基因重组抗体及其抗体片段的制作方法

专利名称：基因重组抗体及其抗体片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及与人类CC亚家族趋化因子受体4(下文称作“CCR4”)的胞外域具有特异性作用的重组抗体及其抗体片段。此外，本发明也涉及人源化抗体、人抗体等重组抗体以及这些抗体的片段，它们特异地与CCR4作用、具有细胞毒性和抑制Th2细胞产生细胞因子的活性、并且包括一个特异性的互补性决定区(下文称作“CDR”)。此外，本发明也涉及编码以上提及的抗体的DNA。另外，本发明还涉及包含该DNA的载体和由此载体转化的转化子。进一步而言，本发明还涉及利用该转化子制造以上提及的抗体的方法，和用于Th2-介导的免疫疾病如变应性疾病等的治疗剂、诊断剂等药物，其中包括应用该抗体。仍进一步而言，本发明还涉及用于癌症如血癌，例如白血病的诊断剂和治疗剂等药物，其中包括应用该抗体。
细胞因子和趋化因子由辅助T细胞产生，其在细胞表面表达CD4(下文中称为“CD4+Th细胞”)。实际上在支气管哮喘病人的导气管发炎部位明显地发现了辅助T细胞的渗透物，其中有相当数量的T细胞被激活，并且哮喘的严重程度和导气管超敏性程度与活化的T细胞数目相关，而且活化的T细胞在外周血中也有增加。(Am.Rev.Respir.Dis.，145s22(1992))。
辅助T细胞依赖于其产生的细胞因子的不同分为Th1细胞和Th2细胞(Annu.Rev.Immunol.，7145(1989))。由Th2细胞产生的细胞因子的实例包括IL-4、IL-5、IL-13等。
已经发现分离自特应性疾病的病人的一个抗原特异性的T细胞克隆在体外受刺激时，释放Th2细胞因子(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，884538(1991))，并且Th2细胞存在于支气管肺泡灌洗液(下文中称为“BAL”)和哮喘病人的导气管粘膜中(N.Engl.J.Med.，326298(1992.Eur.J.Immunol.，231445(1993))。当通过一个变态发炎的动物模型来检查mRNA在BAL中的表达时，Th2细胞的细胞因子IL-4和IL-5表现增加。(Clin.Immunol.Immunopathol.，7575(1995))。当小鼠中诱导的Th2细胞被施用到静脉和鼻腔时，在肺部引发一种抗原特异性的哮喘样发炎症状(J.Exp.Med.，1861737(1997)，J.Immunol.，1601378(1998))和引起嗜酸粒细胞增多(J.Immunol.，1613128(1998))。在哮喘病人的导气管粘膜上和特应性皮炎病人的损害中观察到IL-5的表达。(J.Clin.Invest.，871541(1991)，J.Exp.Med.，173775(1991))，并且在连续性的过敏性鼻炎的粘膜中IL-13的表达水平与血清中的总IgE数量和抗原特异性的IgE呈现相关性(Therapeutics，3219(1998))。
趋化因子是具有白细胞迁移和白细胞活化功能的碱性肝素结合蛋白的总称，且根据保守的cys残基在一级结构中的位置分为CXC，CC，C和CX3C亚家族。迄今为止，已经确定了16种趋化因子的受体(Curr.Opi.Immunol.，11626(1999))，并且已经证明出在每一个白细胞如Th1细胞，Th2细胞等的表面上，每一种趋化因子受体的表达是不同的(Cell Engineering，171022(1998))。
人的CCR4是一个跨膜7次的G蛋白复合受体，已经从人非成熟的嗜碱细胞系KU-812中克隆，命名为K5-5，其氨基酸序列表示在SEQ ID NO17中。由于认为CCR4的跨膜区是氨基酸序列中的第40-67位，第78-97位，第113-133位，第151-175位，第207-226位，第243-270位和第285-308位。胞外区被认为是第1-39位，第98-112位，第176-206位，和第271-284位，且胞内区是位于第68-77位，第134-150位，第227-242位和第309-360位(J.Biol.Chem.，27019495(1995))。据报道，在进行克隆时，CCR4的配体是MIP-1α(巨嗜细胞炎症蛋白1α)，RANTES(受激活作用调节的正常T细胞表达并可能分泌的蛋白质)或MCP-1α(巨嗜细胞趋化蛋白-1α)(Biochem，Biophys，Res.Commun.，218337(1996)，WO96/23068)。然而，其后发现受刺激的人外周血单核细胞(下文称作“PBMC”)和胸腺细胞(J.Biol.chem.，27121514(1996))产生的TARC(胸腺和激活作用调节性趋化因子-)与CCR4特异性结合(J.Biol.Chem.，27215036(1997))。也有报道说分离于巨噬细胞的MDC(源于巨噬细胞的趋化因子)(J.Exp.Med.，1851595(1997))，也称为STCP-1(刺激T细胞趋化性蛋白-1)(J.Biol..Chem.，27225229(1997))，与CCR4的结合比TARC更强(J.Biol.Chem.，2731764(1998))。
已经证明CCR4在产生细胞因子和/或趋化因子的CD4+Th细胞中被表达(J.Biol.Chem.，27215036(1997))，且有报道说CCR4选择性地表达于CD4+Th2细胞中的Th2细胞中(J.Exp.Med.，187129(1998)，J.Immunol.，1615111(1998))。此外，已经发现CCR4+细胞是属于效应/记忆T细胞(CD4+/CD45RO+)组，且当CCR4+细胞受到刺激，产生IL-4和IL-5，但不产生IFN-γ(Int.Immunol.，1181(1999))。也有报道说CCR4+属于记忆T细胞中的一个CLA(皮肤淋巴细胞抗原)-阳性和α4β8整连蛋白-阴性组中，且CCR4表达于与消化道免疫无关而于皮肤及其类似物的系统性免疫有关的记忆T细胞上(Nature，400776(1999))。这些结果有力地暗示一种可能性，也就是通过炎症诱导激活的记忆T细胞表达CCR4，通过配体、MDC和TRAC迁移至炎症部位，且加速了其它炎性细胞的激活。
就目前治疗Th2-介导的免疫疾病而言，已经发展了以下方法(1)细胞因子和趋化因子的拮抗剂，例如一种人源化抗-IL-5抗体(SB-240563Smith Kline Beecham，Sch-55700(CDP-835)Shehling Plaw/Celltech)，一种人源化IL-4抗体(US专利5,914,110)，一种可溶性趋化因子受体(J.Immunol.，160624(1998))，等等；(2)细胞因子趋化因子产生抑制剂，例如一种IL-5产生抑制剂(日本公开的未经过实审的专利申请53355/96)，一种类维生素A拮抗剂(WO 99/24024)，splatast tosilate(IPD-1151T，由Taiho Pharmaceutical制造)，等等；(3)用于嗜酸性粒细胞、肥大细胞等最终炎细胞的药剂，例如一种人源化IL-5受体抗体(WO97/10354)，一种CC趋化因子受体3(CCR3)的拮抗剂(日本公开的未经过实审的专利申请147872/99)，等；(4)炎症分子抑制剂例如一种人源化抗-IgE抗体(Am.J.Respir.Crit.Care Med.，1571429(1998))等及类似物。但是它们只是抑制细胞因子趋化因子和炎性细胞的精密网络中的一部分，所以并不是根本办法。抗-CD4抗体有能力控制T细胞，且对于严重的类固醇依赖性哮喘有效。可是，由于CD4分子广泛地表达于各种免疫细胞，它们缺乏特异性，并且具有伴随着的强免疫抑制效应的缺陷(Int.Arch.Aller.Immunol.，118133(1999))。
所以，为了抑制所有这些，需要特异地控制产生问题的变态反应的上游，即Th2细胞。
对于严重的Th2介导的免疫疾病的病人，目前应用的主要治疗方法是使用类固醇，但不能避免类固醇的副作用。同时具有当暂停使用后，每一个病人的状况又回复到以前的病例状态的缺点，并且当类固醇使用一段时间后又会产生抗药性。
至今，还没有建立这样的单克隆抗体，即可以检测到CCR4-表达细胞，并且同时对CCR4-表达细胞具有细胞毒性。此外，目前还没有一种可以抑制Th2细胞因子产生的治疗剂。
尽管已经有报道，CCR4也表达于白血病(Blood，96685(2000))，但是目前还没有可以杀伤白血病细胞的治疗剂。
一般认为，将一种来自一种非-人动物的抗体，如，一种鼠源抗体，给人使用时，它被识别为外来物质并且在人体中诱导人抗体来对抗鼠源抗体(人抗-鼠抗体下文称为“HAMA”)。已知HAMA与使用的鼠抗体反应引起副作用(J.Clin.Oncol.，2881(1984)；Blood，651349(1985)；J.Natl.Cancer Inst.，80932(1988)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，821242(1985))，并且加速使用的鼠源抗体从身体中的消失(J.Nucl.med.，261011(1985)，Blood，651349(1985)，J.Natl.Cancer Inst.，80937(1988))，且降低了鼠源抗体的治疗效果(J.Immunol.1351530(1985)，Cancer Res.，466489(1986))。
为了解决这些问题，试图应用基因工程技术转化一种来自非人动物的抗体为人源化抗体，如，人嵌合抗体，人互补决定区(下文称为“CDR”)-移植抗体或类似物。人嵌合抗体是一种抗体，其中该抗体的可变区(下文称为“V”区)是一个来自非人动物的抗体，而其恒定区(下文称为“C”区)是来自于一个人抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，816851(1984))。人CDR-移植抗体是一种抗体，其中来自于非人动物的抗体V区的CDR的氨基酸序列是被移植于人抗体的相应位置上(Nature，321522(1986))。与来自于非人动物如鼠抗体等抗体相比较，这些人源化抗体在临床应用上具有多种优点。例如，考虑到免疫原性和血液中的稳定性，有报道说一种人嵌合抗体在血液中的半寿期，大约是使用于人的鼠抗体的6倍。(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，864220(1989))。在应用人CDR-移植抗体中，有报道说其免疫原性降低，并且在猴试验中其血清半寿期是实验中鼠抗体的4-5倍(J.Immunol.，1471352(1991))。所以期望人源化抗体与来自于非人动物的抗体相比具有更小的副作用，且其治疗效果可以持续更长的时间。同时，尤其是在降低CCR4-表达细胞数量上的治疗中，通过抗体的Fc区(此区包括重链铰链区和其后区域)发挥作用的更高的细胞毒性，如补体-依赖的细胞毒性(下文称为“CDC”活性)，抗体依赖的细胞-介导的细胞毒性(下文称为“ADCC”活性)等等，对于治疗效果很重要。有报道说在这些细胞毒性中，人的抗体优于来自于非人动物的抗体，因为人抗体的Fc区域比源于非人动物抗体的Fc区可以更有效地激活人补体成分和在细胞表面具有Fc受体的人效应细胞，例如单核细胞，巨噬细胞，天然杀伤细胞(NK细胞)，等等。例如，有报道说人效应细胞的肿瘤细胞毒性在人嵌合抗体中增加，该嵌合抗体通过转换一个鼠源的针对GD2的抗体的Fc区域为人抗体的Fc区域(J.Immunol.，1441382(1990))，并且对于针对CAMPATH-1抗原的人CDR-移植抗体也有类似的结果报道(Nature，332323(1988))。
这些结果明确地证明，在作为抗体用于人的临床应用中时，人源化抗体优选于源自非人动物的抗体如鼠抗体等。
此外，按照最近蛋白质工程和基因工程的进展，可以产生具有相对小的分子量的抗体片段，例如Fab，Fab’，F(ab)2，单链抗体(下文称为“scFv”)(Science，242423(1988))，二硫键稳定的V区片段(下文称为“dsFv”)等等(Molecular.Immunol.，32249(1995))。由于这些片段的分子量小于完整的抗体分子，在进入靶组织的转移能力上，它们很优秀(Cancer Res.，523402(1992))。在临床应用于人的过程中，人们认为源于人源化抗体的这些片段优于那些源于非人动物如鼠的抗体的片段。
正如以上所述，单独使用源于人源化抗体和抗体片段具有可以期待的诊断和治疗效果，但是已经尝试通过联合使用其它分子来更进一步增强效果。例如，细胞因子可以作为这种分子之一加以使用。细胞因子是对在免疫反应中控制胞内相互作用的多种可溶性因子的总称。例如，CDC活性和ADCC活性是已知的抗体细胞毒性，且ADCC活性是被在细胞表面上具有Fc受体的效应细胞如单核细胞、巨噬细胞、NK细胞等控制的(J.Immunol.，1381992(1987))。由于多种细胞因子活化这些效应细胞，为了增加抗体的ADCC的活性等，它们可以与一个抗体一并使用。
本发明的发明人已获得来自于杂种瘤KM2160中的编码抗体H链和L链的cDNA，该杂交瘤可以产生针对CCR4的鼠单克隆抗体，属于IgG1类；已经发现V区域CDR具有新的氨基酸序列，并且已经构建了一个人源化抗体表达载体，是通过克隆具有新的CDR的、编码H链V区和L链V区的cDNA至一个动物细胞表达载体中而构建，该载体具有编码人抗体H链C区和人抗体L链C区的cDNA序列。通过把该表达载体导入动物细胞，表达抗-CCR4嵌合抗体KM2760，并且纯化。本发明通过证实该抗体特异地与人CCR4反应，且通过其具有的强细胞毒性降低了抗原-阳性细胞的数量，通过在人体中应用该抗体显示其实用性而予以完成。
此外，本发明人通过确定针对CCR4的一种重组抗体可以以高频率地与白血病细胞，特别是T细胞白血病细胞反应，并且通过其强大的细胞毒性降低了CCR4-阳性白血病细胞的数量，并且通过在诊断和治疗如人白血病等血癌中显示该抗体的实用性，完成了本发明。
本发明涉及下述的(1)到(47)。
(1)一种重组抗体或抗体片段，其可以特异性地与人CCR4的胞外区作用。
(2)如(1)所述的重组抗体或抗体片段，其中所述胞外区是选自在SEQ ID NO17中所示的氨基酸序列中的第1-39位，第98-112位，第176-206位，第271-284位的胞外结构域。
(3)如(1)或(2)所述的重组抗体或抗体片段，可以识别存在于在SEQ ID NO17中所示的氨基酸序列中的第2-29位中的一段表位。
(4)如(1)到(3)中的任一项所述的重组抗体或抗体片段，其可与CCR4-表达细胞特异性作用。
(5)如(1)到(4)中的任一项所述的重组抗体或抗体片段，其含有对CCR4-表达细胞具有细胞毒性。
细胞毒性的实例中包括CDC活性，ADCC活性等。
(6)如(5)所述的重组抗体或抗体片段，其中所述抗CCR4-表达细胞的细胞毒性高于源于非人动物杂交瘤产生的单克隆抗体。
术语“细胞毒性高于源于非人动物杂交瘤产生的单克隆抗体”是指所得的重组抗体的细胞毒性高于源于非人动物杂交瘤产生的单克隆抗体的细胞毒性，其特异地与应用于制造重组抗体的CCR4作用，其将在下文叙述。
(7)如(5)所述的重组抗体或抗体片段，其中所述细胞毒性是抗体-依赖的细胞-介导的细胞毒性(ADCC)活性。
(8)如(7)所述的重组抗体或抗体片段，其中所述抗体-依赖的细胞-介导的细胞毒性活性是指诱发Th2细胞凋亡的活性。
(9)如(1)到(8)中的任一项所述的重组抗体或抗体片段，其含有去除Th2细胞的活性。
(10)如(1)到(9)中的任一项所述的重组抗体或抗体片段，其含有抑制Th2细胞因子产生的活性。
(11)如(10)中所述的重组抗体或抗体片段，其中Th2细胞因子是IL-4，IL-5或IL-13。
(12)如(1)到(11)中的任一项所述的重组抗体，其中所述的重组抗体是选自人源化抗体和人抗体。
(13)如(12)中所述的重组抗体，其中所述的人源化抗体是人嵌合抗体或人CDR-移植抗体。
(14)如(1)到(13)的任一项所述的重组抗体，其属于人IgG抗体。
(15)如(12)中所述的重组抗体，其中所述的人源化抗体包括抗体重链(H链)可变区(V区)的互补决定区(CDR)1，CDR2和CDR3分别具有在SEQ ID NO5，6和7中所示的氨基酸序列；且抗体轻链(L链)的V区的CDR1，CDR2和CDR3分别具有在SEQ ID NO8，9和10中所示的氨基酸序列。
(16)如(13)中所述的重组抗体，其中所述的人的嵌合抗体包括与CCR4特异反应的单克隆抗体的抗体重链(H链)可变区(V区)和抗体的轻链(L链)的V区；且人抗体的H链恒定区(C区)和L链C区。
(17)如(16)中所述的重组抗体，其中所述的人嵌合抗体包括H链V区的互补决定区(CDR)1，CDR2和CDR3分别具有在SEQ ID NO5，6和7中所示的氨基酸序列；且L链V区的CDR1，CDR2和CDR3分别具有在SEQ ID NO8，9和10中所示的氨基酸序列。
(18)如(16)中所述的重组抗体，其中所述的人嵌合抗体包括H链V区具有在SEQ ID NO15中所示的氨基酸序列中的第20-138位的氨基酸；且L链V区具有在SEQ ID NO16中所示的氨基酸序列中的第20-132位的氨基酸。
(19)如(13)中所述的重组抗体，其中所述的人的嵌合抗体是一种产自转化的KM2760((FERM BP-7054)的抗体KM2760，且其中，其抗体H链C区属于人IgG1亚类。
(20)如(13)中所述的重组抗体，其中所述的人CDR-移植抗体包括与CCR4特异地作用的单克隆抗体的抗体重链(H链)可变区(V区)的互补决定区(CDR)和抗体轻链(L链)V区；且人抗体的H链和L链的C区和V区框架区。
(21)如(13)中所述的重组抗体，其中所述的人CDR-移植抗体包括H链V区的CDR1，CDR2和CDR3具有分别在SEQ ID NO5，6和7中所示的氨基酸序列；且L链V区的CDR1，CDR2和CDR3具有分别在SEQ ID NO8，9和10中所示的氨基酸序列。
(22)编码如(1)到(21)中任一项所述的重组抗体或抗体片段的DNA。
(23)含有如(22)所述的DNA的重组载体饱和用于人源化抗体表达的串联载体。
(24)将如(22)所述的重组载体的导入宿主细胞的转化子。
(25)如(24)所述的转化子，其中所述转化子是KM2760(FERM BP-7054)(26)制造重组抗体或抗体片段的方法，其中包括培养如(24)或(25)所述的转化子于培养基中生产和积累重组抗体或抗体片段，和从培养基中回收重组抗体或抗体片段。
(27)如(12)所述的重组抗体，其中所述人抗体包括抗体重链(H链)可变区(V区)和/或抗体轻链(L链)V区。
(28)如(27)所述的重组抗体，其中所述人抗体的H链V区和L链V区的互补决定区(CDR)包含的氨基酸序列分别与可以和CCR4特异地作用的单克隆抗体的H链V区和L链V区的CDR具有的氨基酸序列相同。
(29)如(28)所述的重组抗体，其中所述人抗体包括H链V区的CDR1，CDR2和CDR3具有分别在SEQ ID NO5，6和7中所示的氨基酸序列；且L链V区的CDR1，CDR2和CDR3具有在SEQ ID NO8，9和10中所分别表示的氨基酸序列。
(30)如(27)所述的重组抗体，其中所述人抗体的H链V区和L链V区包含的氨基酸序列分别与可以和CCR4特异地作用的单克隆抗体的H链V区和L链V区的氨基酸序列相同。
(31)如(30)所述的重组抗体，其中所述人抗体包括H链V区具有在SEQ ID NO15中所示的氨基酸序列中的第20-138位氨基酸；和/或L链V区具有在SEQ ID NO16中所示的氨基酸序列中的第20-132位的氨基酸。
(32)如(27)到(31)中的任一项所述的重组抗体，其中所述人抗体是从人噬菌体抗体库中得到或从可以产生人抗体的转基因动物中得到。
(33)如(1)到(11)中的任一项所述的抗体片段，其是Fab，Fab’，F(ab‘)2，单链抗体，二硫键稳定的V区片段，或含有抗体互补决定区(CDR)的肽。
(34)如(33)所述的抗体片段，其中包括抗体重链(H链)可变区(V区)和抗体的轻链(L链)V区。
(35)如(34)所述的抗体片段，其中所述抗体片段的H链V区和L链V区的互补决定区(CDR)包含的氨基酸序列分别与可以和CCR4特异地作用的单克隆抗体的H链V区和L链V区的互补决定区(CDR)的氨基酸序列的相同。
(36)如(35)所述的抗体片段，其包括H链V区的CDR1，CDR2和CDR3具有分别在SEQ ID NO5，6和7中所示的氨基酸序列；且L链V区的CDR1，CDR2和CDR3具有在SEQ ID NO8，9和10中所分别表示的氨基酸序列。
(37)如(34)所述的抗体片段，其中所述抗体片段的H链V区和L链V区包含的氨基酸序列分别与可以和CCR4特异地作用的单克隆抗体的H链V区和L链V区的氨基酸序列相同。
(38)如(37)所述的抗体片段，其中包括H链V区具有在SEQ ID NO15中所示的氨基酸序列中第20-138位氨基酸；和L链V区具有在SEQ ID NO16中所示的氨基酸序列中第20-132位的氨基酸。
(39)一种重组抗体或抗体片段，其是如(1)到(21)和(27)到(38)中的任一项所述的重组抗体或抗体片段，其与一种放射性同位素，一种蛋白或一种药剂通过化学或遗传学方法接合在一起。
(40)用免疫学方法检测CCR4的方法，其中包括使用如(1)到(21)和(27)到(39)中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
例如，样品中的CCR4可以使用免疫学方法通过使用重组抗体或抗体片段与样品接触来检测。
(41)用免疫学方法检测在细胞表面表达CCR4细胞的方法，其中包括使用如(1)到(21)和(27)到(39)中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
例如，一种在细胞表面表达CCR4的细胞可以通过让重组抗体或抗体片段与细胞接触的免疫方法来检测。
(42)一种降低和去除在细胞表面表达CCR4的细胞的方法，包括使用如(1)-(21)和(27)到(39)中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
例如，在细胞表面表达CCR4的细胞可以通过使用有效量的针对人或动物的重组抗体或抗体片段的方法来减少或去除。
(43)一种抑制Th2细胞因子产生的方法，其中包括使用如(1)到(21)和(27)到(39)中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
例如，Th2细胞因子的产生可以通过使用有效量的针对人或动物的重组抗体或抗体片段的方法来抑制。
(44)一种药物，包括作为活性成分的如(1)-(21)和(27)到(39)中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
(45)一种用于Th2-介导的免疫疾病的诊断剂或治疗剂，包括作为活性成分的如(1)-(21)和(27)到(39)中任一项所述的的重组抗体或抗体片段。
例如，Th2-介导的免疫疾病可以通过使用有效量的针对人或动物的重组抗体或抗体片段的方法来治疗，并且Th2-介导的免疫疾病的诊断可以通过让重组抗体或抗体片段与待测样品相接触来进行。
(46)一种对于血癌的诊断剂或治疗剂，包括作为活性成分的如(1)-(21)和(27)到(39)中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
例如，血癌可以通过使用有效量的针对人或动物的重组抗体或抗体片段的方法来治疗，并且血癌也可以通过使用重组抗体或抗体片段与待测样品的接触来进行诊断。
(47)如(46)所述的治疗和诊断剂，其中所述血癌是白血病。
在本发明中，Th2-介导的免疫疾病的例子包括急性或慢性的导气管超敏反应或支气管哮喘，特应性皮肤病包括特应性皮炎、过敏性鼻炎、花粉病等。
在本发明中，癌症的例子包括血癌，且尤其是白血病。
可以应用依据本发明的任何重组抗体或抗体片段(下文称为“本发明的抗体”)，只要它可以特异地与人CCR4的胞外结构域反应。一个优选的抗体是一个可以特异地与在SEQ ID NO17中所示的氨基酸序列中的包括第1-39位，第98-112位，第176-206位或第271-284位作用的抗体。更优选的抗体是包含H链V区的CDR1，CDR2和CDR3，其具有的氨基酸序列分别表示在SEQ ID No5，6和7中，且包含L链V区的CDR1，CDR2和CDR3，其具有的氨基酸序列分别表示在SEQ ID No8，9和10中；且一个抗体包括一个H链V区，具有在SEQ ID No15中所示的氨基酸序列的第20-138位氨基酸，且一个L链V区，具有在SEQ ID No16中所示的氨基酸序列的第20-132位的氨基酸。其中有一个或多个氨基酸缺失，增加，替换和/或在这些氨基酸序列中有插入、且与CCR4特异性作用的抗体和抗体片段也在本发明的范围内。
本发明中，在氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失，替换，插入或增加是指在该氨基酸序列中的一个或多个位点上一个或多个氨基酸缺失，替换，插入和/或插入。缺失，替换，插入和/或增加可以是在同一个氨基酸序列中同时发生。同时氨基酸残基的替换，插入或增加可以是天然的或非天然的。天然氨基酸残基的例子包括L-丙氨酸，L-天门冬酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酰胺，L-谷氨酸，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-缬氨酸，L-半胱氨酸等。
下文说明的是氨基酸残基互相替换的例子。同一组的氨基酸残基可以互相替换。
A组亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，缬氨酸，正缬氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸；，甲硫氨酸，O-甲基丝氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，环己烷丙氨酸；B组天冬氨酸，谷氨酸，异天冬氨酸，异谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸；C组天门冬酰胺，谷氨酰胺；D组赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸，2，4-二氨基丁酸，2，3-二氨基丙酸；E组脯氨酸，3-羟基脯氨酸，4-羟基脯氨酸；F组丝氨酸，苏氨酸，高丝氨酸；组G
苯丙氨酸，酪氨酸。
本发明抗体的例子中包括如以下所述的人源化抗体，人抗体和抗体片段。
人源化抗体的例子包括人嵌合抗体和人的CDR-移植抗体。
人嵌合抗体是指包含有非人动物的抗体H链V区(下文也称为“VH”)和抗体L链V区(下文也称为“LH”)，人抗体H链C区(下文也称为“CH”)和人抗体的L链C区(下文也称为“CL”)的抗体。非人动物可以是小鼠，大鼠，仓鼠，兔子和其它可以制备杂交瘤的动物中的任一种。
本发明所述的人嵌合抗体可以通过从可以产生与CCR4特异反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞中获得编码VH和VL的cDNA来制备，将cDNA插入到含有编码人抗体CH和人抗体CL的基因的动物细胞表达载体中以便构建人嵌合抗体表达载体，且将该载体导入动物细胞来表达抗体。
任何人嵌合抗体的CH均可用，只要其属于人免疫球蛋白(下文称为“hIg”)，但优选的是那些hIgG类，且任何一种属于hIgG的亚类，例如hIgG1，hIgG2，hIgG3和hIgG4均可使用。同时可以使用任何人嵌合抗体的CL，只要其属于hIg，且可以使用κ类或λ类的抗体。
抗-CCR4的嵌合抗体的例子包括KM2760，其中抗体的VH包括的氨基酸序列在SEQ ID No15中所示的氨基酸序列中的第20-138位，抗体的CH包括hIgG1亚类的氨基酸序列，抗体的VL包括SEQID No16中所示的氨基酸序列中的第20-132位的氨基酸序列，且抗体的CL具有人抗体κ类的氨基酸序列。
人CDR-移植抗体是一种抗体，其中来自于非人动物的抗体的VH和VL的CDR氨基酸序列被移植于人抗体的VH和VL的相应位置。
本发明所述的人CDR-移植抗体可以通过移植一个与CCR4特异作用的非人动物抗体的CDR序列到一个可选择的人抗体的VH和VL的CDR序列中，从而构建一个编码所得V区的cDNA，将该cDNA插入到一个具有编码人抗体CH和人抗体CL基因的动物细胞表达载体，从而构建了一个人CDR-移植抗体表达载体，然后将此表达载体导入动物细胞来表达该抗体。
任何人CDR-移植抗体的CH均可用，只要其属于hIg，但优选的是那些hIgG类，且任何一种属于hIgG亚类的，例如hIgG1，hIgG2，hIgG3和hIgG4均可使用。同时可以使用任何人CDR-移植抗体的CL，只要其属于hIg，且可以使用那些κ类或λ类。
起初，人抗体是一个自然存在于人体的抗体，但它也包括从人噬菌体抗体库中和生产人抗体的转基因动物中得到的抗体，制备以最近在基因工程、细胞工程和发育工程技术上的进步为基础。
可以得到存在于人体中的抗体，例如，通过分离人外周血淋巴细胞，通过用EB病毒或其它感染使其永生，接着通过克隆，培养产生抗体的淋巴细胞，且从培养基上清中纯化抗体。
人抗体库是指通过把从人B细胞制备的抗体基因插入到噬菌体基因中，从而将诸如Fab，scFv等的抗体片段表达于噬菌体表面的文库。表达一个具有所希望的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体可以通过其与抗原固定化介质的结合活性作为指标来从文库中回收。通过基因工程技术，抗体片段也可以进一步转变为含有两个完整H链和两个完整L链的人抗体分子。
产生人抗体的转基因动物是在其细胞中导入人抗体基因的动物。具体而言，产生人抗体的转基因动物可以通过导入人抗体基因到鼠ES细胞来制备，接种ES细胞于其它小鼠的早期胚胎中，且发育成一个动物。人抗体也可以通过获得产生人抗体的杂交瘤来生产和积累，按照杂交瘤的制备方法一般在非人的哺乳动物中制备杂交瘤，然后培养杂交瘤，在培养基上清中得到人抗体。
抗体片段的例子包括Fab，Fab’，F(ab’)2，scFv，dsFv，包含CDR的肽，等等。
Fab是一个分子量大约为50,000的且具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端的侧链中的大约一半和整个L链通过一个二硫键结合在一起，这些链属于用一种蛋白酶，木瓜蛋白酶处理IgG所获片断之列(在H链第224位的氨基酸残基处切开)。
本发明所述的Fab可以通过用木瓜蛋白酶处理与CCR4特异反应的抗体来制备。Fab片段也可以通过将编码抗体Fab的DNA插入到原核生物表达载体中或真核生物表达载体中，并将该载体导入到原核或真核生物中表达Fab。
F(ab’)2是一个分子量大约为100,000、具有抗原结合活性的抗体片段，其比经由铰链区的二硫键结合的Fab稍大一些，其属于用一种蛋白酶，即木瓜蛋白酶处理IgG所获片断之列(在H链第234位的氨基酸残基处切开)。
本发明的F(ab’)2可以通过用木瓜蛋白酶处理与CCR4特异反应的抗体来制备。F(ab’)2片段也可以通过经由硫醚键或二硫键结合以下描述的Fab’得到。
Fab’是一个分子量大约为50,000的、且具有抗原结合活性的抗体片段，其通过切开F(ab’)2铰链区的二硫键制备。
本发明的Fab’可以通过用还原性药剂，二硫苏糖醇处理可以与CCR4特异作用的F(ab’)2来制备。Fab’片段也可以通过将编码抗体Fab，的DNA插入到原核生物表达载体中或真核生物表达载体，并将该载体转入到原核或真核生物中表达Fab’。
scFv是一个VH-P-VL或VL-P-VH的多肽，其中一个VH链与一个VL链通过合适的多肽接头(下文中称为“P”)连在一起。在本发明中所述的scFv的VH和VL可以是与CCR4作用的本发明的任一抗体，如人源化抗体或人抗体。
本发明的scFv可以通过得到编码可以与CCR4特异作用的抗体的VH和VL的cDNA得到，构建编码scFv的DNA，通过将该DNA插入到原核生物表达载体中或真核生物表达载体，并将该载体导入到原核或真核生物中表达scFv。
dsFv可以通过将多肽用半胱氨酸残基之间的二硫键结合在一起，其中每一个VH和VL中的一个氨基酸残基被一个半胱氨残基所替代。。用半胱氨酸替代的氨基酸残基的选择是依据根据由Reiter等(ProteinEngineering，7697(1994))所证明的方法预测的抗体三维结构来进行。对于本发明dsFv中包含的VH和VL，可以应用本发明中可以特异地与CCR4作用的任一抗体，例如人源化抗体或人抗体。
本发明的dsFv可以通过得到编码可以与CCR4特异作用的抗体的VH和VL的cDNA得到，构建编码的dsFv的DNA，通过将该DNA插入到原核生物表达载体中或真核生物表达载体，并将该载体转入到原核或真核生物中表达dsFv。
包含CDR的肽是通过包含H链的至少一个区和L链CDR来制备。多个CDR可以直接或经由一合适的肽接头结合在一起。
本发明所述的包含CDR的肽可以通过得到编码可以与CCR4特异作用的抗体的VH和VL的cDNA得到，构建编码CDR的DNA，通过将该DNA插入到原核生物表达载体中或真核生物表达载体，并将该载体转入到原核或真核生物中表达该肽。
包含CDR的肽也可以通过化学合成方法制备，例如Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)，tBoc法(叔-丁氧基羰基法)等制备。
本发明的抗体包括抗体衍生物，其中用放射性同位素、蛋白或药剂通过化学或基因工程方法与可以特异地与CCR4作用的任一抗体如人源化抗体，人抗体或抗体片段结合。
本发明的抗体衍生物可以通过化学结合放射性同位素、蛋白或药剂于特异地与CCR4作用的抗体或抗体片段的H链或C链的N-端或C端侧链上，或结合于抗体或抗体片段的合适取代基团或侧链上，或者结合于抗体或抗体片段的糖链上(Antibody Engineering Handbook，edited by Osamu Kanemitsu，published by Chijin Shokan(1994))。
同样地，其可以通过基因工程方法制备，使编码与CCR4特异作用的抗体或抗体片段的DNA与其它编码待结合蛋白的DNA进行连接，插入该DNA于表达载体中，然后将表达载体导入宿主细胞。
放射性同位素的例子包括131I、125I等，它们可以与抗体通过氯胺T等方法偶合。
对于药剂，优选低分子量的药剂。例子包括抗癌药剂如烷基化药剂(如氮芥，环磷酰胺等)，代谢拮抗剂(如，5-氟尿嘧啶，氨甲蝶呤，等)抗生素(如，道诺霉素，博莱霉素，丝裂霉素C，道诺红霉素，阿霉素，等)，植物碱(如，长春花新碱，长春花碱，去乙酰长春酰胺，等)，激素药物(如，三苯氧胺，地塞米松等)等。(Clincal Oncology，edited by Japanese Society of Clincal Oncology，published by Cancerand Chemotherapy(1996))；抗-发炎药剂如类固醇药剂(如，皮质醇，强的松，等)，非类固醇药物(如，阿斯匹林，吲哚美辛等，)，免疫调节剂(如，硫代苹果酸亚金，青霉胺，等)免疫抑制剂(如环磷酰胺，咪唑硫嘌呤，等)，抗组胺剂(如氯苯吡胺，铁线莲亭，等)，和其它类似物(Inflammation and Anti-inflammatory Therapy，Ishiyaku Shuppan(1982))等等。对于将道诺霉素结合到抗体上的方法包括用戊二醛将道诺霉素与抗体的氨基结合的方法，用水溶性的碳二酰亚胺等将道诺霉素的氨基与抗体的羧基接合的方法，对于蛋白，优选的是作为蛋白的可以激活免疫细胞的细胞因子。例子包括人白细胞介素2(下文称为“hIL-2”)，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(下文称为“hGM-CSF”)，人巨噬细胞集落刺激因子(下文称为“hM-CSF”)，人白细胞介素12(下文称为“hIL-12”)，等等。同时为了直接抑制癌细胞，可以使用如蓖麻毒蛋白，白喉类毒素等毒素。例如，可以产生与蛋白融合的抗体，方法是可以通过将编码该抗体或抗体片段的cDNA与其它编码蛋白的cDNA连接，构建编码融合抗体的DNA，插入该DNA于原核生物或真核生物表达载体中，然后将其导入原核或真核生物中表达融合抗体。
制造与CCR4特异作用且在H链和L链V区具有新的氨基酸序列的人嵌合抗体的方法以以下的实施例为基础描述。
1.从杂交瘤中制备抗-CCR4的单克隆抗体(1)制备抗原将含有编码CCR4的cDNA表达载体导入宿主细胞如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等，得到重组CCR4蛋白。也可以是表达CCR4的肿瘤细胞中，通过其得到重组CCR4蛋白，从细胞中纯化的CCR4蛋白或合成的具有CCR4部分序列的多肽可以作为抗原。
选择具有大约5-30个残基的部分蛋白序列作为抗原用的部分肽。为了得到识别具有未修饰的天然结构蛋白的抗体，有必要选择在蛋白三级结构表面的部分序列作为抗原肽。在蛋白三级结构表面的部分可以通过用商业上已有的蛋白序列分析软件如Genetyx Mac等预测一段具有高亲水性的部分序列来估计。一般而言，具有低亲水性的部分绝大多数在蛋白三级结构的内部，而高亲水的部分绝大多数在蛋白的表面。在很多例子中，一个蛋白的N端和C端也在蛋白的表面。但是以此方法选择的部分肽段并不总是具有得到靶抗体的抗原的作用。
为了使部分肽段交联于一个蛋白上，在部分肽段的末端区域加入半胱氨酸。当选择一蛋白的内部序列时，如果必要，那么肽段N端和C端分别被乙酰化和酰胺化。
部分肽段可以通过常规的液相或固相肽合成方法、固液结合方法或修改的这些方法合成(The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，vol.1，edited by Erhard Gross and Johannes Meinhofer，Academic Press(1979)，vol.2(1980)，vol.3(1981)；Fundamentals and Experiments on Peptide Synthesis，Nobuo Izumiya，Maruzen(1985)；Development of Drugs-Second Series，vol.14，Peptide Synthesis，editedby Haruaki Yajima，Hirokawa Shoten(1991)；International Journal of Peptide Protein Research，35161(1990)。
也可以使用自动多肽合成仪。用适宜的侧链被保护的氨基酸如Nα-Fmoc-氨基酸，Nα-Boc-氨基酸等在可以买到的肽链合成仪上，按照每一个合成仪的合成程序可以合成多肽，如由Shimadzu公司制造的多肽合成仪，由Applied Biosystems，Inc.USA公司(下文称为“ABI”)制造的多肽合成仪，由Advanced ChemTech Inc.USA公司(下文称为“ACT”)制造的多肽合成仪等等。
作为原料的被保护氨基酸和载体树脂可以从ABI，Shimadzu，Kokusan Kagaku，Nova Biochem，Watanabe Kagaku，ACT等公司的多肽部门购买。作为原料的被保护氨基酸、被保护有机酸和被保护有机胺也可以通过已知的合成方法或这些方法的修改方法来合成(The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，vol.1，edited by Erhard Grossand Johannes Meinhofer，Academic Press(1979)，vol.2(1980)，vo1.3(1981)；Fundamentals and Experiments on Peptide Synthesis，Nobuo Izumiya，Maruzen(1985)；Development of Drugs-Second Series，vol.14，Peptide Synthesis，edited by Haruaki Yajima，Hirokawa Shoten(1991)；International Journal of Peptide Protein Research，35161(1990)。
(2)免疫动物和制备产生抗体的细胞只要可以制备杂交瘤的任何动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、兔子等等可以用于免疫。以下描述的是用小鼠和大鼠的实施例。
用上述1(1)中制备的抗原免疫年龄在3到20周的小鼠或大鼠，从该动物的脾脏、淋巴结或外周血中收集抗体产生细胞。免疫的过程是通过对动物皮下、静脉或腹腔内多次施用与适当的佐剂配制在一起的抗原来完成的。佐剂的例子包括完全弗氏佐剂、氢氧化铝凝胶和百日咳疫菌的混合物等等。当抗原是部分肽链时，通过与载体蛋白如BSA(小牛血清白蛋白)、KLH(匙孔血蓝蛋白)或其它蛋白与其形成偶合物用于抗原。每次施用3-7天后，从动物的眼底或尾静脉取血样，检测与所用抗原，即CCR4，的作用活性，例如通过酶免疫测定法(酶联免疫分析(ELISA)，由Igaku Shoin(1976)出版，然后用在其血清中显示足够的抗体滴度的小鼠或大鼠作为抗体产生细胞的供应来源。在最后一次使用抗原后的第3天到第7天，从免疫的小鼠或大鼠中提取脾脏，按照已知的方法进行脾细胞与骨髓瘤细胞的融合(AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)。
(3)制备骨髓瘤细胞只要其在体外可以增殖，可以使用任何骨髓瘤细胞。例子包括从小鼠中建立的细胞系，例如8-氮鸟嘌呤-抗性鼠(BALB/c)骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(Europ.J.Immunol，6511(1976))，SP2/0-Ag14(SP-2)(Nature，276269(1978)，P3-X63-Ag8653(653)(J.Immunol.，1231548(1979))，P3-X63-Ag8(X63)(Nature，256495(1975))等等。这些细胞系的培养和次代培养按照已知的方法进行(AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))在细胞融合时细胞的浓度应至少为2×107。
(4)细胞融合洗涤以上获得的抗体产生细胞，加入细胞聚集媒介物如聚乙二醇-1000(PEG-1000)等使细胞融合，细胞悬浮于培养基中。对于细胞的洗涤，可以用MEM培养基、PBS(1.83g磷酸氢二钠，0.21g磷酸二氢钾，7.65g氯化钠，1升蒸馏水，pH7.2)。为了选择性得到靶融合细胞，可以用HAT培养基{正常培养基(通过加入谷氨酰胺(1.5mM)，2-巯基乙醇(5×10-5M)，庆大霉素(10μg/ml)和胎牛血清(FCS)(10％，由CSL制造)到RPHT-1640培养基中，另外补加次黄嘌呤(10-4M)，胸腺嘧啶核苷(1.5×10-3M)和氨基蝶呤(4×10-7M))}作为悬浮融合细胞的培养基。
培养后，收集培养基的上清部分取样，且通过酶免疫测定法选择与抗原蛋白作用而不与非抗原蛋白作用的样品。此后通过有限稀释方法进行克隆，选择显示出稳定的高抗体滴度的杂交瘤作为产生单克隆抗体的杂交瘤。
(5)选择产生抗-CCR4的单克隆抗体的杂交瘤通过以下描述的、按照(抗体-实验操作指南，冷泉港实验室(1988)等所述的方法进行分析来选择产生抗-CRR4单克隆抗体的杂交瘤。按照此分析，在包含于能产生以下描述的抗-CCR4人嵌合抗体或抗体片段的转化子的培养基上清中的抗-CCR4人抗体或所有纯化的抗-CCR4抗体的结合活性可以测量。
酶免疫测定法将抗原包被于96孔的ELISA板上。用杂交瘤培养基上清或由以上方法纯化的抗体作为一抗反应。
一抗作用后，洗涤酶标板，且加入二抗。
二抗可以通过用生物素、酶、化学发光物质、放射性化合物等标记能够识别一抗免疫球蛋白的抗体来得到。如果用鼠制备杂交瘤，可以识别鼠免疫球蛋白的抗体可以用作二抗。
反应后，进行适合于用于标记二抗的物质的反应，来选择可以产生与抗原特异作用的单克隆抗体的杂交瘤。
杂交瘤的例子包括杂交瘤KM2160。
(6)纯化单克隆抗体由上面的1(4)得到的产生抗-CCR4单克隆抗体的杂交瘤细胞通过与降植烷一起腹腔内注射至8-周龄到10-周龄的小鼠或裸鼠中(0.5ml2，6，10，14-四甲基十五烷(降植烷)一起进行腹腔内注射，然后饲养2周)，杂交瘤的剂量为2×107到5×106个细胞/动物。杂交瘤在10-21天中引起腹水肿瘤。从小鼠或裸鼠中收集腹水，离心，用40％-50％的饱和硫酸铵盐析或辛酸沉淀，然后通过DEAE-Sepharose柱、蛋白A柱或Cellulofine GSL 2000(由Seikagaku公司制造)层析，收集IgG或IgM部分作为纯化的单克隆抗体。
纯化的单克隆抗体的亚类可以通过使用小鼠单克隆抗体分类试剂盒或大鼠单克隆抗体分类试剂盒来确定。蛋白的量可以通过劳里法(Lowry法)测定或者在280nm的吸光度确定。
抗体的亚类表示同一类中的同型体，在小鼠中如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，人中如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
小鼠中的IgG2a、IgG2b、IgG3和人中IgG1、IgG3具有相对高的细胞毒性，例如CDC活性、ADCC活性等细胞毒性，所以它们可以用于医疗中。
2.制备人源化抗体(1)构建人源化抗体表达载体人源化抗体表达载体是用于动物细胞的表达载体，其中已经插入了编码人抗体的H链C区和L链C区的基因，是通过克隆人抗体的每一个H链C区和L链C区至动物细胞的表达载体中来构建的。
人抗体的C区可以是任何人抗体的H链C区和L链C区。例子包括人抗体H链的属于IgG1亚类的C区(下文称为“hCγ1”)，人抗体L链的属于κ类的C区(下文称为“hCκ”)，等等。对于编码人抗体的H链C区和L链C区的基因，可以使用包含外显子和内含子的人染色体DNA或cDNA。
对于动物细胞的表达载体，可以使用任何表达载体，只要在其中可以插入并可以表达人抗体的C区。例子包括pAGE107(Cytotechnology，3 133(1990))，pAGE103(J.Biochem.，1011307(1987))，pHSG274(Gene，27223(1984))，pKCR(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，781527(1981))，pSGI βd2-4(Cytotechnology，4173(1990))，等等。用于动物细胞表达载体的启动子和增强子包括SV40的早期启动子和增强子(J.Biochem.，1011307(1987))，莫洛尼鼠白血病毒LTR启动子和增强子(Biochem.Biophys.Res.Comun.，149960(1987))，免疫球蛋白H链启动子(Cell，41479(1985))和增强子(Cell，33717(1983))，等等。
人源化抗体表达载体可以是以下所述的任一种，其中编码抗体H链与编码抗体L链的基因分别在不同的载体上，或者两个基因在同一载体上(串联型)。考虑到构建人源化抗体基因表达载体的易行性，导入动物细胞的易行性，以及抗体H链与L链在动物细胞中的表达量的平衡，更优选串联型人源化抗体表达载体(J.Immunol.Methods，167271(1994))。串联型人源化抗体表达载体的例子包括pKANTEX93(WO97/10354)，pEE18(HYBRIDOMA，17559(1998))等等。
构建的人源化抗体表达载体可以用来在动物细胞中表达人嵌合抗体和人CDR-移植抗体。
(2)制备编码从来自非人动物抗体V区的cDNA和氨基酸序列分析制备编码从来自非人动物如鼠抗体的H链和L链V区的cDNA，其以如下所述进行。
从产生鼠抗体或类似物的杂交瘤细胞中提取mRNA来合成cDNA。合成的cDNA插入到噬菌体、质粒等载体中，制备cDNA文库。且用鼠抗体的C区或V区的部分序列作为探针，从文库中分离每一个包含有编码H链V区的cDNA的重组噬菌体或重组质粒，和每一个包含有编码L链V区的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。测定在重组噬菌体或重组质粒中有重要意义的鼠抗体的H链V区和L链V区的全长核苷酸序列。且从该核苷酸序列中推断出全长H链V区和L链V区的氨基酸序列。
非人动物可以是包括小鼠、大鼠、仓鼠、兔子等只要可以制备杂交瘤的任何动物。
从杂交瘤细胞中制备总RNA的方法的实例包括硫氰酸胍-氯化铯法(Methods in Enzymol.，1543(1987))等等。从总RNA中制备mRNA的方法的实例包括oligo(dT)固定化纤维素柱法(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press，New York(1989))等等。也可以使用从杂交瘤细胞中制备mRNA的试剂盒，包括Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)，Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)等等。
合成cDNA和制备cDNA库的方法实例包括已知的方法(MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press，NewYork(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34)；也可以使用通过商业途径可以获得的试剂盒的方法，例如用于cDNA的合成和质粒克隆的Super ScriptTM质粒系统(GIBCO BRL制造)，ZAP-cDNA试剂盒(Stratagene制造)等等。
将从杂交瘤细胞中提取的mRNA作为模板合成的cDNA插入其中、用于构建cDNA文库的载体可以是任何载体，只要是可以插入cDNA的载体。例子包括ZAP表达载体(Strategies，558(1992))，pBluescript II SK(+)(NucleicAcid Research，179494(1989))，λzapII(Stratagene制造)，λgt10和λgt11(DNA CloningA PracticalApproach，I，49(1985))，Lambda BlueMid(Clontech制造)，λExcell和pT7T3 18U(Pharmacia制造)，pcD2(Mol.Cell.Biol.，3280(1983))，pUC18(Gene，33103(1985))，等等。
由噬菌体或质粒构建的cDNA库可以导入任何大肠杆菌中，只要cDNA文库可以导入、表达和保持稳定。例子包括XL1-Blue MRF’(Strategies，581(1992))，C600(Genetics，39440(1954))，Y1088和Y1090(Science，222778(1983))，NM522(J.Mol.Biol.，1661(1983))，K802(J.Mol.Biol.，16118(1966))，JM105(Gene，38275(1985)，等等。
可以使用放射性同位素或荧光-标记的探针集落杂交或噬菌体斑点杂交的方法在cDNA库中选择编码来源于非人动物抗体的H链V区和L链V区的cDNA克隆(Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Lab.Press，New York(1 989)。编码H链V区和L链V区的cDNA也可以通过制备引物，以及使用从mRNA制备的cDNA或cDNA文库为模板，用聚合酶链式反应(下文称为“PCR”；MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press，NewYork(1989)，Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34)；)来制备。
cDNA的核苷酸序列可以通过以下方法确定，用合适的限制酶和类似物消化以上方法选择的cDNA，克隆该片段到如pBluescrip SK(-)(Stratagene制造)等的质粒中，进行常规的核苷酸分析方法，如Sanger，F.et al.的双脱氧法(Proc.Natl.Acad..Sci.USA，745463(1977))等，然后用如A.L.F.的DNA测序仪(Pharmacia制造)等自动核苷酸序列分析仪分析序列。
得到的cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体全长的H链V区和L链V区氨基酸序列可以通过从测定的核苷酸序列预计出的全长的H链V区和L链V区的氨基酸序列来确认，且通过与已知抗体的全长的H链V区和L链V区氨基酸序列进行比较分析来确认(Sequence ofProteins of Immunological Interest，US Dept.Health and Human Services(1991))。分泌信号序列和N-端氨基酸序列的长度可以通过比较包含分泌信号序列的、具全长的H链V区和L链V区氨基酸序列的抗体与已知抗体的全长的H链V区和L链V区氨基酸序列来推定，(Sequence ofProteins of Immunological Interest，US Dept.Health and Human Services(1991))，它们属于的亚类也可以知道。此外，可以通过比较得到的氨基酸序列与已知抗体的H链V区和L链V区氨基酸序列来发现H链V区和L链V区每一个CDR的氨基酸序列(Sequence of Proteins ofImmunological Interest，US Dept.Health and Human Services(1991))。
此外，可以通过使用全长的H链V区和L链V区氨基酸序列在任何数据库如SWISS-PORT，PIR-Protein或其它数据库中，按照BLAST法(J.Mol，Biol.，215403(1990)或其它类似方法来进行同源性搜索，检查确定该序列的新颖性。
(3)构建人嵌合抗体表达载体人嵌合抗体表达载体可以通过在上面2(1)中描述的人源化抗体表达载体中克隆编码H链V区和L链V区的非人动物的抗体cDNA至编码H链C区和L链C区人抗体基因的上游区来构建。例如，每一个编码源于非人动物抗体的H链V区和L链V区的cDNA与合成包括源于非人动物抗体的H链V区和L链V区的3’端核苷酸序列和人抗体的H链C区和L链C区的5’端核苷酸序列的DNA相连，且在两个末端含有合适的限制酶识别序列，并且克隆每一个cDNA，以便将在上面2(1)中描述的人源化抗体表达载体中的编码H链C区和L链C区的基因表达在上游，由此构建了人嵌合抗体表达载体。源于非人动物的抗体的H链V区和L链V区的cDNA也通过使用合成的在两端具有合适的限制酶识别序列的DNA，用PCR方法来扩增，并且每一个可以克隆至上面2(1)所描述的人源化抗体表达载体中。
(4)构建编码人CDR-移植抗体的V区的cDNA编码人CDR-移植抗体的H链V区和L链V区的cDNA可以通过以下的方法获得。首先，选择欲将源于非人动物抗体的抗体中的H链V区和L链V区的CDR中氨基酸序列移植到其上的人抗体的H链V区和L链V区的FR的氨基酸序列。可以使用任一人抗体的H链V区和L链V区的FR氨基酸序列，只要它们来自人。例子包括在如蛋白数据库等数据库中已经登记的人抗体的H链V区和L链V区的FR氨基酸序列，并且在人抗体的H链V区和L链V区的FR亚类中所共有的氨基酸序列(Sequence of Proteins of Immunological Interest，USDept.Health and Human Services(1991))等等。为了产生具有强活性的人CDR-移植抗体，优选的是选择与源于非人动物的目的抗体的H链V区和L链V区的FR氨基酸序列具有高同源性(至少60％或更多)的氨基酸序列。然后，源于非人动物抗体的H链V区和L链V区的CDR氨基酸序列移植到选择的人抗体的H链V区和L链V区的FR氨基酸序列上，来设计人CDR-移植抗体的H链V区和L链V区的氨基酸序列。根据抗体基因中的核苷酸序列的密码子的偏爱性(Sequenceof Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health and HumanServices(1991))，将设计的氨基酸序列转变成DNA序列，这样就设计了编码人CDR-移植抗体的H链V区和L链V区的氨基酸序列的DNA序列。合成几种大约100个核苷酸长度的DNA序列，用它们进行PCR反应。在这种情况下，考虑到PCR反应的效率与可以合成的DNA的长度，优选在每一个H链和L链中设计合成6个DNA片段。
此外它们可以很容易地通过在合成的DNA的两个末端的5’端引入合适的限制酶识别序列，克隆到上面的1(2)所构建的人源化抗体表达载体中。PCR后，扩增产物克隆至如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)等质粒中，核苷酸序列按照上面2(2)所描述的方法进行测定，就得到一个具有编码设计的人CDR-移植抗体的H链V区和L链V区的DNA序列。
(5)修饰人CDR-移植抗体的V区的氨基酸序列已经知道当人CDR-移植抗体是通过简单地仅将源于非人动物抗体的H链V区和L链V区的CDR区移植到人抗体的H链V区和L链V区的FR中，其抗原结合活性低于起始的源于非人动物的抗体(BIO/TECHNOLOGY，9266(1991))。所以，根据情理，考虑到不仅CDR中而且FR中的几个氨基酸残基直接或间接地与存在于源于非人动物的起始抗体中的H链V区和L链V区的抗原结合活性相关，且它们被变成人抗体的H链V区和L链V区中不同的FR中的不同的氨基酸残基。为了解决此问题，在人CDR-移植抗体中，在人抗体的H链V区和L链V区的FR的氨基酸序列中，直接与抗原结合的氨基酸残基，或者通过与在CDR上的氨基酸残基相互作用或通过保持抗体的三维结构的不直接与抗原结合的氨基酸残基可以被识别和修饰原始的非人动物抗体中发现的氨基酸残基，因此以增加已经减少了的抗原结合活性(BIO/TECHNOLOGY，9266(1991))。在生产人CDR-移植抗体中，怎样有效的识别FR中的有关抗原结合活性的氨基酸残基是最重要的，所以要构建抗体三维结构，并使用X射线晶体照相术(J.Mol.Biol.，112535(1977))、计算机模拟(Protein Engineering，71501(1994))等等分析抗体的三维结构。虽然抗体三维结构信息在生产人CDR-移植抗体时是有用的，但是还没有在能产生人CDR-移植抗体的方法中建立应用于任何抗体方法。所以，目前必需有多种尝试，例如，产生一种抗体的多种修饰抗体，检测每一修饰抗体和抗体结合活性的关系。
在人抗体的H链V区和L链V区中选定的FR的氨基酸序列的修饰可以按照上面2(4)描述的PCR的方法使用多种合成的DNA来完成。关于通过PCR获得的扩增产物，根据上面2(2)描述的方法确定核苷酸序列，以证实是否已经进行了目的修饰。
(6)人CDR-移植抗体表达载体的构建如上面2(1)描述的人源化抗体表达载体中，人CDR-移植抗体表达载体能通过克隆编码在上面2(4)和2(5)中构建的人CDR-移植抗体H链V区和L链V区的cDNA到编码人抗体的H链C区和L链C区的基因的上游而构建。
例如，在用于构建上面2(4)和2(5)中的人CDR-移植抗体H链V区和L链V区中使用的合成DNA中，在合成DNA的5’两端引入合适的限制酶识别位点，进行克隆，以便可以在如上面2(1)中所述的人源化抗体表达载体中在编码人抗体的H链C区和L链C区的基因上游以合适的形式表达它们。
(7)人源化抗体的瞬间表达为了有效的评价产生的各种人源化抗体的抗原结合活性，可以通过使用如2(3)和2(6)中所述的人源化抗体表达载体或修饰后的表达载体瞬间表达人源化抗体。只要宿主细胞可以表达人源化抗体，任何细胞都可以用于宿主细胞。一般地，由于其高表达量，使用COS-7细胞(ATCC CRL1651)(Methods in Nucleic Aids Res.，CRC Press，p.283(1991))。导入表达载体至COS-7细胞的方法实例包括DEAE-葡聚糖法(Methods in Nucleic Aids Res.，CRC Press，p.283(1991))，和脂质转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847413(1987))等。
当载体导入后，在培养基上清中的人源化抗体的表达量和抗体结合活性可以通过酶免疫测定(ELISA)；AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 14(1988)，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press Limited(1996))，等等。
(8)人源化抗体的稳定表达稳定地产生人源化抗体的转化子可以通过将如上面2(3)和2(6)中描述的人源化抗体表达载体导入合适的宿主细胞得到。
导入表达载体于宿主细胞的方法实例包括电穿孔法(Japanese Published Unexamined Patent Application No.257891/90，Cytotechnology，3133(1990))等。
任何细胞可以用作导入人源化抗体表达载体的宿主细胞，只要它可以表达人源化抗体。实例包括鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)，鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)，二氢叶酸还原酶基因(下文称为“DHFR基因”)可用于检测的CHO细胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))，大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATTC CRL1662，下文称为“YB2/0细胞”)，等等。
产生具有抗体-依赖的细胞-介导的细胞毒性的抗体的宿主细胞中优选的细胞是那些将岩藻糖添加到结合于抗体Fc区的N-乙酰葡萄糖胺上的反应中具有低的酶活性或没有酶活性。
对于岩藻糖添加到结合于抗体Fc区的N-乙酰葡萄糖胺上的反应中所用酶的实例包括与α1，6-键相关的酶，例如α1，6-岩藻糖基转移酶；与生物合成GDP-岩藻糖相关的酶，例如GDP-甘露糖4，6-脱水酶，GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶，foco激酶，等等。因此，通过将用作宿主细胞的细胞接受人工突变所获细胞也可以用作宿主细胞，其中人工突变包括该酶基因的缺失或突变以降低或缺失该酶活性。
对于宿主细胞，只要重组抗体可以产生，任何细菌，酵母，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞等均可作为宿主细胞。优选动物细胞，如包括YB2/0细胞，如NS0细胞和SP2/0细胞的鼠骨髓瘤细胞，如CHO/dhfr细胞和CHO/DG44细胞的中国仓鼠卵巢细胞，如COS细胞的猴细胞，如Namalwa细胞的人骨髓瘤细胞等等。
含有糖链结合于抗体Fc区的抗体具有高含量的N-葡萄糖苷结合糖链，其中岩藻糖并不结合于N-乙酰葡萄糖胺，该抗体可以通过使用宿主细胞得到。该抗体显示较源于非人动物的杂交瘤细胞的单克隆抗体高的对CCR4-表达细胞的抗体-依赖细胞-介导的细胞毒性。
当导入表达载体以后，按照Japanese Published Unexamined Patent Application No.257891/90的方法，通过在含有一种如G418硫酸盐(下文称为“G418”，由Sigma制造)等试剂的动物细胞培养基中培养，来选择稳定表达人源化抗体的转化子，动物细胞的培养基的例子包括PRMI1640培养基(Nissui Pharmaceutical制造)，GIT培养基(NissuiPharmaceutical制造)，EX-CELL302培养基(JRH制造)，IMDM培养基(GIBCO BRL制造)，Hybridoma-SFM培养基(GIBCO BRL制造)，通过加入不同的如FCS等添加物于这些培养基中来制备使用的培养基。通过在培养基中培养选择出的转化子，人源化抗体可以产生并积累。在培养基上清中的人源化抗体表达量与抗原结合活性可以通过ELISA等方法测定。同时，在转化子中，按照Japanese Published Unexamined Patent Application No.257891/90的方法人源化抗体的表达量可以通过使用dhfr扩增系统等来增加。
人源化抗体可以通过使用蛋白A柱子从转化子的培养基上清中纯化(AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 14(1988)，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press Limited(1996))。可以使用任何其他的蛋白纯化传统方法。例如，人源化抗体可以通过联合使用凝胶过滤、离子交换层析、超滤等方法纯化。纯化的人源化抗体或抗体分子的H链或L链或整个抗体分子的分子量大小由聚丙烯酰胺凝胶电泳(下文称为“SDS-PAGE”)[Nature，227680(1970)]，蛋白印迹等方法(AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 12(1988)，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic PressLimited(1996))确定。
(9)评价人源化抗体的活性纯化的人源化抗体的抗原结合活性与CCR4-表达细胞系的结合活性可以通过ELISA、免疫荧光方法(Cancer Immuno Immunother.，36373(1993))来确定。对抗原阳性的培养细胞系的细胞毒性可以通过测定CDC活性、ADCC活性(Cancer Immuno Immunother.，36373(1993))等方法来评价。
3.用抗-CCR4抗体检测和确定CCR4的方法本发明涉及用本发明的抗体利用免疫学方法检测和确定CCR4或在表面表达CCR4的细胞的方法。
用本发明的抗体利用免疫学方法检测和确定CCR4或在表面表达CCR4的细胞的方法包括免疫荧光法，酶联免疫分析(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，免疫组织化学染色法如免疫细胞染色法、免疫组织染色法等等(ABC法，CSA法等等)，和上述的酶免疫分析，夹心ELISA法(Monoclonal Antibody Experiment Manual(published by Kodansha Scientific，1987)，Second Series Biochemical Experiment Course，Vol。5，Immunobiochemistry Research Method，published by Tokyo Kagaku Dojin(1986))。
免疫荧光法包括用本发明的抗体与独立的细胞、组织等反应，然后用荧光物质如异硫氰酸荧光素(FITC)等标记的抗-免疫球蛋白抗体或结合片段与以上的反应物反应，然后用流式细胞仪测定荧光物质。
酶联免疫分析(ELISA)包括用独立的细胞或其破碎液，组织或其破碎液，细胞培养基上清，血清，前尿液，腹水液，眼睛液体等等与本发明的抗体反应，然后用如辣根过氧化物酶，生物素等等标记的抗-免疫球蛋白的抗体或结合片段与以上的反应物反应，然后用吸光计测定产物的产生颜色变化。
放射性标记的免疫分析(RIA)包括用独立的细胞或破碎液，组织或其破碎液，细胞培养基上清，血清，前尿液，腹水液，眼睛液体等等与本发明的抗体反应，然后用放射性同位素标记的抗-免疫球蛋白抗体或结合片段与以上的反应物反应，然后用闪烁计数仪等测定放射性活性。
免疫细胞染色和免疫组织染色的方法包括用独立的细胞，组织或类似物与本发明的抗体反应，然后用荧光物质如异硫氰酸荧光素(FITC)等，酶如辣根过氧化物酶，生物素等标记的抗-免疫球蛋白抗体或结合片段与以上的反应物反应，然后用显微镜观察细胞、组织等。
夹心ELISA的方法包括将本发明所述抗体中具有不同表位的两个抗体之一吸附于板子上；用荧光物如异硫氰酸荧光素(FITC)等，酶如辣根过氧化物酶，生物素等标记另一个抗体；在吸附抗体的板上与独立的细胞或破碎液，组织或其破碎液，细胞培养基上清，血清，前尿液，腹水液，眼睛液体等等反应，然后用另一个标记的抗体按照标记物的反应特性与其反应。
4.诊断和治疗Th2-介导的免疫疾病或癌症由于本发明的人源化抗体可以特异地与表达于培养细胞系的CCR4结合且显示如CDC活性ADCC活性等细胞毒性，所以其可以在诊断和治疗Th2-介导的疾病等有作用。同时由于在人源化抗体中源于人抗体的氨基酸序列的比例较其他非人动物抗体要高，其有望表现出在人体中强细胞毒性，但并没有免疫原性，且作用持久。
另外，由IL-4，IL-5，IL-13等细胞产生的Th2细胞因子可以通过施用本发明抗体于实验对象的细胞或组织中来抑制。
在本发明使用的Th2细胞优选的是活化的Th2细胞或记忆Th2细胞，特殊的例子包括具有CD45RA-和CD4+活性的细胞。
本发明重组抗体的细胞毒性活性在以下情况下产生，如当本发明抗体结合于Th2细胞诱导细胞凋亡。同时在诱导凋亡中，细胞可能被掩蔽和去除。
同时，诊断Th2-介导的免疫疾病或癌症的方法包括存在于一个实验对象的细胞或组织中的人CCR4阳性细胞用以上方法进行免疫学诊断的方法。
此外，本发明的抗体可以用于Th2介导的免疫疾病或癌症，或由于Th2细胞的异常增多或减少导致病理状态不断发展的疾病中的诊断剂。
还有，由于本发明抗体可以通过其细胞毒性减少或去除CCR4-表达细胞，其可以提供一个对Th2-介导的免疫疾病或癌症的治疗或诊断方法，包括使用本发明的抗体，和对Th2-介导的免疫疾病或癌症的治疗剂和预防剂，其中包括将本发明抗体作为活性成分。
Th2-介导的免疫疾病包括，不考虑轻微或严重，如急性或慢性呼吸道超敏感性或支气管哮喘，特应性皮肤病包括特应性皮炎，过敏性鼻炎，花粉病等等发炎的疾病；由炎症敏感细胞导致的疾病，如嗜伊红粒细胞，肥大细胞等，它们可以由Th2细胞释放的细胞因子和趋化因子刺激增殖或活化，可以通过Th2细胞释放的细胞因子和趋化因子产生的生物学功能分子如IgE等引起，等等；和由于Th2细胞的异常变化导致的病理状态不断发展的免疫疾病。
本发明的抗体可以单独使用，但是一般优选的是，作为药物配方中的一种，与至少一种药学上可接受的载剂，按照药学上常规的技术工艺混合的方法使用。
在进行预想的治疗时，优选的是选择一种最有效的给药方式，如口服或肠胃外投药，如口内用药、气管用药、直肠用药、皮下注射、肌内注射和静脉注射等等。在由抗体或多肽组成的配方中优选静脉注射。
药剂类型包括喷雾、胶囊、片剂、粒剂、糖浆、乳剂、栓剂、注射剂、药膏和带剂等等。
用于口服的合适配方包括乳剂、糖浆、胶囊、片剂、粉剂和粒剂等。
液体药剂包括乳剂和糖浆的制备可以通过添加剂，例如水；糖类如蔗糖，山梨醇，果糖等等；二醇类，如聚乙二醇，丙二醇等等；油类，如芝麻油，橄榄油，豆油，等等；抗菌药，如p-羟基苯甲酸，等；气味剂，如草莓气味剂，胡椒薄荷，等等。
胶囊，片剂，粉剂，粒剂等可以通过使用添加剂，例如填充物如乳糖，葡萄糖，蔗糖，甘露醇；分散剂，如淀粉，海藻酸钠等；滑润剂如硬脂酸镁等；粘合剂如聚乙烯醇，羟基丙基纤维素，明胶等；表面活性剂如脂肪酸酯等；增塑剂如丙三醇等。
适于肠胃外投药配方的例子包括注射，栓剂，喷雾剂等等。
注射剂可以通过用盐溶液，葡萄糖溶液或二者混合等等作载剂来制备。
栓剂可以通过用可可脂，硬化脂，羧酸等作为载剂来制备。
同时喷雾剂可以通过抗体或多肽自身，或使用不刺激病人口腔和呼吸道粘膜，且可以通过分散成小颗粒有助于抗体或多肽吸收的载剂等来制备。
载剂的例子包括乳糖，甘油等。依赖于抗体或多肽的性质来使用载剂，可以制作为气溶胶，干粉等等。在口服剂制备中使用的添加剂也可以加入到肠道外用药的制备中。
给药剂量和频度依赖于预想的治疗效果，给药方式，治疗期，年龄，体重等不同而不同， 但剂量一般为每一个成人每天从10μg/kg到8mg/kg。
图2表示的是质粒pKM2160VH41和pKM2160VL61的构建步骤。
图3表示的是质粒pKANTEX2160H的构建步骤。
图4表示的是质粒pKANTEX2160的构建步骤。
图5表示的是纯化的抗-CCR4嵌合抗体KM2760的SDS-PAGE(5％至20％梯度胶)电泳图。左边显示的是电泳在非还原条件下进行的结果，右边显示的是电泳在还原条件下进行的结果，泳道1，2，3和4分别代表高分子量参照物，KM2760，低分子量参照物和KM2760的电泳结果。
图6表示的是通过改变抗体浓度测定的纯化的抗-CCR4嵌合抗体KM2760与CCR4部分肽的结合活性。纵坐标和横坐标分别表示CCR4的结合活性和抗体浓度。
图7表示的是通过免疫荧光活化细胞分离器测定的KM2760与CCR4-高-表达细胞(CCR4/EL-4)的反应性。
图8表示的是对于CCR4/EL-4细胞(上图)和EL-4细胞(下图)的通过ADCC活性表示的细胞毒性。
图9表示的是对于人PBMC通过ADCC活性表示的细胞毒性，根据对CD4和CD45RA有不同染色性质的四个组分中膜联蛋白V的阳性比率来测定。


图10表示的是抑制从人PBMC中产生IL-4，IL-5，IL-13和IFN-γ的抑制效果。
图11表示的是抗-CCR4嵌合抗体KM2760与人T细胞白血病细胞系的反应性。
图12表示的是抗-CCR4嵌合抗体KM2760对人T细胞白血病细胞系的细胞毒性，其中已经确定了细胞系与抗-CCR4嵌合抗体KM2760的反应性。
图13表示的是当抗-CCR4嵌合抗体KM2760加入到小鼠(Macacafascicularis)中，IL-4随着时间产生量的特征变化。
图14表示的是当抗-CCR4嵌合抗体KM2760加入到Macacafascicularis中，IL-13随着时间产生量的变化。
图15表示的是当抗-CCR4嵌合抗体KM2760加入到Macacafascicularis中，IL-γ随着时间产生量的变化。
图16表示的是当抗-CCR4嵌合抗体KM2760用于hCCR4-高-表达鼠源细胞，CCR4/EL-4细胞已经皮下移植的鼠中，肿瘤体积的平均值随着时间产生的特征性变化。
图17表示的是当抗-CCR4嵌合抗体KM2760用于hCCR4-高-表达鼠源细胞，CCR4/EL-4细胞已经皮下移植的鼠中，在施药组肿瘤体积的平均值与未施药组肿瘤体积的平均值的比率。
图18表示的是当抗-CCR4嵌合抗体KM2760用于CCR4-表达人T细胞白血病细胞系CCRF-CEM细胞(ATCC CCL-119)已经皮下移植的鼠中，肿瘤体积的平均值随着时间的特征性变化。
(1)制备抗原人CCR4(以下称hCCR4)蛋白的氨基酸序列使用Genetyx Max分析，选择化合物1作为合适的抗原的部分序列，是从具有高亲水性、N端、C端片断中选择出来的。而且，选择相应化合物1的鼠CCR4(以下称“mCCR4”)(BBRC，218337(1996))蛋白的部分氨基酸序列作为化合物2(SEQ ID NO2)。SEQ ID NO1和2分别对应于人CCR4和鼠CCR4中从N-端氨基酸计算起的第2-29位。
本发明中使用的氨基酸和它们的保护基团的缩写根据生化术语IUPAC-IUB联合委员会的推荐方案进行(European Journal of Biochemistry，1389(1984))。
除非另外表示，以下缩写表示以下氨基酸。
AlaL-丙氨酸AsnL-门冬酰胺AspL-天冬氨酸Asx-天冬氨酸或L-门冬酰胺CysL-半胱氨酸GlnL-谷氨酰胺GluL-谷氨酸GlxL-谷氨酸或L-谷氨酰胺Gly甘氨酸IleL-异亮氨酸LeuL-亮氨酸LysL-赖氨酸MetL-甲硫氨酸PheL-苯丙氨酸ProL-脯氨酸SerL-丝氨酸ThrL-苏氨酸TyrL-酪氨酸ValL-缬氨酸以下缩写表示相应氨基酸的保护基团和侧链保护氨基酸。
Fmoc9-芴甲氧基羰基Tbut-丁基Trt三苯甲基Boct-丁基羰基Fmoc-Thr(tBu)-OHNα-9-芴甲氧基羰基-O-t-丁基-L-苏氨酸Fmoc-Ser(tBu)-OHNα-9-芴甲氧基羰基-O-t-丁基-L-丝氨酸Fmoc-Tyr(tBu)-OHNα-9-芴甲氧基羰基-O-t-丁基-L-酪氨酸Fmoc-Lys(Boc)-OHNα-9-芴甲氧基羰基-Nε-t-丁基氧碳化-L-赖氨酸Fmoc-Asn(Trt)-OH:Nα-9-芴甲氧基羰基-Nγ-三苯甲基-L-门冬酰胺Fmoc-Gln(Trt)-OHNα-9-芴甲氧基羰基-Nα-三苯甲基-L-谷酰胺Fmoc-Asp(OtBu)-OHNα-9-芴甲氧基羰基-L-天冬氨酸β-t-丁基醚Fmoc-Glu(OtBu)-OHNα-9-芴甲氧基羰基-L-谷氨酸γ-t-丁基醚Fmoc-Cys(Trt)-OHNα-9-芴甲氧基羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸PyBOP苯并三唑-1-基氧基三吡咯磷酸鎓HOBtN-羟基苯并三唑DMFN，N-二甲基甲酰胺DCM二氯甲烷TFA三氟乙酸NMMN-甲基吗啉DTT二硫苏糖醇(i)化合物1的合成((SQ ID NO1)(H_Asn-Pro-Thr-Asp-Ile-Ala-Asp-Thr-Thr-Leu-Asp-Glu-Ser-Ile-Tyr-Ser-Asn-Tyr-Tyr-Leu-Tyr-Glu-Ser-Ile-Pro-Lys-Pro-Cys-OH)在自动合成仪的反应容器里(由Shimadzu制造)，放入连接有16.8μ摩尔H-半胱氨酸(Trt)的30毫克载体树脂(三苯甲基氯树脂，由AnaSpec制造)，往那里加入毫升DCM/DMF(1∶1)，搅拌10分钟后，将溶液抽走，再加入1毫升DMF，搅拌1分钟后，将溶液抽走，然后根据Shimadzu提供的的合成方案进行以下程序。
(a)搅拌在DMF(588.2μl)中的Fmoc-pro-OH(168μ摩尔)，PyBOP(168μ摩尔)，HoBt.1H2O(168μ摩尔)和NMM(252μ摩尔)5分钟，得到的溶液加入到树脂，然后搅拌60分钟，将溶液抽走。
(b)载体树脂用707μl的DMF洗涤1分钟，重复此步骤5次。这样，Fmoc-Pro-Cys(Trt)合成到载体上。
接着，进行以下Fmoc基团去保护步骤。
(c)加入707μl30％的哌啶-DMF溶液，然后搅拌4分钟，将溶液抽走，再重复此步骤。
(d)用707μlDMF洗涤载体树脂1分钟，将溶液抽走，此步重复5次。
这样，获得连接有Fmoc基团-除去了H-Pro-Cys(Trt)的载体树脂。
接着，进行浓缩反应，步骤(a)使用Fmoc-Lys(Boc)-OH，然后通过洗涤步骤(b)和去保护步骤(c)和(d)在载体上合成H-Lys(BOC)-Pro-Cys(Trt)。接着，在步骤(a)中按此顺序使用Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH重复步骤(a)到步骤(d)。接着，使用Fmoc-Asn(Trt)-OH进行浓缩反应的步骤(a)，进行洗涤步骤(b)，重复使用Fmoc-Asn(Trt)-OH的浓缩反应的步骤(a)和洗涤步骤(b)，然后进行去保护步骤(c)和(d)。随后，按顺序使用Fmoc-Ser(TBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH重复步骤(a)到(d)。接着，使用Fmoc-Leu-OH进行浓缩反应的步骤(a)，进行洗涤步骤(b)，重复使用Fmoc-Leu-OH的浓缩反应的步骤(a)和洗涤步骤(b)，然后进行去保护步骤(c)和(d)。其后，按顺序在步骤a中使用Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH重复浓缩反应的步骤(a)和(b)两次，进行去保护步骤(c)和(d)。接着，在重复完一系列这些步骤后，按顺序使用甲醇和丁基醚洗涤混合物，减压干燥12小时获得接有一侧链保护肽的载体树脂。往那里加入TFA(90％)，苯硫基甲烷(5％)和1，2-乙烷二巯基化物(5％)的混合溶液1毫升，室温孵育2小时以除去侧链保护基团，同时从树脂中切去肽。过滤移去树脂后，在所得的溶液中加入10毫升的醚，离心重新获得沉淀，倾析，减压干燥，获得63.7毫克粗制肽。在60毫克DTT存在下粗制肽溶于2毫升DMF，然后使用反向柱(CAPCELL PAK C18，30mm I.D.X25mm，由Shiseido生产)的HPLC提纯。根据线性密度梯度的方法进行洗脱，含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液加入到0.1％TFA水溶液中，220nm检测获得含有化合物1的部分。此部分冻干后，获得2.5毫克的化合物1。
质谱分析(FAB MS)m/z＝3227.5(M+H+)氨基酸分析Asx4.8(5)，Glx2.7(2)，Ser3.1(3)，Thr2.0(3)，Ala1.1(1)，Pro3.1(3)，Tyr3.8(4)，Leu2.2(2)，Lys1.2(1)，Ile3.0(3)，Cysl.2(1)(ii)合成化合物2(SEQ ID NO2)(H-Asn-Ala-Thr-Glu-Val-Thr-Asp-Thr-Thr-Gln-Asp-Glu-Thr-Val-Tyr-Asn-Ser-Tyr-Tyr-Phe-Tyr-Glu-Ser-Met-Pro-Lys-Pro-Cys-OH)使用50毫克连接有28.0μ摩尔H-Cys(Trt)的载体树脂作为起始物质，使用Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH使用如(i)的方式在步骤a中按此顺序重复步骤(a)到(d)。使用Fmoc-Ser(tBu)-OH进行浓缩反应的步骤(a)，进行洗涤步骤(b)，重复使用Fmoc-Ser(tBu)-OH的浓缩反应的步骤(a)和洗涤步骤(b)，然后进行去保护步骤(c)和(d)。随后，使用Fmoc-Asn(Trt)-OH进行浓缩反应的步骤(a)，进行洗涤步骤(b)，重复使用Fmoc-Asn(Trt)-OH的浓缩反应的步骤(a)和洗涤步骤(b)，然后进行去保护步骤(c)和(d)。其后，按顺序使用Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，重复浓缩反应的步骤(a)和(d)。然后，使用Fmoc-Gln(Trt)-OH进行浓缩反应步骤a，进行洗涤步骤(b)，使用Fmoc-Gln(Trt)-OH再重复进行浓缩反应步骤a，洗涤步骤(b)，进行去保护步骤(c)和(d)。其后，按顺序在步骤a中使用Fmoc Thr(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH重复浓缩反应的步骤(a)和(b)两次，进行去保护步骤(c)和(d)。重复完这一系列步骤后，洗涤混合物，干燥，获得连接有侧链保护肽的载体树脂。去掉侧链保护基团获得粗制肽(96.3克)，用如(i)同样的方法去掉树脂的肽，使用反向柱HPLC进一步提纯，获得化合物2。
质谱分析(TOFMS)m/z＝3297.7(M+H+)氨基酸分析Asx4.1(4)，Glx4.3(4)，Ser2.0(2)，Thr4.6(5)，Ala1.0(1)，Pro2.2(2)，Tyr3.9(4)，Val1.9(2)，Met1.0(1)，Phe1.0(1)，Lys1.1(1)，Cys1.1(1)(2)制备免疫抗原为了增加它的免疫原性，通过以下方法，制备它与KLH(Calbiochem)的共轭物，然后在实施例1(1)获得的hCCR4部分肽作为免疫原。即，KLH溶于PBS，10毫克/毫升，后，逐滴加入1/10体积的25毫克/毫升的MBS(Nakalai Tesque)搅拌30分钟。游离的MBS从凝胶过滤柱如Sephadex G-25柱中流出，凝胶过滤柱预先用PBS等平衡。，1毫克得到的KLH-MB与1毫克溶于0.1磷酸钠缓冲液(pH7.0)的肽混合，室温搅拌3小时。反应后，混合物把PBS渗析出来。
(3)动物免疫和产生生产抗体的细胞实施例1(2)制备的100微摩尔肽-KLB与2毫克凝胶铝和1×109个百日咳菌苗(由中国血清研究所制造)注射入5周龄母鼠，2周后，每周注射一次100微克此共轭物，共注射4次。从每只动物的眼底静脉丛抽取血样，用以下描述的酶联免疫测定法检测，最后一次免疫后3天把脾从鼠身上切除，显示有足量的抗体值。最后一次免疫3天后，从鼠身上切除脾脏并在MEM(由Nissui Pharmaceutical制造)切成片，用钳子把细胞分离，离心(1200rpm，5分)，去上清，3毫升三羟甲基-氯化铵缓冲液(pH7.65)处理1到2分钟以去除红细胞。剩下的细胞进一步用MEM洗涤3次，用于细胞融合。
(4)制备鼠骨髓瘤细胞培养8-氮鸟嘌呤鼠骨髓瘤细胞系，P3×63Ag8U.1(ATCC CRL-1597，以下称“P3-U1”)，作为细胞融合的母系。
(5)制备杂交瘤细胞脾细胞和在实施例1(3)和(4)中获得的骨髓瘤细胞以10∶1的比率混合，离心(1200rpm，5分)，去上清，在37℃条件下，每108个脾细胞加入0.5毫升聚乙二醇溶液(含2克聚乙二醇-1000，2毫升MEM，0.7毫升DMSO)，完全悬浮。然后，以1到2分钟的间隔加入1到2毫升MEM几次，最后的体积用MEM调节至体积50毫升。离心去上清(900rpm，5分钟)，沉淀用100毫升HAT培养基悬浮，以100微升/孔分散入96孔微量滴定板(由Sumitomo Bakelite制造)，5％二氧化碳培养箱37℃培养10到14天。可以观察到融合细胞在孔中繁殖，hCCR4部分肽(化合物1)在培养基上清中的结合活性可以用在实施例2的2(3)中描述的ELISA测量。活性被确定的每一孔用限制性稀释液总共2次克隆，一次改变培养基为HT培养基，然后改变培养基为一般培养基。这样，获得产生鼠抗体KM2160的杂交瘤细胞KM2160。如图1所示，KM2160特异性地与hCCR4部分肽(化合物1)反应。
实施例制备抗-CCR4嵌合抗体1分离分析编码抗-CCR4鼠抗体V区的cDNA〔1〕从产生抗-CCR4鼠抗体的杂交瘤细胞中制备mRNA从实施实施例1描述的杂交瘤细胞KM1260中制备mRNA。根据使用说明使用mRNA制备试剂盒，Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)从8×107个杂交瘤细胞KM2160中制备48微克mRNA。
〔2〕抗CCR4鼠抗体的H链和L链的cDNA文库的生产根据使用说明使用cDNA合成试剂盒〔由Amersham PharmaciaBiotech制造〕从实施例2的1〔1〕获得的5微克KM2160 mRNA中合成两端有EcoRI-NotI接头的cDNA。制备的cDNA溶于20微升无菌水，琼脂糖凝胶电泳分离，使用QIA快速凝胶回收试剂盒(由QIAGEN制造)分别收回相对于k型L链的大约1.0kb的cDNA和相对于IgG型抗体H链的大约1.5kb的cDNA片断。然后，使用EcoRI/CIAP-预消化处理的λZAPII载体试剂盒〔由Stratagene制造〕，每0.1微克大约1.5kb的cDNA片断和0.1微克大约1.0kb的cDNA片断根据使用说明与1微克限制性酶EcoRI消化，小牛肠碱性磷酸酶末端去磷酸化的λZAPII载体连接。连接后，根据使用说明使用GigapackIII Gold Packaging Extract(由Stratagene制造)，将每个反应溶液的2.5微升包装入λ噬菌体中。然后用适当量的噬菌体感染大肠细胞XL1-Blue(Biotechniques，5376(1987))，获得9.3×104噬菌体克隆作为KM2160 H链的cDNA文库和7.4×104噬菌体克隆作为L链cDNA文库。然后，根据使用说明将每个噬菌体固定在尼龙滤膜Hybond-N+(由Amersham Pharmacia Biotech生产)上。
〔3〕抗-CCR4鼠抗体的H链和L链的cDNA克隆使用ECL直接核酸标记和检测系统〔由Amersham Pharmacia Biotech生产〕，根据使用说明，在尼龙滤膜上的实施例2的1(2)制备的KM2160 H链cDNA文库和L链cDNA文库的克隆可以用鼠抗体(H链是鼠Cγ1cDNA的BamHI-EcoRI片断(EMBO J.，32047)1984))的C区cDNA检测，作为探针的L链是CκcDNA的HpaI-EcoRI片断，每一H链和L链中得到与探针结合强的各10个噬菌体克隆。接着，根据使用说明使用λZAPII克隆试剂盒(由Stratagene制造)，每个噬菌体克隆通过体内切割的方法转变为质粒。使用BigDye terminator cycle sequencing Fs ready reaction Kit试剂盒(由PE Biosystems制造)，用此方法获得的每个质粒包含的cDNA序列根据使用说明用由相同的制造者制造的DNA序列仪ABI PRISM 337分析。结果，获得ATG序列认为是起始密码子的包含全长功能性H链的cDNA的质粒pKM2160H4和包含有全长功能性L链的cDNA的质粒pKM2160L6。
〔4〕分析抗-CCR4鼠抗体V区的氨基酸序列包含在质粒pKM2160H4中的H链V区的完全的核苷酸序列，从那里得到H链V区的完全的核苷酸序列。包含在质粒pKM2160L6中的L链V区的完全的核苷酸序列，从那里得到L链V区的完全的核苷酸序列，它们分别描述于SEQ ID NO3，15，4，16。而且，SEQ ID NO15和16表示的氨基酸序列不同于SEQ ID NO3和4表示的序列，有很多核苷酸序列对应表示SEQ ID NO15和16的氨基酸序列。它们全部都包括在本发明所涉及的范围。与已知的鼠抗体的序列数据相比较(Sequences of Protein of Immunological Interest，US Dept.health and human services(1991))。使用蛋白质分析仪(PPSQ-10，由Shimadzu)比较提纯的抗-CCR4鼠抗体KM2160的H链和L链的N端氨基酸序列的分析结果，发现分离的每一cDNA是编码抗CCR4鼠抗体KM2160的全长cDNA，包含分泌信号序列，其是在H链的SEQ ID NO15表示的氨基酸序列的氨基酸位点1-19和显示于L链的SEQ ID NO16的氨基酸序列的氨基酸位点1-19。
接着，检测抗-CCR4的鼠抗体KM2160的H链和L链的V区氨基序列的新颖性。使用GCG程序包(版本9.1，由Genetics ComputerGroup制造)作为序列分析系统，用BLAST法(Nucleic Acids Res.，253389(1997)搜索已知蛋白质的氨基酸序列数据库。结果，未发现H链和L链的完全一致的序列，所以断定鼠抗-CCR4的抗体KM2160中的H链V区和L链V区具有新的氨基酸序列。
同时鼠抗-CCR4的抗体KM21 60的H链V区和L链V区的CDRs通过比较已知抗体的氨基酸序列来确定。鼠抗-CCR4的抗体KM2160H链V区的CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列分别见于SEQ ID NO5，6和7，L链V区的CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列分别见于SEQ ID NO8，9和10。
(7)用动物细胞制备稳定表达的抗-CCR4嵌合抗体(1)构建抗-CCR4嵌合抗体表达载体pKANTEX2160抗-CCR4嵌合抗体表达载体pKANTEX2160的构建如下，使用表达人IgG1和κ型的抗体的人源化抗体表达载体pKANTEX93，且在实施例2中的1(3)制备的质粒pKM2160H4和pKM2160L6。
为了用PCR得到KM21 60的H链V区的cDNA设计一个具有在SEQ ID NO11和12中核苷酸序列的合成的DNA，和为了用PCR得到KM2160的L链V区的cDNA设计一个具有在SEQ ID NO13和14中核苷酸序列的合成的DNA。每一个合成的DNA在其5’端都具有用于克隆至pKANTEX93的限制酶识别序列，且DNA的合成在有信誉的Genset公司进行。在实施例2的1(3)中得到的质粒pKM2160H4(20ng)加入到含有50微升的随KOD DNA聚合酶附带的PCR缓冲液#1(TOYOBO制造)缓冲液中，0.2mM dNTPs，1mM MgCl2和0.5μM含有SEQ ID NO11和12的核苷酸序列的合成DNA引物，混合物加热到94℃ 3分钟，然后加入2.5单位的KOD DNA聚合酶(TOYOBO制造)，混合物随后进行25轮反应，每一轮包括加热至94℃ 30秒，58℃ 30秒74℃ 60秒，反应在DNA热循环仪GenAmp PCR系统9600(由PERKIN ELMER制造)。以同样的方式，20ng如实施例2的1(3)得到的pKM2160L6质粒加入到含有50微升的随KOD DNA聚合酶附带的PCR缓冲液#1(TOYOBO制造)缓冲液中，0.2mM dNTPs，1mM MgCl2和0.5μM含有SEQ ID NO13和14的核苷酸序列的合成DNA引物，PCR的反应条件如上。10μl反应溶液用于琼脂糖凝胶电泳，H链V的PCR产物大约0.46Kb，L链VPCR产物大约0.43Kb，有QIA快速凝胶抽提试剂盒抽提以上片段(由QIAGEN制造)。
下一步，通过用限制酶SmaI(Takara Shuzo制造)消化质粒pBruescript SK(-)(Stratagene制造)得到的0.1μgDNA和大约0.1μg每一PCR产物，最后加入0.5μl无菌水和7.5μl Takara DNA连接试剂盒VER.2(Takara Shuzo制造)的溶液I，和0.3μl限制酶SmaI，混合物22℃反应过夜。使用得到的重组质粒DNA溶液，转化大肠杆菌DH5α(TOYOBO制造)。从转化克隆中制备的每一质粒DNA使用BigDyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(由PEBiosystems制造)，按照使用说明进行反应，核苷酸序列的分析由相同的制造商制造的DNA序列分析仪ABI PRISM 377完成。最终得到具有所需的核苷酸序列的如图2的质粒pKM2160VH41和pKM2160VL61。
下一步，3μg人源化抗体表达载体pKANTEX93和以上得到的3μg pKM2160VH41质粒加入到含有30μl的10mMTris-HCl(pH7.5)缓冲液中，再加入10mM MgCl2和1mM DTT，10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo制造)。反应溶液用乙醇沉淀，得到的沉淀物加入到含有10μl 50mM Tris-HCl(pH7.5)中，100mMNaCl 10mM MgCl2和1mM DTT，100μg/ml的BSA，0.01％的Triton X-100，10单位的限制酶NotI(Takara Shuzo制造)加入其中。混合物37℃反应一小时，反应混合物用琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收pKANTEX93和pKM2160VH41的ApaI-NotI大约12.75kb和大约0.44kb的片段。得到的以上两种片段使用Takara DNA连接试剂盒Ver.2根据使用说明连接，使用重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α(TOYOBO制造)。每一质粒DNA从转化克隆中制备，用限制酶酶切鉴定，获得如图3所示的质粒，pKANTEX2160H，其中插入了所需的0.44kb的ApaI-NotI片段。
下一步，3μg以上获得的pKANTEX2160H和3μg以上获得的pKM2160VL61加入到含有50mM Tris-HCl(pH7.5)中，100mMNaCl 10mM MgCl2和1mM DTT，100μg/ml的BSA，溶液总体积30μl，加入10单位的限制酶BsiWI(New England Biolabs制造)，混合物55℃反应一小时。然后加入限制酶EcoRI(Takara Shuzo制造)，混合物37℃反应一小时，反应混合物用琼脂糖凝胶电泳分离，回收大约13.20kb和大约0.41kbEcoRI-BsiWI的pKANTEX2160H和pKM2160VL61片段。得到的以上两种片段使用Takara DNA连接试剂盒Ver.2根据使用说明连接，使用重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α(TOYOBO制造)。每一质粒DNA从转化克隆中制备，用限制酶酶切鉴定，获得如图4所示的质粒，pKANTEX2160，其中插入了所需的0.41kb的EcoRI-BsiWI片段。
获得的质粒DNA使用BigDye Terminator Cycle Sequencing FSReady Reaction Kit(由PEBiosystems制造)按照使用说明进行反应，核苷酸序列的分析由相同的制造商制造的DNA序列分析仪ABI PRISM377完成。最终确定得到含有编码KM2160的H链和L链V区的cDNA的质粒。
(2)用动物细胞稳定表达抗-CCR4嵌合抗体使用如实施例2的2(1)中得到的抗-CCR4嵌合抗体表达载体pKANTEX2160表达在动物细胞中表达的抗-CCR4嵌合抗体。
质粒pKANTEX2160用限制酶AatII(TOYOBO制造)转变成线性，且用其中10μg通过电穿孔法导入4×106大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)(Cytotechnology，3133(1990))，细胞悬浮于40ml的H-SFM(GIBCO-BRL制造)培养基(补充5％FCS)，且以200μl/孔分装于96孔板(Sumitomo Bakelite制造)。37℃，5％CO2培养箱培养24小时以后，加入G418至终浓度是1mg/ml，然后培养1-2周。从每一个出现了抗G418的转化子且发生融合的克隆中的孔中回收培养基上清，上清中的抗-CCR4嵌合抗体的抗原结合活性用实施例2的2(3)所示的ELISA法测定(辣根过氧化物酶标记的山羊抗-人IgG(γ)抗体作为二抗)为了增加抗体的表达量，使用dhfr基因扩增系统，抗-CCR4嵌合抗体在培养基上清中表达，在这样孔中的转化子用含有1mg/ml G418和50nM的dhfr基因产物二氢叶酸还原酶(下文称为”DHFR”)的抑制物氨甲喋呤(下文称为“MTX”，Sigma制造)的H-SFM培养基悬浮，密度为1-2×105细胞/ml，悬浮物以1ml/孔分装入24孔板(Greiner制造)。混合物37℃，5％CO2培养箱培养1-2周，诱导出显示对50nM MTX有抗性的转化子。当转化子在孔中融合，培养基上清中的抗--CCR4嵌合抗体的抗原结合活性用实施例2的2(3)所示的ELISA测定。转化子在培养基上清中发现有抗-CCR4嵌合抗体的表达的孔中，以同样的方式MTX浓度增加到100nM，然后到200nM，最后获得能在含有1mg/ml G418和200nM MTX的H-SFN培养基中生长的转化子，能够高表达抗-CCR4嵌合抗体。用限制性稀释分离两次，所获得的转化子单细胞分离(克隆)有最高的抗-CCR4嵌合抗体表达的转化子克隆命名为KM2760。KM2760抗CCR4嵌合抗体表达量大约为5μg/106细胞/24小时。另外KM2760抗体H链C区属于入IgGI亚类。KM2760已经以FERM BP-7054 KM2760于2000年2月24日在国际贸易和工业部的工业科学技术部的国家生物科学和人类技术研究所保藏，(现用名国家高级工业科学和技术研究所的国际专利生物保藏处)(Higashi1-1-3，Tsukuba-shi，Ibaraki Prefecture，Japan)。
(3)测定抗体对CCR4部分肽段的结合活性(ELISA)在实施实施例1(1)中获得的hCCR4部分肽段与甲状腺球蛋白(以下表示为“THY”)接合作为分析的抗原。生产方法见于实施实施例1(2)，除了4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC，Sigma制造)代替MBS作为交联剂以外。以上方式制备的交联物以10μg/ml和50μg/ml分装至作EIA的96孔板(Greiner制造)中，4℃放置包被吸附过夜。用PBS洗涤后，用含有1％BSA的PBS(以下表示为“1％BSA-PBS”)，以100μl/孔加入，混合物室温反应1小时，以封闭仍有活性的基团。倾去1％BSA-PBS以后，稀释转化子培养上清溶液，提纯的鼠抗体或提纯的人嵌合抗体以50μl/孔分装，混合物室温反应1小时。反应后，每一孔用含0.05％Tween20的PBS)(以下表示为“Tween-PBS”)洗涤，辣根过氧化物酶标记的兔抗-鼠Ig抗体溶液(DAKO制造)用1％的BSA-PBS稀释400倍，辣根过氧化物酶标记的山羊抗-人IgG(γ)抗体溶液(American Qualex制造)用1％的BSA-PBS稀释3,000倍，分别分装至加入了鼠抗体的孔和加入了人嵌合抗体的孔中，以50μl/孔作为二抗。混合物室温作用1小时。反应后，每孔用Tween-PBS洗涤，ABTS溶液(通过溶解0.55g2，2’-连氮基-双(3-乙基苯硫吡咯因-6-磺酸)铵在1升0.1M柠檬酸缓冲液(pH4.2)制备，使用前加入1μl/ml过氧化氢)以50μl/孔分装用于显色，在415nm(以下表示为“OD415”)测定吸光度。
(4)从培养基上清中纯化抗-CCR4嵌合抗体将在实施例2(2)中得到的表达抗-CCR4嵌合抗体的转化细胞克隆，KM2760，悬浮于含有200nM的MTX和5％的Daigo’s GF21(由Wako Pure Chemical Industries制造)的H-SFM(GIBCO-BRL制造)中，得到的细胞密度为1-2×105细胞/ml，在175cm2的烧瓶(Greiner制造)中放入100ml细胞悬液。细胞37℃，5％CO2培养箱培养5-7天，当它们融合时，回收培养基上清，根据使用说明使用Prosep-A柱(Bioprocessing制造)从200ml培养基上清中纯化抗-CCR4嵌合抗体KM2760，以获得大约1.9mg的纯化蛋白。根据已知方法(Nature，227；680(1970))，将3μg得到的抗-CCR4嵌合抗体KM2760应用于电泳以测定其分子量和纯度。结果表示于图5中。如图5所示，在非还原条件下，纯化的抗-CCR4嵌合抗体KM2760大约是150千道尔顿(以下表示为“Kd’)；在还原条件下，检查到两条大约50Kd和大约25Kd的带。蛋白质的大小几乎与从KM2760的H链和L链cDNA核苷酸序列推断的分子量一致(H链49,226，L链24,168)，也与报道的在非还原条件下IgG类型抗体的分子量大约为150Kd一致，且在还原条件下，由于分子间二硫键(以下表示为“S-S键”)的切断，降解为分子量大约为50Kd的H链和分子量大约为25Kd的L链((AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 14(1988)，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press Limited(1996))，这样就证明抗-CCR4嵌合抗体KM2760表达为有正确结构的抗体分子。而且纯化的抗-CCR4嵌合抗体KM2760的H链和L链的N端氨基酸序列使用蛋白质测序仪(PPSQ-10，Shimadzu制造)分析，证明它们与抗-CCR4鼠抗体KM2160的N端氨基酸序列吻合。
3.hCCR4高效表达细胞的建立(1)构建用于动物细胞的表达载体CAG-pcDNA3用如以下所述的方法构建表达载体，以生产表达载体(CAG-pcDNA3)，其中动物细胞表达载体pcDNA3(INVITROGEN制造)的启动子区域，从巨细胞病毒(CMV)启动子变为CAG((带有CMV-IE增强子的AG启动子(修饰的鸡β肌动蛋白))，且在载体中插入了CCR4基因。
pcDNA3(5μg)与限制酶Nru I(Takara Shuzo制造)37℃反应一小时，然后用乙醇沉淀，回收DNA片段。然后与限制酶Hind III反应(Takara Shuzo制造)37℃反应一小时，用琼脂糖凝胶电泳分离以回收大约5.8kb含有无CMV启动子区域的DNA片段。具有CAG启动子区的质粒CAG-pBluescript IIKS(+)(Nuc.Acid.Res.，233816(1995))(3μg)与限制酶SalI(Takara Shuzo制造)反应，37℃反应一小时，然后用37℃反应用平端试剂盒(Takara Shuzo制造)处理成平端，用HindIII酶切，37℃反应一小时，然后用琼脂糖凝胶电泳分离以回收大约1.8kb含有CAG启动子区域的DNA片段。分别回收的DNA片段用DNA连接试剂盒进行连接(Takara Shuzo制造)，用得到的重组质粒DNA转化大肠杆菌DH5α来得到质粒CAG-pcDNA3。
(2)构建hCCR4表达载体使用在实施例2的3(1)中获得的CAG-pcDNA3和hCCR4DNA-插入的pcDNA3(CCR4/pcDNA3)，按照如以下所述的方法构建hCCR4表达载体。CAG-pcDNA3和CCR4/pcDNA3在37C与HindIII反应一小时，用乙醇沉淀，回收DNA片段。然后，37℃与BglII(TakaraShuzo制造)反应一小时，通过琼脂糖凝胶电泳分离以回收含有CAG启动子区域的大约2.0kb的DNA片段和含有hCCR4基因区域的大约5.5kb的DNA片段。然后，使用两种DNA片段，用如实施例2的3(1)中所述的同样方法制备质粒CAG-CCR4/pcDNA3。
(3)在动物细胞中hCCR4的表达如实施例2的2(2)所述的同样方式使用电穿孔法将质粒导入动物细胞。将EL-4细胞ATCC TIB-39)悬浮于PBS(-)(GIBCO-BRL制造)中，得到浓度为1×107细胞/500μl的细胞悬液，将实施例2的3(2)中获得的CAG-CCR4/pcDNA3取10μg加入其中，混合物冰浴10分钟，然后置入专用小池(Bio-Rad制造)，在260V 500μFD进行基因导入。混合物进一步冰浴10分钟后，细胞悬浮于200ml 10％的FCS-RPMI培养基并且按照200μl/孔分装到用于细胞培养的96孔板中。培养后24小时。每一孔取出100μl的培养基上清，再加入含有1mg/ml的G418的10％FCS-RPMI培养基100μl/孔，使终浓度为0.5mg/ml。两周后，选择10到100个的单克隆再培养。
(4)选择hCCR4高效表达细胞使用在实施实施例1(5)中制备的KM2160细胞，用免疫荧光法选择该细胞。在96孔U形板中，将选择出的数十个具有基因导入的克隆中每一种取2×105的细胞分装于每一个孔中。用FACS缓冲液(1％BSA-PBS，0.02％EDTA，0.05％NaN3，pH7.4)将用已知标记方法(Enzyme Antibody Method，由Gakusai Kikaku出版)进行了生物素标记的KM2160稀释至5μg/ml，加入人IgG(Welfide制造)至3.75mg/ml来抑制非特异性染色，，每一个这样稀释的抗体溶液按200μl/孔分装加入，混合物在冰上反应30分钟。对于负对照，在同样的浓度下使用生物素化的抗-IL-5R的抗体(WO97/10354)。用该缓冲液以200μl/孔洗涤两次以后，分装加入链亲合素-PE(Becton Dickinson Japan制备)20μl/孔。在暗处，冰上反应30分钟后，细胞用200μl/孔洗涤3次，且最终悬浮于500μl，荧光强度用流式细胞仪测量，选择具有最强荧光强度的一株细胞系。
(2)抗-CCR4嵌合抗体与hCCR4-高-表达细胞的反应性(免疫荧光法)纯化的抗-CCR4嵌合抗体KM2760与由实施例2的3(4)制备的hCCR4-高-表达细胞(以后指“CCR4/EL-4”)的反应性用与实施例2的3(4)相同的方式测定。如图7所示，抗-CCR4嵌合抗体KM2760显示出与CCR4/EL-4细胞的强反应性。
2.抗-CCR4嵌合抗体的体外细胞毒性(ADCC活性)为了评估纯化的由实施例2的2(4)得到的CCR4嵌合抗体的体外细胞毒性活性，其ADCC活性按以下的方法测定。
(1)制备靶细胞悬浮液在实施例2的3(4)得到的hCCR4-高-表达细胞CCR4/EL-4用含有0.5mg/ml的G418的10％FCS-RPMI 1640培养基，得到的细胞密度为1×106细胞/0.5ml，将1.85MBq当量的放射性活性的镉酸钠(Na251CrO4)(Daiichi Pure Chemicals制造)加入其中，混合物在37℃反应1.5小时，从而同位素标记细胞。反应后，细胞悬浮于RPMI1640培养基，离心，洗涤，重复三次，再悬浮于培养基，4℃冰浴30分钟，从而自然地释放放射性物质。离心后，加入5ml10％FCS-RPMI1640培养基，得到2×105细胞/ml，混合物作为靶细胞悬浮液使用。
(2)效应细胞悬浮液的制备使用包含200单位(200μl)的肝素钠注射液(Takeda Pharmaceutical制造)的注射器收集健康人的外周血(60ml)。用相同量的生理盐水(Otsuka Pharmaceutical制造)稀释两次，至总体积为120ml。以每管5ml分装Lymphoprep(NYCOMED制造)于12个15ml离心管中(Sunmitomo Bakelite制造)，稀释的外周血以每管10ml加到其上层，混合物在室温800xg离心20分钟。从离心管中收集血浆层和lymphoprep层之间的PBMC部分，并悬浮于含有1％FCS-的RPMI 1640培养基中(GIBCO制造)(以下表示为“1％FCS-RPMI”)，通过400Xg 4℃离心5分钟洗涤两次，最后重新悬浮，使浓度为5×106细胞/ml，用作效应细胞。
(3)测定ADCC活性由实施例3的2(1)制备的靶细胞悬液分装50μl(1×104细胞/孔)至96孔U底板(Falcon制造)的孔中。下一步，将在实施例3的2(2)制备的效应细胞悬液以100μl的用量分装加入(5×105细胞/孔，效应细胞对靶细胞的比率为50∶1)。然后加入每一种抗--CCR4嵌合抗体，至终浓度0.01到-10μg/ml，混合物37℃反应4小时。反应完成后，板离心，且用γ-计数器测定每一孔100μl上清中51Cr的量。用与以上同样的方式，只是使用培养基代替效应细胞悬浮液和抗体溶液，用γ-计数器测定上清中的51Cr的量，来计算自发解离的51Cr的量。用与以上同样的方式，只使用培养基代替抗体溶液，用1N的HCl代替效应细胞悬液，用γ-计数器测定上清中的51Cr的量，来计算总解离的51Cr的量。ADCC活性的计算通过以下公式完成 结果见于图8。如图8所示，抗-CCR4嵌合抗体显示出在0.01到10μg/ml范围内的抗体-浓度-依赖的强细胞毒性活性。以同样的方法测定没有基因导入的细胞系EL-4的ADCC活性作为负对照，其没有活性，因此可以确定细胞毒性活性是CCR4-特异的。以上结果显示抗-CCR4嵌合抗体KM2760可以通过有效激活人的效应细胞来降低或去除CCR4-表达的Th2细胞，这对于诊断和治疗在人中的Th2-介导的免疫疾病如支气管哮喘，特应性皮肤发炎等。
以与实施例3的2(2)相同的方式分离PBMC，悬浮至终浓度为1×107细胞/ml。混合物分装100μl/孔至在实施例3的2(2)中使用的U板，终密度为1×106细胞/孔。每一个KM2760和抗-IL-5受体抗体的负对照(WO97/10354)稀释至终浓度为20μg/ml，以100μl/孔分装于已经分装了细胞的孔中。37℃，5％CO2的气流下，培养24小时后，回收细胞。细胞毒性的测定使用膜联蛋白V-EGFP凋亡检测试剂盒(MBL制造)，且膜联蛋白V-阳性细胞被认为是死细胞。细胞4℃，400Xg离心3分钟，悬浮于试剂盒配备的结合缓冲液中，至浓度为5×105细胞/200μl。悬浮液与1μl膜联蛋白V-EGFP试剂混合，随后用抢头混匀数次，混合物避光反应5分钟。反应后，混合物4℃，400Xg离心3分钟，去上清。沉淀通过在涡流混合器上轻搅使其变松散，加入在冰上预冷的100μl的含有甲醇的2.5mM CaCl2，混合物4℃温浴10分钟。混合物8000xg离心30秒，去上清。沉淀用200μl结合缓冲液悬浮且通过离心洗两次。去上清后的剩余的沉淀，加入10μl PC5-标记的抗-CD4抗体(Coulter制造)，20μl PE-标记的抗-CD45RA抗体(Coulter制造)，和20μl含有2.5mM CaCl2的FACS缓冲液，混合物在4℃反应30分钟。此后混合物通过用含有2.5mM CaCl2的FACS缓冲液离心洗涤3次，用流式细胞仪(Coulter制造)分析。首先，依据其在CD4和CD45RA的染色特性的不同，细胞分为四组分(CD4+CD45RA+，CD4+CD45RA-，CD4-CD45RA+，CD4-CD45RA-)，测定在每一组分的膜联蛋白V-阳性的比率，并用它代表细胞毒性(％)。结果见图9，只在与KM2760共培养的PBMC中观察到细胞毒性，且只在属于CCR4阳性细胞的CD4+CD45RA-组分中特异地检测到毒性。
(2)抑制从人PBMC产生细胞因子的效应以与实施例3的2(3)描述的相同的方式，通过共培养PBMC和KM2760(终浓度10μg/ml)24小时来诱导ADCC活性。培养后，100μl上清去除，加入100μl含有1μg/ml的PMA(乙酸肉豆蔻佛波醇)和200ng/ml的A23187(calcimycinRBI制造)的培养基，PMA和A23187的终浓度分别为0.5μg/ml和100ng/ml，然后细胞因子通过刺激细胞来诱导产生(条件(I))。作为另一个刺激条件，细胞因子的产生是通过使用50ng/ml终浓度的抗-CD3抗体OKT-3(ATCC CRL-8001)代替A23187(条件(ii))。加入每一个刺激试剂，培养24小时后，回收培养基上清，使用细胞因子测定试剂盒(BioSource制造)来测定IL-4，IL-5，IL-13和干扰素(IFN)-γ。如图10显示，Th2细胞因子IL-4，IL-5，IL-13的产生在KM2760-加入组中受到抑制，但Th1的细胞因子IFN-γ的产生没有受到影响。
(2)ADCC活性在实施例5的1中已经证实与抗-CCR4嵌合抗体KM2760有反应性的5个细胞系的ADCC活性的测定用与实施例3的2中所述方法相同的方法进行。如图12所示，抗-CCR4嵌合抗体KM2760浓度依赖性的伤害了所有测试细胞。
纯化的抗-CCR4嵌合抗体KM2760的剂量(蛋白含量)是0.1mg/kg，1.0mg/kg或10mg/kg，在每一剂量组通过单只静脉注射，抗体注射于两只4周岁的雄性老鼠(Macaca fascicularis)。在注射前和注射后第一周，第二周，第三周，第四周从股静脉收集血样，肝素(肝素钠注射液，1000单位/ml Shimizu Pharmaceutical制造)作为抗凝集素使用，加入到1ml的血中，终浓度为25单位/ml。使用平底24孔板，每个个体外周血以500μl/孔分装入两孔。含有刺激剂(PMA终浓度50ng/mlIONOMYCIN终浓度为1μg/ml)的培养基加入到一孔中，无刺激剂的培养基加入到另一孔中，每一孔500μl/孔，混合物轻微搅拌37℃，5％CO2，95％空气培养24小时。另外加入0.5ml青霉素-链霉素溶液(GIBCO BR制造)和5.6ml灭活的胎牛血清(PAA Laboratories制造)到100ml RPMI 1640(GIBCO BRL)中制备使用的培养基。培养后，含有血细胞的肉汤培养基从每一孔中回收并离心(6700xg，5分钟，4℃)获得上清。从得到的培养基上清获得的IL-4，IL-13和IFN-γ分别由细胞因子测定试剂盒(IL-4OptEIA人IL-4试剂盒，PharMingen制造；IL-13细胞筛选人IL-13免疫分析试剂盒BioSource International制造；IFN-γ细胞筛选人IFN-γ免疫分析试剂盒BioSource International制造)。每一孔产生的细胞因子的含量通过从加入了刺激剂(0.1mg/kg组，孔Nos.L-1和L-2；1.0mg/kg组，孔Nos.M-1和M-2；10mg/kg组，孔Nos.H-1和H-2)获得的量减去没有加入刺激剂所获得的量计算的数值。结果示于图13-15。在这些图中注射前的每孔在IL-4，IL-13和IFN-γ中每一个的值作为100％，注射后产生的量以％显示。Th2细胞因子，IL-4(图13)和IL-13(图14)在所有的注射组注射后一周后都有大幅度的降低，注射后4周抑制作用仍持续。另一方面，对于Th1细胞因子IFN-γ(图15)的影响是极小的。
基于这些结果，发现当抗-CCR4嵌合抗体KM2760注射入Macacafascicularis后，从外周血单核细胞产生Th2细胞因子会被抑制至少四周。也显示在Macaca fascicularis体内，在外周血中抗CCR4嵌合抗体KM2760降低或去除了CCR4-表达的Th2细胞。
表1

(2)抗CCR4嵌合抗体KM2760在同基因皮下移植模型中的抗肿瘤作用测定抗CCR4嵌合抗体KM2760在同基因皮下移植模型中的抗肿瘤作用，其中实施例2的2(4)获得的hCCR4高表达鼠源CCR4/EL-4细胞皮下移植入大鼠。使用8-周龄雄性C57BL/6大鼠(CLEA Japan)。CCR4/EL-4细胞悬浮于PBS(-)(GIBCO BRL制造)使细胞的密度为1×106细胞/ml，并以50μl/动物的剂量注入18只C57BL/6大鼠的腹侧皮下。用柠檬酸缓冲液(10mM的柠檬酸和150mM的NaCl水溶液，调pH至6)把100μl KM2760稀释到2mg/ml，，在移植后4小时每隔一天持续5天注射入18只动物中的5只的尾部静脉。在这种情况下每一次注射的剂量为200μg/动物。另6移植后4小时，7天，14天，200μlKM2760用柠檬酸缓冲液稀释到2mg/ml注射入尾部静脉。在此情况下每只注射剂量为400μg/动物。剩下的7只不注射嵌合抗体作为负对照组。移植后6天，周期性地使用游标卡尺测量肿瘤直径，通过每一注射组中肿瘤体积的平均值比每一非注射组的肿瘤体积平均值的比率和注射开始后的存活天数来确定抗肿瘤效应。肿瘤体积通过以下公式计算肿瘤体积＝(宽度)2×长度×0.5每一组肿瘤体积平均值示于表2和图16，每一注射组肿瘤体积平均值比每一非注射组的肿瘤体积平均值的比率的结果示于表3和图17。移植后18天，在5天持续注射200μg的组中，每一KM2760注射组的肿瘤体积平均值比上非注射组肿瘤体积平均值的比率是0.356，在3次注射400μg的组该比率为0.257，所以KM2760在同基因皮下移植模型，按照每一注射计划对于CCR4-阳性白血病细胞的的生长有抑制作用。
表2

单位；mm3±标准偏差表3

(3)抗-CCR4嵌合抗体KM2760异种移植模型的抗肿瘤作用测定抗-CCR4嵌合抗体KM2760大鼠皮下肿瘤的异种移植模型的抗肿瘤作用，其中hCCR4表达人T细胞白血病细胞系CCRF-CEM细胞(ATCC CCL-199)皮下移植入裸鼠。使用8周龄雄性的Balb/c裸鼠(CLEA Japan)。CCRF-CEM细胞悬浮于RPMI 1640培养基(GIBCO BRL制造)使得细胞密度为1×108细胞/ml，以200μl/动物的剂量移植入20只Balb/c裸鼠的腹侧皮肤。然后每组5个动物分为4组，移植后4小时，3天，6天，200μl的KM2760用柠檬酸缓冲液稀释到2mg/ml，0.5mg/ml或者0.2mg/ml注射到三个组的尾静脉。在此情况下，每个组KM2760的注射量是400μg/动物/天，100μg/动物/天，40μg/动物/天。把200μl的人免疫球蛋白G(以下表示为“hIgG”)，用柠檬酸缓冲液稀释到2mg/ml，注射到作为负对照组的剩下的一个组的尾静脉中(400μg/动物/天)。移植后4天，使用游标卡尺周期性测量肿瘤直径，每一组用肿瘤体积判定抗肿瘤效果。肿瘤体积用以下公式计算肿瘤体积＝(宽度)2×长度×0.5每一组肿瘤体积的平均值随时间的改变量显示于表4和图18，在所有的注射KM2760组，都可以观察到完全的肿瘤生长移植作用，所以，KM2760对CCR4-阳性白血病细胞皮下肿瘤异种移植模型有生长抑制效应。
表4

单位；mm3±标准偏差工业适用性如以上所描述的，根据本发明，提供了关于特异性结合到人CCR4和包含有对CCR4是新的CDR的重组抗体和抗体片段。通过免疫染色法，本发明抗体可以应用于对于人Th2细胞的免疫检测中，应用于诊断或治疗所有的Th2-介导的免疫疾病包括支气管哮喘和特应性皮肤病，其中由于Th2细胞和包括血癌例如白血病在内的癌症的异常平衡而导致的病理情况发展。序列列表中的随意版本SEQ ID NO11-合成序列的说明合成DNASEQ ID NO12-合成序列的说明合成DNASEQ ID NO13-合成序列的说明合成DNASEQ ID NO14-合成序列的说明合成DNA
序列表<110>协和发酵工业株式会社(KYOWA HAKKO KOGYO CO.，LTD.)<120>基因重组抗体及其抗体片断<130>P-36976<150>JP 2000-59508<151>2000-03-03<150>JP 2000-401563<151>2000-12-28<160>17<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>28<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr Ser1 5 10 15Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys20 25<210>2<211>28<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>2Asn Ala Thr Glu Val Thr Asp Thr Thr Gln Asp Glu Thr Val Tyr Asn1 5 10 15Ser Tyr Tyr Phe Tyr Glu Ser Met Pro Lys Pro Cys20 25<210>3<211>414<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><221> CDS<222>(1)..(414)<400>3atg aac ctc ggg ctc agt ttg att ttc ctt gcc ctc att tta aaa ggt 48Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly1 5 10 15gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac tta atg aag 96Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Met Lys20 25 30cct gga ggg tcc ctg aaa atc tcc tgt gca gcc tct gga ttc att ttc 144Pro Gly Gly Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe35 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31<210>15<211>138<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>15Met Asn Leu Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Met Lys20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe35 40 45Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Met Arg Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn85 90 95Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Ile100 105 110Tyr Tyr Cys Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp115 120 125Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala130 135<210>16<211>132<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>16Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala1 5 10 15Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile35 40 45Val His Ile Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110Phe Gln Gly Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu115 120 125Glu Ile Arg Arg130<210>17<211>360<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>17Met Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr1 5 10 15Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys Thr Lys Glu20 25 30Gly Ile Lys Ala Phe Gly Glu Leu Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu35 40 45Val Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val Leu50 55 60Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn65 70 75 80Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Leu Pro Phe Trp Gly85 90 95Tyr Tyr Ala Ala Asp Gln Trp Val Phe Gly Leu Gly Leu Cys Lys Met100 105 110Ile Ser Trp Met Tyr Leu Val Gly Phe Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Val115 120 125Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe130 135 140Ser Leu Arg Ala Arg Thr Leu Thr Tyr Gly Val Ile Thr Ser Leu Ala145 150 155 160Thr Trp Ser Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Phe Leu Phe Ser165 170 175Thr Cys Tyr Thr Glu Arg Asn His Thr Tyr Cys Lys Thr Lys Tyr Ser180 185 190Leu Asn Ser Thr Thr Trp Lys Val Leu Ser Ser Leu Glu Ile Asn Ile195 200 205Leu Gly Leu Val Ile Pro Leu Gly Ile Met Leu Phe Cys Tyr Ser Met210 215 220Ile Ile Arg Thr Leu Gln His Cys Lys Asn Glu Lys Lys Asn Lys Ala225 230 235 240Val Lys Met Ile Phe Ala Val Val Val Leu Phe Leu Gly Phe Trp Thr245 250 255Pro Tyr Asn Ile Val Leu Phe Leu Glu Thr Leu Val Glu Leu Glu Val260 265 270Leu Gln Asp Cys Thr Phe Glu Arg Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Gln Ala275 280 285Thr Glu Thr Leu Ala Phe Val His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Ile Tyr290 295 300Phe Phe Leu Gly Glu Lys Phe Arg Lys Tyr Ile Leu Gln Leu Phe Lys305 310 315 320Thr Cys Arg Gly Leu Phe Val Leu Cys Gln Tyr Cys Gly Leu Leu Gln325 330 335Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Met340 345 350Asp His Asp Leu His Asp Ala Leu355 360
权利要求
1.一种与人CCR4细胞外区域特异性作用的重组抗体或抗体片段。
2.如权利要求1所述的重组抗体或抗体片段，其中，所述的胞外区是选自SEQ ID NO17所示的氨基酸序列中的第1-39位、第98-112位、第176-206位和第271-284位的胞外区。
3.如权利要求1或2中的任一项所述的重组抗体或抗体片段，其识别存在于SEQ ID NO17所示氨基酸序列中的第2-29位中存在的表位。
4.如权利要求1到3中的任一项所述的重组抗体或抗体片段，其可以与CCR4-表达细胞特异性地作用。
5.如权利要求1到4中的任一项所述的重组抗体或抗体片段，其具有抗CCR4-表达细胞的细胞毒性活性。
6.如权利要求5所述的重组抗体或抗体片段，其中，所述抗CCR4-表达细胞的细胞毒性活性高于源于非人动物的杂交瘤所产生的单克隆抗体的细胞毒性活性。
7.如权利要求5所述的重组抗体或抗体片段，其中，所述细胞毒性活性是抗体-依赖的细胞-介导的细胞毒性(ADCC)活性。
8.如权利要求7所述的重组抗体或抗体片段，其中，所述抗体-依赖的细胞-介导的细胞毒性活性是指诱导Th2细胞凋亡的活性。
9.如权利要求1到8中的任一项所述的重组抗体或抗体片段，其具有去除Th2细胞的活性。
10.如权利要求1到9中的任一项所述的重组抗体或抗体片段，其具有抑制Th2细胞因子产生的活性。
11.如权利要求10所述的重组抗体或抗体片段，其中所述的Th2细胞因子是IL-4，IL-5或IL-13。
12.如权利要求1到11中的任一项所述的重组抗体，其中所述重组抗体是选自人源化抗体和人抗体。
13.如权利要求12所述的重组抗体，其中，所述人源化抗体是人嵌合抗体或人CDR-移植抗体。
14.如权利要求1到13中的任一项所述的重组抗体，其属于人IgG抗体。
15.如权利要求12所述的重组抗体，其中，所述人源化抗体包括抗体重链(H链)可变区(V区)的互补决定区(CDR)1，CDR2和CDR3，其具有分别由SEQ ID NO5，6和7所示的氨基酸序列；且抗体轻链(L链)V区的CDR1，CDR2和CDR3，其具有分别由SEQ ID NO8，9和10所示的氨基酸序列。
16.如权利要求13所述的重组抗体，其中，所述人嵌合抗体包括一个可以与CCR4特异反应的单克隆抗体的抗体重链(H链)可变区(V区)和抗体轻链(L链)V区；和一个人抗体的H链恒定区(C区)和L链C区。
17.如权利要求16所述的重组抗体，其中，所述人嵌合抗体包括抗体H链V区的互补决定区(CDR)1，CDR2和CDR3，其具有分别由SEQ ID NO5，6和7所示的氨基酸序列；且抗体L链V区的CDR1，CDR2和CDR3，其具有分别由SEQ IDNO8，9和10所示的氨基酸序列。
18.如权利要求16所述的重组抗体，其中，所述人嵌合抗体包括H链V区具有在SEQ ID NO15中所示的氨基酸序列中的第20-138位的氨基酸；且L链V区具有在SEQ ID NO16中所示的氨基酸序列中的第20-132位的氨基酸。
19.如权利要求13所述的重组抗体，其中，所述人嵌合抗体是通过转化子KM2760(FERM BP-7054)产生的抗体KM2760，且其中该抗体的H链C区属于人IgG1亚类。
20.如权利要求13所述的重组抗体，其中，所述人CDR-移植抗体包括与CCR4特异反应的单克隆抗体的抗体重链(H链)可变区(V区)的和抗体轻链(L链)V区的互补决定区(CDR)；且人抗体的H链和L链的C区以及V区框架区。
21.如权利要求20所述的重组抗体，其中，所述人CDR-移植抗体包括H链V区的CDR1，CDR2和CDR3，其具有分别由SEQ ID NO5，6和7所示的氨基酸序列；且L链V区的CDR1，CDR2和CDR3，其具有分别由SEQ ID NO8，9和10所示的氨基酸序列。
22.一种编码如权利要求1-21中的任一项所述的重组抗体或抗体片段的DNA。
23.一种包含有如权利要求22所述DNA的重组载体和一种用于人源化抗体表达的串联载体。
24.一种如权利要求23所述的重组载体导入宿主细胞的转化子。
25.如权利要求24所述的转化子，其中，所述转化子是KM2760(FERM BP-7054)。
26.一种产生重组抗体或抗体片段的方法，其中包括培养如权利要求24或25中的任一项所述的转化子，在培养基中产生和积累重组抗体或抗体片段，和从培养基中回收重组抗体或抗体片段。
27.如权利要求12所述的重组抗体，其中，所述人抗体包括抗体重链(H链)可变区(V区)和/或抗体轻链(L链)V区。
28.如权利要求27所述的重组抗体，其中，所述人抗体的H链V区和L链V区的互补决定区(CDR)包含的氨基酸序列与和CCR4特异反应的单克隆抗体的H链V区和L链V区的CDR各自的氨基酸序列相同。
29.如权利要求28所述的重组抗体，其中，所述人抗体包括H链V区的CDR1，CDR2和CDR3，其具有分别由SEQ ID NO5，6和7所示的氨基酸序列；且L链V区的CDR1，CDR2和CDR3，其具有分别由SEQ ID NO8，9和10所示的氨基酸序列。
30.如权利要求27所述的重组抗体，其中，所述人抗体的H链V区和L链V区包含的氨基酸序列各自与和CCR4特异反应的单克隆抗体的H链V区和L链V区各自的氨基酸序列相同。
31.如权利要求30所述的重组抗体，其中，所述人抗体包括H链V区，其中含有在SEQ ID NO15中所示的氨基酸序列中的第20-138位的氨基酸；和/或L链V区，其中含有在SEQ ID NO16中所示的氨基酸序列中的第20-132位的氨基酸。
32.如权利要求27-31中的任一项所述的重组抗体，其中，所述人抗体是从人噬菌体抗体文库中或产生人抗体的转基因动物中得到的抗体。
33.如权利要求1到11中的任一项所述的抗体片段，其为Fab，Fab’，F(ab’)2，单链抗体，二硫键固定的V区片段，或包含抗体互补决定区(CDR)的肽。
34.如权利要求33所述的抗体片段，其中，所述抗体片段包括抗体的抗体重链(H链)可变区(V区)和抗体轻链(L链)的V区。
35.如权利要求34所述的抗体片段，其中，所述抗体片段的H链V区和L链V区的互补决定区(CDR)包含的氨基酸序列与和CCR4特异反应的单克隆抗体的H链V区和L链V区的CDR各自的氨基酸序列相同。
36.如权利要求35所述的抗体片段，其中包括H链V区的CDR1，CDR2和CDR3分别具有由SEQ ID NO5，6和7所示的氨基酸序列；且L链V区的CDR1，CDR2和CDR3分别具有由SEQ ID NO8，9和10所示的氨基酸序列。
37.如权利要求34所述的抗体片段，其中，所述抗体片段的H链V区和L链V区包含的氨基酸序列与和CCR4特异反应的单克隆抗体的H链V区和L链V区各自的氨基酸序列相同。
38.如权利要求37所述的抗体片段，其中包括具有在SEQ ID NO15中所示氨基酸序列中的第20-138位氨基酸的H链V区；和/或具有在SEQ ID NO16中所示氨基酸序列中的第20-132位的氨基酸的L链V区。
39.一种重组抗体或抗体片段，其为如权利要求1到21和27到38中的任一项所述的重组抗体或抗体片段，其通过化学的或基因工程的方法接合了放射性同位素、蛋白或试剂。
40.一种免疫学检测CCR4的方法，其中包括使用如权利要求1到21和27到39中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
41.一种免疫学检测在细胞表面表达CCR4的细胞的方法，其中包括使用如权利要求1到21和27到39中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
42.一种减少或去除在细胞表面表达CCR4的细胞的方法，其中包括使用如权利要求1到21和27到39中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
43.一种抑制Th2细胞因子产生的方法，其中包括使用如权利要求1到21和27到39中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
44.一种以权利要求1到21和27到39中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
45.一种用于Th2-介导的免疫疾病的治疗剂或诊断剂，其中作为活性成分，含有如权利要求1到21和27到39中的任一项所述的重组抗体或抗体片段为活性成分的药物。
46.一种用于血癌的治疗剂或诊断剂，其中作为活性成分，含有如权利要求1到21和27到39中的任一项所述的重组抗体或抗体片段。
47.如权利要求46所述的治疗剂或诊断剂，其中，所述血癌是白血病。
全文摘要
本发明涉及一种与人CCR4胞外区域特异作用的基因重组抗体或抗体片段；一种编码所述基因重组抗体或抗体片段的DNA；一种产生所述基因重组抗体或抗体片段的方法；一种免疫学检测CCR4的方法，一种免疫学检测在细胞表面表达CCR4的细胞的方法，一种用于减少或去除在细胞表面表达CCR4的细胞的方法，以及一种用于抑制Th2细胞因子产生的方法，每一种均使用上述的基因重组抗体或其片段；用于Th2－介导的免疫疾病的药物、治疗剂或诊断剂和用于血癌的治疗剂或诊断剂，每种均含有上述的基因重组抗体或其片段作为活性成分。
文档编号A61P11/06GK1407993SQ01805990
公开日2003年4月2日 申请日期2001年3月2日 优先权日2000年3月3日
发明者设乐研也, 花井陈雄, 庄司绘美, 樱田干子, 古谷安希子, 中村和靖, 丹羽伦平, 柴田健志, 山崎基生 申请人:协和发酵工业株式会社