促进心脏组织修复的凝血酶衍生肽的制作方法

专利名称：促进心脏组织修复的凝血酶衍生肽的制作方法
政府的支持本发明整体或部分得到了国家健康研究院R43 HL64508项拨款的资助。该政府部门在本发明中享有一定的权利。
本发明的背景人体α凝血酶似乎对各种组织的许多种细胞都具有促进生长的活性。举例而言，在没有加入血清或其他纯化生长因子的情况下，α凝血酶可以和某些仓鼠的纤维原细胞及人类内皮细胞协同作用以引发培养基中纤维原细胞的繁殖，从而在哺乳动物晶状体上皮细胞和脾细胞中引发细胞的分裂或DNA的合成，并激励单核细胞和嗜中性粒细胞。然而，凝血酶作为生长因子的用途和它在治疗创伤方面的潜在重要性还没有得到普遍认可。这在一定程度上是因为凝血酶参与凝血过程、血小板活化作用和启动细胞繁殖的复杂性以及凝血酶和类凝血酶分子受血清蛋白酶抑制剂和细胞释放蛋白酶连接蛋白的调节十分复杂的缘故。但是，这一复杂性和高度的生理调节性却对这一启动途径在创伤愈合方面的潜在重要性构成了支持。
凝血酶在正常的血管再生以及细胞从血液向伤口位置的迁移过程中发挥着作用。同时也在与肿瘤相关的异常转移及血管再生方面发挥着作用。凝血酶提高内皮细胞增生以及改变血管屏障功能的能力也对血管新生以及组织伤口处的感染有帮助作用。
本发明就凝血酶衍生物肽在治疗创伤中的促效和拮抗凝血酶和/或凝血酶受体的活性对这种衍生物进行了说明。美国5,500,412号专利或5,352,664号专利的内容在此通过引证被并入本文。然而，该专利并未指出凝血酶衍生物肽在治疗心脏受损组织、血管再生或防止血管闭锁及血管再狭窄方面的新应用。
发明概述本发明涉及到促进心脏组织修复、促进心肌修复、促进血管再生或防止血管闭锁或血管再狭窄的方法。该方法包括向心脏组织或血管施用具有疗效剂量的血管生长凝血酶衍生物肽。在优选的实施方案中，这种肽是美国5,500,412或5,352,664号专利中所说明的肽，这两项专利的内容在此通过引证被全部并入本文。举例而言，在优选情况下，这种肽含有肽受体结合区域，结合区域含有序列Arg-Gly-Asp-Ala(第2号序列标识)；该结合域还具有丝氨酸酯酶保留序列。优选的丝氨酸酯酶保留序列为Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val(第2号序列标识)。在另一优选实施方案中，凝血酶衍生物肽含有的氨基酸序列 为Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Ary-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val(第3号序列标识)，比如由序列为Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第3号序列标识)的氨基酸构成的肽。
与血管生长凝血酶衍生物肽具有等同生理功能的物质也在本发明的范围之内。举例而言，这些肽的羧基末端可转化为醯胺，氨基末端可以形成乙酰基物质。在某一实施方案中，第3号序列标识的氨基酸由以下具有同等生理功能的物质表示Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly_asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四号序列标识)；Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第五号序列标识)或Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第六号序列标识)。(“AC”是CH3-C(O)-)。具有第4号序列标识的肽在本文中也被称为“TP508”。
肽更适宜在心脏手术过程中或手术后进行使用，例如肽以溶液的形式或以可持续释放的方式注射到或通过导管输送到受损的心脏组织或缺血的心脏组织。
本发明还与刺激血管再生或血管内皮细胞增生的方法有关；如本文所述，该方法包括向心脏组织施以具有疗效剂量的血管生长凝血酶衍生物肽。
本发明还与防止血管闭锁或血管再狭窄的方法有关，该方法包括向血管中施放具有疗效剂量的血管生长凝血酸受体结合肽，例如通过组织注射的方法将肽释放到血管中，或者通过导管将肽输送到受损血管所在地，或者通过将肽附着在金属丝网管上而送入机体组织。
图示简介

图1表明，提高TP508(具有第4号氨基酸序列标识的肽)的浓度可以刺激人类微血管内皮细胞在试管中的增殖。图1表明了在加入不同浓度的TP508(浓度以μg/ml表示)48小时后细胞的数量。
图2表明了提高TP508的浓度可促进微血管内皮细胞的迁移。该图表明了在施用不同浓度的TP508后细胞所迁移的距离。
图3表明了用TP508治疗后心脏功能的变化情况以及心脏缺血实验猪的心脏功能变化情况。
本发明的详细说明心血管疾病的基本特征是心脏供血或其他目标器官的供血出现障碍。心肌梗死是由心脏内冠状动脉的变窄或闭锁造成的，心肌梗死会切断心脏所需的养份和氧气供应。当心脏的供血受到威胁时，细胞的反应是产生可以促使新血管生长的化合物，从而增加对心脏的供血。这些新血管被称为旁系血管。这种诱导现有脉管系统生成出新生血管的过程被称为血管创生，细胞所产生的诱导血管创生的物质是血管生长因子。
当心肌由于血管闭锁而失去氧气和养分时，心肌组织就会缺血，并丧失收缩能力和功能。来自缺血心肌的自然信号可恢复丧失的功能，这种信号通过旁系血管的生长来诱导血管的再生，旁系血管在闭锁血管旁边建立了旁路血管。这种血管再生或血管创生过程包括对内皮细胞增殖的刺激以及新生血管的萌发及迁移。然而，在许多情况下，这种自然信号不足以引发旁系血管的生长。缺血组织可能会出现纤维化及坏死。如果这种纤维化及坏死过程没能通过疏通闭锁的血管或进一步建立旁系血管所逆转，则心脏可能会完全丧失功能，结果是需要进行心脏移殖。
本文中所述的肽可用来诱导血管的再长以及促进血管内皮细胞的迁移，从而形成新的毛细血管及旁系血管；这样可有助于恢复受损或缺血心脏组织的功能。再适宜的方法是，在开胸进行搭桥手术或植入血管辅助装置时直接将肽注射到或施用到心脏组织中，或者将肽以溶液的形式或可持续释放的方式通过导管输送到心脏。
内皮细胞的增殖，例如在血管新生过程出现的细胞增殖同样也有助于避免或抑制血管扩张手术后的血管再狭窄现象。血管小球扩张手术过程通常会损伤到衬套在血管内壁上的内皮细胞，并且会损伤到血管壁的完整。平滑肌细胞和炎症细胞通常会渗入到受伤的血管中，从而引起二次阻塞，这一过程被称为“再狭窄”。对位于因植入小球而受损区域附近的内皮细胞进行刺激，使其发生增殖和迁移，这样可使一层新的内皮细胞覆盖住血管的内表面，从而帮助血管恢复原有的结构。
在优选情况下，内皮生长包括血管整形手术后为抑制、防止或减小血管再狭窄而出现的内皮再生。本领域的技术人员将认识到，用本发明方法进行治疗的患者可以用金属丝网管进行治疗，也可以不用金属丝网管进行治疗。
为了将肽输送到预定的动脉中，可以使用带有膨胀小球的导管，小球或导管外表涂有肽，这种导管可直接将肽注射到血管的内皮中。
血管小球整形术是治疗缺血性心脏病的普通疗法，在该疗法中，为了疏通闭锁的血管，一个小气球将在阻塞的血管中膨胀。但不幸的是，这种疗法会损伤衬在血管内壁上的内皮细胞，其结果通常是再狭窄。为了使新的单层内皮细胞覆盖住血管的内腔表面，本文所述的肽可用来诱导气球所损伤区域附近的内皮细胞进行增殖和迁移，这一做法希望可以恢复血管的原有结构。冠状动脉整形术通常伴随有在血管内展开金属丝网管，从而帮助维持血管的功能，并且防止再狭窄。金属丝网管上涂有肝素，这样是为了在金属丝网管所形成的新通道开始出现内皮细胞生长前防止发生凝血。使用本领域技术人员已知的多种方法可将本文所述的肽直接施加到金属丝网管上。为了增强血管或血管壁的内皮细胞增长和/或调节其他抑制或减少凝血及再狭窄的生理过程，这些肽可以局部使用或全身给药。
在优选情况下，本发明使用合成或天然衍生出的多肽促效剂，这种促效剂对凝血酶受体有中和作用。这二类物质具有凝血酶受体结合区，其中包括能够与高亲和力凝血酶受体进行有选择性结合的一段多肽。这一段多肽具有的氨基酸序列与纤维结合素的三肽细胞结合区的氨基酸序列同源。
除凝血酶受体结合区外，激发性(促效性)多肽具有一套氨基酸序列；其中氨基酸所具有的序列是从十二肽的N-未端氨基酸衍生出来的序列，这种十二肽以往在丝氨酸蛋白酶中是非常稳定的。然而，抑制性多肽不含有这些对丝氨酸蛋白酶不敏感的序列。
举例而言。本发明提供多种有助于促进心脏组织修复的多肽。在这一方面，本发明提供凝血酶的多肽衍生物(或与这种衍生物具有等同生理功能的物质)，这种衍生物含有凝血酶受体结合区以及至少由12个氨基酸构成的序列区，这一序列区对丝氨酸酯酶不敏感。本发明还提供某种至少由23个L-氨基酸构成的多肽化合物，这种多肽化合物即含有凝血酶受体结合区，也含有对丝氨酸酯酶不敏感的氨基酸序列区。本文所述方法所使用的肽化合物通常带有12-33个氨基酸，更适宜的是带有12-23个氨基酸。
在某一实施方案中，本发明提供了数种含有特定氨基酸序列的多肽物质，比如某种多肽化合物，其中凝血酸受体结合区含有L-氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala(第1号序列标识)，同时还含有对丝氨酸酯酶不敏感的氨基酸序列Asp-Ala-Cys-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第2号序列标识)。在优选实施方案中，该多肽化合物包括L-氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Ary-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第3号序列标识)。
与血管生长凝血酶衍生肽具有等同生理功能的物质也在本发明的范围之内。举例而言，这些肽化合物的羧基未端转化成醯胺，氨基未端可形成乙酰基物质。在某一具体实施方案中，第3号氨酸序列由下列具有等同生理功能的物质代表Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly_asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四号序列标识)；Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第五号序列标识)或Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第六号序列标识)。(“AC”是CH3-C(O)-)。具有第4号序列标识的肽在本文中也被称为“TP508”。
本发明还提供促进组织修复的药物成份，这种药物成份含有前面所述的具有有效治疗浓度的任何化合物以及药理学上可接受的赋形剂。一般而言，这些药物成份包括足够浓度的多肽，正如本文所阐明的，这样可以对凝血酶受体产生有效的刺激作用。因此，这些药物成份通常应达到足够的浓度，以便多肽在预定组织部位能够达到与其在试管中刺激受体的相同水平。当内源性二级信号被认为不够时，可以使用这些药物成份，这些药物成份中还进一步添加了具有有效治疗浓度的VEGF、α凝血酶、γ凝血酶和其他生长因子。这些成份组合在一起可以起到附加的或协同的作用。如果组织损伤十分严重，以至于能对多肽做出响应的细胞数量不足，在这种情况下，为了提供有效治疗的组合方法，则应同时向受损组织注入有响应能力的细胞。
合适的载体会对预定目标释放出活性组份，更适宜的情况是在一段时间内缓慢地持续地释放出活性组份。许多合成的并且是可生物降解的聚合物可以作为具有持续释放特性的载体。具体的聚合物包括如聚乳酸/聚乙醇酸均聚物和共聚物这样的聚α羟基酯、聚磷腈、聚酸酐和聚(丙烯反丁烯二酸酯)。
在本技术领域内，聚乳酸/聚乙醇酸均聚物和其聚物是众所周知的具有可持续释放特征的载体。技术人员通过改变聚乳酸与聚乙醇酸的比例以及聚合物的分子量来调节释放的速度(参见Anderson等人在Adv.Drug Deliv.Rev.上的文章，285(1997)，该文献的全文在此通过引证被并入本文)。在这种聚合物中加入聚(乙二醇)可以形成微粒载体，这种微粒载体可进一步延长活性组织的释放时间(参见Cleek等人在J.Control Release上的文章，48259(1997)，该文献的全文在通过引证被并入本文)。聚乳酸/聚乙醇酸微粒载体通常与聚合凝胶或胶原混合使用，以此来防止微粒的集结，并使微粒适于直接注射。
聚磷腈含有交替的氮和磷，但在该聚合物的主链中没有碳，其结构如下式(I)所示
通过适当改变聚合物主链两侧所结合的基团R的R’，可以调整该聚合物的特性。举例而言，通过改变易于水解的侧面基团的量可以控制聚磷腈的降解以及对药物成份的释放速度。在加入更多咪唑或乙基酐氨酸取代的聚磷腈后，降解的速度提高了(参见Laurencin等人在J Biomed Mater.Res.上所著的文章，27963(1993)，该文献的全文在此通过引证被并入本文)，因此提高了药物释放的速度。
结构式(II)所表明的聚酸酐具有明确的降解和释放特性，通过改变如葵二酸和1.3-二(对羟基苯氧基)丙烷这些疏水性或亲水性单体的量可以控制聚酸酐的降解及释放特性(参见Leong等人在J.Biomed.Mater.Res.上的文章，19941(1985)，该文章的全文在此通过引证被并入本文)。
聚(丙烯反丁烯二酸酯)是一种生物兼容性很高的可植入载体，因为这些物质是可注射的、可原地聚合的并且是可生物降解的材料。“可注射的”意味着这种材料可使用注射器通过注射浆体或胶体所用的标准针头进行注射。聚(丙烯反丁烯二酸酯)与乙烯基单体(N-乙烯基吡咯烷酮)和引发剂(苯酰基过氧化物)共同形成了一种可原地聚合的可注射溶液(参见Suggs等人在Macromolecules上的文章，304318(1997)，参见Peter等人在J.Biomater.Sci.Poly，.Eng.上的文章，10363(1999)，参见Yaszemski等人在Tissue Eng上的文章，141(1995)，这些文章的全文在此通过引证被并入本文)。
如本文所用，“具有治疗效果的浓度”被定义为特定药剂的浓度，这种药剂可令人满意地提高组织修复或血管再生的速度，或者这种药剂可令人满意地降低或抑制血管狭窄或血管闭锁的程度。再者，这些浓度被认为是达到了足以在试管中对高亲和性凝血酶受体进行刺激的水平。然而，当刺激性(促效性)多肽的浓度在0.1μm～10μm之间时，这些药剂组份被认为是效力最高的。
就本发明目的而言，无论是在活的有机体内生成的还是在试管是合成的，凝血酶衍生物被定义为任何一种带有氨基酸序列的分子，其中氨基酸的序列至少有部分是从凝血酶的序列衍生出来的。因此，正如本文所指的，凝血酶衍生物是指比凝血酶含有更少氨基酸的多肽分子。
与凝血酶衍生肽具有同等生理功能的物质包括那些在特性上不同于凝血酶衍生肽的分子；这些分子不会影响凝血酶受体结合区或对丝氨酸酶不敏感的氨基酸序列的功能。这些特性包括稳定的氨基酸替换或改性；例如羧基未端的醯胺化，氨基未端的乙酰化；这些特性还包括多肽与生理惰性载体分子结合，或者序列按照对丝氨酸酯酶不敏感的序列而变化；但这些特性并不局限于此。
本领域中任何一种已知的方法都可以实现羧基未端的醯胺化。因此，羧基未端的氨基酸用结构或(III)表示
其中R是氨基酸侧链，R1和R2分别选自氢、C1-C6的烷基(有支链的和直链的烷基基因)，R1和R2与它们所结合的氮形成了一个非芳烃杂环，例如氮杂戊环/对二氮己环/吗啡环或哌啶环。在优选情况下，R1和R2是氢。
本领域中任何一种已知的方法都可以实现氨基末端的乙酰化。因此，具有氨基末端的氨基酸用结构式(IV)表示R1-C(O)-NH-CHR-C(O)-(IV)其中R是氨基侧链，R1是C1-C6的烷基(有支链的和直链的烷基基团)。在优选情况下，R是甲基(-CH3)。
凝血酶受体结合区被定义多肽序列，该多肽序列可直接与凝受体相结合，和/或优先抑制高亲和力的凝血酶与α凝血酶之间的结合。
具有对丝氨酸酯酶不敏感序列的区域含有多肽序列，该多肽序列至少含有4-12个十二肽中的N-末端氨基酸，其中十二肽以往在丝氨酸蛋白酶中是高度稳定的，(Asp-X1-Cys-X2-Gly-Asp-Ser-gly-Gly-Pro-X3-Val-第7号序列标识)；其中X1为Ala或Ser；X2是Glu或Gln；X3是Phe、Met、Leu、His或Val。
刺激性多肽被定义为凝血酶的多肽衍生物，或具有同等生理功能的物质，这些物质有能力与凝血酶受体结合以及激发凝血酶受体。因此，刺激性肽将含有二个区域，一个区域是凝血酶受体结合区，另一个是带有对丝氨酸酯酶不敏感的氨基酸序列的区域。
本发明通过下面范例加以说明，这些范例不具任何限制性。
实施例例1TP508在试管中刺激人体内皮细胞的增殖和迁移为了确定TP508是否能够直接诱发内皮细胞的增殖，实验人员从Clonetics购买了人体微血管内皮细胞，这些细胞被涂在24孔培养盘的组织培养级塑料上，并在不加血清的情况下放置24小时。然后使用含有TP508和不含TP508的介质对细胞刺激48小时，然后通过直接计数细胞的数量来评估增殖情况。如图1所示，在只受介质(1.0ug/mlTP508)处理过的微血管内皮细胞中，有30～50％受到TP508刺激后出现了增殖现象。这种效果似乎具有特异性，因为从小鼠动脉分离出来的平滑肌生长不受TP508的影响。
TP508对人体内皮细胞迁移的影响是通过试管单层创伤实验加以评估的。在该实验中，内皮细胞被涂在35mm的培养盘上，并使其生长3天，达到接近融合的程度，此时，用橡皮划过培养盘的中心，除去一条细胞，从而使单层细胞受到“创伤”。在经过拍照后，使用单一的无盐介质或含有不同浓度TP508的介质对细胞进行处理，并使细胞生长48小时。然后再对细胞进行拍照，并对内皮细胞在创伤区域所迁移的距离进行测量。如图2所示，即使细胞只在塑料上进行培养，TP508也激发了内皮细胞的迁移。
这些研究表明，TP508对人体内皮细胞有促其生成血管的直接作用，TP508在试管中引发了细胞更多的增殖和迁移。其他的研究表明，TP508对内皮细胞有保护作用，TP508可防止因暴露在氧化剂下而导致的细胞死亡。这种保护作用也对内皮再生和血管生成过程有促进作用。
例2TP508在试管中刺激尿囊绒膜中的血管生成对实验鼠背部的所有皮科手术切口及开放性伤口的研究表明，局部单独使用TP508会刺激血管再生以及穿越手术切口血管的开放。实验人员在实验鼠的背部做出两个手术切口。一个切口只用TP508(0.1μg)处理，另一个切口则不进行处理。结果是血管被引到了处理过的切口上，而不是引到了对比切口上。
在置于小鸡胚胎尿囊绒膜上的琼脂盘中加入TP508会导致血管向外生长。在TP508的刺激下，血管长到了含有TP508的琼脂盘中。TP508同样也可使血管阻塞处的血管末梢出现旁系血管加速外生的现象，这种外生现象与使用其他血管生长因子所得的现象是相似的。
例3TP508可有效治疗实验猪的心肌缺血实验人员在Yucatan小型猪的左弯动脉附近放置了环形ameroid闭锁器。ameroid在经过一段时间的吸水后，造成了血管的变窄。在植入闭锁器4星期后，血管造影的结果显示血管出现了闭锁。此时，再打开实验猪的胸腔，然后向缺血部位注入可以缓慢释放的TP508，例如向胸腔中注入悬浮于聚丙二醇/环氧乙烷加聚物凝胶中并且含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸微粒。聚乳酸/聚乙醇酸微粒的制备如例6所述，这种微粒初期的药物释放量很大(24小时释放出50％的药量)，然后在此后的3～4天以有控制的方式释放药物，此时已有80％的药量被释放了出去。所使用的凝胶是在0.9％盐水中加入30％W/V聚丙二醇/环氧乙烷加聚物F68所得的液体。每毫升凝胶都放置在冰上以降低凝胶的粘度。在临注射前，向凝胶中加入3.3毫克的聚乳酸/聚乙醇酸微粒。这样得到的TP508浓度为100毫克/毫升凝胶，药物被注射到缺血区域的10处位置(每个位置注射100微升)。对比试样则注射不含TP508的聚乳酸/聚乙醇酸微粒。该实验得到了基准线及后处理过的血管造影和超声波心动图。
心肌厚度及心脏供血比例指数表明，经TP508处理过的实验动物在耐受多巴胺诱发的刺激方面要好于对比实验动物。3个星期后，这些动物用对照强化超声波心动图进行评估。这一数量有限的动物实验的初步结果表明，经TP508处理过的动物在多巴胺刺激下心脏的射血量增长程度稍高一些，与对照实验动物相比，经TP508处理过的动物能保持更好的壁厚。因此，使用TP508进行处理似乎有助于恢复缺血心肌的功能。
例4使用TP508刺激兔子心肌的血管再生该实验中，TP508加入到具有可持续释放特性的聚乳酸/聚乙醇酸微粒中，TP508被注射到兔子的缺血心肌中。正如Operschall等人在J.Appl.Physiol.中的文章所述，一个ameroid闭锁器被放置到两只兔子左边主冠状动脉的侧支上，放置位置正好位于A-V沟槽的下方。在放入闭锁器二星期后，兔子的胸部被再次打开。在一只兔子的闭锁血管供血区域内或周围，任意选择8个位置，然后将TP508的凝胶微粒(如例3中所述的)注射到这8个位置上。另一只兔子则作为不加任何处理的对比动物。在注射TP508后约4个星期，将实验兔解剖，并将兔子的心脏在10％的富尔马林缓冲溶液中放置24小时。然后切开所要研究的心脏部位，并使用苏木精署红进行染色，同时用Von Willebrand内皮细胞标志因子进行免疫标记。
从组织结构的观察得出结论，在对比实验兔体内，闭锁器所作用的区域出现了严重的纤维化。另一方面，经TP508治疗过的心脏却具有健康的心肌，心肌上带有更多的功能性毛细血管，毛细血管上带有明显的血红细胞。
例5使用TP508抑制胆固醇水平过高的兔子出现血管再狭窄这一实验的目的在于为测定试验样品的功效提供一个系统，其中的试验样品被用来抑制胆固醇水平过高的新西兰白兔在经过血管整形术后可能出现的新内膜形成以及血管的闭锁。这些白兔在3个星期中被喂以含0.5％胆固醇和2.0％花生油的高脂肪食物。正如本文所述的，血管小球整形手术损伤了兔子的回肠动脉，术后的兔子用TP508治疗7天；在手术前24小时，兔子接受预处理程序。在此后的4星期中，继续用高脂肪食物喂养兔子。在进行血管小球整形术前和实验结束时对兔子的血管进行造影。将受伤和未受伤的回肠动脉收集起来，以备组织结构观察之用。对腹腔、新内膜(如果存在)以及膜介质进行形态测定。
TP508的试验样品被溶解在无菌、无热原质的盐水中，并稀释到所要求的浓度，并在手术的前一天和手术当天以及术后的连续6天内以0.2毫升的量对实验动物进行静脉注射。
在兔子的颈部做5cm的中线切口，使右颈动脉暴露出来，在对颈动脉进行绑扎后将动脉切开。然后在动脉中插入4Fr Berman气球血管造影导管。5Fr套管通过4Fr Berman气球血管造影导管被引入到动脉中。抽取3毫升血液进行胆固醇测定。然后对兔子注射肝素和更多的麻醉剂(如果必要)。为了对回肠动脉进行观察，6毫升76％的Hypaque以及4毫升无菌盐水的混合液通过导管被注射到兔子体内。对兔子回肠动脉进行成象(图象用格栅加以标记，剪切标记在右侧)。然后将4Fr Berman气球血管造影导管从套管中抽出。然后再将一根0.014″/3.0mm×20.0mm/120cm的气球导管经套管插入到兔子的动脉中，并且插入到回肠动脉处。气球在10ATM下膨胀3次，每次持续30秒，两次膨胀间隔1分钟。然后将导管和套管取出。使用3.0的丝线将右颈动脉绑扎起来。使用PDS闭合颈部的切口，并将皮肤缝合，同时涂上抗生素油膏。
然后，将测试样品或对比样品施加给兔子。测试样品按以下方式进行稀释用23G1针头将0.3毫升盐水抽入到期1.0毫升的注射器中。然后将这些盐水注射到TP508中。待TP508溶解后，取溶液0.25毫升对兔子进行给药。然后用盐水对套管进行冲洗。如果兔子是参照对象，则给该兔子注射0.2毫升的盐水，并再用盐水进行冲洗。兔子还通过皮下注射的方式接受0.3毫升的Buprenorphine。
在手术后，将兔子放在热垫上，使其恢复警觉。然后将兔子送回笼中，并随意喂以食物和水。这些兔子再喂养4星期后进行解剖。
4星期后，两只兔子的回肠动脉原位复原，解剖后将回肠动脉收集起来，以制备组织结构样本。然后，对间隔约为1毫米的组织切片进行数字成像，并对损伤区域的腹腔、新内膜(如果存在)和膜介质进行形态测定。
组织结构总结研究人员使用Image-Pro plus及Excel软件对19个样品进行了形态组织结构分析。在19个样品中，2个样品具有外侧弹性层受损。还有一样品需要进行再切片处理。因此，对照比较了16个样品，其中7个样品是经过TP508处理的，另外9个样品为盐水处理对照样品。
通过数字分析测定新内膜的面积可以确定再狭窄病灶的厚度。血管的膜介质也使用类似的方法进行测定。然后将这两个面积加在一起，并除以同一组织切片系列中正常(未受损)介质的面积，将所得到的数据进行归一化处理。
当药物处理过的动物与对照动物进行比较时，研究人员使用3种不同的方法对再狭窄的程度进行分析；这3种方法是“单一最大值”法；“平均损伤厚度”法和“所有切片平均值”法。“单一最大值”法对接受手术血管的最大再狭窄值进行比较。“平均损伤厚度”法对接受手术血管间被明确定为损伤区域内所有非正常点的平均值进行比较。最后，“所有切片平均值”法对所有被测定样品的平均厚度进行比较，不管这些样品是否有部分损伤。研究人员通过Student’s T-test对这些结果的平均值进行统计显著性测试。
数据汇总所有的数据分析都是使用双尾t测试法进行的，该测试法假定偏差是不相等的。α值是0.05，平均差值被假设为0。在每项数据分析中，n＝7用于经药物处理后的动物，n＝9用于盐水对照动物。数据分析结果汇总在下面的表1中。表中所示的“差值”是经药物处理过的样品与相应的对照样品间的差别百分数，带有星号的数值具有统计意义。
结论数据显示，TP508可显著抑制胆固醇水平过高的兔子出现血管再狭窄和血管闭锁。这一结果是可靠的，因为该结果与对结果进行定量分析所选的技术无关。
表1

例6制备TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物微粒双重乳化技术被用来制备含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物。简单地说，基质组分溶解在二氯甲烷中，TP508溶解在水中。当搅拌时，这两种液体逐渐混合在一起，形成油包水的乳液。在进一步搅拌的同时，向乳液中加聚乙烯醇(0.3％的水溶液)，从而形成第二种乳液(水包油)，这样就形成了双重乳化一种是由聚乳酸/聚乙醇酸小滴组成的水包油乳液，在这些小滴内，第二分散相由溶于水中的TP508组成。根据相分离原理，聚乳酸/聚乙醇液滴形成离散的微粒，这些微粒含有腔体，腔体中容纳着TP508。为了造成微粒的相分离，在乳液中加入2％的异丙醇溶液。乳液中的颗粒通过离心方式加以收集，然后再经冷冻除去残留的水分，改变基质的组份可以形成具有不同释放动力学特性的微粒(表2)。
表2不同微粒配方的组成

微粒的直径用Coulter计数器进行测定。将称重后的微粒溶解于二氯甲烷并将释放出的药物萃取到水中后，使用波长为276nm的光谱分析仪来测定药物的夹带效率。(表3)表3配方直径和药物效率

为了测定TP508从不同聚乳酸/聚乙醇酸基质上释放的情况，20毫克的微粒被放入盛有1.0毫升PBS的1.5毫升聚丙烯微型离心管中。管子在37℃下进行培养，并以每分钟60圈的速度进行摇动。在不同的时间下，管子进行离心运动，含有释放出来的TP508的上层液体被取出，并经冷冻后进行分析。新的PBS被加到微粒中，培养过程仍然继续。上层液体中的TP508通过对波长为276nm光波的吸收情况加以测定。对于每种配方而言，释放情况测定要重复4次。配方B和配方D在37℃下培养28天期间没有测到有药物释放出来。其余的所有配方都释放出了可检测到的TP508，虽然所有的配方在3-4天内所释放出来的药量均低于检测底限(＜1μg/mg基质)。配方A和配方C的TP508释放量最大，在3-4天的时间内释放出了所夹带药物的60～80％。配方C的释放动力学特性最快，这一配方被选来在例3和例4所述的活体研究中做进一步的测试。
虽然本发明是根据本文中的优选实施方案进行具体说明和描述的，但本领域技术人员应该理解的是，在不脱离本文所附权利要求所限定的本发明范围的情况下，可以对本发明的形式及细节做出各种各样的修改。
权利要求
1.一种促进心脏组织修复的方法，该方法包括对心脏组织施用具有疗效剂量的药剂；该药剂与血管生成凝血酶衍生肽具有等同的生理功能。
2.如权利要求1所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物含有凝血酶受体结合区和丝氨酸酯酶保留序列，其中凝血酶受体结合区含有序列Arg-Gly-Asp-Ala(第一号序列标识)。
3.如权利要求2所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物含有氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第三号序列标识)。
4.如权利要求1所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物由以下氨基酸序列组成Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四号序列标识)。
5.如权利要求1所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物由以下氨基酸序列组成Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第五号序列标识)。
6.如权利要求1所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物由以下氨基酸序列组成Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第六号序列标识)。
7.如权利要求1所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物是在心脏手术过程中或术后进行给药的。
8.如权利要求1所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物是通过注射对心脏组织给药的。
9.如权利要求1所述的方法，其中含有与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物的可持续释放配方被施用于心脏组织。
10.如权利要求9所述的方法，其中可持续释放的配方是含有与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能药物的聚乳酸/聚乙醇酸微粒。
11.一种刺激血管再生的方法，该方法包括对心脏组织施用具有疗效剂量的药剂；该药剂与血管生成凝血酶衍生肽具有等同的生理功能。
12.一种在需要这类治疗的患者中刺激血管内皮增殖的方法，该方法包括对患者给予有疗效剂量的药剂，该药剂与血管生成凝血酶衍生肽具有等同的生理功能。
13.一种在血管小球整形术后抑制再狭窄的方法，所述的方法包括对患者给予有疗效剂量的药剂，该药剂与血管生成凝血酶衍生肽具有等同的生理功能。
14.如权利要求13所述的方法，其中的肽涂在血管小球整形导管上。
15.如权利要求13所述的方法，其中的肽是进行全身给药。
16.如权利要求13所述的方法，其中的肽是对气球造成的血管损伤区域进行局部给药。
17.如权利要求13所述的方法，其中涂有血管生成凝血酶衍生物肽的金属丝网管插入到气球所损伤区域的血管中。
18.如权利要求13所述的方法，其中的肽含有凝血酶受体结合区和丝氨酸酯酶保留序列，其中凝血酶受体结合区含有序列Arg-Gly-Asp-Ala(第一号序列标识)。
19.如权利要求18所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物含有氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第三号序列标识)。
20.如权利要求13所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物由以下氨基酸序列组成Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四号序列标识)。
21.如权利要求13所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物由以下氨基酸序列组成Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(第五号序列标识)。
22.如权利要求13所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物由以下氨基酸序列组成Ac-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第六号序列标识)。
23.一种涂有与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能药物的金属丝网管。
24.如权利要求23所述的金属丝网管，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物是Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四号序列标识)。
25.一种抑制患者发生血管闭锁的方法，所述的方法包括对患者施用具有疗效剂量的药剂；该药剂与血管生成凝血酶衍生肽具有等同的生理功能。
26.如权利要求25所述的方法，其中与血管生成凝血酶衍生肽具有等同生理功能的药物是Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-Phe-Val-CONH2(第四号序列标识)。
全文摘要
本发明涉及促进心脏组织修复的方法，该方法包括对心脏组织施放具有疗效剂量的血管生长凝血酶衍生肽和/或抑制或降低血管的闭塞或再狭窄。本发明还与刺激血管新生的方法有关。在另一个实施方案中，在制造本文所述方法所用药物的过程中，本发明还涉及凝血酶衍生肽的使用。
文档编号A61K9/16GK1622827SQ02828569
公开日2005年6月1日 申请日期2002年1月16日 优先权日2002年1月16日
发明者达芮尔·H·卡尼 申请人:德克萨斯系统大学董事会