和厚朴酚在制备抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物中的应用的制作方法

专利名称：和厚朴酚在制备抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种木脂素类化合物和厚朴酚在制备抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物中的应用。
背景技术：
全世界每年约有1000万新发癌症患者，并且由于人口老龄化、吸烟、饮食习惯和膳食结构的改变和工业化程度的提高，全球癌症的发病数还将以年均3％-5％的速度递增，死亡率也呈逐年上升趋势。对癌的治疗目前采取的是一种包括手术、放疗、化疗以及生物、免疫治疗等在内的综合治疗，但不管采用哪种手段，癌的总体治愈率仍徘徊在30％左右，长期生存率和生活质量仍不理想。
肿瘤是细胞增殖与凋亡平衡失调的一种疾病，同时又是细胞周期异常的疾病，它包含几个不同生物学水平上损伤的长期聚集和细胞的生物化学及基因的改变。肿瘤的发生是一个历时数年(平均15-20年)、复杂的、多阶段渐进过程，其过程可分为启动(initiation)、进展(promotion)及促癌(progression)三个阶段。癌前细胞进一步经促癌剂作用就会转化为癌，然后是癌细胞的自主生长、浸润和转移，演变的前半阶段也是有可能阻断的环节。
因此，理想的控制肿瘤发生发展的方法是采取两手政策，一是有效杀死肿瘤细胞，另一是采取有效的预防干预措施，抑制促肿瘤发展的因素。
可是，大多数已知化疗药物都具有较强的毒副作用，如抑制造血系统，表现为白细胞、红细胞和血小板减少，机体免疫力低下等。相当一部分的癌症病人最终可能不是死于癌症，而是死于化疗药物所致的机体机能衰竭。因此，高效低毒作用机制明确的新抗癌药物的研制为癌症治疗所急需。另一方面，高效安全无毒的化学预防剂在世界各国竞相开展研制。而从天然产物或传统中草药中筛选并分离广谱化学预防剂日益受到重视，主要因为其作用机制广泛，资源丰富，更具安全性和实用性而引起了研究者的广泛关注。迄今已有数十种天然产物进入临床前和临床研究，如天然产物中的多酚类、黄酮与类黄酮、芳香异硫氰酸酯类、萜类、胡萝卜素、有机硫化合物等；食物中的微量成份，如维生素甲类、维生素C、维生素E、钙、硒等；其他天然产物如姜黄素、多胺、纤维素等也在研究中。因此，高效低毒的化疗药物和癌症发生发展的干预阻断试剂的开发显得相当重要。当然，更为理想的是同一种药物兼具两种作用。
和厚朴酚(honokiol)的分子式为C18H18O2的白色晶体，熔点84.8～85.0℃，分子量为266，其结构式为 式I该化合物和其同分异构体都是从木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的树皮或根皮中提取的，在中医上用于温中、下气、燥湿、消痰的药物。

发明内容
本发明的目的在于提供和厚朴酚作为有效成分在制备治疗或预防血液系统肿瘤的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供和厚朴酚作为有效成分在制备治疗或预防消化道肿瘤的药物中的应用。
本发明化合物和厚朴酚如式I所示， 式I该式I化合物具有抗氧化、清除自由基、降低某些致癌物毒性、预防肿瘤发生发展或复发的作用，可用于制备抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物。
本发明式I化合物制备的抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物优选为一种治疗或预防血液系统肿瘤的药物组合物。
本发明式I化合物制备的抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物优选为一种治疗或预防消化道肿瘤的药物组合物。
本发明的抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物包含有效量的式I化合物以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明制得的药物既可以单独作为抗肿瘤药使用，也可以和其它抗肿瘤药物联合使用。
本发明制得的药物既可以单独作为预防肿瘤药物使用，也可以和其它已知化学预防剂伍方使用。
本发明的式I化合物可按本领域抑制方法配成肠道或非肠道组合药的制剂，如片剂、胶囊、颗粒剂、注射液等根据本发明原理，式I化合物和厚朴酚还可以制备成用于肿瘤化疗或化学预防的辅助保健品。
本发明的化合物是一种从中药厚朴中提取出来的苯环类天然活性分子，对各种血液瘤细胞和各种实体瘤细胞均具有细胞毒作用，主要通过引起肿瘤细胞凋亡达到抗癌目的，是一类天然广谱抗癌药物。药代动力学数据说明，和厚朴酚能被胃肠道和腹腔粘膜迅速吸收，在体内滞留的时间相对较长。动物体内试验说明，和厚朴酚具有理想的抑制腹水瘤和实体瘤生长的活性，显著延长荷瘤动物的生存时间。和厚朴酚体内抑瘤效率与经典抗癌药物阿霉素相当。在给予有效剂量时，无论是体外培养的原代正常细胞，还是体内喂养小鼠都无明显的毒副作用。和厚朴酚是一种安全、高效、广谱、给药方便的肿瘤化疗候选药物。
本发明的化合物同时具有显著的抗氧化作用，增强LDH、GST、GSH-px等酶活性；可直接与致癌物结合形成复合物，影响致癌物的吸收、分布和代谢活化；影响致癌物引起的DNA加合物形成；影响代谢酶的活性，从而影响致癌物代谢及其代谢产物的降解与排泄；显著抑制端粒酶活性；能诱导没分化成熟的白血病细胞的进一步分化；选择性抑制环氧化酶异构酶之一COX-2的表达；抑制肿瘤细胞增殖并可引起早期癌变细胞凋亡。体内动物试验证实对多种诱变剂和致癌物有较强的抗诱变作用，所以和厚朴酚亦可作高效低毒干预阻断试剂的组合物。


图1为和厚朴酚对人成纤维细胞、淋巴细胞和脐静脉内皮细胞毒性检验；其中 为分离自人新鲜血液的淋巴细胞；□为原代培养的来源自小儿包皮的人成纤维细胞； 为原代培养的人脐静脉内皮细胞。
图2A为经和厚朴酚处理的RKO细胞DNA梯带检测；其中，对照为未加和厚朴酚组；H5为5ug/ml和厚朴酚处理组；H10为10ug/ml和厚朴酚处理组；H15为15ug/ml和厚朴酚处理组；图2B为经和厚朴酚处理的K562细胞DNA梯带检测；其中，对照为未加和厚朴酚组；H5为5ug/ml和厚朴酚处理组；H10为10ug/ml和厚朴酚处理组；H15为15ug/ml和厚朴酚处理组。
图3A为和厚朴酚处理的RKO细胞的亚二倍体峰检测和细胞周期分析；其中，A图为未加和厚朴酚组；B图为5ug/ml和厚朴酚处理组；C图为10ug/ml和厚朴酚处理组；D图为15ug/ml和厚朴酚处理组。 表示凋亡； 表示G1期； 表示S期；□表示G2期；图3B为和厚朴酚处理的K562细胞的亚二倍体峰检测和细胞周期分析；其中，A图为未加和厚朴酚组；B图为5ug/ml和厚朴酚处理组；C图为10ug/ml和厚朴酚处理组；D图为15ug/ml和厚朴酚处理组。 表示凋亡； 表示G1期； 表示S期；□表示G2期。
图4A为经不同浓度和厚朴酚处理的RKO细胞中Caspase-3和-9蛋白表达；其中，对照为未加和厚朴酚组；H5为5ug/ml和厚朴酚处理组；H10为10ug/ml和厚朴酚处理组；图4B为经不同浓度和厚朴酚处理的K562细胞中Caspase-3和-9蛋白表达；其中，对照为未加和厚朴酚组；H5为5ug/ml和厚朴酚处理组；H10为10ug/ml和厚朴酚处理组。
图5为和厚朴酚腹腔注射药代动力学曲线。
图6为和厚朴酚对Balb/c裸鼠所荷RKO实体瘤的抑制效果；其中， 为对照组，仅注射生理盐水；■为溶剂组，仅注射等量与和厚朴酚组相应剂量的溶剂； 为阿霉素组，注射溶于生理盐水的50ug/20g小鼠； □为和厚朴酚组，按100mg/kg剂量注射注射小鼠。
图7为Western blot检测iNOS蛋白表达；其中，对照组为不加和厚朴酚；H5为加5ug/ml和厚朴酚处理；H10为加10ug/ml和厚朴酚处理。
图8为Western blot检测Cox-2蛋白的表达；其中，对照组为不加和厚朴酚；H5为加5ug/ml和厚朴酚处理组；H10为加10ug/ml和厚朴酚处理组。
图9为和厚朴酚预防DMH所致肠肿瘤和癌效果。其中□为肿瘤发生率(％)； 表示癌发生率； 表示荷瘤数与荷癌数的百分率。
具体实施例方式
实施例1-2是对和厚朴酚细胞学效用评价该部分实验主要通过和厚朴酚对于多种血液病细胞和实体瘤细胞的杀伤作用进行效果评价，并利用原代培养细胞进行毒性检验。
其中，所用的细胞系为k562(人慢性骨髓性白血病细胞系)，HL-60(人早幼粒急性白血病细胞系)，Aspc-1(人胰腺癌细胞系)，MG-63(人骨肉瘤细胞系)，SW480(人原发结肠腺癌细胞系)，SW620(人转移结肠腺癌细胞系)，RKO(人大肠癌细胞系)，ECV304(永生化人脐静脉内皮细胞)，293(人肾癌细胞系)，LS174T(人结肠腺癌细胞系)，NCI-H460(人肺癌细胞系)，RD(人横纹肌肉瘤细胞系)，Hela(人宫颈癌细胞系)，Bcap37(人乳腺癌细胞系)，HepG2(人HBV肝癌细胞系)，NB4(人急性前中幼粒白血病细胞系)，BxPC-3(人胰腺瘤细胞系)，HCT-116(人结直肠癌细胞系)，HT29(人COX-2阳性肠癌细胞系)，U937(人巨嗜细胞淋巴瘤细胞系)，以上这些人细胞系均由浙江大学肿瘤研究所提供。
所用的试剂和仪器如下和厚朴酚溶液单晶用DMSO溶解，配成5mg/ml的工作液，用RPMI 1640配成工作液。RPMI 1640，MTT，小牛血清，培养板，二氧化碳培养箱，酶标仪，流式细胞仪(FACS)。细胞培养用RPMI-1640(Gibco BRL)培养基，其中含10％灭活的小牛血清(中国杭州四季青生物技术公司)、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素，于37℃、5％CO2孵箱培养。Caspase-3，-7，-9和Pan-actin购自NeoMarkers，Fremont，CA，USA。和厚朴酚取于中国生物制品药品鉴定所，标定纯度大于98％。该药用DMSO配成10mg/ml的储备液，使用时用培养基稀释使DMSO终浓度小于1％。MTT购自美国Sigma化学品公司。实验用的Balb/c鼠和Balb/c裸鼠均购自浙江大学实验动物中心。
实施例1、MTT法检测和厚朴酚对不同细胞系细胞增殖抑制抑制及IC50值方法细胞悬液以三个平行复孔种于96孔板，每孔100ul。37℃培养24小时使细胞贴壁，用含不同浓度和厚朴酚的新鲜培养基配成终体积200ul，37℃孵育68小时后，每孔加50ul 2mg/ml的MTT，继续培养4小时，平板离心1000rpm×10min，弃去上清。加120ul DMSO溶解MTT结晶，平板振荡10min，570nm下Elisa读值。每种细胞均进行三次独立试验。
计算方法IC50＝抑制率为50％时的药物浓度实验结果列于表1，由表1数据可以看出，和厚朴酚在体外可抑制各类肿瘤细胞增殖，其细胞毒性与药物浓度和作用时间呈正比，导致半数肿瘤细胞死亡的药物浓度(IC50)大约是5-15ug/ml，和厚朴酚是一种天然广谱抗癌的酚类化合物药物。
表1、和厚朴酚作用下各种细胞系IC50

实施例2、用原代培养细胞进行毒性检验方法原代人成纤维细胞(fibroblast)取自新鲜小儿包皮，培养于DMEM中；人淋巴细胞(lymphocyte)分离自脐带血，培养于加进口胎牛血清的IMDM中，并加入5ug/ml植物血凝素(PHA)；人脐静脉内皮(HUVEC)取自新分娩脐带，所用培养基为M199。所有细胞均5000个/孔种于96孔板，贴壁后用不同浓度(0-80ug/ml)和厚朴酚作用24h，每浓度三个平行复孔。细胞活性用台盼蓝染色计算。所有毒性实验均重复三次。
实验结果如图1所示，和厚朴酚对原代培养的正常人成纤维细胞和人血淋巴细胞的毒性较小，安全剂量可达40ug/ml。但人脐静脉内皮细胞对和厚朴酚表现出异于寻常的低耐受力。
实施例3-6是对化合物和厚朴酚的作用机制的研究优选RKO和K562细胞作为试验对象，分别检测DNA梯带的形成、亚二倍体峰存在及caspase家族蛋白表达变化，确认其作用机制主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡。
实施例3、DNA梯带检测方法RKO或K562细胞经5，10，15ug/m的和厚朴酚作用48h，用含50mMTris-HCL(PH7.5)，20mM EDTA和1％NP-40裂解缓冲液裂解，然后加1％ SDS和Rnase(5ug/ml)到上清中，56℃孵育2h，再加蛋白酶K(2.5ug/ml)37℃孵育2h。用醋酸铵(3.3M)和酒精(99.5％)溶解沉淀，加入上样缓冲液。DNA梯带经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察。
实验结果根据和厚朴酚对RKO细胞毒性的IC50，我们以5、10、15ug/ml作为检测浓度。以上浓度分别作用48小时后，RKO细胞呈现特征性的凋亡形态胞体变圆、胞浆出现颗粒和空泡，胞膜皱缩，最终整个细胞悬浮于培养液中。如图2A所示，药物处理组细胞基因组DNA断裂，经琼脂糖凝胶电泳出现180bp-200bp倍数的梯带。这些现象提示，和厚朴酚可能诱导体外培养的RKO细胞发生凋亡。K562细胞的处理结果如图2B所示，同样显示K562细胞发生了凋亡且比例更大。
实施例4、DNA含量和细胞周期分析方法不同浓度(5、10和15ug/ml)和厚朴酚分别处理RKO细胞48h，用不加和厚朴酚但加等量于15ug/ml和厚朴酚组体积的DMSO的RKO细胞作为对照，亦培养48h，分组收获细胞。在4℃用70％酒精固定细胞15min，PI(1.0ug/ml)染色，流式细胞仪488nm波长下检测细胞周期变化，结果用ModFIt 3.0软件分析。每份样品检测1万个细胞。K562细胞同上方法处理。
实验结果结果列于表2，药物处理组出现与剂量相关的G0/G1z期阻滞。如图3A所示，随着和厚朴酚浓度增加，亚二倍体细胞数量增加；当浓度达到10ug/ml和15ug/ml时，DNA碎片明显增加，分别达14.10％和20.31％。这些结果进一步说明和厚朴酚引起细胞凋亡现象。K562如图3B所示，随和厚朴酚处理浓度增高，亚二倍体峰逐渐增大，凋亡细胞数明显上升。
表2、和厚朴酚对RKO细胞的周期分布和凋亡的影响

#P＜0.05；*P＜0.01是与对照组相比。
实施例5、Western blot分析凋亡分子caspase家族表达方法5×106RKO细胞用含0.02％EDTA的0.4％胰酶消化，收集后用冰PBS(PH7.4)洗两次。细胞总蛋白用细胞裂解液{150mM NaCL，0.5M Tris-HCL(PH 7.2)，0.25M EDTA(PH 8.0)，1％ Triton X-100，5％ glycerol，1.25％ SDS}抽提。取30ug蛋白在12％ SDS-PAGE电泳，250mA转膜2h至PVDF膜上(转移缓冲液含25mM Tris-HCL(PH8.3)，192mM甘氨酸和20％甲醇)。5％脱脂奶室温封闭2h，加caspase-3，-9一抗(TBST按1∶400稀释)4℃过夜。加入辣根过氧化酶标记的二抗(1∶5000稀释)，室温作用1h；TBST洗涤数次后加显色液，曝光洗片。K562细胞为悬浮细胞，不需胰酶消化，直接收集并按上述方法处理。
实验结果Caspase家族是细胞凋亡通路的重要调控因子。为说明和厚朴酚引起的细胞凋亡与Caspase家族的相关性，我们用Western blot方法检测了Caspase-3和-9的表达变化。如图4A所示，RKO细胞在药物作用48小时后，细胞内两种Caspase蛋白的表达量明显增加，并与药物剂量呈正相关。如图4B所示，相应两种蛋白均有显著上调。
实施例6-9动物体内效果评价该部分实施例则主要分析和厚朴酚在小鼠体内的药物分布参数，评价对相关腹水瘤模型和移植瘤模型鼠的抗瘤效果。
实施例6、药代动力学研究方法用聚乙二醇400(PEG400)和葡萄糖按7∶3体积比混溶和厚朴酚，使成20mg/ml原液。30只Balb/c鼠每鼠腹腔注射250mg/kg和厚朴酚，不同间隔时间收集血样，每时间点取三只鼠作为样品，样品处理参照文献[Proc.Natl.Acad.Sci.1997；942620-2625和Nucleic Acid Drug Dev.1998；8135-139]。血浆中药物浓度用高效液相色谱(HPLC)分析，检测波长为290nm，色谱柱采用5um×100mm×2.1mm(i.d)反相C18柱，流动相采用甲醇0.1％三氟乙酸(体积比)，流速0.2ml/min。药代动力学参数用Modkine软件分析(Biosoft，UK)。
实验结果如图5所示，Babl/c小鼠腹腔注射和厚朴酚250mg/kg，最大血药浓度出现在注射后27.179±6.252分钟。血浆消除曲线以一级吸收一室模型描述半数吸收时间12.1±2.761分钟，消除半衰期是5.218±0.461小时。
实施例7、延长荷RKO腹水瘤裸鼠的生存时间方法Balb/c裸鼠腹腔接种1×107RKO细胞，随机分成药物处理组和对照组。和厚朴酚溶于PEG400/Tween20(体积比9∶1)。药物处理组分别在接种后0、2、4、6、8、10天每只鼠每天灌胃2mg和厚朴酚，对照组灌胃等体积溶剂。定期观测腹腔膨胀和体重变化。
实验结果结果列于表3，和厚朴酚200mg/kg灌胃明显抑制RKO腹水瘤形成，显著延长荷瘤动物的生存时间。所有对照组动物(n＝5)腹腔接种RKO细胞后陆续出现腹部膨隆，并在22天内死亡。而服用和厚朴酚组(n＝5)只有1例死于腹水，其他4例生存率超过40天。因此，和厚朴酚对RKO成腹水瘤抑制总有效率为80％。
表3、和厚朴酚对荷RKO腹水瘤的裸鼠生存影响

实施例8、抑制RKO致实体瘤的生长方法5×106RKO细胞接种于Balb/c裸鼠腋部皮下。大约一周当瘤体可见时，动物均匀分成四组阿霉素处理组、和厚朴酚处理组、载体组和空白对照组。和厚朴酚组每次腹腔注射80mg/kg，载体组注射等量和厚朴酚溶剂(PEG400dextrose，体积比7∶3)。阿霉素组注射5mg/kg阿霉素(溶于生理盐水)，对照组注射等体积生理盐水。所有动物隔两天注射药物或安慰剂一次，并用卡尺测量瘤体大小。瘤体体积计算采用公式体积＝∏/6×(长×宽2)，宽代表最短径。
实验结果如图6所示，空白对照组和溶剂组小鼠在接种RKO细胞后的4周内，瘤体体积呈现渐进性的增长，28天增长率分别是1627.6％和1408.2％。药物处理组小鼠的瘤体增长比相应的对照组动物慢。和厚朴酚处理组28天瘤体增长率为968.9％，与溶剂组相比差异具有显著性(P＜0.05)。阿霉素组的28天增长率709.9％，与其对照组相比差异显著，但与和厚朴酚组无显著差异(P＞0.05)。这一结果说明，和厚朴酚在体内能有效抑制RKO致实体瘤的增长，其抗癌功效与经典抗癌药阿霉素相当。
实施例9、荷RKO实体瘤裸鼠生命的延长化疗药物除抑制肿瘤体积的增长，另一个十分重要的指标是生命延长率。和厚朴酚处理的小鼠相比较对照组、溶剂组和阿霉素组小鼠的平均生命延长均被检测。结果是和厚朴酚组和阿霉素组效果相近，与对照组相比具有显著的生命延长，如表4，图8所示，对照组和溶剂组之间无明显差别。
表4、和厚朴酚对荷实体RKO瘤裸鼠的效果

*P＜0.05.
实施例10-14为体外和厚朴酚对肿瘤细胞的化学预防机制研究实施例10、抗氧化清除自由基方法1>.羟自由基反应系统2ml反应液中有2-脱氧-D-核糖(30mmol/L)170ul，EDTA(10mmol/L)40ul，FeSO4(2mmol/L)40ul；次黄嘌呤(2mmol/L)200ul；磷酸缓冲液(0.1mol5/L，PH7.4)1.5ml；H2O2(17.6mmol/L)10ul，反应开始加入黄嘌呤氧化酶(0.4u/ml)40ul。反应混和液在35℃培养15min。
2>.氧自由基反应系统用0.15mol/L、PH7.4的磷酸缓冲液代替上述羟自由基反应系统中的FeSO4和H2O2。
3>.硫代巴比妥酸(TBA)显色反应取上述培养液1ml加入TBA(1％W/V于0.05mol/L NaOH)1ml和冰醋酸1ml，混匀后在沸水浴中加热30min，冷却后于分光光度计上测定A532，以1.1-3.3.-四甲氧基丙烷作为标准液，每种样品重复测定6份。
实验结果列于表5，和厚朴酚能同时清除羟自由基和氧自由基，总体效果看比SOD要强。有文献报道和厚朴酚的抗氧化能力是VE的500～700倍，而已被用于临床的茶多酚类只有VE的9.6倍(Life Sciences including Phamacology Letters，1997；611961-1971)。这与我们的试验结果相符，其清除自由基能力很强。
表5、和厚朴酚抗氧化清除自由基效果

注对照组不加清除剂(即SOD和和厚朴酚)组；SOD组超氧化物歧化酶处理组；和厚朴酚组用10um和厚朴酚作用于上述两个反应。
实施例11、抑制端粒酶活性方法用不同浓度和厚朴酚处理HT29细胞48h，收集细胞、计数，分别取50×102、25×102、12.5×102、6.25×102个细胞，以生理盐水洗涤3次；4℃、12krpm离心10min，弃上清；将沉淀打散后，加入预冷裂解液50μl，混匀，4℃ 2h；4℃、12krpm离心10min；取细胞提取液3μl，加入25μl TRAP-PCR扩增液；无菌DEPC水补足体积至50μl，石蜡油覆盖，行PCR扩增；扩增条件25℃ 30min，94℃ 5min94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 90sec；30循环；72℃ 10min。取PCR产物5μl，加变性液20μl混匀，室温10min加杂交液225μl，混匀；取出100μl包被于抗地高辛的酶标板中，室温、避光作用2h；洗涤液洗3～5次，拍干加入过氧化物酶工作液100μl/孔，室温、避光30min；洗涤液洗3～5次，拍干；加入TMB底物100μl/孔，室温、避光30min；加入终止液100μl/孔以终止反应；用分析仪测定其在450nm、690nm波长的吸光度(A值)，以A＝A460-A690计算。阳性标本A值＝A460-A690＞0.2。
实验结果列于表6，HT29细胞为端粒酶高活性细胞株。当用不同浓度和厚朴酚处理，端粒酶活性随之下调，当达到10μg/ml时，其A值已小于0.2，表现为阴性样本。
表6、和厚朴酚处理后HT29细胞的端粒酶活性变化

注对照为不加和厚朴酚但加等量于H10组所加和厚朴酚体积的DMSO的处理组；H1为1ug/ml和厚朴酚处理组；H5为5ug/ml和厚朴酚处理组；H10为10ug/ml和厚朴酚处理组；A值是表示端粒酶活性的相对吸光度值。
实施例12、诱导HL60细胞分化方法采用NBT还原试验检测。收集HL60细胞1×106个，加0.5ml含1.34mmol/L NBT(硝基四氮唑蓝)和200ug/L TPA(十四烷酰佛波醋酸酯)的生理盐水，37保温1小时，离心弃上清，制细胞涂片，Wright-Giemsa染色，油镜下观察200个细胞，计算NBT阳性细胞百分率。
实验结果对照组有3.9％呈阳性反应，3ug/ml和厚朴酚处理后有27.3％的细胞呈阳性反应，而6ug/ml和厚朴酚处理的HL-60细胞有大量细胞死亡，没死亡的细胞中有56.1％的细胞阳性(p＜0.01)，具有极显著性。实验证明和厚朴酚具有一定的诱导HL-60细胞分化的能力，但据我们的进一步分析发现和厚朴酚不能引导细胞进行终末分化。
实施例13、抗一氧化氮(NO)作用方法RKO细胞经不同浓度和厚朴酚处理24h后收获，用2×SDS细胞蛋白提取液提取总蛋白。Western blot检验(具体过程参见实施例5)。对照组不加和厚朴酚；H5加5ug/ml和厚朴酚处理；H10加10ug/ml和厚朴酚处理。
实验结果来源于L-精氨酸的NO对一些重要的生物分子有损害作用，其过度表达与癌症发生和发展有关。Rao CV等研究发现，可诱导性NO合成酶(iNOS)可能在结肠癌的发生中起主要作用，氧化偶氮甲烷(AOM)可通过诱导iNOS产生以形成结肠畸变隐窝(carcinogenesis，1999，20(1))。图7所示，10ug/ml的和厚朴酚可明显抑制iNOS的表达，从而抑制了诱导的结肠癌形成，使其发生率显著降低(P＜0.05)。
实施例14、选择性下调Cox-2表达方法HT29(人大肠癌细胞系)细胞经不同浓度和厚朴酚处理24h收获，细胞蛋白提取液抽提总蛋白，行western blot检验(具体参见实施例5)。对照组不加和厚朴酚；H5加5ug/ml和厚朴酚处理组；H10加10ug/ml和厚朴酚处理组。
实验结果Cox-2是环氧化酶异构酶之一，在正常组织中几乎不表达，而在85％以上的散发性结直肠癌中存在过度表达，与结直肠肿瘤的发生发展有密切关系，其高表达可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，增加恶性肿瘤细胞的侵袭力，是肠肿瘤发生的催化剂。HT29为Cox-2高表达细胞株。如图8所示，当和厚朴酚处理HT29细胞后，可观测到HT29细胞的Cox-2蛋白表达的显著下调。
实施例15、和厚朴酚化学预防作用的体内动物试验材料昆明种小白鼠，雄性，体重18±2.5g，浙江大学试验动物中心提供。DMH购自Sigma公司。DMH以灭菌生理盐水溶解，临用时配制，以5％的碳酸氢钠调PH至6.5-7.0。
方法将100只小鼠随机分成4组，阴性对照组(简称NS组)10只，每周一次皮下注射生理盐水，连续20周；阳性对照组(DMH组)30只，按20mg/kg剂量每周皮下注射DMH溶液，连续20周；实验组60只，诱癌启动阶段给药，按和厚朴酚给药浓度50mg/kg、150mg/kg分为2小组。DMH每周一次诱癌，和厚朴酚隔天一次灌胃，连续20周。每周称小鼠体重一次，以调整给药剂量。
第20周末处死各组小鼠，解剖小鼠大肠，自肛门向上纵行剪开大肠至回盲部，观察大肠肿瘤的形态及分布部位，计数并测量肿瘤最大直径。洗净整段大肠用全层席卷法将全部大肠固定于10％的甲醛溶液，乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，备用。切片常规切片，烤片，保存备用。苏木素-伊红染色及镜检计算小鼠肿瘤发生率、平均肿瘤数、抑瘤率、癌发生率、癌百分率。抑瘤率＝(对照组平均瘤数-用药组平均瘤数)/对照组平均瘤数×100％。
实验结果如图9所示，1>.20周时和厚朴酚对小鼠肿瘤发生率的影响DMH组30只小鼠均发生大肠肿瘤(腺瘤和癌)，肿瘤发生率为100％，处理组H1、H2组分别为86％和72％，有一定差异。生理盐水组无肿瘤。
2>.20周时和厚朴酚对小鼠肠癌发生率的影响DMH组30只小鼠镜下均发现癌灶，肠癌发生率为100％，而H1组只有59％，H2组有43％，DMH组和处理组有明显差异(P＜0.01)；H1和H2之间亦有差异。
3>.和厚朴酚对小鼠平均荷瘤数的影响DMH组30只小鼠计发生肠肿瘤358个，平均每只小鼠发生肿瘤8.95个，H1和H2组分别只有3.67、3.01个，DMH组显著高于其余各组(P＜0.01)。另外，DMH组中癌324个，占90.5％，而H1和H2仅47％和31％。
整个实验过程中没发现和厚朴酚对小鼠有明显的致死性毒副作用，表明和厚朴酚是安全有效的，从试验结果看和厚朴酚的抗诱变作用是肯定的，不失为一种有潜力的化学预防剂。
权利要求
1.一种式I所示的化合物和厚朴酚在制备抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物中的应用。 式I
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物是治疗或预防血液系统肿瘤的药物组合物。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物是治疗或预防消化道肿瘤的药物组合物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物包含有效量的式I化合物以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物为单独使用。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物为和其它抗肿瘤药物联合使用。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤或预防肿瘤的药物组合物为肠道或非肠道组合药的制剂。
全文摘要
本发明涉及一种如式I所示的木脂素类化合物和厚朴酚(honokiol)在制备抗肿瘤或预防肿瘤药物组合物的应用，该化合物具有高效广谱的抗肿瘤活性和优良的化学预防肿瘤特点，体内体外试验均证实其安全无毒，同时在体有易于吸收且发挥作用时间长的优点。
文档编号A61K31/045GK1692901SQ20041003771
公开日2005年11月9日 申请日期2004年5月8日 优先权日2004年5月8日
发明者陈菲, 王弢, 黄炜, 钱凯先 申请人:陈菲, 王弢