铜绿假单胞菌抗原的制作方法

专利名称：铜绿假单胞菌抗原的制作方法
技术领域：
本申请涉及来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的抗原蛋白以及这些蛋白在药物中的应用，尤其是在铜绿假单胞菌感染的治疗、预防和诊断中的应用。
背景技术：
铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性需氧能运动细菌。它是一种在环境中普遍存在的、细胞外、机会性病原体，能使免疫受损患者产生明显的发病率和死亡率。感染对于囊性纤维化、烧伤、慢性支气管炎、支气管扩张和癌症患者特别显著。
最近已经对铜绿假单胞菌基因组进行了测序，项目细节放在因特网上(http//www.pseudomonas.com)。然而，在本发明的优先权日，该信息不完全，且没有证实。现在这个信息完全了并已经被证实。
免疫反应的鉴定、对候选疫苗和用于诊断检测的合适成分的寻求集中于铜绿假单胞菌的外膜成分。铜绿假单胞菌的外膜包含毒素，包括脂多糖内毒素、磷脂和外膜蛋白(OMPs)。
多种铜绿假单胞菌外膜蛋白(OMPs)已经指定了字母命名体系。虽然用这个方案描述了几个蛋白的特性，但是其中一些蛋白的表达只是短暂的且高度依赖于营养可利用性、培养条件和抗生素的存在。目前，认识到三个主要的OMPs，称为F、H2和I，是铜绿假单胞菌所有菌株的共有抗原，且以高拷贝数量表达。

发明内容
发明人采用蛋白纯化方法分离OMPs和胞质蛋白的均一制品。采用Zwittergent提取及修改的液相柱层析和凝胶电泳步骤，已经纯化了几个蛋白，鉴定并估计了它们的疫苗潜力。用它们的分子量来表示这些蛋白，其本质经氨基末端测序而确认。
发明人已经分离和鉴定了来自铜绿假单胞菌标本的蛋白。这些蛋白称为Pa13、Pa20(ACP)、Pa40(酰胺酶)、Pa45和Pa80。已经得到了Pa13、Pa20(ACP)、Pa40(酰胺酶)、Pa45和Pa80的氨基末端序列。序列分析后，用BLAsT(基本本地比对检索工具，国立生物技术信息中心，Bethesda，MD，美国，Altschul等，Nucleic Acids Research，25 3389-3402(1997))，对获得的数据进行检索。Pa20归于ACP，因为它与来自丁香假单胞菌和铜绿假单胞菌的蛋白具有同源性。Pa40与已知的铜绿假单胞菌脂肪族酰胺酶具有同源性。检索没有发现称为Pa13、Pa45和Pa80的蛋白。
因此，本发明的第一个方面，提供了来自铜绿假单胞菌的蛋白或其抗原性片段或同系物，其中该蛋白用SDS PAGE在还原条件下测定，具有大约13kDa的分子量，并具有下列氨基末端序列A E T I V N T T K AAla Glu Thr Ile Val Asn Thr Thr Lys Ala(SEQ ID NO1)。
本发明的第二个方面，提供了来自铜绿假单胞菌的蛋白或其抗原性片段或同系物，其中该蛋白用SDS PAGE在还原条件下测定，具有大约45kDa的分子量，并具有下列氨基末端序列M R A E L N Q G L I D F L K AMet Arg Ala Glu Leu Asn Gln Gly Leu Ile Asp Phe Leu Lys Ala(SEQ ID NO2)。
本发明的第三个方面，提供了来自铜绿假单胞菌的蛋白或其抗原性片段或同系物，其中该蛋白用SDS PAGE在还原条件下测定，具有大约80kDa的分子量，并具有下列氨基末端序列M S E Q N N E Q R S Q A A(SEQ ID NO3)Met Ser Glu Gln Asn Asn Glu Gln Arg Ser Gln Ala Ala。
本领域熟练技术人员会领会到本发明的蛋白或多肽的同系物或衍生物也可用于本发明文本中的用途，即作为抗原/免疫原性物质。因此，例如包括一个或更多添加、缺失、替代等的蛋白或多肽包括在本发明中。另外，也可能用相似“类型”的另一个氨基酸置换一个氨基酸。例如用另一个疏水氨基酸置换一个疏水氨基酸。可以使用程序如CLUSTAL程序比较氨基酸序列。这个程序对氨基酸序列进行比较并通过在任一序列中适当插入空格找到最佳比对。对于最佳比对，计算氨基酸等同性或相似性(氨基酸类型的等同性加保守性)是可能的。象BLASTx等程序会排列最长区段的相似序列并赋予该匹配一个值。这样就可能得到比较，其中发现类似的几个区域，每个具有一个不同的分值。本发明中考虑到分析的两种类型。
为了本发明的目的，当采用上面提及的算法之一时，如果相当多的构成氨基酸显示同源性，可以认为一个蛋白序列与另一个蛋白基本同源。按照递增的优选级别，至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％的氨基酸可以是同源的。
在本说明书中，已经用SDS-PAGE在还原条件下，测定了蛋白的分子量。正如本领域的熟练技术人员将领会到的，用这个方法得到的分子量值只能精确到大约±10％的程度。
如这里讨论的，本发明的蛋白可用作抗原物质。这种物质可以是“抗原性的”和/或“免疫原性的”。一般来说，“抗原性的”是指该蛋白能够被用来使受试者产生抗体或确实能够诱导抗体反应。“免疫原性的”是指该蛋白能够引起受试者的保护性免疫反应。因此，在后一种情况下，该蛋白可能不仅能够产生抗体反应，而且，此外，还可以产生不基于抗体的免疫反应。
第一、第二和第三个方面的蛋白可以从铜绿假单胞菌提取获得，因此，本发明更进一步的方面，提供了分离和纯化的蛋白的制备方法，该方法包括下列步骤(a)制备铜绿假单胞菌培养物，使培养物在适当的条件下生长并收获培养物，之后离心洗涤得到洗过的细胞沉淀；
(b)在适当的缓冲液中重悬洗过的细胞，之后破裂细胞；(c)离心去除细胞碎片，得到含有可溶性细胞蛋白的上清液；(d)采用氯化钠梯度洗脱对所得溶液进行阴离子交换层析，并合并对应于每个分离峰的馏分；(e)使用在28mm(内径)柱中聚合的带有4％T-0.36％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺浓缩胶的10％T-1.42％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺分离胶通过SDS-PAGE纯化蛋白馏分，在上室和下室中用1％(w/v)SDS、0.025M Tris、0.2M甘氨酸缓冲液pH8.3以40mA和10W电泳14个小时，用0.025M Tris，pH8.3的缓冲液洗脱蛋白，以1ml/分钟的流速收集6ml馏分；和(f)选择包含具有13kDa、45kDa或80kDa分子量的蛋白质的馏分，从选择的馏分中分离该蛋白。
可供选择地，该蛋白可以通过表达合适的DNA来制备。
因此，本发明另一方面提供了重组或分离的编码本发明第一、第二或第三个方面蛋白质的核酸或与之互补的核酸。
为了表达，该核酸可以是DNA，可以插入到载体中，载体可以是质粒、粘粒或噬菌体。载体可插入到宿主生物体的基因组中，宿主生物体可以是原核或真核生物体。
该核酸或包含该核酸的载体，可适合在待治疗的受试者中表达本发明的蛋白，即可以是DNA疫苗的形式。适合制备DNA疫苗的方法和试剂是本领域熟练技术人员熟知的。
除了上面提及的蛋白，发明人分离和纯化了其它铜绿假单胞菌蛋白。发现这些蛋白中的几个是抗原性的，因此可能在铜绿假单胞菌感染的治疗和预防方法中有用，该方法包括给需要这种治疗的患者施用有效量的这些蛋白之一，或其抗原性片段。
该蛋白在诊断铜绿假单胞菌感染中也有用。
因此，本发明进一步的方面，提供了蛋白或编码该蛋白的核酸用于医学领域，尤其是用于治疗、预防或诊断由铜绿假单胞菌引起的感染，其中该蛋白来自铜绿假单胞菌，并且
i)用SDS PAGE在还原条件下测定时，具有大约13kDa的分子量，并且具有下列氨基末端序列A E T I V N T T K AAla Glu Thr Ile Val Asn Thr Thr Lys Ala(SEQ ID NO1)或其抗原性片段或同系物；或ii)用SDS PAGE在还原条件下测定时，具有大约20kDa的分子量，并且具有下列氨基末端序列S T I E E R V K K I V A E Q LSer Thr Ile Glu Glu Arg Val Lys Lys Ile Val Ala Glu Gln Leu(SEQ ID NO4)或其抗原性片段或同系物；或iii)用SDS PAGE在还原条件下测定时，具有大约40kDa的分子量，并且具有下列氨基末端序列M R H G D I S S S N D T V GMet Arg His Gly Asp Ile Ser Ser Ser Asn Asp Thr Val Gly(SEQ ID NO5)或其抗原性片段或同系物；或iv)用SDS PAGE在还原条件下测定时，具有大约45kDa的分子量，并且具有下列氨基末端序列M R A E L N Q G L I D F L K AMet Arg Ala Glu Leu Asn Gln Gly Leu Ile Asp Phe Leu Lys Ala(SEQ ID NO2)或其抗原性片段或同系物；或v)用SDS PAGE在还原条件下测定时，具有大约80kDa的分子量，并且具有下列氨基末端序列M S E Q N N E Q R S Q A A(SEQ ID NO3)Met Ser Glu Gln Asn Asn Glu Gln Arg Ser Gln Ala Ala或其抗原性片段或同系物。
蛋白可从铜绿假单胞菌经提取得到，因此，本发明进一步的方面，提供了分离和纯化的蛋白的制备方法，该方法包括下列步骤(a)制备铜绿假单胞菌培养物，使培养物在适当的条件下生长并收获培养物，之后离心洗涤得到洗过的细胞沉淀；(b)在适当的缓冲液中重悬洗过的细胞，之后破裂细胞；(c)离心去除细胞碎片，得到含有可溶性细胞蛋白的上清；(d)采用氯化钠梯度洗脱对所得溶液进行阴离子交换层析，并合并对应于每个分离峰的馏分；(e)使用在28mm(内径)柱中聚合的带有4％T-0.36％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺浓缩胶的10％T-1.42％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺分离胶通过SDS-PAGE纯化蛋白馏分，在上室和下室中用1％(w/v)SDS、0.025M Tris、0.2M甘氨酸缓冲液pH8.3以40mA和10W电泳14个小时，用0.025M Tris，pH8.3的缓冲液洗脱蛋白，以1ml/分钟的流速收集6ml馏分；和(f)选择包含具有20kDa或40kDa分子量的蛋白的馏分，从选择的馏分中分离蛋白。
可供选择地，该蛋白可以通过表达合适的DNA来制备。
除了在治疗或预防由铜绿假单胞菌引起的感染中有用，本发明的蛋白在这种感染的诊断中也有用。因此，另一方面提供了检测和/或诊断铜绿假单胞菌的方法，包括(a)使待检测的样品接触选自上述限定的抗原性蛋白和/或其抗原性片段的一个或多个抗原；以及(b)检测针对铜绿假单胞菌的抗体的存在。
本发明进一步的方面，提供了该蛋白，或编码该蛋白的核酸在制备用于治疗、预防或诊断由铜绿假单胞菌引起的感染的试剂中的应用，其中该蛋白来自铜绿假单胞菌，并且i)用SDS PAGE在还原条件下测定时，具有大约13kDa的分子量，并且具有下列氨基末端序列A E T I V N T T K AAla Glu Thr Ile Val Asn Thr Thr Lys Ala(SEQ ID NO1)或其抗原性片段或同系物；或ii)用SDS PAGE在还原条件下测定时，具有大约20kDa的分子量，并且具有下列氨基末端序列S T I E E R V K K I V A E Q LSer Thr Ile Glu Glu Arg Val Lys Lys Ile Val Ala Glu Gln Leu(SEQ ID NO4)或其抗原性片段或同系物；或iii)用SDS PAGE在还原条件下测定时，具有大约40kDa的分子量，并且具有下列氨基末端序列M R H G D I S S S N D T V GMet Arg His Gly Asp Ile Ser Ser Ser Asn Asp Thr Val Gly(SEQ ID NO5)或其抗原性片段或同系物；或iV)用SDS PAGE在还原条件下测定时，具有大约45kDa的分子量，并且具有下列氨基末端序列M R A E L N Q G L I D F L K AMet Arg Ala Glu Leu Asn Gln Gly Leu Ile Asp Phe Leu Lys Ala(SEQ ID NO2)
或其抗原性片段或同系物；或v)用SDS PAGE在还原条件下测定时，具有大约80kDa的分子量，并且具有下列氨基末端序列M S E Q N N E Q R S Q A AMet Ser Glu Gln Asn Asn Glu Gln Arg Ser Gln Ala Ala(SEQ ID NO3)或其抗原性片段或同系物。
正如已经提及的，发明人分离的蛋白已经显示出抗原性，这些蛋白和/或其片段，因而能够用作疫苗或用于治疗或诊断由铜绿假单胞菌引起感染的试剂。
因此，本发明也提供了一种药物组合物，包含上面限定的蛋白(i)到(vi)和/或其抗原性片段的一个或多个，以及药学上可接受的赋形剂。
该组合物可以是疫苗组合物，在这种情况下，它也可以包含佐剂。本领域熟知的佐剂实例包括无机凝胶如氢氧化铝或油包水乳剂如不完全弗氏佐剂。其它有用的佐剂对本领域熟练技术人员是熟知的。
正如已经提及的，发明人分离的蛋白具有抗原性，因而本发明也提供了与上面限定的蛋白(i)到(vi)之一特异性结合的抗体。该抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。制备单克隆抗体和多克隆抗体的技术是本领域熟练技术人员熟知的。
人们熟知，可以筛选抗原性或免疫原性蛋白或多肽来鉴定表位区域，即那些负责蛋白或多肽的抗原性或免疫原性的区域。可用本领域熟练技术人员熟知的方法检测片段和/或同系物和/或衍生物的抗原性。因此，本发明的片段应该包括一个或更多这种表位区域或与这种区域足够相似以致保留着它们的抗原性/免疫原性特性。因此，对于根据本发明的片段，等同性的程度可能是无关的，因为它们可以与如这里描述的蛋白或多肽、同系物或衍生物的特定部分100％等同。关键的问题是，再重复一次，该片段保留着它所来源的蛋白的抗原性/免疫原性特性。
该蛋白可以通过多种途经给予，包括肠道给药，如口服、鼻腔、颊、局部和肛门给药，或非肠胃给药，如通过静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内途径。
当然，组合物和它含有的赋形剂采取的形式将依赖于所选择的给药途径。例如，口服制剂可以糖浆、酏剂、片剂或胶囊剂的形式，它可以被肠包衣以保护蛋白在胃中不降解。鼻腔或经皮制剂通常会分别是喷雾或膜片。注射用制剂可以是蒸馏水或另一药学上可接受溶剂或悬浮剂中的溶液或混悬剂。
在进一步的方面中，本发明提供了一种给受试者接种疫苗以抵抗铜绿假单胞菌的方法，包括给受试者施用有效量的这里限定的蛋白的步骤。
当非肠胃途径给药时，疫苗中本发明蛋白的适当剂量是大约5-100微克。然而，鼻腔或口服给药时，该剂量将高10-100倍，这依赖于制剂、佐剂、患者总体情况等。
如本领域熟练技术人员能领会到的，上述蛋白的抗原性片段可用到任何上述对于全长蛋白的应用中。
就每一方面而言，该发明的每一方面的优选特征可以进行必要的修改。这里提及的现有技术文件以法律允许的最全程度引入作为参考。


现在参考下列实施例和附图对本发明作更详细的描述，其中图1显示了用阴离子交换层析从粗Zwittergent提取物得到铜绿假单胞菌蛋白的洗脱分布图。
图2显示了铜绿假单胞菌粗Zwittergent提取物阴离子交换层析得到的峰馏分的SDS-PAGE分析。
图3显示了纯化的铜绿假单胞菌抗原的SDS-PAGE分析结果。样品在4-15聚丙烯酰胺凝胶上分析，考马斯染色。泳道1-分子量标准(左侧是kDa值)；2-Pa13；3-Pa20(ACP)；4-Pa40(酰胺酶)；5-Pa45；6-Pa80。
图4显示了Western印迹证明抗原特异性抗血清识别铜绿假单胞菌(385株)细胞裂解产物中的Pa80。
图5显示了铜绿假单胞菌385(血清型2)细胞裂解产物的斑点印迹，证明抗原特异性抗血清对Pa 80的识别。
图6显示了检测与铜绿假单胞菌结合的抗原特异性抗体(IgG)的计数(纵轴)和log荧光(水平刻度)图。曲线1代表非免疫血清的阴性结合，曲线2显示了与蛋白抗血清结合后的荧光检测。
A抗Pa13；B抗Pa20(ACP)；C抗Pa40(酰胺酶)；D抗Pa45；E抗Pa80图7显示了Pa40的DNA和翻译的氨基酸序列。
图8显示了Pa45的DNA和翻译的氨基酸序列。
实施例实施例1-从铜绿假单胞菌分离蛋白细菌株粘液型铜绿假单胞菌分离株385，血清型2用于纯化、免疫和同种攻击(homologous challenge)。这个菌株最初从慢性感染的囊性纤维化患者中分离。细菌原种于-80℃保存在补充10％甘油(v/v)的营养肉汤培养基(Oxoid Unipath Ltd，Basingstock，Hampshire，UK)中。
细菌生长条件每一提取使用二百个营养琼脂平板(Oxoid Unipath Ltd，Basingstock，Hampshire，UK)。细菌划线到琼脂平板上以使菌苔生长，并在37℃培养过夜。刮擦收集细菌并离心洗涤三次(12000×g，14分钟，4℃，Bechman离心机)。每一离心步骤后，保留细菌沉淀，接着重悬在新鲜无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中。
蛋白纯化洗过的细胞沉淀重悬在20ml 1M醋酸钠和1mM β-巯基乙醇(pH4)中。室温搅拌悬液45分钟后，加入80ml 500mM氯化钙、5％w/v的Zwittergent 3-14TM(Calbiochem，Alexandria，NS，澳大利亚)。在室温搅拌90分钟后，加入20％(v/v)无水乙醇。溶液在4℃放置两小时。悬液在4℃，17000×g离心15分钟，并将上清调至乙醇的终浓度为80％(v/v)。溶液4℃保存过夜。此溶液在4℃以17000×g离心25分钟，蛋白沉淀重悬在30ml缓冲液Z中(5％的Zwittergent3-14TM(w/v)，50mM Tris和0.01M EDTA，pH8.0)，并在室温温育45分钟。溶液在4℃以12000×g离心15分钟，保留上清并用蒸馏水4℃透析过夜。粗蛋白提取物冷冻到-70℃并冷冻干燥。
阴离子交换层析使用Bio-scale Q2TM和Q5TM柱(Bio-Rad)进行阴离子交换层析。该柱是用强碱性季铵基团(-N+(CH3)3)进行衍生化以促进带负电荷蛋白结合的MP10支持介质。用20ml缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH8.5)以2ml/分的流速平衡柱子。冷冻干燥的粗蛋白提取物重悬在缓冲液A中至＜5mg/ml(Q2)或＜20mg/ml(Q5)的浓度。加入浓度不断增加的缓冲氯化钠(缓冲液B，20mM Tris-HCl，pH8.5，500mM氯化钠)以1ml/分的流速从柱中洗脱蛋白。将峰顶馏分透析过夜，冰冻至-70℃并冷冻干燥以进行SDS-PAGE分析。分别混合不同峰的相应馏分用于进一步纯化。
用SDS制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳对已部分纯化的蛋白进行进一步纯化。来自阴离子交换柱的混合后馏分进行冷冻干燥，重悬在最小量的蒸馏水中并进一步溶解在四倍量的SDS还原缓冲液中(62.5mM Tris，pH6.8；10％v/v甘油；2％w/v SDS； 5％v/v β-巯基乙醇；1.2×10-3％w/v溴酚蓝)。该制品在加到电泳柱的浓缩胶上之前，在37℃温育至少30分钟。
制备型SDS-PAGE在Bio-Rad 491 Prep Cell，在28mm(内径)柱中聚合的带有10-ml 4％T-0.36％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺浓缩胶的20-ml 10％T-1.42％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺分离胶上进行。浓缩胶和分离胶由30％/2.67w/v丙烯酰胺/双丙烯酰胺单体贮存液(Bio-Rad)制备。在上室和下室中用1％(w/v)SDS、0.025MTris、0.2M甘氨酸缓冲液pH8.3使蛋白电泳。电泳条件是40mA和10W，14个小时。用0.025M Tris，pH8.3的缓冲液洗脱蛋白，以1ml/分的流速收集馏分6ml。收集到的馏分冰冻至-70℃，冷冻干燥，每第5个馏分用SDS-PAGE分析。接着混合鉴定到的含有相同蛋白的连续馏分。
电洗脱对一些纯化，用电洗脱替代制备型凝胶电泳。用Protean ITTMxicell(Bio-Rad)和垂直平板电泳装置电泳分离粗蛋白或部分纯化蛋白。用在16cm(w)×16cm(h)和1.0mm(d)装置中聚合的4％T-0.36％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺浓缩胶和10％T-1.42％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺分离胶进行电泳。以16mA迁移通过浓缩胶和以24mA在分离胶中分离进行电泳。
用完全Gel EluterTM(Bio-Rad)从平板胶中洗脱蛋白条带。洗脱是在25mA下，以横向通过胶厚度45分钟而进行的。真空下将洗脱到狭窄室的蛋白收集到12mm×75mm管中。
除去SDS电泳条件下分离的蛋白含有SDS，随后除去。这包括向浓缩蛋白馏分中加入磷酸钾至20mM的浓度。样品在冰上放置60分钟，6000×g和4℃下离心20分钟除去沉淀的SDS。通过透析将样品脱盐。
馏分分析用分析型SDS-PAGE和银染或考马斯染色估测液相柱层析和制备型凝胶电泳或电洗脱得到的馏分中的蛋白含量。用染色分析型SDS-PAGE凝胶证实特定洗脱馏分中感兴趣的蛋白的存在。混合仅含有均一(单一)条带的片段，用Pierce Micro BCATM蛋白测定试剂和PierceTM白蛋白标准(Laboratory Supplies，Marrickville，NSW，澳大利亚)测定蛋白浓度。
分析型SDS-PAGE
主要按Laenmli描述的进行SDS-PAGE分析以分析馏分中感兴趣蛋白的存在。将10μl馏分样品加入到等体积的含有SDS和二硫苏糖醇(DDT)的加样缓冲液中，并煮沸5分钟。使用BioradTM体系，梯度10到15％的小胶进行电泳。分子量标记(Pharmacia)在相同的小胶上迁移，以确定蛋白的分子量。
除去SDS这个方法包括向浓缩蛋白样品中加入磷酸钾至20mM的浓度。样品在冰上放置60分钟。在6000×g和4℃下，离心20分钟除去沉淀的SDS，然后对蒸馏水透析。
聚丙烯酰胺凝胶染色分析型SDS-PAGE后进行考马斯染色或银染。凝胶在考马斯染色液中染60分钟，其中含有1.0g考马斯蓝R-250染料(BioradTM)，在400ml甲醇、100ml醋酸和50ml去离子水中溶解。在400ml甲醇、100ml醋酸和50ml去离子水的脱色液中脱色过夜。银染包括在30％甲醇、10％醋酸和甲醛中固定4小时。用50％乙醇漂洗后，用0.8mM硫代硫酸钠预处理凝胶1分钟。用水漂洗三次后，接着在在银浸透液中温育20分钟。再用水漂洗两次后，在显影液(18％碳酸钠、甲醛和硫代硫酸钠)中温育。用50％甲醇和12％醋酸的溶液终止反应。
蛋白浓度的测定用Pierce Micro BCA蛋白测定试剂和Pierce白蛋白标准(Laboratory Supplies，Marrickville，NSW，澳大利亚)测定蛋白浓度。
脂多糖的测定用银染SDS-PAGE凝胶和用E-TOXATE limulus溶解试验(Sigma，StLouis，Mo.USA)来估测脂多糖(LPS)的存在。
结果图1显示了铜绿假单胞菌Zwittergent提取物阴离子交换层析的洗脱分布图。清晰可见七个峰。前5个峰分开混合，用SDS PAGE分析并测定蛋白的分子量(图2)。用制备型电泳进一步纯化蛋白，以进行实施例4中讨论的免疫研究。图3显示了用于免疫研究的纯化蛋白的SDS-PAGE分析。
实施例2Pa80的纯化将分离足够用于免疫研究数量的蛋白纯化方案用于来自铜绿假单胞菌的蛋白。利用Zwittergent去污剂提取、液相柱层析和制备型SDS-PAGE三个阶段的方法进行分离。抗原Pa80从铜绿假单胞菌385(血清型2)纯化。SDS-PAGE证实纯化样本的均一性。分离Pa80(80kDa)，证实没有内毒素污染，因而适合研究其疫苗潜力。
材料和方法用铜绿假单胞菌株385(血清型2)细菌纯化Pa80用于免疫研究。细菌生长过夜，收集，洗涤，如前所述(实施例1)获得粗去污剂可提取蛋白制备物。冷冻干燥的粗提取物重悬于最少量的蒸馏水和SDS还原缓冲液中。用阴离子交换层析和制备型SDS-PAGE纯化Pa80，用Pa80特异性抗血清进行Western和斑点印迹杂交。对于Western杂交，采用10-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶(BioRadTM)的分析型SDS-PAGE，电泳分离铜绿假单胞菌的细胞溶解产物，用半干转移装置(BioRadTM)转移到硝酸纤维素膜(BioRadTM)上。在1％w/v脱脂乳的Tris缓冲盐水(TBS)中封闭60分钟后，膜与1/1000稀释的混合免疫血清在室温温育90分钟。接着用TBS和0.05％Tween 20(TTBS)洗膜，与1/1000稀释的耦合了辣根过氧化物酶(HRP)的抗大鼠IgG共同温育90分钟。用HRP显影剂(BioRadTM)进行印迹的显影并用GS570光密度计(BioRadTM)扫描。Pa385(血清型2)细胞溶解产物的斑点印迹直接应用于硝酸纤维素膜。后续步骤与Western杂交一样。
结果用Zwittergent提取法纯化Pa80本研究用Pa80特异性抗血清证实了对细胞溶解物中Pa80的免疫识别。(图4和图5)
用阴离子交换层析纯化Pa80用阴离子交换层析进一步分离Zwittergent提取的粗蛋白。Bio-scale Q2柱(BioRadTM)，一般来说，将复杂提取物分离为七个分离的蛋白峰(图1)。Pa80出现在第五个峰中并在SDS-PAGE上鉴定出分子量(图2)。从阴离子柱中洗脱Pa80的条件是80％缓冲液A(20mM Tris pH8.5)与20％缓冲液B(1.5M NaCl，20mM Tris，pH8.5)，UV(AU)0.228，导电率(mS/cm)0.674。
用制备型SDS-PAGE纯化Pa80用BioRad Prep cell491型和Protean II制备型SDS-PAGE在变性条件下进一步从含有Pa80的馏分中纯化蛋白。
通过银染凝胶的检验来测定LPS污染的存在。用E-TOXATE Limulus溶解试验定量化发现所有制备物低于检测水平(限度是0.015 EU/ml)。
表1.每一铜绿假单胞菌(385株)提取的Pa80产量

讨论Pa80的鉴定联合使用Zwittergent提取和阴离子交换层析已经将Pa80纯化均一。该蛋白被免疫大鼠血清识别并显示出抵抗活铜绿假单胞菌对肺攻击的保护性(见实施例4)。该蛋白代表以前未检测的可用于抗铜绿假单胞菌感染的免疫的抗原。
实施例3-纯化蛋白的测序Pa80的NH2末端和内部氨基酸序列分析都在BiomolecularResource Facility，分子结构和功能中心，澳大利亚国立大学和Liverpoor U.K大学进行。用SDS-PAGE相容的S-2-氨甲酰乙基化方法进行测序。蛋白烷基化反应在10％甘油(v/v)，5％(w/v)SDS，0.25MTris HCl，100mM 1，4-二硫苏糖醇(1，4-DTT)，pH8.3的溶液中进行。通过在90℃温育该混合物15分钟初次还原蛋白。接着将样品冷却至37℃，加入丙烯酰胺至终浓度3M并将混合物在氩中避光温育30至60分钟。加入SDS还原缓冲液，样品进行SDS-PAGE，通过考马斯染色可看到蛋白，从凝胶中切下蛋白。测序后，获得的数据进行BLAST检索(基础本地比对检索工具；国家生物技术信息中心，Bethesda，MD，USA)。
对于Pa80，样品在SDS-PAGE凝胶中迁移并Western印迹到PVDF。切下条带，直接放到测序仪上。采用Edman降解法进行N末端分析。
蛋白抗原纯化及其鉴定如上所述，从铜绿假单胞菌385中纯化蛋白。用SDS-PAGE(图3)以及氨基酸测序估计蛋白纯度，二者均成功鉴定到均一蛋白样品。蛋白样品中LPS水平估定显示没有用E-TOXATE试剂盒limulus试验(试验的检测限度是0.015内毒素单位/ml)可检测到的内毒素水平。
N末端氨基酸测序后，为了鉴定蛋白，用“Entrez”进行Genbank序列和在因特网PA01数据库中公布序列的电子数据库检索(见表2)。Pa13的N末端序列测定是AETIVNTTKA(SEQ ID NO1)。这10个残基序列与铜绿假单胞菌无匹配，表明该蛋白尚未被测序。
测定Pa20的N末端序列是STIEERVKKIVAEQL(SEQ ID NO4)，它与来自铜绿假单胞菌(DDBJ/EMBL/GenBank注册号054439)和丁香假单胞菌(DDBJ/EMBL/GenBank注册号P80923)的酰基载体蛋白有15个氨基酸重叠的100％等同性。
测定Pa40的N末端序列是MRHGDISSSNDTVG(SEQ ID NO5)，它与来自铜绿假单胞菌的酰胺酶(DDBJ/EMBL/GenBank注册号P11436和M27612)有14个氨基酸重叠的100％等同性。
测定Pa45的N末端序列是MRAELNQGLIDFLKA(SEQ ID NO4)。
测定Pa80的N末端序列是MSEQNNEQRSQAA(SEQ ID NO3)。表2-从铜绿假单胞菌385株纯化的蛋白抗原N末端氨基酸测序的鉴定

实施例4-免疫接种大鼠模型后细菌清除率实验第1天，无特定病原体雄性DA大鼠接受集合淋巴小结内(IPP)免疫接种，第14天气管内(IT)加强，和第21天给予活细菌攻击。麻醉镇静动物。通过腹中线切开暴露小肠，用27号针浆膜下给每个集合淋巴小结注射抗原。免疫蛋白是将每毫升100或200μg的蛋白(每只大鼠分别总接种5或10μg)以1∶1比率乳化于不完全弗氏佐剂(IFA)和磷酸缓冲盐水(PBS)中制成的。IPP免疫接种后14天，用含5或10μg蛋白的50μl PBS给动物进行IT加强。IPP免疫接种后21天，动物接受活铜绿假单胞菌(细菌计数5×108CFU)攻击4小时。细菌在营养琼脂平板上5％CO2中37℃过夜、回收、洗涤并在PBS中重悬至需要的浓度。用于IT加强的蛋白和攻击的细菌通过经口插入气管的套管导入镇静大鼠的肺中。细菌攻击后，在第4小时动物安乐死。收集血液，取等分的血清保存在-20℃用于抗体分析。用5×2ml PBS灌洗肺，混合灌洗物(BAL)估计细菌数量。肺灌洗后，移出肺，匀浆并估计细菌数量。对实施例1中分离的所有蛋白进行实验。但仅列出显示了保护性效果的那些蛋白。
结果-免疫接种对肺清除率的影响表3显示了初次IPP和第二次IT免疫接种的剂量和被处理动物的数量(N)。表4显示了免疫过的和对照大鼠得到的细菌清除率水平。结果证明BAL和肺匀浆物的清除率水平均没有显著的差异，除了用Pa20(ACP)免疫接种组发现有差异，尽管负载细菌减少，但它没有达到统计学显著性。
表3-用于IPP和IT免疫接种的纯化蛋白的浓度

表4-从用蛋白抗原免疫接种和免疫接种后用活铜绿假单胞菌攻击的大鼠回收的活细菌

在表4中，攻击后4小时，铜绿假单胞菌的CFU(log10)显示的值是在用活铜绿假单胞菌匀一攻击肺后4小时后BAL液或大鼠肺匀浆物的平均值±标准误。
Pa40(酰胺酶)、Pa45和Pa80的BAL值与未免疫组有显著性差异，p＜0.01。
Pa13的BAL值和Pa13、Pa20(ACP)、Pa40(酰胺酶)、Pa45和Pa80的肺匀浆物值与未免疫和单一免疫组有显著性差异，p＜0.05。
实施例5-流式细胞术铜绿假单胞菌385株在营养肉汤培养基中生长至对数中期阶段并以1000×g 4℃离心10分钟收获。接着细菌以1∶50的稀释液(PBS中)与非免疫血清、免疫血清或PBS在37℃培养1小时。离心细胞，去除上清并将细菌重悬于200μl用PBS 1∶50稀释的偶联了异硫氰酸荧光素的抗大鼠IgG中。在37℃培养30分钟后，加入1.8mlPBS并用流式细胞术(Coulter ZL-MCL)分析细菌细胞。共计数20000个细胞，以及在向前散射、侧散射和荧光的对数模式的仪器状态获得数据。
结果未免疫大鼠血清用作对照，显示没有与铜绿假单胞菌非特异性结合(图6曲线1)。来自免疫接种大鼠蛋白的血清的结合程度在图6中曲线2显示。结合的程度由图中荧光曲线向右移的程度决定。因此，抗Pa13没有显示表面结合，而抗Pa20(ACP)、Pa40(酰胺酶)、Pa45和Pa80的抗血清显示出与铜绿假单胞菌显著的表面结合。
实施例6 Pa40和Pa45基因的克隆铜绿假单胞菌Pa385染色体DNA的纯化铜绿假单胞菌如实施例1中描述的生长。用30ml PBS洗涤细菌并以4,000rpm离心10分钟回收，重复步骤。洗过沉淀重悬于含0.4MEDTA 0.4ml的50mM Tris HCl 10ml中并在37℃培养20分钟。接着加入20mg/ml的溶菌酶0.4ml，混合物进一步在37℃温育10分钟后加入540μg蛋白酶K，0.4ml 10％w/v SDS和10μl 10mg核糖核酸酶A/ml。接着混合物在37℃温育2小时直到悬液澄清。对于第一次提取，加入用10mM Tris-HCL和1mM EDTA饱和的酚8ml，在37℃ 30秒混合，提取DNA相。对于第二次提取，将DNA相转移到含有5ml酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)的第二个试管中，在冰上混合30秒。接着混合物在4℃以8,000rpm离心15分钟。对于第三次提取，DNA相转移到含有5ml氯仿/异戊醇(24∶1)的试管中，在4℃以8,000rpm离心15分钟。第四次提取重复第三次提取的步骤。用2倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA。卷曲DNA浸入70％v/v乙醇中并悬浮在1-2ml TE缓冲液中并4℃保存。
寡核苷酸的设计选择定点克隆以确保正确定位到阅读框架。最大限度增加GC含量，寡核苷酸由GIBCO BRL定制引物(Life Technologies，Rockville，MD)获得并设计如下Pa40BF，编码酰胺酶基因起始的5’寡核苷酸。序列(5’至3’)GGCGGA TCC CGT CAC GGC GAT ATT TCC AGC AGC A。该寡核苷酸长度是34-mer并插入了BamH1限制性位点。耦合有效性估计为99％以及GC含量是61％。
Pa40HR，编码酰胺酶基因3’末端的3’寡核苷酸。序列(5’至3’)GGCAAG CTT GGC CTC CTT CTC CAG TCC CTC。该寡核苷酸长度是30-mer并插入了HindIII限制性位点。耦合有效性估计为99％以及GC含量是63％。
Pa45BF，编码Pa45基因起始的5’寡核苷酸。序列(5’至3’)GGC GGATTC CGC GCA GAA CTC AAC CAG GGC CTG。该寡核苷酸长度是33-mer并插入了BamH1限制性位点。耦合有效性估计为99％以及GC含量是67％。
Pa45HR，编码Pa45基因3’末端的3’寡核苷酸。序列(5’至3’)GGCAAG CTT GGG CAG CTC GCT GCT GGC GTA GAA。该寡核苷酸长度是33-mer并插入了HindIII限制性位点。耦合有效性估计为99％以及GC含量是63％。
聚合酶链式反应PCR反应混合物由1ng Pa DNA，15pmol引物(每条)，7.5μm dNTP(每种)和1U Taq DNA聚合酶(QIAGEN)组成，反应混合物共50μl。用于扩增的条件是循环1[94℃-3分钟，55℃-10秒，72℃-15秒]×1循环；循环2[94℃-10秒，50℃-10秒，72℃-15秒]×35循环；循环3[72℃-5分钟，25℃-1分钟]×1循环，使用CorbettFTS4000热测序仪(Corbett research，悉尼，NSW，澳大利亚)。PCR产物的大小和非特异性产物在1％琼脂糖凝胶上电泳肉眼评估。
Pa40和Pa45基因的克隆PCR后，用二氧化硅基质方法(Progen Industries)去除未用完的dNTPS，用琼脂糖凝胶上显现纯化产物检查回收率。PCR产物与pGEMT-简单载体系统(Promega，USA)连接。用T4 DNA聚合酶在厂商推荐的标准条件下实施插入片段与载体的连接。样品置于4℃过夜。
连接的DNA用CaCl2方法转化。感受态JM109细胞在冰上解冻5分钟，加入900μl 0.1M CaCl2。每200μl等分，加入1μl DNA。使用没有插入的阳性对照质粒，和用水代替DNA的阴性对照。细胞在冰上孵育30分钟，在45℃接着热休克45秒。细胞放置到1ml等分LB培养基中，放在37℃，以150rpm振荡1小时使细胞复苏。1∶100和1∶10稀释(用LB肉汤培养基稀释)的转化混合物和未转化的混合物放在含100μg氨苄青霉素/ml的LB琼脂平板上。然后估计每微克质粒的转化体数量。
少量培养物的快速筛选选择转化体的单一克隆并加入到含50μg/ml氨苄青霉素/ml、X-Gal和IPTG的5ml LB肉汤培养基中并以180rpm在37℃培养过夜。载体线性化后，在琼脂糖凝胶上肉眼观察检测白克隆的插入。
DNA序列的鉴定在NSW大学对来自重组质粒的双链DNA进行测序。用于测序的产物通过用pUC/M13正向和反向引物和Big Dye终止子与3.2pmol引物和100ng模板混合，用无菌水制成10μl体积而制成。测序循环[96℃-10秒，50℃-5秒，60℃-4分钟]×25循环在Corbett FTS4000热测序仪上进行。用DNA Strider1.3进行序列分析。
结果Pa40的序列和证实杂交株的存在对来自铜绿假单胞菌385的Pa40的序列分析显示在图7中。确定的核酸序列的N末端区氨基酸翻译与N末端氨基酸测序得到的SEQ IDNo5下所列氨基酸相符。用特异性引物Pa40BF和Pa40HR进行PCR估计其它铜绿假单胞菌菌株和血清型中Pa40基因的存在。结果证明在所有被测的菌株和血清型中均存在正确大小的PCR产物(见下表5)。
Pa45的序列和证实杂交株的存在对来自铜绿假单胞菌385的Pa45的序列分析显示在图8中。确定的核酸序列的N末端区氨基酸翻译与N末端氨基酸测序得到的SEQ ID No2下所列氨基酸相符。用特异性引物Pa45BF和Pa45HR进行PCR估计其它铜绿假单胞菌菌株和血清型中Pa45基因的存在。结果证明在大多数被测的菌株和血清型中均存在正确大小的PCR产物(见下表5)。血清型Pa373、血清型12、血清型14和血清型17没有得到PCR产物。表5各种血清型和临床分离株中Pa40和Pa45基因的PCR分析+＝存在扩增基因＝无PCR产物

权利要求
1.来自铜绿假单胞菌的蛋白质或其抗原性片段或同系物，其中该蛋白质具有用SDS PAGE在还原条件下测定的大约13kDa的分子量，并具有下列氨基末端序列A E T I V N T T K AA1a Glu Thr Ile Val Asn Thr Thr Lys Ala(SEQ ID NOI)。
2.来自铜绿假单胞菌的蛋白质或其抗原性片段或同系物，其中该蛋白质具有用SDS PAGE在还原条件下测定的大约45kDa的分子量，并具有下列氨基末端序列M R A E L N Q G L I D F L K AMet Arg Ala Glu Leu Asn Gln Gly Leu Ile Asp Phe Leu Lys Ala(SEQ ID NO2)。
3.来自铜绿假单胞菌的蛋白质或其抗原性片段或同系物，其中该蛋白质具有用SDS PAGE在还原条件下测定的大约80kDa的分子量，并具有下列氨基末端序列M S E Q N N E Q R S Q A AMet Ser Glu Gln Asn Asn Glu Gln Arg Ser Gln Ala Ala(SEQ ID NO3)。
4.分离和纯化的蛋白的制备方法，该方法包括下列步骤(a)制备铜绿假单胞菌培养物，使培养物在适当的条件下生长并收获培养物，之后离心洗涤得到洗过的细胞沉淀；(b)在适当的缓冲液中重悬洗过的细胞，之后破裂细胞；(c)离心去除细胞碎片，得到含有可溶性细胞蛋白质的上清液；(d)采用氯化钠梯度洗脱对所得溶液进行阴离子交换层析，并合并对应于每个分离峰的馏分；(e)使用在28mm(内径)柱中聚合的带有4％T-0.36％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺浓缩胶的10％T-1.42％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺分离胶通过SDS-PAGE纯化蛋白馏分，在上室和下室中用1％(w/v)SDS、0.025M Tris、0.2M甘氨酸缓冲液pH8.3以40mA和10W电泳14个小时，用0.025M Tris，pH8.3的洗脱缓冲液洗脱蛋白，以1ml/分钟的流速收集馏分6ml；和(f)选择包含具有13kDa、45kDa或80kDa分子量的蛋白质的馏分，并从选择的馏分中分离该蛋白质。
5.编码权利要求1至3任一项的蛋白质、其同系物或抗原性片段的核酸或与之互补的核酸。
6.包含权利要求5的核酸的载体。
7.转化了权利要求5的核酸的生物体。
8.权利要求1至3任一项的蛋白质的制备方法，该方法包括表达权利要求5的核酸。
9.用于医学，尤其是用于铜绿假单胞菌感染的治疗、预防或诊断的蛋白质，其中该蛋白质来自铜绿假单胞菌，并且i)具有用SDS PAGE在还原条件下测定的大约13kDa的分子量并且具有下列氨基末端序列A E T I V N T T K AAla Glu Thr Ile Val Asn Thr Thr Lys Ala(SEQ ID NO1)或其抗原性片段或同系物；或ii)具有用SDS PAGE在还原条件下测定的大约20kDa的分子量并且具有下列氨基末端序列S T I E E R V K K I V A E Q LSer Thr IIe Glu Glu Arg Val Lys Lys IIe Val Ala Glu Gln Leu(SEQ ID NO4)或其抗原性片段或同系物；或iii)具有用SDS PAGE在还原条件下测定的大约40kDa的分子量并且具有下列氨基末端序列M R H G D I S S S N D T V GMet Arg His Gly Asp Ile Ser Ser Ser Asn Asp Thr Val Gly(SEQ ID NO5)或其抗原性片段或同系物；或iV)具有用SDS PAGE在还原条件下测定的大约45 kDa的分子量并且具有下列氨基末端序列M R A E L N Q G L I D F L K AMet Arg Ala Glu Leu Asn Gln Gly Leu Ile Asp Phe Leu Lys Ala(SEQ ID NO2)或其抗原性片段或同系物；V)具有用SDS PAGE在还原条件下测定的大约80kDa的分子量并且具有下列氨基末端序列M S E Q N N E Q R S Q A AMet Ser Glu Gln Asn Asn Glu Gln Arg Ser Gln Ala Ala(SEQ ID NO3)或其抗原性片段或同系物。
10.分离和纯化的蛋白的制备方法，该方法包括下列步骤(a)制备铜绿假单胞菌培养物，使培养物在适当的条件下生长并收获培养物，之后离心洗涤得到洗过的细胞沉淀；(b)在适当的缓冲液中重悬洗过的细胞，之后破裂细胞；(c)离心去除细胞碎片，得到含有可溶性细胞蛋白质的上清液；(d)采用氯化钠梯度洗脱对所得溶液进行阴离子交换层析，并合并对应于每个分离峰的馏分；(e)使用在28mm(内径)柱中聚合的带有4％T-0.36％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺浓缩胶的10％T-1.42％C丙烯酰胺-N，N-甲叉双丙烯酰胺分离胶通过SDS-PAGE纯化蛋白馏分，在上室和下室中用1％(w/v)SDS、0.025M Tris、0.2M甘氨酸缓冲液pH8.3以40mA和10W电泳14个小时，用0.025M Tris，pH8.3的洗脱缓冲液洗脱蛋白质，以1ml/分钟的流速收集馏分6m1；和(f)选择包含具有20kDa或40kDa分子量的蛋白质的馏分，从选择的馏分中分离蛋白质。
11.检测和/或诊断铜绿假单胞菌的方法，包括(a)使待检测的样品接触选自权利要求9中限定的抗原性蛋白和/或其抗原性片段的一个或多个抗原；以及(b)检测针对铜绿假单胞菌的抗体的存在。
12.权利要求9中限定的蛋白质或其抗原性片段在制备用于治疗、预防或诊断铜绿假单胞菌感染的试剂中的应用。
13.药物组合物，包含权利要求9中限定的蛋白(i)到(v)或其抗原性片段的一个或多个，以及药学上可接受的赋形剂。
14.权利要求13的药物组合物，其是疫苗组合物并进一步包含佐剂。
15.与权利要求9中限定的蛋白(i)到(v)之一特异性结合的抗体。
16.给受试者接种疫苗以抵抗铜绿假单胞菌的方法，包括给受试者施用有效量的权利要求9中限定的蛋白质或其抗原性片段的步骤。
全文摘要
来自铜绿假单胞菌的蛋白是抗原性的，在铜绿假单胞菌感染的治疗、预防和诊断中有用。
文档编号A61P31/04GK1409764SQ00817159
公开日2003年4月9日 申请日期2000年12月4日 优先权日1999年12月3日
发明者A·W·克里普斯, J·M·基德, L·D·托马斯 申请人:普罗瓦利斯英国有限公司