期小结中具有坏死中心，被渗透的混合炎症细胞所包围。可发生的其它临床表现包括心包炎、胸膜炎、冠脉炎、拌有肺纤维化的肺炎、干燥性角结膜炎和类风湿小结。
儿童慢性关节炎是慢性特发性炎症性疾病，通常在不到16岁时开始发病。其表型与RA有一些相似；一些类风湿因子阳性的患者被分类为儿童类风湿性关节炎。该疾病进一步分为三种亚型少关节型、多关节型和全身性。关节炎病情可很严重，而且通常具有破坏性，导致关节僵硬并阻滞生长。其它临床表现包括慢性前眼色素层炎和全身性淀粉样变性。
退化性软骨关节炎(OA)是局限性退化性疾病，它可累及关节结构并导致疼痛和功能衰退。OA的特点是软骨表层内充气(pertubations)，随后出现裂口和纤维化，最终导致丧失整个软骨层厚度。OA的其它症状包括关节周围骨的钙化外生和伴随非对称性软骨损伤的外形损伤。OA可以分为两种类型原发和继发。原发OA是指基本病因没有明确的退化性关节疾病。通常，原发性OA累及的关节是手的指骨间关节，第一腕掌关节，髋关节，膝关节，脊柱和足中部(midfoot)的一些关节。有意思的是，在原发OA中，大关节(例如踝关节，肘关节和肩关节)并不易受累。相反，继发OA源自局限损伤。继发性OA通常与代谢性疾病(例如血色素沉着症和尿黑酸尿症)、发育异常(例如髋关节的发育不良(先天性髋关节脱位)和肢长差异(limb-lengthdescrepancies)(包括创伤))炎症性关节炎(例如类风湿性关节炎或痛风，脓毒性关节炎和神经病性关节炎)相关。
软骨的损伤分为三类(1)微损伤或顿伤，(2)软骨骨折和(3)骨软骨骨折。
软骨细胞和软骨基质的微损伤可由单次碰撞或反复的顿伤引起。软骨骨折的特点是关节表面的破坏，但不侵犯软骨下层。在受伤区域发生软骨细胞坏死，随后存活的软骨细胞的有丝分裂和代谢增加，在受伤后几天之内使患处形成边界。在这之后，纤维组织排列于表面的裂口上。在受伤大约2周之后，细胞外基质组分和II型胶原的合成增加，在这之后，合成代谢恢复正常。然而，由此引起的有丝分裂和代谢活性以及修复应答活性的短暂增加并不是最佳反应——其导致纤维软骨的形成。在三种损伤类型中最严重的是骨软骨骨折，其损伤穿过tidemark或基底软骨下盘。在这种类型的损伤中，软骨下脉管系统(vasculature)的出现可诱导在血管组织常见的三相反应(1)坏死；(2)炎症；(3)修复。在最初，患处充满血液和血凝块，产生的纤维蛋白凝块激活炎症应答，并形成血管化的修复组织，而且各种细胞组分释放生长因子和细胞因子，包括转化生长因子β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、骨形蛋白和胰岛素样生长因子。Buckwalter等，J.Am.Acad.Orthop.Surg.2191-201(1994)。
椎关节病是具有共同临床特点并与HLA-B27基因产物相关的一组病症。所述病症包括强直性脊椎炎，Reiter’s综合症(反应性关节炎)，与炎症性肠疾病相关的关节炎，牛皮癣有关的脊椎炎，儿童期发病的椎关节病和未分类的椎关节病。特并性特点包括伴随或不伴随脊椎炎的骶髂炎；炎症性不对称性关节炎；与HLA-27(MHC I类HLA-B等位基因的血清学定义)的相关性；眼感染和与其它类风湿疾病相关的自身抗体的缺陷。在诱导所述疾病中提示起关键作用的细胞是CD8+T淋巴细胞，该细胞通过MHC I类分子参与抗原递呈。CD8+T淋巴细胞可以与MHC I类等位基因HLA-B27发生反应，将其看作通过MHC I类分子表达的外源肽。有假说认为HLA-B27的表位可以模拟细菌或其它微生物的抗原表位，因此可诱导CD8+T细胞应答。
可以用本发明的联合治疗进行治疗的其它LFA-1和/或TNF-α介导的疾病和病症包括(1)TNF-α介导的疾病和病症，例如(A)急性和慢性免疫和自身免疫病，如系统性红斑狼疮(SLE)，类风湿性关节炎，甲状腺炎，移植物抗宿主疾病，硬皮病，糖尿病，Graves’s疾病等；(B)感染，包括但不限于由急性或慢性细菌感染、急性或慢性寄生虫感染和/或感染性疾病、细菌、病毒或酵母引起的脓毒血症、恶病质、循环衰竭和休克，例如HIV感染，即AIDS(包括恶病质症状，自身免疫病，AIDS痴呆复征和感染)；(C)炎症性疾病，例如慢性炎症性疾病和血管炎症性疾病，包括慢性炎症性病(例如结节病，慢性炎症性肠病，溃疡性结肠炎和Crohn’s病)和血管炎症性病(包括但不限于弥散性血管内凝血，动脉粥样硬化和Kawasaki’s病)；(D)神经退化性疾病，包括但不限于脱髓鞘性疾病，如多发性硬化，急性横贯性脊髓炎；椎体外和小脑疾病，例如皮质脊髓系统损伤；基底神经节疾病或小脑疾病；运动机能亢进性运动障碍，例如Huntington’s舞蹈病和老年舞蹈病；药物诱导的运动障碍，例如由药物诱导的阻断CNS多巴受体的那些运动障碍；运动功能衰退性运动障碍，例如Parkinson’s病；进展性上神经原麻痹；小脑或脊髓小脑障碍，例如小脑的非结构性(astructural)损伤；脊髓小脑退化(脊髓共济失调，Freiedreich’s共济失调，小脑皮质退化，多系统退化(Mencel，Dejerine-Thomas，Shi-Drager和MachadoJoseph))；全身性疾病(Refsum’s病，无β脂蛋白血症，共济失调，毛细管扩张和线粒体性多系统疾病))；脱髓鞘核心病(demyelinating core disorders)，例如多发性硬化，急性横贯性脊髓炎；运动神经单位的疾病，例如神经源性骨骼肌萎缩(前角细胞退化，例如肌萎缩性侧面硬化，婴儿脊髓肌萎缩和儿童脊髓肌萎缩)；Alzheimer’s病；Down’s综合症；慢性酒精中毒；Creutzfeldt-Jakob病；亚急性硬化性全脑炎，Hallerrorden-Spatz病；和拳击员痴呆或任何其亚群；(2)LFA-1介导的疾病或病症，例如T细胞炎症性应答(例如炎症性皮肤疾病，包括牛皮癣)；与炎症性肠疾病相关的应答(例如Crohn’s疾病和溃疡性结肠炎)；成人呼吸窘迫综合症；皮肤炎；脑膜炎；脑炎；眼色素层炎；过敏症(例如湿疹和水中以及其它涉及T细胞渗透和慢性炎症反应的病情)；皮肤超敏反应(包括气根毒藤和野葛)；粥样动脉硬化；淋巴细胞粘符缺陷；自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)，糖尿病，多发性硬化，Reynaud’s综合症，自身免疫性甲状腺炎，实验性自身免疫性脑脊髓炎，Sjorgen’s综合症，儿童发病的糖尿病和与由细胞因子和T淋巴细胞介导的延迟超敏反应相关的免疫应答，通常出现于结核病，结节病，多肌炎，肉芽肿病和血管炎)；恶性贫血；涉及淋巴细胞渗出的疾病；CNS感染性疾病，由败血症或创伤继发的多器官损伤综合症；自身免疫性溶血性贫血；myethemia gravis；抗原抗体复合物介导的疾病；所有类型的移植，包括移植物对宿主或宿主对移植物疾病；等等。
系统性硬化病(硬皮病)的病因尚不清楚。该病的标志是皮肤硬化；这可能是由活化的炎症反应所诱导。硬皮病可以为局限性或全身性；常见血管损伤，在全身性硬化的进展中，微血管内皮细胞损伤是早期的重要事件；血管损伤可由免疫系统介导。皮肤损伤中出现的单核细胞渗透和许多患者中出现的抗核抗体，提示了该疾病的免疫学基础。皮肤损伤处的纤维细胞表面ICAM-1表达上调，说明T细胞与这些细胞的反应可能在所述疾病的发病中发挥作用。涉及的其它器官包括胃肠道导致异常蠕动/运动的平滑肌萎缩和纤维化；肾集合管内皮下内膜增殖，影响到弓形和小叶间动脉，导致肾皮质血流的减少，从而引起蛋白尿、氮质血症和高血压；骨骼肌萎缩，间质纤维化；炎症肺间质性肺炎和间质性纤维化；和心收缩带坏死、结瘢/纤维化。
特发性炎症性肌病(包括皮肌炎、多肌炎及其它)是病因不明的慢性肌组织炎症，导致肌无力。肌损伤/炎症通常表现为对称性和进展性。自身抗体与多数所述疾病类型相关，这些肌炎特异性自身抗体针对并抑制参与蛋白合成的组分、蛋白和RNAs的功能。
Sjogren’s综合症是由免疫介导的炎症反应和随后发生的泪腺和唾液腺功能损伤所引起。该病与炎症性结缔组织疾病相关或相伴随。该病与抗Ro和La(二者均为小RNA-蛋白复合物)抗原的自身抗体的产生有关。损伤导致角膜结膜炎干燥症，口干燥症和其它的临床表现或联合症(包括胆汁性肝硬化，周围或感觉神经病和明显的紫癜)。
全身性脉管炎的主要损伤是炎症及随后发生的对血管的损伤，其导致受损血管供应的组织的缺血/坏死/退化，并在一些病例中最终导致器官功能障碍。血管炎也可以作为其它免疫炎症介导的疾病(类风湿性关节炎，全身性硬化等，尤其是与免疫复合物形成有关的疾病)的继发损伤或并发症而发生。原发性脉管炎疾病包括全身性坏死性血管炎结节性多动脉炎，变态性脉管炎和肉芽肿病，多发性脉管炎；Wegener’s肉芽肿病；淋巴瘤样肉芽肿病；和巨细胞动脉炎。各种血管炎包括皮肤粘膜淋巴结综合症(MLNS或Kawasaki’s病)，分离的CNS血管炎，Beher’s病，thromoboangiitisobliterans(Buerger’s病)和皮肤坏死性血管炎。大部分脉管炎类型的发病机制被认为主要是由于免疫球蛋白复合物在血管壁上的沉积及随后诱导的炎症反应(通过ADCC，补体激活，或二者均参与)。
结节病是一种不明病因的疾病，它的特点是在身体的几乎任何组织中出现上皮样肉芽肿；肺是最常累及的器官。发病机制涉及在该疾病发生的部位持续存在激活的巨噬细胞和淋巴细胞，并且由于这些细胞产生的活性产物的释放，引起慢性并发症。
自身免疫性溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血，免疫性全血细胞减少症和阵发性夜间血红蛋白尿)是由与在红细胞表面(在有些病例中也包括血小板)表达的抗原发生反应的抗体所引起的，通过补体介导的溶解反应和/或ADCC/Fc-受体介导的机制，消除那些被抗体包被的细胞。
在自身免疫性血小板减少症(血小板减少性紫癜和其它临床背景下的免疫系统介导的血小板减少症)中，抗体或补体与血小板粘附，随后通过补体溶解作用、ADCC或Fc受体介导的机制消除血小板，从而引起血小板的破坏/消除。
甲状腺炎(Grave’s病，Hashimoto’s甲状腺炎，儿童淋巴性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎)是由抗体引起的，该抗体与在甲状腺中出现的通常为甲状腺特异的蛋白发生反应。已有的实验模型包括自发模型大鼠(BUF和BB大鼠)和鸡(肥鸡品系)；可诱导模型用甲状腺球蛋白或甲状腺微粒体抗原(甲状腺过氧化物酶)免疫的动物。
I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病是胰岛B细胞自身免疫性损伤起因的，这种损伤是由自身抗体和自身反应性T细胞所介导的。胰岛素抗体或胰岛素受体的抗体也可产生胰岛素无应答性表型。
免疫系统介导的肾疾病是由抗体或T淋巴细胞介导的对肾组织的损伤引起，所述损伤可直接由抗肾抗原的自身反应性抗体或T细胞引起，也可间接由在肾组织中沉积的抗体和/或免疫复合物(与其它非肾抗原发生反应)引起。因此，其它导致免疫复合物形成的由免疫系统介导的疾病也可以诱导免疫系统介导的肾疾病(作为并发症)。直接或间接免疫机制均导致炎症性应答，产生/诱导肾组织的损伤进展，并且导致器官功能受损，在一些病例中可发展成肾衰。体液和细胞免疫机制均参与了损伤的发病机制。
一般认为中枢和外周神经系统的脱髓鞘性疾病(包括多发性硬化；特发性脱髓鞘性多神经病或Guillain-Barre综合症；和慢性炎症性脱髓鞘多神经病)具有自身免疫基础，神经脱髓鞘是对少突胶质细胞或髓磷脂的直接破坏而引起的。在MS中，有证据说明疾病的诱导和进展取决于T淋巴细胞。多发性硬化病是T淋巴细胞依赖性脱髓鞘疾病，病程表现为复发-缓解或慢性进展。其病因尚不清楚，但是病毒感染、遗传易感性、环境和自身免疫等因素均可参与发病。损伤中包括主要由T淋巴细胞介导的浸润物，微胶质细胞和浸润的巨噬细胞；损伤处的主要细胞类型为CD4+T淋巴细胞。少突胶质细胞死亡机制及随后发生的脱髓鞘的机制尚不清楚，它可能是T淋巴细胞驱动的。
炎症性和纤维化性肺疾病(包括嗜酸细胞性肺炎，特发性肺纤维化和超敏性肺炎)可能涉及失调的免疫-炎症应答。抑制该应答在治疗上是有益的。
自身免疫或免疫介导的皮肤疾病(包括Bulious皮肤病，多形红斑和接触性皮炎)是由自身抗体所介导的，它的发生为T淋巴细胞依赖性。
牛皮癣是T淋巴细胞介导的炎症性疾病，其特点是牛皮癣患处的表皮和真皮中角化细胞的过度增殖和活化T细胞的积累。损伤包括T细胞、巨噬细胞和抗原递呈细胞以及一些中性粒细胞的浸润。
可从对免疫和/或炎症应答的干预中获益的其它疾病是感染性疾病，包括但不限于病毒感染，细菌感染，酵母感染和原虫性或寄生虫性感染(可激活MLR的分子(或其衍生物/拮抗剂)可在治疗上用来增加对抗感染体的免疫应答)，免疫缺陷性疾病(可激活MLR的分子/衍生物/拮抗剂，可用于在遗传性、获得性、感染诱导(如HIV感染)的或治疗源性(即化疗引起)免疫缺陷和肿瘤等疾病状态的治疗中，来增加免疫应答)。
另外，抑制具有致炎特性的分子对下述疾病的治疗是有益的，这些疾病包括再灌注损伤；休克；心肌感染；动脉粥样硬化；急性肺损伤；出血性休克；烧伤；败血症性/脓毒性休克；急性管状坏死；子宫内膜异位；退化性关节疾病和胰腺炎。
E.产品在本发明的另一个实施方案中，提供了包含用于治疗上文所述疾病的物质的产品。所述产品包括容器和说明。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器和试管。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器可内含一种能有效治疗例如LFA-1和/或TNF-α介导的疾病(例如退化性软骨疾病)的组合物，并具有无菌存取口(例如该容器可以是静脉注射袋或带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的小瓶)。组合物中的活性药物为LFA-1拮抗剂和/或TNF-α拮抗剂。所述组合物可以包括任何或多种在本发明中公开的组分。容器上(或与其相连)的说明书说明所述组合物可有效的治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、任何其它退化性软骨疾病或LFA-1和/或TNF-α介导的任何其它疾病。所述产品可进一步包括含可药用缓冲液(例如磷酸缓冲盐，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液)的第二个容器。或者，所述组合物可包含任何在“E.药用组合物和剂量”章节中所述的载体、赋形剂和/或稳定剂。它还可包括具有商业需要以及符合用户需要的其它材料，如其它缓冲液、稀释剂，滤器，针头，注射器和说明用途的包装插页。
F.试验/模型用试验和动物模型来评估本发明方法中所用的化合物的组合活性。下文叙述了一些试验和模型，它们可有效评估所述化合物在治疗关节疾病、修复软骨和治疗退化性软骨疾病中的效果。
胶原诱导的关节炎试验/模型类风湿性关节炎(RA)是与产生自身抗体有关的免疫性疾病。在一些RA患者的滑液中可出现针对软骨中大量表达的蛋白(称为II型胶原)的抗体。Trentham，D.E.等，Arthrit.Rheum.241363-9(1981)。然而，这些抗体并不是疾病发生所必须的，而可能是继发于炎症。给动物注射II型胶原可在滑膜关节内产生特异性免疫反应。
胶原诱导的关节炎(CIA)模型被认为是合适于人关节炎中潜在药物和生物活性研究的模型，因为其许多免疫学和病理学特点与人RA相象，包括局部主要组织相容性的介入，完全的II类限制性T辅助淋巴细胞的激活和组织损伤的相似性。该CIA模型与RA患者相似的特点包括关节边缘的软骨和骨的糜烂(如放射照片所见)，增生性滑膜炎，对称性累及四肢的小和中等大小的外周关节，但不累及axial和骨骼。Jamieson，T.M.等，Invest.Radiol.20324-9(1985)。而且，与RA一样，在CIA中也涉及到IL-1和TNF-α。Joosten等，免疫学杂志，1635049-5055(1999)。在这个模型中，TNF中和抗体和TNFRFc分别可减轻RA的症状(见Williams等，PNSA，1992年10月，899784-9788；Wooley等，1993，免疫学杂志，1516602-6607)。CIA模型可预示人体病情及其对RA治疗的应答的其它证据可参见用ENBREL治疗的临床结果。在实施例中将更详细的叙述该模型。
在这个类风湿性关节炎模型中，II型胶原是从牛关节软骨中纯化的(Miller，1972，生物化学114903)，并用其免疫小鼠(Williams等，1994，美国国家科学院院刊，912762)。关节炎的症状包括红斑和/或肢体肿胀以及通过组织学方法确定的软骨和骨的糜烂或缺失。例如，Holmdahl等，1989，APMIS 97575中也叙述了这个广泛应用的模型。
关节软骨外植体试验此试验叙述了在软骨基质上受试化合物的合成和预防能力。为了此目的，检测蛋白聚糖(PG)的合成和降解，并检测一氧化氮的释放。蛋白聚糖是关节软骨中第二大的有机物质组分(Kuettner KE等，关节软骨生物化学，Raven Press，纽约，美国(1986)，p.456；Muir H，Biochem Soc.Tran.11613-622(1983)；Hardingham，TE，Biochem.Soc.Trans.9489-497(1981))。因为蛋白聚糖辅助决定软骨的物理和化学特点，软骨中PG的减少(发生于关节退化期间)可导致压缩强度和弹性的丧失，水通透性的增加，水含量的增加(肿胀)和其它细胞外组分(如胶原)排列的改变。因此，PG丧失在退化性软骨疾病的进展过程中是早期步骤，其进一步干扰关节的生物机械和生物化学的稳定性。由于关节软骨中的PG可能在骨骼的生长和疾病中发挥作用，其已经被广泛的研究。Mow.VC和Ratcliffe A.Biomaterials 1367-97(1992)。可利用比色DMMB试验定量外植体介质中的PG，从而测定蛋白聚糖的降解(在患病关节中蛋白聚糖降解增加)。Famdale和Buttle，Biochem.Biophys.Acta 883173-177(1985)。用蛋白聚糖中35S硫酸盐的掺入作为蛋白聚糖合成的指征。
有很多证据表明IL-1α和退化性软骨疾病的相关性。例如，已经发现在患病关节中出现高水平的白介素1α(IL-1α)(Pelletier JP等，“软骨退化中细胞因子和炎症”见Osteoarthritic Edition of Rheumatic Disease Clinics of NorthAmerica，Eds.RW Moskowitz，Philadelphia，WD Saunders Company，1993，p.545-568)和IL-1受体(Martel-Pelletier等，类风湿性关节炎35530-540(1992))，而且IL-1α可诱导软骨基质降解并抑制新基质分子的合成。Baragi等，J.Clin.Invest.，962454-60(1995)；Baragi等，骨关节炎软骨5275-82(1997)；Evans等，J.Leukoc.Biol.6455-61(1998)；Evans等，风湿病学杂志242061-63(1997)；Kang等，Biochem.Soc.Trans.25533-37(1997)；Kang等，骨关节炎软骨5139-43(1997)。由于IL-1α和IL-1受体与患病组织相连，故还检测了在IL-1α存在的条件下受试化合物的作用。受试化合物不但对软骨具有有利作用，而且可反作用于IL-1α的分解代谢效应，受试化合物的该能力是说明其具有保护作用的强有力的证据。另外，该活性提示受试化合物可抑制关节炎中发生的退化，因为有证据表明拮抗IL-1α的功能可缓解骨关节炎的进展。Arend，WP等，Ann.Rev.Immunol.1627-55(1998)。
分解代谢性细胞因子(例如IL-1)在软骨中可诱导产生一氧化氮(NO)。Palmer，RMJ等，Biochem.Biophys.Res.Commun.193398-405(1993)。在关节炎中发生的关节损伤中，也提示有NO产生。Ashok等，Curr.Opin.Rheum.10263-268(1998)。与正常(未患病或未受伤)软骨不同，患有骨关节炎的关节的软骨回体(ex vivo)可产生大量的一氧化氮，甚至在没有刺激(如白介素-1或脂多糖)的情况下也可产生。在体外，一氧化氮对软骨细胞的功能有不利影响，包括抑制胶原和蛋白聚糖的合成，促进细胞调亡和抑制对细胞外基质的粘附。研究表明骨关节炎患者滑膜液中亚硝酸盐的浓度比类风湿性关节炎患者滑膜液中的浓度高。Renoux等，骨关节炎软骨4175-179(1996)。而且，动物模型表明抑制一氧化氮的产生可缓解关节炎的进展。Pelletier JP等，类风湿性关节炎71275-86(1998)；van de Loo等，类风湿性关节炎，41634-46(1998)；Stichtenoth DO和Frolich JC英国风湿病学杂志37246-57(1998)。由于NO对其它细胞也有影响，因此关节内NO的出现可增加血管扩张和其通透性，促进淋巴细胞大量释放细胞因子，并且由单核细胞-巨噬细胞刺激血管生成活性。因此，软骨中NO的产生与有病的状态有关，而且由于NO对关节疾病的侵蚀性(erosive)组分和炎症性组分均可发挥作用，因此减少一氧化氮产生的因子可能对退化性软骨疾病的治疗有利。
本文所述试验的基本原理是2，3-二氨基萘(DAN)与亚硝酸盐在酸性条件下反应生成可以被定量的荧光产物1-(H)-奈噻唑。由于NO迅速代谢成亚硝酸盐(NO2-1)和硝酸盐(NO3-1)，检测亚硝酸盐是检测(虽然不完全)软骨组织中实际产生的NO量的一种方法。
小鼠髌骨(Patellae)试验该实验可检测受试化合物对小鼠髌骨(膝盖骨)中蛋白聚糖合成的影响。在该检测中应用完整的软骨(包括下层骨)，因此可在与软骨体内环境相似的条件下检测因子。在分析回体髌骨中蛋白聚糖的合成之前，即可以在体外将化合物加到髌骨中，也可以在体内将化合物注射到膝关节中。先前的研究已经表明，经体内治疗的髌骨的回体PG合成明显改变。(Van den Berg等，Rheum.Int.1165-9(1982)；Vershure.PJ等，Ann.Rheum.Dis.53455-460(1994)；和Van de Loo等，Arthrit.Rheum.38164-172(1995))。在此模型中，将各个动物的对侧关节作为对照。在实施例中将详细叙述该方法。
豚鼠模型该试验用动物模型测定受试化合物在Dunkin Hartley(DH)豚鼠(公认的用于骨关节炎的动物模型)对软骨基质中刺激回体PG合成和抑制回体PG释放的影响。Young等，“骨关节炎”，人类疾病的自发动物模型，2卷，pp.257-261，Acad.Press.纽约(1979)；Bendele等，类风湿性关节炎，341180-1184；Bendele等，类风湿性关节炎31561-565(1988)；Jimenez等，实验动物科学，47卷(6)598-601(1997)。
DH豚鼠可以患上与人体的膝及其它关节的骨关节炎(OA)相似的关节损伤。在2月龄时，这些动物可患上轻度OA(可检测到微小的组织学变化)。例如，蛋白聚糖合成增加，其证据是软骨组织本身以及滑膜液中PG水平较高。该病继续进展，到16-18月龄时，在中间胫骨丘(medial tibial plateau)上出现中度到重度的软骨损伤，到22个月时，该动物出现严重的损伤，包括胫骨和股骨的边缘骨赘，胫骨丘软骨下骨的硬化，股骨齿突包囊和附属韧带的钙化。Jimenez等，见上述。
下述实施例仅是用来举例说明本发明，而不是意图以任何方式限制本发明的范围。在本说明书中引用的所有专利和文献在此引入本文作为参考。
实施例实施例1-3叙述了在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，用LFA-1拮抗剂(抗鼠CD11a抗体，M17)或TNF拮抗剂(ENBRELEtanercept)(单独或组合)治疗关节炎。所述CIA模型见上文“试验/模型”条目所述。实施例1和3叙述了在两种品系小鼠中，用抗鼠CD11a抗体(M17)和ENBREL联合治疗关节炎。实施例2叙述了单独用M17或ENBREL进行的治疗。在ENBREL的临床前研究中使用相同的动物模型。
实施例1用LFA-1拮抗剂和TNF拮抗剂治疗用溶于100μl完全Freund佐剂(CFA)的100μg牛II型胶原免疫DBA-1J小鼠，21天后用溶于不完全Freund佐剂(IFA)中的相同胶原再次注射。在尾根部皮下注射溶于CFA或IFA的II型胶原。
每隔一天检测动物一次。在任何动物中出现关节炎(以任何爪出现肿胀为标志)时，将动物随机分为如下治疗组(每组12只)，开始对所有动物进行治疗。
第一组.对照组盐水治疗组。100μl，腹腔注射，每天一次连续14天。其后每周3次，隔天注射(星期一、星期三、星期五)第二组 抗鼠CD11a单克隆抗体M17给药组。150μg(约8mg/kg)，在发病之日腹腔注射给药，其后每周3次，隔天注射(星期一、星期三、星期五)，直到实验结束。
第三组ENBREL(人TNF-Fc，50μg)组，从发病之日起每日腹腔注射给药，共14天。
第四组ENBREL和抗CD11a联合给药组抗鼠CD11a单克隆抗体M17，150μg(约8mg/kg)，在发病之日腹腔注射给药，其后每周3次，隔天注射(星期一、星期三、星期五)，直到实验结束。ENBREL，从发病之日起每日腹腔注射给药，共14天。
在开始治疗之后，每周检测小鼠3次，隔天进行，将各只爪肿胀的严重程度人为进行分级，严重程度分为0-4，0＝正常，1＝最轻，2＝轻微，3＝中度，4＝严重。记录各个动物的累计分数(可能的范围为0-16)。在治疗开始后38天，处死所述动物，拍摄所有四肢的放射照片以评估关节损害，并收集鼠爪进行组织学检查。对各组动物的根据临床评分(均数±标准差)确定的疾病严重程度进行做图并进行组间比较。在本研究结束时对所有四只爪进行的放射照相和组织学检测的结果，确证了最后一天取得的临床评分结果。
与对照组相比，用ENBREL或抗CD11a抗体治疗可降低临床评分(p＜0.05)。与单独使用ENBREL的情况相比，ENBREL和抗CD11a抗体联合给药可改善临床评分(p＜0.05)。见图一实施例2用LFA-1拮抗剂或TNF拮抗剂治疗关节炎在此实施例中，在DBA-1LacJ小鼠(图2)或DBA-1J(图3)小鼠中诱导关节炎，随后用抗鼠CD11a抗体(M17)、ENBREL或作为对照的盐水对所述小鼠进行治疗。按实施例1和插图2和3中所述方法进行这些实验。在免疫后第48天或第22天(在图2和图3的实验中关节炎发病的当天)开始治疗。
图2和图3所示结果表明，单独用抗鼠CD11a抗体(M17)或ENBREL治疗可降低临床评分，说明可有效治疗关节炎。
实施例3用LFA-1拮抗剂或TNF拮抗剂治疗关节炎在此实施例中，在DBA-1LacJ小鼠(图4)或DBA-1J(图5)小鼠中诱导关节炎，随后单独用抗鼠CD11a抗体(M17)、单独用ENBREL、盐水(作为对照)或联合用抗鼠CD11a抗体(M17)和ENBREL对所述小鼠进行治疗，按实施例1和插图4和5中所述方法进行这些实验。图4中，在免疫后第40天开始治疗，每周3次给药160μg M17，直到实验结束。联合给药的治疗中，每天给药ENBREL 50μg，其中一组实验给药14个剂量，另一组实验全程给药。在图5中，在免疫后第24天(关节炎发病当天)开始进行治疗，ENBREL每日给药(qd)共14天，其后隔天给药(qod)(星期一、星期三、星期五)直到实验结束。
图4和图5所示结果表明，与单独应用LFA-1拮抗剂或TNF拮抗剂治疗相比，用LFA-1拮抗剂和TNF拮抗剂联合治疗具有协同作用，使该动物模型的平均临床评分更大幅度的下降，几乎达到正常。
在下面的实施例4-6中，受试化合物是指LFA-1拮抗剂(如抗CD11a抗体)或TNF拮抗剂(如ENBREL)。所述体积、浓度和时间点仅为举例，可以对其进行变动，这对本领域技术人员是熟知的。
实施例4关节软骨外植实验如上文“试验/模型”章节中所述，在软骨基质上测定了受试化合物的合成与预防潜能，该潜能由刺激基质合成和抑制基质降解所确定(1)在关节基质中合成PG；(2)抑制PG释放；(3)抑制IL-1α诱导的降解；(4)抑制一氧化氮。
关节软骨外植在无菌条件下，将4-6月龄雌猪的掌指关节打开，使关节软骨从其下层骨分离。将软骨切碎、冲洗，并在95％空气、5％CO2的潮湿条件下大块(in bulk)培养至少24小时，培养基为无血清低葡萄糖5050DMEMF12培养基(含0.1％BSA、100U/ml青霉素/链霉素(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺、1xGHT、0.1mM MEM丙酮酸钠(Gibco)、20μg/ml庆大霉素(Gibco)、1.25mg/L两性霉素B(Sigma)、5μg/ml维生素E及10μg/ml转铁蛋白)。把大约50mg关节软骨分置于微电子学试管(Micronics tube)中，在上述培养基中孵育至少24小时，然后转入无维生素E及转铁蛋白的培养基中。之后加入受试蛋白，在不同时间点(如0、24、48、72小时)收集并更换培养基。
蛋白聚糖的检测DMMB是一种染料，与硫酸化糖胺聚糖(GAG)(蛋白聚糖的侧链)结合后，可出现变色反应(颜色改变，在这里由兰色变为紫色)。向DMMB中加入硫酸化蛋白聚糖可降低590和660nm吸光度峰值，而增加530nm的吸光度。通过向96孔平板中加入DMMB染料，用分光光度计(Spectramax 250)定量颜色改变，可检测培养液中蛋白聚糖的总量。DMMB试验是非常公认的检测软骨培养物中蛋白聚糖含量的方法。用0.0到0.5μg范围内的硫酸软骨素绘制此检测的标准曲线。所述方法修改自Famdale和Buttle(Biochem.Biophys.Acta 833173-177(1986))所述的比色分析检测。
关节软骨外植体中蛋白聚糖合成的检测在改变培养基48小时后，向软骨外植体中加入35S-硫酸盐(至终浓度10μCi/ml)。37℃孵育过夜之后，保留培养基，用来测定一氧化氮或蛋白聚糖含量。将软骨片用外植体培养基洗涤两次。向各试管中加入900μl消化缓冲液(含10mM EDTA，0.1M磷酸钠和1mg/ml蛋白酶K(Gibco BRL))，50℃水浴过夜。将600μl所述消化产物与600μl 10％(w/v)十六烷基氯化吡啶鎓(Sigma)混合。1000×g离心样品15分钟。去除上清，向所述样品中加入500μl甲酸(Sigma)，溶解沉淀物。将溶解的团块(pellet)转入含10ml闪烁液(ICN)的闪烁瓶中，并将所述样品在闪烁仪上计数。
一氧化氮(NO)的检测向100μl软骨外植体的培养液中加入10μl 0.05mg/ml 2，3-二氨基萘(DAN)(溶于0.62M HCl)。将样品混合，并在室温下孵育10-20分钟。用5μl 2.8M NaOH终止反应。利用Cytoflor荧光平板记录仪，用360nm激发光和450nm发射光检测荧光产物2，3-二氨基萘噻唑。
实施例5小鼠髌骨检测该检测用来测定LFA-1拮抗剂和TNF拮抗剂(例如抗CD11a抗体和ENBREL)在体内对小鼠髌骨中蛋白聚糖合成的影响。髌骨是非常有用的模型，因为它可以评估受试化合物对还没有与下层骨组织分离的软骨的作用。而且，对定点ambular体内注射治疗的评估实际上提供了理想的实验对照，因为每个动物具有两个相互独立的位于身体不同区域的髌骨。本文的方法改自文献(Van den Berg等，Rheum.Int.1165-9(1982)；Vershure PJ等，Ann.Rheum.Dis.53455-460(1994)；和Van de Loo等，Arhtit.Rheum.38164-172(1995))中所述方法。在“试验/模型”章节中对该检测进行了讨论。
在回体(ex vivo)治疗组中，小心取出小鼠的髌骨，并用培养基孵育过夜，所述培养基为以下几种情况无其它因子(例如盐水对照)；含IL-1(例如浓度为100ng/ml)；含抗CD11a抗体或ENBREL；含IL-1和抗CD11a抗体或IL-1和ENBREL；含抗CD11a抗体和ENBREL的组合，以观察受试化合物对IL-1功能的抑制能力。在孵育的最后3小时期间，在组织培养箱中加入30Ci/ml35S-硫，随后用PBS洗涤3次。将样品在10％福尔马林中固定过夜，之后用5％甲酸decaling至少5小时。将软骨与下层骨组织分离，并将其置于500l溶剂中，60℃孵育15小时。向各试管中加入10ml HIONIC-荧光剂，并充分混合。将所述溶液转入闪烁瓶中，然后在闪烁记录仪上检测35S吸收以指示PG的合成。
在体内治疗组中，将动物分成两个亚组，将受试化合物(如抗CD11a抗体和ENBREL)分别或组合注射到一个例如膝关节中。剂量和给药方案可以改变，从而确定最佳治疗条件。然后收集髌骨，并按上述方法进行检测。
实施例6豚鼠模型该豚鼠模型是公认的用于骨关节炎的动物模型，并且可用于检测受试化合物对Dunkin Hartley(DH)豚鼠中蛋白聚糖(PG)合成的刺激和抑制PG从软骨基质中释放的影响。
雄性Dunkin Hartley豚鼠得自Charles River实验室(Wilmingon，MA)，并将其分笼饲养。将所述动物分成在1-2、6和12月龄时处死动物的治疗组。用上述拮抗剂单独或联合治疗所述动物，如实施例1所述。还包括适当的对照(例如盐水单独注射)。在处死动物时，无菌分离掌指关节，并通过free-hand切割分离关节软骨，小心避免取到下层骨组织。将软骨切碎、冲洗，并在95％空气、5％CO2的潮湿环境条件下大块(in bulk)培养至少24小时，培养基为无血清(SF)LG DMEM/F12培养基(含0.1％BSA、100U/ml青霉素/链霉素(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺、1xGHT、0.1mM MEM丙酮酸钠(Gibco)、20μg/ml Genamicin(Gibco)和1.25mg/L两性霉素B。将关节软骨分置于微电子学试管(Micronics tube)(每管大约55mg)中，并在上述培养基中孵育至少24小时，在不同时间点(0、24、48、72小时)收集并更换培养基。
蛋白聚糖释放利用Famdale和Buttle等(Biochem.Bhiophys.Acta 833173-177(1985))所述1，9-二甲基甲撑蓝(DMB)比色分析法，检测不同时间点收集的培养基中蛋白聚糖的含量。用0.0到5.0mg范围的硫酸软骨素制备标准曲线。
蛋白聚糖合成的检测在改变培养基48小时后，向软骨外植体培养物中加入终浓度为10mCi/ml的35S。37℃再孵育17小时之后，保留培养基，用于随后的一氧化氮或蛋白聚糖检测。将软骨片用外植体培养基洗涤两次。向各试管中加入900μl消化缓冲液(含10mM EDTA，0.1M磷酸钠和1mg/ml蛋白酶K(Gibco BRL))，50℃水浴过夜。将600μl所述消化产物与600μl 10％(w/v)十六烷基氯化吡啶鎓(Sigma)混合。1000×g离心样品15分钟。去除上清，向所述样品中加入500μl甲酸(Sigma)，溶解沉淀物。将溶解的团块(pellet)转入含10ml闪烁液(ICN)的闪烁瓶中，并将所述样品在闪烁仪上计数。
权利要求
1.一种治疗LFA-1或TNF-α介导的疾病的方法，其包含向需要治疗的哺乳动物给药有效量的LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂。
2.一种用有效量的LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂治疗损伤所致的软骨损伤或预防退行性软骨疾病或损伤所致的最初的或连续的损伤的方法。
3.权利要求1或2的方法，其中所述疾病是退行性软骨疾病。
4.权利要求3的方法，其中所述退行性软骨疾病选自类风湿性关节炎和骨关节炎。
5.权利要求1-4中的任何一项权利要求的方法，其中所述LFA-1拮抗剂是一种抗LFA-1抗体，优选是一种抗CD11a抗体。
6.权利要求1-5中的任何一项权利要求的方法，其中所述抗LFA-1抗体是非T细胞耗竭的抗CD11a抗体。
7.权利要求1-6中的任何一项权利要求的方法，其中所述TNF-α拮抗剂是一种免疫粘附素。
8.权利要求1-7中的任何一项权利要求的方法，其中所述免疫粘附素是至少TNF-α结合蛋白的一部分和免疫球蛋白的一部分的融合。
9.权利要求1-8中的任何一项权利要求的方法，其中所述TNF-α结合蛋白是TNF-α受体-IgGFc融合蛋白。
10.一种组合物，该组合物包含LFA-1拮抗剂和TNF-α拮抗剂。
11.权利要求10的组合物，其中所述LFA-1拮抗剂是抗LFA-1抗体。
12.权利要求11的组合物，其中所述抗LFA-1抗体是抗CD11a抗体。
13.权利要求12的组合物，其中所述抗CD11a抗体是非T细胞耗竭的抗体。
14.权利要求10的组合物，其中所述TNF-α拮抗剂是免疫粘附素。
15.权利要求14的组合物，其中所述免疫粘附素是至少TNF-α结合蛋白的一部分和免疫球蛋白的一部分的融合。
16.权利要求15的组合物，其中所述TNF-α结合蛋白是TNF-α受体-IgGFc融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及通过给与有效量的LFA－1拮抗剂和TNF－拮抗剂，治疗LFA－1介导的疾病或TNF－α介导的疾病的方法。
文档编号A61P25/28GK1409639SQ00817171
公开日2003年4月9日 申请日期2000年12月14日 优先权日1999年12月14日
发明者怀恩·P·李, 丹尼尔·B·图马斯 申请人:杰南技术公司