专利名称：治疗心血管疾病的缓释制剂及其制备方法、质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗心血管疾病的缓释制剂，特别涉及葛根总黄酮缓释制剂，属于制剂领域。
背景技术：
临床实践已证明愈风宁心片是心血管疾病较为理想的中成药，该药对解除高血压引起的颈项疼痛，头晕头痛，冠心病，心绞痛等症疗效显著。然而目前其生产工艺还比较原始，质量的可控性较差，剂型单一，且制剂中有效成分含量较低，服用剂量大。这些问题的存在不能满足和适应现代临床用药的需要，为了提高该药的质量，充分发挥其效用，非常有必要研制方便而长效的新剂型。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种治疗心血管疾病的葛根总黄酮缓释制剂；本发明的另一个目的在于公开制备一种治疗心血管疾病的葛根总黄酮缓释制剂的制备方法；本发明的另一个目的在于公开该缓释制剂的质量控制方法。
本发明药物组合物制成缓释制剂的原料药组成及重量比例如下葛根总黄酮提取物300-600重量份羟丙基甲基纤维素50-200重量份硬脂酸镁1-4重量份。
本发明药物组合物制成缓释制剂的原料药组成及重量比例优选为葛根总黄酮提取物350-500重量份羟丙基甲基纤维素80-150重量份硬脂酸镁1-3重量份。
本发明药物组合物制成缓释制剂的原料药组还可以是葛根总黄酮提取物300-600重量份羟丙基甲基纤维素50-200重量份硬脂酸镁1-4重量份二氧化硅1-6重量份。
本发明药物组合物制成缓释制剂的原料药组成及重量比例优选为葛根总黄酮提取物350-500重量份羟丙基甲基纤维素80-150重量份硬脂酸镁1-3重量份二氧化硅3-5重量份。
本发明药物组合物制成缓释制剂的方法为将葛根总黄酮提取物粉碎过筛，按比例与羟丙基甲基纤维素混合均匀，加适量乙醇作润湿剂，过15-30目筛制粒，30-60℃干燥1-3小时，过24目筛整粒，按比例加入硬脂酸镁和二氧化硅，混合均匀，经常规制成临床可接受的缓释制剂如片剂、胶囊、颗粒剂、微丸等。
上述原料葛根总黄酮提取物可选用市售品，也可用以下方法制得葛根(野葛根)用7倍量稀乙醇，提取3次，每次2小时，提取液浓缩得稠膏(50℃相对密度为1.3-1.4)加2倍于药量的水溶解，过滤，滤液蒸去乙醇，加水使成0.5～1g生药/ml溶液过大孔树脂柱，去杂质，剩余部分水洗，被吸附的有效成分，90％乙醇解吸，乙醇液干燥得葛根总黄酮提取物，其性状特征为总黄酮含量为50-80％(UV法测定)，易溶于水。
葛根总黄酮提取物不是单一成分，而是一类化学物质，其性状因药材的产地、提取工艺等的不同，差异很大。缓释制剂是一技术含量与要求很高的剂型，所以对葛根总黄酮提取物相关的质量要求较高，否则，所制备的缓释片质量与工艺的重现性难以保证，下述指纹图谱法可达到监测控制质量、评价本发明缓释制剂多组分释药行为，控制内在质量。
本发明药物组合物制成缓释制剂的指纹图谱法质量控制方法为1.高效毛细管电泳法(HPCE)-[参见附图1]色谱条件高效毛细管电泳仪，石英毛细管柱50μm×39cm，检测窗100×200μm柱温25℃
紫外检测器检测波长为254nm分离缓冲溶液0.1M Borax·0.1M NaOH(pH10.12)分离电压20KV正极压力进样，进样时间5秒标准品溶液的制备制备黄芩甙标准溶液、葛根素标准溶液、大豆苷、大豆苷元标准溶液；供试品溶液的制备 样品葛根黄酮缓释片(批号000914)实验方法按照《中华人民共和国药典》2000年版二部释放度测定法的第一法进行，采样时间点为0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h。
指纹图谱测定方法按照上述色谱条件进样标准品溶液和供试品溶液，记录30分钟的色谱图即得。
主要峰的出峰顺序及保留时间大豆苷(daidzin)10-13min；大豆苷元(daidzein)12-16min；黄芩甙(Bdicalin内标物)15-19min；葛根素(Puerarin)21-25min。
2.高效液相色谱法(HPLC)-[参见附图2]色谱条件高效液相色谱仪，检测器UV-1575，泵TU-1580，自动进样器AS-1555色谱柱C18(5μm)检测波长254nm柱温20-35℃流速1.0ml/min流动相0.2％醋酸水溶液-乙腈二元梯度洗脱梯度程序
进样量20μl标准品溶液的制备制备葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷标准溶液；供试品溶液的制备样品葛根黄酮缓释片(批号031002)实验方法按照《中华人民共和国药典》2000年版二部释放度测定法的第一法进行，采样时间点为0.5h，1h，2h，3h，4h，6h，8h，10h，12h。
指纹图谱测定方法按照上述色谱条件进样标准品溶液和供试品溶液，记录50分钟的色谱图即得。
可监测约16个峰，其中按照出峰先后顺序可定量分析6个主要峰，其中葛根素的色谱峰保留时间为19-21min，3′-甲氧基葛根素的色谱峰保留时间为24-27min，大豆苷的色谱峰保留时间为28-31min，大豆苷元的色谱峰保留时间为38-40min。
本发明克服现有的制剂工艺困难，通过对适合于葛根总黄酮提取物的缓释制剂骨架材料、辅料及各组份用量进行选择，发明一种工艺稳定，给药方便，延长药效，减少副作用的缓释剂。本发明缓释制剂克服目前普通片剂的缺点，制剂中有效成分含量高，服用剂量小，并且本发明所用缓释材料为羟丙基甲基纤维素(HPMC)，比其他公开文献缓释系统简单，从而有利于质量控制，工业化生产安全可行。
本发明指纹图谱法质量控制方法，操作简便易行省时，可对本发明缓释制剂进行有效质量控制。
以下实验例进步说明本发明。
实验例1本发明缓释片处方筛选试验以辅料与葛根黄酮提取物的比例，制备工艺等为考察因素，设计了多个处方，通过评价片剂的体外释放度，按照缓释片的释放度设计要求，即1，3，8小时的释放度可分别稳定地控制在15-30％，30-50％和大于70％，从而筛选出最佳处方及制备工艺。
经筛选本发明处方(13号)为最佳处方。
实验例2本发明缓释片与普通片剂(愈风宁心片)生物利用度的比较实验样品葛根黄酮缓释片(自制，批号991115)愈风宁心片(北京同仁堂中药提炼厂，批号9120006)实验动物健康杂种犬3只给药剂量的筛选与确定按照愈风宁心片临床用量推算犬的给药量应为15mg/kg，但是试验中，按此剂量给药，因葛根素的血药浓度很低，HPLC的检测限内未检测到血中葛根素，故将剂量加大到60mg/kg，以上实验结果，是在此剂量下得到的。
实验过程健康杂种犬3只，实验前禁食24h，采用双处理、两周期随机交叉实验设计，洗净期为2周。剂量按60mg/kg葛根黄酮给犬口服缓释片和愈风宁心片。葛根黄酮缓释片清晨口服，服药后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、24h取静脉血2ml，肝素钠抗凝，立即离心5min(4000r/min)，分离出血浆备用。愈风宁心片处理同上。
结果愈风宁心片的达峰时间Tmax和平均滞留时间MRT分别3.3±0.6h和4.6±0.4h。葛根黄酮缓释片的Tmax和MRT分别为4.7±1.2h和7.6±0.6h，缓释作用明显。葛根黄酮缓释片的相对生物利用度为181±54％，吸收优于愈风宁心片。
实验例3发明缓释片与普通片剂(愈风宁心片)体外放度比较的比较本发明缓释片(批号000315)与市售愈风宁心片(北京同仁堂中药提炼厂批号9120006)的体外释放度比较
结是可见，自制缓释片与市售愈风宁心片的体外释放度相比，具有明显的缓释作用。
从释药行为来看，市售愈风宁心片在6小时已经释药完全，而自制缓释片则持续到12小时，具有缓释作用。
从数据的偏差来看，市售愈风宁心片各时间点数据的标准偏差较大，而自制缓释片的数据标准偏差较小，质量可控性好。
实验例4本发明缓释片体内外相关性试验葛根素在犬体内的药时曲线符合开放二室模型，根据Loo-Riegelman方程计算体内吸收百分率(Fa)，以同批葛根黄酮缓释片体外释放百分率(Fd)对同一时间犬体内吸收百分率(Fa)作回归，相关系数为0.9898，体内外相关，可根据体外释放度数据预测体内吸收情况。
实验例5本发明质量控制方法的相关性比较按照《中华人民共和国药典》2000年版二部释放度测定法的第一法进行体外释放度实验，比较紫外分光光度法(检测总黄酮)，高效液相色谱法(HPLC、检测葛根素)，高效毛细管电泳法(HPCE、检测葛根素)评价体外释放度的相关性。
样品批号991115
可见，高效液相色谱法、高效毛细管电泳法与紫外分光光度法比较，基本一致，相关性较好。
实验例6缓释制剂的高效毛细管电泳法(HPCE)质量控制方法1.1仪器与色谱条件仪器P/ACE5000型高效毛细管电泳仪，美国Beckman公司生产石英毛细管柱50μm×39cm，检测窗100×200μm柱温25℃紫外检测器检测波长为254nm分离缓冲溶液0.1M Borax·0.1M NaOH(pH10.12)分离电压20KV正极压力进样，进样时间5秒1.2对照品与试剂葛根素(Puerarin)对照品(批号0752-9806购于中国药品生物制品鉴定所)黄芩甙(Bdicalin)对照品(批号0715-9708购于中国药品生物制品鉴定所)
大豆苷(daidzin)对照品(批号C1803购于ICC公司)大豆苷元(daidzein)对照品(批号C1801购于ICC公司)Borax(批号970203，分析纯，北京益利精细化学品有限公司)NaOH，分析纯，北京化工厂甲醇，分析纯。水为高纯水。
1.3标准品溶液的制备黄芩甙标准溶液准确称取黄芩甙4.23mg，溶解于10ml甲醇中，得0.423mg/ml标准溶液。葛根素标准溶液准确量取浓度为2.11mg/ml的葛根素甲醇溶液适量，稀释成浓度为2.11μg/ml、4.22μg/ml、8.44μg/ml、12.66μg/ml的标准溶液。
精密称取大豆苷适量，用甲醇配制成13.0μg/ml的溶液。
精密称取大豆苷元适量，用甲醇配制成20.8μg/ml的溶液。
1.4供试品溶液的制备样品葛根黄酮缓释片(批号000914)实验方法按照《中华人民共和国药典》2000年版二部释放度测定法的第一法进行，采样时间点为0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h。
1.5指纹图谱(见附图1)测定方法按照上述色谱条件进样标准品溶液和供试品溶液，记录30分钟的色谱图即得。
主要峰的出峰顺序及保留时间大豆苷(daidzin)-约12min；大豆苷元(daidzein)-约14min；黄芩甙(Bdicalin内标物)-约17min；葛根素(Puerarin)-约23min葛根素的定量以标准溶液浓度对峰面积回归得线性方程，相关系数为0.9993，以此方程计算。
未知峰的定量以内标物黄芩甙的峰高值为分母(hs)，计算峰A，B，C，D峰高比值ha/hs，hb/hs，hc/hs，hd/hs。
1.6缓释片释放度
1.7缓释片中ABCD峰高比与时间的关系
可见，A，B，C，D峰的释放特征与葛根素有较好的相关性。实验例7缓释制剂高效液相色谱法(HPLC)的质量控制方法2.1仪器与色谱条件JASCO高效液相色谱仪，检测器UV-1575，泵TU-1580，自动进样器AS-1555色谱柱ZORBAX Extend-C18(4.6×250mm，5μm，Agilent)检测波长254nm柱温25℃流速1.0ml/min流动相0.2％醋酸水溶液-乙腈二元梯度洗脱梯度程序
进样量20μl2.2对照品与试剂葛根素(Puerarin)对照品(批号0752-200108购于中国药品生物制品鉴定所)大豆苷(daidzin)对照品(批号C1803购于ICC公司)大豆苷元(daidzein)对照品(批号1502-200101购于中国药品生物制品鉴定所)3′-甲氧基葛根素实验室提取、纯化制得。
甲醇，分析纯。乙腈，色谱纯。水为高纯水。醋酸，分析纯。
2.3标准品溶液的制备葛根素标准溶液准确量取浓度为2.11mg/ml的葛根素甲醇溶液适量，稀释成浓度为2.11μg/ml、4.22μg/ml、8.44μg/ml、12.66μg/ml的标准溶液。
精密称取3′-甲氧基葛根素适量，用甲醇配制成10μg/ml的溶液。
精密称取大豆苷适量，用甲醇配制成13.0μg/ml的溶液。
精密称取大豆苷元适量，用甲醇配制成20.8μg/ml的溶液。
2.4供试品溶液的制备样品葛根黄酮缓释片(批号031002)实验方法按照《中华人民共和国药典》2000年版二部释放度测定法的第一法进行，采样时间点为0.5h，1h，2h，3h，4h，6h，8h，10h，12h。
2.5指纹图谱(见附图2)测定方法按照上述色谱条件进样标准品溶液和供试品溶液，记录50分钟的色谱图即得。
可监测约16个峰，其中按照出峰先后顺序可定量分析6个主要峰，其中葛根素的色谱峰保留时间约20.708min，3′-甲氧基葛根素的色谱峰保留时间约25.8min，大豆苷的色谱峰保留时间约29.242min，大豆苷元的色谱峰保留时间约39.867min。
2.6缓释片释放度(峰1-6)
图1高效毛细管电泳法指纹图谱(HPCE)图2高效液相色谱法指纹图谱(HPLC)以下实施例均能达到上述实验例。
实施例1缓释片葛根总黄酮提取物 220g羟丙基甲基纤维素(K4M)50g硬脂酸镁 0.6g。
将葛根总黄酮提取物粉碎过筛，按组方与羟丙基甲基纤维素混合均匀，加适量乙醇作润湿剂，过20目筛制粒，45℃干燥2小时，过24目筛整粒，按比例加入硬脂酸镁，混合均匀，压片即得1000片。片重为270毫克；口服，一日2次，1次3片。
实施例2缓释片葛根总黄酮提取物220g羟丙基甲基纤维素60g硬脂酸镁0.6g二氧化硅1g。
将葛根总黄酮提取物粉碎过筛，按比例与羟丙基甲基纤维素混合均匀，加适量乙醇作润湿剂，过20目筛制粒，50℃干燥2小时，过24目筛整粒，按比例加入硬脂酸镁和二氧化硅，混合均匀，压片即得。
权利要求
1.一种治疗心血管疾病的缓释制剂，其特征在于该缓释制剂主要是由如下原料制成的葛根总黄酮提取物 300-600重量份羟丙基甲基纤维素 50-200重量份硬脂酸镁 1-4重量份。
2.如权利要求1所述的缓释制剂，其特征在于该缓释制剂主要是由如下原料制成的葛根总黄酮提取物 350-500重量份羟丙基甲基纤维素 80-150重量份硬脂酸镁 1-3重量份。
3.如权利要求1所述的缓释制剂，其特征在于该缓释制剂主要是由如下原料制成的葛根总黄酮提取物 300-600重量份羟丙基甲基纤维素 50-200重量份硬脂酸镁 1-4重量份二氧化硅 1-6重量份。
4.如权利要求1所述的缓释制剂，其特征在于该缓释制剂主要是由如下原料制成的葛根总黄酮提取物 350-500重量份羟丙基甲基纤维素 80-150重量份硬脂酸镁 1-3重量份二氧化硅 3-5重量份。
5.如权利要求3-4所述的缓释制剂的制备方法，其特征在于该方法为将葛根总黄酮提取物粉碎过筛，按比例与羟丙基甲基纤维素混合均匀，加适量乙醇作润湿剂，过15-30目筛制粒，30-60℃干燥1-3小时，过24目筛整粒，按比例加入硬脂酸镁和二氧化硅，混合均匀，经常规制成临床可接受的缓释片剂、缓释胶囊、缓释颗粒剂、缓释微丸。
6.如权利要求5所述的缓释制剂的制备方法，其特征在缓释片剂制备方法为将葛根总黄酮提取物粉碎过筛，按比例与羟丙基甲基纤维素混合均匀，加适量乙醇作润湿剂，过20目筛制粒，40℃干燥2小时，过24目筛整粒，按比例加入硬脂酸镁和二氧化硅，混合均匀，压片即得。
7.如权利要求1-4所述的缓释制剂质量控制方法中的，其特征在于采用的高效毛细管电泳法包括以下方法色谱条件高效毛细管电泳仪，石英毛细管柱50μm×39cm，检测窗100×200μm，柱温25℃；紫外检测器检测波长为254nm，分离缓冲溶液0.1M Borax·0.1M NaOH(pH10.12)，分离电压20KV，正极压力进样，进样时间5秒；标准品溶液的制备，制备黄芩甙、葛根素、大豆苷、大豆苷元标准溶液；供试品溶液的制备，样品葛根黄酮缓释片按照《中华人民共和国药典》2000年版二部释放度测定法的第一法进行，采样时间点为0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h；测定方法按照上述色谱条件进样标准品溶液和供试品溶液，记录30分钟的色谱图即得。
8.如权利要求1-4所述的缓释制剂，其特征在于采用的高效毛细管电泳法，色谱条件高效毛细管电泳仪，石英毛细管柱50μm×39cm，检测窗100×200μm，柱温25℃紫外检测器检测波长为254nm，分离缓冲溶液0.1MBorax·0.1M NaOH(pH10.12)，分离电压20KV，正极压力进样，进样时间5秒；标准品溶液的制备，制备黄芩甙标准溶液、葛根素标准溶液、大豆苷、大豆苷元标准溶液；供试品溶液的制备，样品葛根黄酮缓释片按照《中华人民共和国药典》2000年版二部释放度测定法的第一法进行，采样时间点为0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h；测定方法按照上述色谱条件进样标准品溶液和供试品溶液，记录30分钟的色谱图，所得指纹图谱主要峰的出峰顺序及保留时间大豆苷(daidzin)10-13min；大豆苷元(daidzein)12-16min；黄芩甙(Bdicalin内标物)15-19min；葛根素(Puerarin)21-25min。
9.如权利要求1-4所述的缓释制剂的指纹图谱质量控制方法，其特征在于采用高效液相色谱法包括以下方法色谱条件高效液相色谱仪，检测器UV-1575，泵TU-1580，自动进样器AS-1555，色谱柱C18(5μm)，检测波长254nm，柱温20-35℃，流速1.0ml/min；流动相0.2％醋酸水溶液-乙腈二元梯度洗脱梯度程序
，进样量20μl；标准品溶液的制备制备葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷标准溶液；供试品溶液的制备样品葛根黄酮缓释片，实验方法按照《中华人民共和国药典》2000年版二部释放度测定法的第一法进行，采样时间点为0.5h，1h，2h，3h，4h，6h，8h，10h，12h；测定方法按照上述色谱条件进样标准品溶液和供试品溶液，记录50分钟的色谱图即得。
10.如权利要求1-4所述的缓释制剂，其特征在于采用高效液相色谱法，色谱条件高效液相色谱仪，检测器UV-1575，泵TU-1580，自动进样器AS-1555，色谱柱C18(5μm)，检测波长254nm，柱温20-35℃，流速1.0ml/min；流动相0.2％醋酸水溶液-乙腈二元梯度洗脱梯度程序
，进样量20μl，标准品溶液的制备制备葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷标准溶液；供试品溶液的制备样品葛根黄酮缓释片， 实验方法按照《中华人民共和国药典》2000年版二部释放度测定法的第一法进行，采样时间点为0.5h，1h，2h，3h，4h，6h，8h，10h，12h；测定方法按照上述色谱条件进样标准品溶液和供试品溶液，记录50分钟的色谱图即得；所得指纹图谱可监测约16个峰，其中按照出峰先后顺序可定量分析6个主要峰，其中葛根素的色谱峰保留时间为19-21min，3′-甲氧基葛根素的色谱峰保留时间为24-27min，大豆苷的色谱峰保留时间为28-31min，大豆苷元的色谱峰保留时间为38-40min。
全文摘要
本发明公开了一种治疗心血管疾病的缓释制剂及其制备方法，还涉及该缓释制剂的质量控制方法。该缓释制剂的原料药组成及重量比例为葛根总黄酮提取物60－80％、羟丙基甲基纤维素10－40％、硬脂酸镁0.1－0.8％；制备成缓释片剂方法为将葛根总黄酮提取物粉碎过筛，按比例与羟丙基甲基纤维素混合均匀，加适量乙醇作润湿剂，过20目筛制粒，30－50℃干燥2小时，过24目筛整粒，按比例加入硬脂酸镁和二氧化硅，混合均匀，压片即得。本发明制剂中有效成分含量高，服用剂量小，对治疗心血管疾病有很好的效果。
文档编号A61P9/10GK1660123SQ200410004449
公开日2005年8月31日 申请日期2004年2月25日 优先权日2004年2月25日
发明者朱春燕, 田瑞华, 徐丽珍, 杨光 申请人:北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂, 中国医学科学院药用植物研究所