专利名称：成纤维细胞生长因子-19(fgf-19)的核酸和多肽以及用于治疗肥胖的方法
技术领域：
本发明主要涉及鉴定和分离新的DNA，涉及重组产生本文中称为成纤维细胞生长因子-19(FGF-19)多肽的新多肽，涉及使用此多肽治疗肥胖和用于制备具有治疗和药理学特性(包括与治疗肥胖有关的那些)的药物活性物质的方法、组合物和测定法。
背景技术：
肥胖是现代社会极为普遍的慢性疾病，不仅与社会不美观感有关，而且与寿命缩短和大量医学问题有关，所述大量医学问题包括不良心理发展，生殖障碍如多囊卵巢疾病，皮肤病学病症如感染、静脉曲张、黑棘皮症和湿疹，运动耐力差，糖尿病，胰岛素抗性，高血压，高血胆甾醇血症，胆石病，骨关节炎，矫型损伤，血栓性疾病，癌症和冠心病。Rissanen等，BritishMedical Journal，301835-837(1990)。
现有的减肥疗法包括标准日常饮食和锻炼，极低热量饮食，行为疗法，涉及食欲抑制剂、产热药物、食物吸收抑制剂的药物疗法，医疗器械如颌栓结术(jaw wiring)，束腰和气囊以及手术。Jung和Chong，Clinical Endocrinology，3511-20(1991)；Bray，Am.J.Clin.Nutr，55538S-544S(1992)。已有报道节制蛋白的改良型禁食方法在青少年减轻体重方面有效。Lee等，Clin.Pediatr，31234-236(April 1992)。作为减肥疗法的热量限制引起机体贮存蛋白的分解代谢并产生负氮平衡。因此，补充蛋白的饮食作为减少热量限制期间氮损失的措施已广受欢迎。由于这样的饮食仅产生适度的氮减少，因此需要保持苗条身体和蛋白贮备的更有效方法。此外，如果这类方案还导致机体脂肪损耗加速，则能改进减肥治疗。此类治疗的各种方法包括Weintraub和Bray在Med.Clinics N.Amer.，73237(1989)；Bray，在Nutrition Reviews，4933(1991)中讨论的那些。
考虑到肥胖在社会中的极度普遍性和前面提到的与肥胖相关的严重并发症，任何潜在地可用于减轻肥胖个体体重的治疗药物必将对他们的健康产生深刻的有益影响。本领域需要使肥胖个体全身体重减轻至其理想体重并帮助肥胖个体保持其降低后的体重水平而没有严重副作用的药物。
因此，期望提供可用于肥胖个体恢复其正常、理想体重的治疗方案。
期望进一步提供能长时期保持低体重的减肥疗法。
也期望预防肥胖，和一旦开始治疗则阻止继发于肥胖的疾病的进展或者预防其发作，所述继发病如动脉硬化和多囊卵巢疾病。
本发明也提供这类治疗方法及相关组合物。本发明还提供新的蛋白和核酸，以及筛选所述新蛋白和核酸的调节子的方法。本发明提供的其它方法、治疗和组合物对于本领域熟练技术人员而言将变得显而易见。
发明概述已经鉴定了编码新多肽的cDNA克隆(本文称为DNA49435-1219)，其与成纤维细胞生长因子家族的成员-本申请中的″成纤维细胞生长因子-19″(FGF-19)具有某些序列相似性。
本发明的一个方面，提供分离的包含编码FGF-19多肽的核苷酸序列的核酸分子。
一方面，分离的核酸分子含有与(a)编码含图2(SEQ ID NO2)所示从约1或约23至约216的氨基酸序列(包括两端残基在内)的PEACH多肽的DNA分子，或者(b)(a)所述DNA分子的互补链，具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核酸序列同源的核苷酸序列。
另一方面，分离的核酸分子含有(a)编码含图2(SEQ ID NO2)所示从约1或约23至约216的氨基酸序列(包括两端残基在内)的FGF-19多肽的核苷酸序列，或者(b)(a)所述核苷酸序列的互补链。
再一方面，分离的核酸分子含有与(a)
图1(SEQ ID NO1)所示由约464或约530至约1111的核苷酸序列(包括两端残基在内)的DNA分子，或者(b)(a)所述DNA分子的互补链，具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核酸序列同源的核苷酸序列。
还一方面，分离的核酸分子含有(a)图1(SEQ ID NO1)中从约464或约530至约1111位的核苷酸序列，或者(b)(a)所述核苷酸序列的互补链。
此外，本发明涉及分离的核酸分子，其含有与(a)编码由1997年11月21日在ATCC保藏的ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)的人蛋白cDNA编码的相同成熟多肽的DNA分子，或者(b)(a)所述DNA分子的互补链，具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核酸序列同源的核苷酸序列。在一优选的实施方案中，分离的核酸分子含有(a)编码与1997年11月21日在ATCC保藏的ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)的人蛋白cDNA编码的相同成熟多肽的核苷酸序列，或者(b)(a)所述核苷酸序列的互补链。
另一方面，发明涉及分离的核酸分子，其含有与(a)1997年11月21日在ATCC保藏的ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)的人蛋白cDNA的全长多肽编码序列，或者(b)(a)所述核苷酸序列的互补链，具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核酸序列同源的核苷酸序列。在一优选的实施方案中，分离的核酸分子含有(a)1997年11月21日在ATCC保藏的ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)的人蛋白cDNA的全长多肽编码序列，或者(b)(a)所述核苷酸序列的互补链。
还一方面，发明涉及分离的编码下面定义的活性FGF-19多肽的核酸分子，其包括能与编码图2(SEQ ID NO2)中1或约23～约216位氨基酸(包括两个端点氨基酸残基在内)的核酸序列的互补链杂交的核苷酸序列。优选地，杂交在严格杂交条件和洗涤条件下发生。
另一方面，发明涉及分离的编码下面定义的活性FGF-19多肽的核酸分子，其包括与图1(SEQ ID NO1)所示核苷酸约464或约530和约1111之间(包括两个端点残基在内)核酸序列的互补链杂交的核苷酸序列。优选地，杂交在严格杂交条件和洗涤条件下发生。
再一方面，发明涉及分离的具有至少约22个核苷酸的核酸分子，其是在严格条件下使测试DNA分子与(a)编码具有图2(SEQ ID NO2)中1或约23至约216(包括两端残基在内)氨基酸残基的序列的FGF-19多肽的DNA分子，或者(b)(a)所述DNA分子的互补链进行杂交而产生的，而且，如果该测试DNA分子与(a)或(b)具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％至少约99％的核酸序列同一性，则分离该测试DNA分子。
另一方面，发明涉及分离的核酸分子，其含有(a)编码与图2(SEQ ID NO2)约1或约23至216残基所示氨基酸序列(包括两端氨基酸残基在内)相比，具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％评分阳性的多肽的核苷酸序列，或者(b)(a)所述核苷酸序列的互补链。
一个特定方面，本发明提供分离的核酸分子，包括编码没有N-末端信号序列和/或起始蛋氨酸的FGF-19多肽的DNA，或者此编码核酸分子的互补链。信号肽已被试验性地确定为在图2(SEQ ID NO2)所示序列中从约氨基酸1位向约氨基酸22位延伸(包括两端残基在内)。然而，应当指出，信号肽的C-末端边界可能不同，但是在信号肽C-末端边界两端最可能不超过约5个氨基酸，如本文最初的鉴定，其中信号肽C-末端边界可能是依据本领域用于鉴定这类氨基酸序列元件时通常使用的标准来确定的(例如，Nielsen等，Prot.Eng.101-6(1997)和von Heinje等，Nucl.Acids.Res.144683-4690(1986))。而且，也应认识到，在有些情况下，从分泌的多肽上裂解的信号序列不完全相同，从而导致一种以上的分泌类型。这些多肽和编码它们的多核苷酸是本发明考虑的内容。本申请图2(SEQ ID NO2)所示FGF-19多肽的信号肽，从图2(SEQ ID NO2)的氨基酸1向X延伸，其中X是图2(SEQ ID NO2)中从17到27的任何氨基酸。因此，本发明包括FGF-19多肽的成熟形式，其中包括那些含有图2(SEQ ID NO2)中X到216氨基酸的多肽以及下面将要描述的它们的变体，其中X是图2(SEQ ID NO2)中从17到27的任何氨基酸。也包括分离的编码这些多肽的核酸分子。
另一实施方案涉及FGF-19多肽序列的片段，包括用作例如杂交探针或FGF-19多肽中可任选地编码含抗-FGF-19抗体结合位点之多肽的编码片段的编码序列。此类核酸片段长度通常至少约20个核苷酸，或者至少约30个核苷酸，或至少约40个核苷酸，或至少约50个核苷酸或至少约60个核苷酸，或者至少约70个核苷酸，或至少约80个核苷酸，或至少约90个核苷酸，或至少约100个核苷酸，或者至少约110个核苷酸，或至少约120个核苷酸，或至少约130个核苷酸，或至少约140个核苷酸，或者至少约150个核苷酸，或至少约160个核苷酸，或至少约170个核苷酸，或至少约180个核苷酸，或者至少约190个核苷酸，或至少约200个核苷酸，或至少约250个核苷酸，或至少约300个核苷酸，或至少约350个核苷酸，或至少约400个核苷酸，或至少约450个核苷酸，或至少约500个核苷酸，或至少约600个核苷酸，或至少约700个核苷酸，或至少约800个核苷酸，或至少约900个核苷酸，或至少约1000个核苷酸，其中本文术语“约”是指核苷酸序列有关长度加或减10％。在一优选的实施方案中，核苷酸序列片段衍生自图1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列的任何编码区。应当指出，可用常规方法测定FGF-19多肽-编码核苷酸序列的新片段，其通过使用众多公知序列对比程序中任何一个将FGF-19多肽的编码核苷酸序列与其它已知核苷酸序列对比，测定出其中哪个或哪几个FGF-19多肽-编码核苷酸序列片段是新的。本文考虑到了所有这类FGF-19多肽-编码核苷酸序列，并且可以用不繁琐的实验予以测定。也考虑到由这些核苷酸分子片段编码的FGF-19多肽片段，优选是含有抗-FGF-19抗体结合位点的那些FGF-19多肽片段。
在另一实施方案中，发明提供含有编码FGF-19或其变体的核苷酸序列的载体。该载体可含有上述定义的任何分离的核酸分子。
也提供含有此类载体的宿主细胞。例如，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌、感染了杆状病毒的昆虫细胞或酵母。进一步提供生产FGF-19多肽的方法，包括在适宜表达FGF-19的条件下培养宿主细胞并从细胞培养物中回收FGF-19。
在另一实施方案中，发明提供分离的由上面所定义的任一分离的核酸序列所编码的FGF-19多肽。
一特定方面，本发明提供分离的天然序列FGF-19多肽，在某些实施方案中，它包括图2(SEQ ID NO2)所示由约1或约23到约216残基的氨基酸序列。
另一方案，本发明涉及分离的FGF-19多肽，包括与图2(SEQ ID NO2)中约1或约23到约216残基所示氨基酸序列(包括两端残基在内)至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。
再一方面，本发明涉及分离的FGF-19多肽，其含有与1997年11月21日在ATCC保藏的ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)的人蛋白cDNA编码的氨基酸序列具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。在一优选的实施方案中，分离的FGF-19多肽含有由1997年11月21日在ATCC保藏的ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)的人蛋白cDNA编码的氨基酸序列。
另一方面，发明涉及分离的FGF-19多肽，其含有与图2(SEQ ID NO2)中约1或约23到约216位残基所示氨基酸序列(包括两端残基在内)至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％评分阳性的氨基酸序列。
一特定方面，本发明提供分离的没有N-末端序列和/或起始蛋氨酸的FGF-19多肽，该多肽由编码前述氨基酸序列的核苷酸序列编码。本文也公开了制备该多肽的方法，方法包括在适宜表达FGF-19多肽的条件下，培养含有相应编码核酸分子的载体的宿主细胞，并从培养物中回收FGF-19多肽。
还一方面，本发明涉及分离的FGF-19多肽，包括图2(SEQ ID NO2)中约1或约23至约216残基所示氨基酸序列(包括两端残基在内)或其生物活性片段，或足以提供与抗-FGF-19抗体结合位点的片段，其中具有生物活性或提供抗-FGF-19抗体结合位点的FGF-19多肽片段的鉴定，可以用本领域公知的常规技术来完成。优选地，FGF-19片段在性质上保留天然FGF-19多肽的生物活性，包括治疗肥胖的能力。
再一方面，本发明提供如下制备的多肽(i)在严格条件下，使测试DNA分子与(a)编码具有图2(SEQ ID NO2)中约1或约23至约216氨基酸残基的序列(包括两端残基在内)的FGF-19多肽的DNA分子，或者(b)(a)所述DNA分子的互补链进行杂交，且如果该测试DNA分子与(a)或(b)具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的核酸序列同一性，则(ii)在适宜表达该多肽的条件下培养含有该测试DNA分子的宿主细胞，和(iii)从细胞培养物中回收该多肽。
在另一实施方案中，本发明提供含有与异源多肽或氨基酸序列融合的FGF-19多肽的嵌合分子，其中FGF-19多肽可含有前述任何FGF-19多肽或其变体或片段。此嵌合分子的一个实例是含有与免疫球蛋白表位标记序列或Fc区融合的FGF-19多肽的嵌合分子。
在另一实施方案中，发明提供下述定义的与前述FGF-19多肽特异结合的抗体。任选地，抗体是单克隆抗体、抗体片段或单链抗体。
在另一实施方案中，本发明涉及下述定义的天然FGF-19多肽的激动剂和拮抗剂。在一具体实施方案中，激动剂或拮抗剂是抗-FGF-19抗体或小分子。
在另一实施方案中，发明涉及鉴定FGF-19多肽的激动剂或拮抗剂的方法，方法包括使FGF-19多肽与候选分子接触，并检测由所述FGF-19多肽介导的生物活性。优选地，FGF-19多肽是天然FGF-19多肽。
在另外一个实施方案中，本发明涉及含有本文所述FGF-19多肽、FGF-19多肽的激动剂或拮抗剂、或抗-FGF-19抗体、以及载体的组合物。任选地，载体是可药用载体。
本发明另一实施方案涉及本文所述FGF-19多肽或其激动剂或拮抗剂或抗-FGF-19抗体在制备用于治疗对FGF-19多肽、其激动剂或拮抗剂、或抗-FGF-19抗体应答的病症的药物中的应用。
在一个实施方案中，提供了筛选能够结合FGF-19的生物活性剂的方法。一方面，方法包括向FGF-19样品中加入候选生物活性剂，并测定所述候选生物活性剂与所述FGF-19的结合，其中如果发生结合，则表明是能够与FGF-19结合的生物活性剂。
本文另外提供筛选能够调节FGF-19活性的生物活性剂的方法。在一个实施方案中，提供一个方法，该方法包括下述步骤向FGF-19样品中加入候选生物活性剂，并检测FGF-19生物活性的变化，如果有变化，则表明是能够调节FGF-19活性的生物活性剂。在一实施方案中，FGF-19活性是减少细胞中葡萄糖的摄取。在另一实施方案中，FGF-19活性是增加leptin自细胞释放。在一优选的实施方案中，FGF-19活性是降低葡萄糖摄取并增加leptin自细胞释放。优选这类细胞是脂肪细胞。在另一实施方案中，FGF-19活性是增加脂类和碳水化合物的氧化。优选这类细胞是肝细胞或肌肉细胞。
在另一实施方案中，发明提供鉴定FGF-19受体的方法。在一优选实施方案中，该方法包括使FGF-19与含有细胞膜物质的组分结合，如果所述FGF-19与所述细胞膜物质上的受体形成复合物，则鉴定所述受体就是FGF-19受体。在一实施方案中，方法包括使所述FGF-19与受体交联的步骤。细胞膜取自完整细胞或者细胞膜提取物制品(extract preparation)。
本发明的另一方面，提供诱导leptin自细胞(优选脂肪细胞)释放的方法，在一实施方案中，该方法包括向细胞施用能有效诱导leptin释放的量的FGF-19。
在本文提供的方法中，FGF-19可以以表达FGF-19的核酸形式或以蛋白形式来施用。如下面将详述的那样，可通过输注或持续释放制剂而施用FGF-19。优选地，FGF-19与可药用载体一起施用于个体。
也提供诱导细胞(优选脂肪细胞)的葡萄糖摄取减少的方法。在一实施方案中，该方法包括向细胞施用能有效诱导葡萄糖摄取减少的量的FGF-19。
本发明另一方面提供治疗个体肥胖的方法。在一实施方案中，该方法包括向个体施用含有有效治疗肥胖的量的FGF-19的组合物。也可以以这种方式治疗与肥胖有关的病症如心血管疾病。
本文也提供降低个体总体重的方法，包括向所述个体施用有效量的FGF-19。在一优选的实施方案中，减少个体肥胖(脂肪)。
此外，本文提供降低个体的至少一种甘油三酯和游离脂肪酸水平的方法，包括向所述个体施用有效量的FGF-19。本文也提供增加个体代谢率的方法，包括向所述个体施用有效量FGF-19。
本文还提供在各种条件和状态下检测FGF-19及调节物的效应的动物模型。在一实施方案中，提供含有编码FGF-19的转基因的基因组的动物，优选是啮齿类动物。
附图简述图1显示含有编码天然序列FGF-19的核苷酸序列(核苷酸464-1111)cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，其中该核苷酸序列(SEQ IDNO1)是本文称为″DNA49435-1219″的克隆。也以粗字体和下划线标出各自的起始和终止密码子的位置。
图2显示衍生自SEQ ID NO1中编码序列的天然序列FGF-19多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。也显示各种其它重要多肽结构域的近似位置。
图3A和3B显示证明MLC-FGF-19转基因小鼠体重较其未转基因的同窝鼠体重轻(图3A)及具有较低的循环leptin水平的直方图(图3B)。图3A显示6周龄FGF-19转基因鼠(实心棒)和未转基因(野生型)同窝鼠(点彩棒)在自由进食期间(最左侧)、禁食6小时和24小时、和结束24小时禁食后24小时(最右侧)的重量。图3B显示图3A中所示相同组小鼠在leptin测定中的血清(垂直棒)。
图4A-4D是表明FGF-19转基因鼠增加食物摄取和尿量但仍具有正常血细胞比容的直方图。监测一组小鼠自由进食期间和结束24小时禁食之后24小时的食物摄取(图4A)、水摄取(图4B)、排尿量(图4C)和血细胞比容(图4D)情况，其中每组中FGF-19转基因鼠的结果用实心黑棒表示，野生型鼠的结果用点彩棒表示。
图5是表示FGF-19转基因鼠增加氧消耗率的直方图。显示了FGF-19转基因鼠(实心黑棒)和野生型(点彩棒)在日间和夜间、禁食24小时和结束24小时禁食后24小时的氧消耗情况。
图6A和6B是表明与野生型小鼠(点彩棒)相比，FGF-19转基因鼠(实心黑棒)降低甘油三酯(图6A)和游离脂肪酸(图6B)的直方图。
图7A和7B是表明与输注不含FGF-19的安慰剂(点彩棒)相比，给未转基因鼠输注FGF-19(实心黑棒)导致食物摄取增加(图7A)和氧消耗增加(图7B)的直方图，其中″n″代表黑夜，而″d″代表白天。
图8A和8B是表明FGF-19增加leptin自脂肪细胞释放(图8A)和减少脂肪细胞摄取葡萄糖(图8B)的直方图。
图9是显示FGF-19转基因鼠(阴影棒)或野生型(实心黑棒)分别高脂饮食(HFD)一段时间后脂肪垫重量的直方图，其中沿水平方向自左开始，分别是6周时附睾(HFD Ep)的和腹膜后与肾周(HFD RP/PR)的结果，接着是10周时附睾的结果，然后是腹膜后和肾周的结果。
图10是显示FGF-19转基因鼠(阴影棒)或野生型鼠(实心黑棒)随着时间的葡萄糖耐量情况的直方图(均高脂饮食10周)。
优选实施方案详述I.定义本文所用术语″FGF-19多肽″、″FGF-19蛋白″和″FGF-19″，包括天然序列FGF-19和FGF-19多肽变体(将进一步定义)。FGF-19多肽可以是从各种来源(如人组织或其它来源)分离得到的，也可以用重组和/或合成方法制得。
″天然序列FGF-19″包括具有与得自天然FGF-19相同的氨基酸序列的多肽。此天然序列FGF-19可以是从自然界分离得到的，或者是用重组和/或合成方法制得的。术语″天然序列FGF-19″特别包括FGF-19的天然截短型或分泌型(例如，细胞外结构域序列)，天然变体型(例如，可替换式剪切型)和天然等位变体。在本发明一实施方案中，天然序列FGF-19是包括图2(SEQ IDNO2)中1至216氨基酸的成熟或全长天然序列FGF-19。并且，尽管图2(SEQID NO2)公开的FGF-19多肽显示由本文定义为位置1的蛋氨酸残基开始，但是图2(SEQ ID NO2)中氨基酸1位上游或下游的另一蛋氨酸残基作为FGF-19多肽的起始氨基酸残基是可以想象到的和可能的。
″FGF-19变体多肽″指如下定义的与下列氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的活性FGF-19多肽(a)图2(SEQ ID NO2)所示FGF-19多肽的1或约23至216残基的氨基酸序列，(b)图2(SEQ ID NO2)所示FGF-19多肽的X至216残基的氨基酸序列，其中X是图2(SEQ ID NO2)中17至27的任何氨基酸残基，或者(c)衍生自图2(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的另一特定片段。此类FGF-19变体多肽包括，例如，在图2(SEQ ID NO2)所示序列的N-和/或C-末端以及在一个或多个内部结构域内增加或删减一个或多个氨基酸残基的FGF-19多肽。通常，FGF-19变体多肽与(a)图2(SEQ IDNO2)所示FGF-19多肽的1或约23至216残基的氨基酸序列，(b)图2(SEQID NO2)所示FGF-19多肽的X至216残基的氨基酸序列，其中X是图2(SEQ ID NO2)中17至27的任何氨基酸残基，或者(c)衍生自图2(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的另一特定片段，具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的氨基酸序列同一性。FGF-19变体多肽不包括天然FGF-19多肽序列。一般地，FGF-19变体多肽的长度是至少约10个氨基酸，或至少约20个氨基酸，或者至少约30个氨基酸，或至少约40个氨基酸，或至少约50个氨基酸，或至少约60个氨基酸，或者至少约70个氨基酸，或至少约80个氨基酸，或至少约90个氨基酸，或至少约100个氨基酸，或者至少约150个氨基酸，或至少约200个氨基酸，或至少约300或更多个氨基酸。
本文所说有关FGF-19多肽序列的″氨基酸序列同一性百分比(％)″是指候选序列的氨基酸残基，在进行序列对比，并在必要时导入空隙以获取最大百分比的序列同一性，而不将任何保守取代视为序列同一性时与FGF-19序列的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域各种方法进行序列对比以便测定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量对比的适宜参数，包括针对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为此目的，氨基酸序列同一性％值是使用下述序列对比计算机程序ALIGN-2而获得的，其中ALIGN-2程序的全部源代码见表1。ALIGN-2序列对比计算机程序的作者是Genentech，Inc.，表1所示源代码和用户资料一起已经提交地处Washington D.C.，20559的美国版权局，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众通过Genentech，Inc.，SouthSan Francisco，California可以得到ALIGN-2程序，或者可从表1提供的源代码进行编制。ALIGN2程序应当为在UNIX操作系统，优选在数码UNIXV4.0D使用而进行编制。ALIGN-2程序设定了所有序列对比参数并且不变。
为了本发明目的，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者这样说给定氨基酸序列A具有或含有给定氨基酸序列B相同氨基酸序列的％)如下计算X/Y比值乘以100其中X是用序列对比程序ALIGN-2比较A和B的氨基酸残基后计算出的相同氨基酸数，其中Y是B的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。作为计算氨基酸序列同一性％的一个实例，表2和3说明如何计算指定为″对照蛋白″的氨基酸序列与指定为″PRO″的氨基酸序列的序列同一性％。
除非另外特别声明，否则本文所用所有氨基酸序列同一性％值是按照上述使用ALIGN-2序列对比计算机程序获得的。然而，氨基酸序列同一性％也可使用序列对比程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic acids Res.253389-3402(1997))进行测定。NCBI-BLAST2序列对比程序可从http//www.ncbi.nlm.nih.Gov下载，或从National Institute of Health，Bethesda，MD得到。NCBI-BLAST2使用数种检索参数，其中所有这些参数设定为默认值，包括例如，非掩蔽＝yes，链(strand)＝全部(all)，预期的出现＝10，最低复杂长度＝15/5，多-程e-值＝0.01，多-程常数＝25，最终缺口化对比的陡降(dropoff)＝25，和评分矩阵＝BLOSUM62。
当使用NCBI-BLAST2进行氨基酸序列比较时，给定氨基酸序列A针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者说，给定氨基酸序列A具有或含有与给定氨基酸序列B相同的氨基酸序列的％)如下计算X/Y比值乘以100其中X是用序列对比程序NCBI-BLAST2比较A和B氨基酸残基后计算出的相同氨基酸数量，其中Y是B的氨基酸残基总数量。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A针对B的氨基酸序列同一性％将不等于B针对A的氨基酸序列同一性％。
″FGF-19变体多核苷酸″或″FGF-19变体核酸序列″是指编码下述定义的活性FGF-19多肽的的核苷酸分子，它与(a)编码图2(SEQ ID NO2)所示FGF-19多肽的1或约23至216残基的氨基酸序列的核苷酸序列，(b)编码图2(SEQ ID NO2)所示FGF-19多肽的X至216残基的氨基酸序列的核苷酸序列，其中X是图2(SEQ ID NO2)中17至27的任何氨基酸残基，或者(c)编码衍生自图2(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的另一特定片段的核苷酸序列，具有至少约80％的氨基酸序列同一性。通常，FGF-19变体多核苷酸与(a)编码图2(SEQ ID NO2)所示FGF-19多肽的1或约23至216残基的氨基酸序列的核苷酸序列，(b)编码图2(SEQ ID NO2)所示FGF-19多肽的X至216残基的氨基酸序列的核苷酸序列，其中X是图2(SEQ ID NO2)中17至27的任何氨基酸残基，或者(c)编码衍生自图2(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的另一特定片段的核苷酸序列，具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的核酸序列同一性。FGF-19多核苷酸变体不包括天然FGF-19核苷酸序列。
一般地，FGF-19变体多核苷酸的长度是至少约30个核苷酸，或至少约60个核苷酸，或至少约90个核苷酸，或至少约120个核苷酸，或者至少约150个核苷酸，或至少约180个核苷酸，或至少约210个核苷酸，或至少约240个核苷酸，或者至少约270个核苷酸，或至少约300个核苷酸，或至少约450个核苷酸，或至少600个核苷酸，或至少900或更多个核苷酸。
本文所述有关编码FGF-19多肽的核酸序列的″核酸序列同一性百分比(％)″是指候选序列中与编码FGF-19多肽的核酸序列相比时，具有相同核苷酸的百分数，这是在对比序列，和如果必要则引入空隙，以达到最大序列同一性百分比的前提下获得的。为测定核苷酸序列同一性百分比而进行的序列对比可使用本领域各种方法，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于测量对比的适宜参数，包括针对所比较序列的全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为此目的，核苷酸序列同一性％值是如下述使用序列对比计算机程序ALIGN-2而获得的，其中ALIGN-2程序的全部源代码见表1。ALIGN-2序列对比计算机程序的作者是Genentech，Inc.，表1所示源代码和用户资料一起已经提交地处Washington D.C.，20559的美国版权局，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众通过Genentech，Inc.，South San Francisco，California可以得到ALIGN-2程序，或者从表1提供的源代码进行编制。ALIGN2程序应当为在UNIX操作系统，优选在数码UNIXV4.0D使用而进行编制。ALIGN-2程序设定了所有序列对比参数并且不变。
为了本发明目的，给定核酸序列C相对于给定核酸序列D的核酸序列同一性％(或者这样说给定核酸序列C具有或含有与给定核酸序列D相同的核酸序列的％)如下计算W/Z比值乘以100其中W是用序列对比程序ALIGN-2比较C和D后计算出的相同核苷酸的数量，和其中Z是D的核苷酸总数量。可以理解，当核酸序列C与核酸序列D的长度不相等时，C针对D的核酸序列同一性％将不等于D针对C的核酸序列同一性％。作为计算核酸序列同一性％的一个实例，表4和5说明如何计算指定为″对照DNA″的核酸序列与指定为″PRO-DNA″的核酸序列的同一性％。
除非另外特别声明，否则本文所用所有核酸序列同一性％值是按照上述使用ALIGN-2序列对比计算机程序获得的。然而，核酸序列同一性％也可使用序列对比程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))进行测定。NCBI-BLAST2序列对比程序可从http//www.ncbi.nlm.nih.Gov下载，或从National Institute of Health，Bethesda，MD得到。NCBI-BLAST2使用数种检索参数，其中所有这些参数设定为默认值，包括例如，非掩蔽＝yes，链＝全部，预期的出现＝10，最低复杂长度＝15/5，多-程e-值＝0.01，多-程常数＝25，最终缺口化对比的陡降＝25，和评分矩阵＝BLOSUM62。
当使用NCBI-BLAST2进行序列比较时，给定核酸序列C与给定核酸序列D的核酸序列同一性％(或者说，给定核酸序列C具有或含有与给定核酸序列D相同的核酸序列的％)如下计算
W/Z比值乘以100其中W是用序列对比程序NCBI-BLAST2比较C和D后计算出的相同核苷酸数量，和其中Z是D的核苷酸总数量。可以理解，当核酸序列C与核酸序列D的长度不相等时，C针对D的核酸序列同一性％将不等于D针对C的核酸序列同一性％。
在另一实施方案中，FGF-19变体多核苷酸是编码活性FGF-19多肽的核酸分子，它能够与编码图2(SEQ ID NO2)所示全长FGF-19多肽的核苷酸序列杂交(优选地在严格杂交和洗涤条件下杂交)。FGF-19变体多肽可以是由FGF-19变体多核苷酸编码。
在如上述进行氨基酸序列同一性比较时使用的术语″阳性″，不仅包括所比较的序列中相同的氨基酸残基，也包括其中具有相似特性的氨基酸残基。针对目的氨基酸残基评分为阳性值的氨基酸残基是那些与目的氨基酸残基相同或是目的氨基酸残基的首选取代的氨基酸残基。(见下表6中定义)。
为了本发明目的，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列阳性值％(或者这样说给定氨基酸序列A具有或含有与给定氨基酸序列B相同的氨基酸序列的阳性％)如下计算X/Y比值乘以100其中X是用上述序列对比程序ALIGN-2比较A和B后得出的如上定义的评分阳性氨基酸数量，其中Y是B的氨基酸残基总数量。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A针对B的阳性％将不等于B针对A的阳性％。
当用″分离的″来描述本文的各种多肽时，是指已从天然环境的组成中鉴定和分离和/或回收的多肽。优选地，分离的多肽与其天然结合的所有组分没有任何结合。多肽的天然环境中的污染成分是那些将干扰使用多肽进行诊断和治疗的物质，可包括酶、激素和其它蛋白性或非-蛋白性溶质。在优选的实施方案中，多肽被纯化为(1)使用转杯式蛋白测序仪，达到足以获得N-末端或内部氨基酸序列至少15个残基的程度，或者(2)达到在非-还原或还原条件下经SDS-PAGE电泳和考马斯蓝或优选银染证实为同质性的程度。分离的多肽包括在重组细胞内的原位多肽，因为FGF-19自然环境中的至少一个组分是不存在的。然而，通常用至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。
编码FGF-19多肽的″分离的″核酸分子是从FGF-19编码核酸的天然来源中通常与其结合的至少一种杂质核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。优选地，所述分离的核酸与其天然结合的所有组分没有任何结合。一分离的编码FGF-19的核酸分子不同于其天然形式或组合(setting)。因此分离的编码FGF-19的核酸分子区别于其在天然细胞中的存在形式。但是，分离的编码FGF-19多肽的核酸分子，包括通常表达FGF-19的细胞中所含的FGF-19-编码核酸分子，例如，所述核酸分子与天然细胞所在的染色体位置不同。
术语“控制序列”指在特定宿主生物中使可操作连接的编码序列表达所需的DNA序列。适于原核生物的调控序列可包括如启动子，任选操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核生物细胞利用启动子，聚腺苷酸化信号和增强子。
当一种核酸与另一种核酸序列处于功能相关的位置时，该核酸与该另一种核酸“可操作相连”。例如如果一种多肽表达为参与该多肽的分泌的前体蛋白，则将前序列或分泌前导序列的DNA与该多肽的DNA可操作相连；启动子或增强子当能影响编码序列的转录时可与该编码序列可操作相连；或核糖体结合位点当其位置能促进翻译时可与编码序列可操作相连。通常“可操作相连”指被连接的DNA序列是相邻的，而且，如果是分泌前导序列，则相邻且为阅读状态。然而，增强子不必是相邻的。连接可通过在方便的限制性位点相连而实现。如果不存在这样的位点，可根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
本文所用术语″抗体″是指最广义上的抗体，并特别包括例如单链抗-FGF-19单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)、具有多表位特异性的抗-FGF-19抗体组合物、单链抗-FGF-19抗体和抗-FGF-19抗体的片段(见下述)。本文中术语″单克隆抗体″，是指来自基本上同质的抗体群的抗体，即除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。
杂交反应的″严格度″由本领域技术人员很容易地确定，通常根据经验在考虑探针长度、洗涤温度和盐浓度的基础上计算得出。一般而言，长的探针需要较高的温度以便正确退火，而短的探针需要较低温度。杂交通常取决于变性的DNA在低于解链温度的环境中存在互补链时重退火能力。探针和杂交序列之间所需同源程度越高，则可使用的相对温度越高。结果是，相对温度较高将使反应条件趋于更加严格，而较低温度则使反应的严谨度较小。有关杂交反应的严格度的其它细节和解释，见Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biologv，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
本文的″严格条件″或″高度严格条件″，可以定义为(1)使用低离子强度和高温洗涤，例如，50℃0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中42℃使用变性剂如甲酰胺，譬如，含0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠；或者(3)42℃使用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt′s溶液、超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中和于55℃在50％甲酰胺中洗涤，接着于55℃用0.1x含EDTA的SSC进行高度严格洗涤。
″中等严格条件″可以按照Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，New YorkCold Spring Harbor Press，1989的定义，包括使用严格度低于前述的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度，离子强度和SDS％)。中等严格条件的一个实例是，于37℃在如下组成的溶液中过夜温育20％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5xDenhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切的鲑精DNA，接着于37-50℃在1x SSC中洗涤杂交膜。本领域熟练技术人员懂得如何必要地调整温度、离子强度等条件以适应诸如探针长度等因素。
本文使用的术语″表位标记″，是指含有与″标记多肽″融合了的FGF-19多肽的嵌合多肽。该标记多肽具有足够多的残基以提供针对所制备抗体的表位，而且要足够短以便它不干预与其融合的多肽的活性。标记多肽也优选确实是独一无二的，这样抗体与其它表位基本上不发生交叉反应。通常，适宜的标记多肽至少有6个氨基酸残基，一般为约8～50个氨基酸残基(优选为10～20个氨基酸残基)。
在本文中术语“免疫粘附素”定义为抗体样分子，其将异源“粘附素”蛋白(例如受体、配体或酶)的结合结构域与免疫球蛋白恒定区组合。结构上，免疫粘附素包括具有所需结合特异性之粘附素氨基酸残基与免疫球蛋白恒定区序列的融合，所述粘附素氨基酸不同于抗体的抗原识别和结合位点(抗原结合位点)(即为“异源性”)。免疫粘附分子的粘附素部分通常是包括受体或配体的至少一个结合位点的邻接氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
本文中″活性″是指保留完整或天然FGF-19的生物学和/或免疫学活性的FGF-19形式，其中″生物学″活性指完整或天然FGF-19引起的生物学功能(抑制或兴奋)，不是指诱导产生针对完整或天然FGF-19所拥有的表位的抗体的能力；而″免疫学″活性则是指诱导产生针对完整或天然FGF-19所拥的有表位的抗体的能力。优选的生物活性包括下述任何一个或多个活性增加个体的代谢(或代谢速率)，降低个体体重，减轻个体肥胖，减少葡萄糖摄取进入脂肪细胞，增加leptin自脂肪细胞释放，降低个体的甘油三酯水平和减少个体的游离脂肪酸。应当懂得，FGF-19的部分活性是由FGF-19直接诱导的，而有些活性是间接诱导的，但是，每种活性均是FGF-19存在的结果，如果没有FGF-19，将不会产生这些结果。
本文中术语″拮抗剂″，使用其广义含义，包括部分或完全阻断、抑制或中和本文所述天然FGF-19多肽生物活性的任何分子。类似地，术语″激动剂″也使用其广义含义，包括模拟本文所述天然FGF-19多肽生物活性的任何分子。适宜的激动剂或拮抗剂分子特别包括激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段、天然FGF-19多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、小的有机分子等。鉴定FGF-19多肽的激动剂或拮抗剂的方法可以是，使FGF-19多肽与待测激动剂或拮抗剂分子接触，并测定正常情况下与FGF-19多肽有关的一个或多个生物活性的可测得变化。
″治疗″是指治疗性治疗和预防性措施，其目的是阻止或延缓(减轻)所针对的病理性病症。那些需要治疗的个体包括，已经患有病症或有患病倾向或者为了预防患上病症的个体。
″慢性″给药，指与快速给药模式相反，将试剂以连续给药模式施用，以便在长时间内保持初始治疗效果(活性)。″间断″给药是指治疗不是没有间歇地连续进行，而是以周期性为特征。
意欲治疗的″哺乳动物″是指归为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园里的动物、参与运动项目的动物或宠物如狗、马、猫、牛等。优选所述哺乳动物为人类。
″个体″是指任何主体，优选是哺乳动物，更优选是人。
″肥胖″指哺乳动物的体重指数(BMI)至少为25.9的状况，该指数按照体重(kg)除以高度(米)的平方来计算。通常，具有正常体重的人的BMI为19.9～小于25.9。本文所述肥胖可以是任何起因，无论是遗传还是环境因素所致。
导致肥胖或说是肥胖原因的病症的实例包括过度进食和食欲过盛、多囊卵巢疾病、颅咽管瘤、Prader Willi综合征、弗勒赫利希综合征(Frohlich′ssyndrome)、II型糖尿病、GH-缺陷型个体、身材矮小常态变异、特纳综合征(Turner′s syndrome)，和其它表现为代谢活动减低或静态能量消耗占不含脂肪的物质总量(fat-free mass)的比例下降的病理性病症，例如，患急性淋巴细胞性白血病的儿童。
″与肥胖有关的病症″是指是造成肥胖或使肥胖加重的病症，例如但不限于皮肤病如感染、静脉曲张、黑棘皮症、以及湿疹，运用耐力差，糖尿病，胰岛素抵抗，高血压，血胆甾醇过多症，胆石病，骨关节炎，整形术损伤，血栓性疾病，癌症和冠心病(或心血管病)，特别是那些与个体高甘油三酯和游离脂肪酸有关的心血管病症。
与一个或多个其它治疗剂″联合″给药包括同时给药和以任何顺序的联贯给药。
本文所用″载体″包括在所用剂量和浓度下对细胞或哺乳动物无毒性的可药用载体、赋形剂、稳定剂。可药用载体常常是含水的pH缓冲的溶液。可药用载体的实例包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于10个残基)多肽；蛋白，如白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTMTM。
″抗体片段″包含完整抗体的一部分，优选是完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二价抗体；线形抗体(Zapata等，Protein Eng.8(10)1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体可产生两个相同的各带有单个抗原结合位点的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残余的“Fc”片段，Fc段的名称反应了其易于结晶的能力。经胃蛋白酶处理可产生具有两个抗原结合位点并仍然能交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整的识别和结合位点的最小抗体片段。此区由一个重链可变区与一个轻链可变区紧密地非共价连接形成的二聚体组成。在这个构象中每个可变区的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面限定一个抗原结合位点。这六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或Fv的一半仅含有三个抗原特异性CDR)也具有识别和结合抗原的能力，尽管与完整的结合位点相比其亲和力较低。
Fab段还包括轻链恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab’与Fab的差别在于Fab’在重链CH1的羧基末端多出几个残基，包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定区半胱氨酸残基中至少有一个游离巯基的Fab’。F(ab’)2抗体片段在最初产生为Fab’片段对，在它们之间具有铰链区半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联是众所周知的。
脊椎动物任何物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可依据其恒定区氨基酸序列而归为完全不同的两型(称为k和λ)中的一型。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同类。主要有5类免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
单链Fv”或“scFv”抗体片段，包括抗体的VH和VL结构域，这些结构域存在于单个多肽链上。优选Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含一个多肽接头，它能使sFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述见Pluckthun在《单克隆抗体的药理学》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段在一条多肽链(VH-VL)上含有相连的一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)。利用一种非常短的接头，其使得同一条链上的两个结构域无法配对，不得不与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。在EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等，美国国家科学院院刊，906444-6448(1993)中有对二价抗体的更详细描述。
“分离的”抗体是已从其天然环境的组成中鉴定、分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是干扰抗体的诊断或治疗应用的物质，可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选的实施方案中，该抗体的纯度应达到(1)经Lowery法确定的抗体重量的95％以上，最优选所述重量的99％以上，(2)足以获得用旋转杯状(spinning cup)序列分析仪所测至少15个残基的N端或内部氨基酸序列，(3)通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色、优选银染色所证实的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为该抗体的自然环境中的至少一种组分已不存在。一般情况下分离的抗体可通过至少一个纯化步骤来制备。
本文中所用″标记″一词，是指直接或间接地与抗体偶联从而产生″标记″抗体的可检测的化合物或组分。标记可以是其本身可被测得(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者如果是酶标记时，可催化底物化合物或组分发生化学变化，这种变化是可检测的。
“固相”是指本发明抗体可粘附的非水性基质。本文中固相的实例包括部分或全部由玻璃(如控制孔径的玻璃)、多糖(如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷制成的那些固相。在某些实例中，根据上下文的内容，固相可包括测试板的孔；在其它的例子中，它可以是纯化柱(如亲和层析柱)。该术语也包括美国专利4275149中公开的分散颗粒的不连续固相。
“脂质体”是由能向哺乳动物有效运送药物(如本文公开的抗FGF-19多肽和/或其抗体)的各类脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小分子囊泡。脂质体的组分通常排列为双层形式，与生物膜的脂质排列相似。
本文中″小分子″定义为分子量低于约500道尔顿的分子。
表1(此处插入原文第34-50页的计算机命令符)<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[ Table 1 /* * *C-C increased from 12 to 15 *Z is average of EQ *B is average of ND *match with stop is_M；stop-stop＝0；J(joker)match＝0 */ #define _M -8 /*value of a match with a stop */ int _day[26][26]＝{ /* A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z*/ /*A*/ {2，0，-2，0，0，-4，1，-1，-1，0，-1，-2，-1，0，_M，1，0，-2，1，1，0，0，-6，0，-3，0}， /*B*/ {0，3，-4，3，2，-5，0，1，-2，0，0，-3，-2，2，_M，-1，1，0，0，0，0，-2，-5，0，-3，1}， /*C*/ {-2，-4，15，-5，-5，-4，-3，-3，-2，0，-5，-6，-5，-4，_M，-3，-5，-4，0，-2，0，-2，-8，0，0，-5}， /*D*/ {0，3，-5，4，3，-6，1，1，-2，0，0，-4，-3，2，_M，-1，2，-1，0，0，0，-2，-7，0，-4，2}， /*E*/ {0，2，-5，3，4，-5，0，1，-2，0，0，-3，-2，1，_M，-1，2，-1，0，0，0，-2，-7，0，-4，3}， /*F*/ {-4，-5，-4，-6，-5，9，-5，-2，1，0，-5，2，0，-4，_M，-5，-5，-4，-3，-3，0，-1，0，0，7，-5}， /*G*/ {1，0，-3，1，0，-5，5，-2，-3，0，-2，-4，-3，0，_M，-1，-1，-3，1，0，0，-1，-7，0，-5，0}， /*H*/ {-1，1，-3，1，1，-2，-2，6，-2，0，0，-2，-2，2，_M，0，3，2，-1，-1，0，-2，-3，0，0，2}， /*I*/ {-1，-2，-2，-2，-2，1，-3，-2，5，0，-2，2，2，-2，_M，-2，-2，-2，-1，0，0，4，-5，0，-1，-2}， /*J*/ {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}， /*K*/ {-1，0，-5，0，0，-5，-2，0，-2，0，5，-3，0，1，_M，-1，1，3，0，0，0，-2，-3，0，-4，0}， /*L*/ {-2，-3，-6，-4，-3，2，-4，-2，2，0，-3，6，4，-3，_M，-3，-2，-3，-3，-1，0，2，-2，0，-1，-2}， /*M*/ {-1，-2，-5，-3，-2，0，-3，-2，2，0，0，4，6，-2，_M，-2，-1，0，-2，-1，0，2，-4，0，-2，-1}， /*N*/ {0，2，-4，2，1，-4，0，2，-2，0，1，-3，-2，2，_M，-1，1，0，1，0，0，-2，-4，0，-2，1}， /*O*/{_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，0，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M}， /*P*/ {1，-1，-3，-1，-1，-5，-1，0，-2，0，-1，-3，-2，-1，_M，6，0，0，1，0，0，-1，-6，0，-5，0}， /*Q*/ {0，1，-5，2，2，-5，-1，3，-2，0，1，-2，-1，1，_M，0，4，1，-1，-1，0，-2，-5，0，-4，3}， /*R*/ {-2，0，-4，-1，-1，-4，-3，2，-2，0，3，-3，0，0，_M，0，1，6，0，-1，0，-2，2，0，-4，0}， /*S*/ {1，0，0，0，0，-3，1，-1，-1，0，0，-3，-2，1，_M，1，-1，0，2，1，0，-1，-2，0，-3，0}， /*T*/ {1，0，-2，0，0，-3，0，-1，0，0，0，-1，-1，0，_M，0，-1，-1，1，3，0，0，-5，0，-3，0}， /*U*/ {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}， /*V*/ {0，-2，-2，-2，-2，-1，-1，-2，4，0，-2，2，2，-2，_M，-1，-2，-2，-1，0，0，4，-6，0，-2，-2}， /*W*/ {-6，-5，-8，-7，-7，0，-7，-3，-5，0，-3，-2，-4，-4，_M，-6，-5，2，-2，-5，0，-6，17，0，0，-6}， /*X*/ {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}， /*Y*/ {-3，-3，0，-4，-4，7，-5，0，-1，0，-4，-1，-2，-2，_M，-5，-4，-4，-3，-3，0，-2，0，0，10，-4}， /*Z*/ {0，1，-5，2，3，-5，0，2，-2，0，0，-2，-1，1，_M，0，3，0，0，0，0，-2，-6，0，-4，4} }；Table 1(cont’) /* */ #include ＜stdio.h＞ #include ＜ctype.h＞ #defineMAXJMP 16 /* max jumps in a diag */ #defineMAXGAP24/* don′t continue to penalize gaps larger than this */ #defineJMPS 1024 /* max jmps in an path */ #defineMX4 /* save if there′s at least MX-1 bases since last jmp */ #defineDMAT 3 /* value of matching bases */ #defineDMIS 0 /* penalty for mismatched bases */ #defineDINS0 8 /* penalty for a gap */ #defineDINS1 1 /* penalty per base */ #definePINS0 8 /* penalty for a gap */ #definePINS1 4 /* penalty per residue */ struet jmp { short n[MAXJMP]； /* size of jmp(neg for dely) */ unsigned shortx[MAXJMP]； /* base no.of jmp in seq x */ }； /* limits seq to 2^16-1 */ struct diag { int score； /* score at last jmp */ long offset； /* offset of prev block */ short ijmp； /* current jmp index */ struct jmpjp； /* list of jmps */ }； struct path { int spc；/* number of leading spaces */ short n[JMPS]；/* size of jmp(gap) */ int x[JMPS]；/* loc of jmp(last elem before gap) */ }； char *ofile； /* output file name */ char *namex[2]；/* seq namesgetseqs() */ char *prog；/* prog name for errmsgs */ char *seqx[2]； /* seqsgetseqs() */ int dmax； /* best diagnw() */ int dmax0；/* final diag */ int dna； /* set ifdnamain() */ int endgaps； /* set if penalizing end gaps */ int gapx，gapy； /* total gaps in seqs */ int len0，len1； /* seq lens */ int ngapx，ngapy； /* total size of gaps */ int smax； /* max scorenw() */ int *xbm； /* bitmap for matching */ long offset； /* current offsetin jmp file */ struct diag *dx； /* holds diagonals */ struct path pp[2]；/* holds path for seqs */ char *calloc()，*malloc()，*index()，*strcpy()； char *getseq()，*g_calloc()；Table 1(cont’) /* Needleman-Wunsch alignment program * * usageprogs file1 file2 * where file1 and file2 are two dna or two protein sequences. * The sequences can be in upper-or lower-case an may contain ambiguity * Any lines beginning with′；′，′＞′or′＜′are ignored * Max file length is 65535(limited by unsigned short x in the jmp struct) * A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA * Output is in the file″align.out″ * * The program may create a tmp file in/tmp to hold info about traceback. * Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650 */ #include″nw.h″ #include″day.h″ static_dbval[26]＝{ 1，14，2，13，0，0，4，11，0，0，12，0，3，15，0，0，0，5，6，8，8，7，9，0，10，0 }； static_pbval[26]＝{ 1，2|(1＜＜(′D′-′A′))|(1＜＜(′N′-′A′))，4，8，16，32，64， 128，256，0xFFFFFF，1＜＜10，1＜＜11，1＜＜12，1＜＜13，1＜＜14， 1＜＜15，1＜＜16，1＜＜17，1＜＜18，1＜＜19，1＜＜20，1＜＜21，1＜＜22， 1＜＜23，1＜＜24，1＜＜25|(1＜＜(′E′-′A′))|(1＜＜(′Q′-′A′)) }； main(ac，av) main intac； char *av[]； { prog＝av
； if(ac！＝3){ fprintf(stderr，″usage％s file1 file2\n″，prog)； fprintf(stderr，″where file1 and file2 are two dna or two protein sequences.\n″)； fprintf(stderr，″The sequences can be in upper-or lower-case\n″)； fprintf(stderr，″Any lines beginning with′；′or′＜′are ignored\n″)； fprintf(stderr，″Output is in the file\″align.out\″\n″)； exit(1)； } namex
＝av[1]； namex[1]＝av[2]； seqx
＝getseq(namex
，& len0)； seqx[1]＝getseq(namex[1]，& len1)； xbm＝(dna)？_dbval_pbval； endgaps＝0；/*l to penalize endgaps */ ofile＝″align.out″； /*output file */ nw()； /*fill in the matrix，get the possible jmps */ readjmps()；/*get the actualjmps */ print()； /*print stats，alignment */ cleanup(0)；/*unlink any tmp files */ }Table 1(cont’) /* do the alignment，return best scoremain() * dnavalues in Fitch and Smith，PNAS，80，1382-1386，1983 * proPAM 250 values * When scores are equal，we prefer mismatches to any gap，prefer * a new gap to extending an ongoing gap，and prefer a gap in seqx * to a gap in seq y. */ nw() nw { char *px，*py； /* seqs and ptrs */ int*ndely，*dely； /* keep track of dely */ intndelx，delx； /* keep track of delx */ int*tmp；/* for swapping row0，row1 */ intmis； /* score for each type */ intins0，ins1； /* insertion penalties */ register id； /* diagonal index */ register ij； /* jmp index */ register *col0，*col1；/* score for curr，last row */ register xx，yy； /* index into seqs */ dx＝(struct diag*)g_calloc(″to get diags″，len0+len1+1，sizeof(struct diag))； ndely＝(int*)g_calloc(″to get ndely″，len1+1，sizeof(int))； dely＝(int*)g_calloc(″to get dely″，len1+1，sizeof(int))； col0＝(int*)g_calloc(″to get col0″，len1+1，sizeof(int))； col1＝(int*)g_calloc(″to get col1″，len1+1，sizeof(int))； ins0＝(dna)？DINS0PINS0； ins1＝(dna)？DINS1PINS1； smax＝-10000； if(endgaps){ for(col0
＝dely
＝-ins0，yy＝1；yy＜＝len1；yy++){ col0[yy]＝dely[yy]＝col0[yy-1]-ins1； ndely[yy]＝yy； } col0
＝0； /* Waterman Bull Math Biol 84 */ } else for(yy＝1；yy＜＝len1；yy++) dely[yy]＝-ins0； /* fill in match matrix */ for(px＝seqx
，xx＝1；xx＜＝len0；px++，xx++){ /* initialize first entry in col */ if(endgaps){ if(xx＝＝1) col1
＝delx＝-(ins0+ins1)； else col1
＝delx＝col0
-ins1； ndelx＝xx； } else { col1
＝0； delx＝-ins0； ndelx＝0； }Table 1(cont’) for(py＝seqx[1]，yy＝1；yy＜＝len1；py++，yy++){ mis＝col0[yy-1]； if(dna) mis+＝(xbm[*px-′A′]&xbm[*py-′A′])？DMATDMIS； else mis+＝_day[*px-′A′][*py-′A′]； /* update penalty for del in x seq； * favor new del over ongong del * ignore MAXGAP if weighting endgaps */ if(endgaps||ndely[yy]＜MAXGAP){ if(col0[yy]-ins0＞＝dely[yy]){ dely[yy]＝col0[yy]-(ins0+ins1)； ndely[yy]＝1； }else{ dely[yy]-＝ins1； ndely[yy]++； } }else{ if(col0[yy]-(ins0+ins1)＞＝dely[yy]){ dely[yy]＝col0[yy]-(ins0+ins1)； ndely[yy]＝1； }else ndely[yy]++； } /* update penalty for delin y seq； * favor new del over ongong del */ if(endgaps||ndelx＜MAXGAP){ if(col1[yy-1]-ins0＞＝delx){ delx＝col1[yy-1]-(ins0+ins1)； ndelx＝1； }else{ delx-＝ins1； ndelx++； } }else{ if(coll[yy-1]-(ins0+ins1)＞＝delx){ delx＝col1[yy-1]-(ins0+ins1)； ndelx＝1； }else ndelx++； } /* pick the maximum score；we′re favoring * mis over any del and delx over dely */Table 1(cont’) id＝xx-yy+len1-1； if(mis＞＝delx && mis＞＝dely[yy]) col1[yy]＝mis； else if(delx＞＝dely[yy]){ col1[yy]＝delx； ij＝dx[id].ijmp； if(dx[id].jp.n
&& (！dna||(ndelx＞＝MAXJMP && xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis＞dx[id].score+DINS0)){ dx[id].ijmp++； if(++ij＞＝MAXJMP){ writejmps(id)； ij＝dx[id].ijmp＝0； dx[id].offset＝offset； offset+＝sizeof(struct jmp)+sizeof(offset)； } } dx[id].jp.n[ij]＝ndelx； dx[id].jp.x[ij]＝xx； dx[id].score＝delx； } else{ col1[yy]＝dely[yy]； ij＝dx[id].ijmp； if(dx[id].jp.n
&&(！dna||(ndely[yy]＞＝MAXJMP && xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis＞dx[id].score+DINS0)){ dx[id].ijmp++； if(++ij＞＝MAXJMP){ writejmps(id)； ij＝dx[id].ijmp＝0； dx[id].offset＝offset； offset+＝sizeof(struct jmp)+sizeof(offset)； } } dx[id].jp.n[ij]＝-ndely[yy]； dx[id].jp.x[ij]＝xx； dx[id].score＝dely[yy]； } if(xx＝＝len0 && yy＜len1){ /*last col */ if(endgaps) col1[yy]-＝ins0+ins1*(len1-yy)； if(col1[yy]＞smax){ smax＝col1[yy]； dmax＝id； } } } if(endgaps && xx＜len0) col1[yy-1]-＝ins0+ins1*(len0-xx)； if(col1[yy-1]＞smax){ smax＝col1[yy-1]； dmax＝id； } tmp＝col0；col0＝col1；col1＝tmp； } (void)free((char*)ndely)； (void)free((char*)dely)； (void)free((char*)col0)； (void)free((char*)col1)； }Table 1(cont’) /* * * print()--only routine visible outside this module * * static * getmat()--trace back best path，count matchesprint() * pr_align()--print alignment of described in array p[]print() * dumpblock()-dump a block of lines with numbers，starspr_align() * nums()--put out a number linedumpblock() * putline()--put outa line(name，[num]，seq，[num])dumpblock() * stars()--put a line of starsdumpblock() * stripname()--strip any path and prefix from a seqname */ #include″nw.h″ #define SPC 3 #define P_LINE 256/* maximum output line */ #define P_SPC 3 /* space between name or num and seq */ extern _day[26][26]； int olen；/* set output line length*/ FILE *fx； /* output file*/ print() print { int lx，ly，firstgap，lastgap；/* overlap */ if((fx＝fopen(ofile，″w″))＝＝0){ fprintf(stderr，″％scan′t write ％s\n″，prog，ofile)； cleanup(1)； } fprintf(fx，″＜first sequence％s(length＝％d)\n″，namex
，len0)； fprintf(fx，″＜second sequence％s(length＝％d)\n″，namex[1]，len1)； olen＝60； lx＝len0； ly＝len1； firstgap＝lastgap＝0； if(dmax＜len1-1){ /*leading gap in x */ pp
.spc＝firstgap＝len1-dmax-1； ly-＝pp
.spc； } elseif(dmax＞len1-1){/* leading gap in y */ pp[1].spc＝firstgap＝dmax-(len1-1)； lx-＝pp[1].spc； } if(dmax0＜len0-1){ /* trailing gap in x */ lastgap＝len0-dmax0-1； lx-＝lastgap； } else if(dmax0＞len0-1){/*trailing gap in y */ lastgap＝dmax0-(len0-1)； ly-＝lastgap； } getmat(lx，ly，firstgap，lastgap)； pr_align()； }Table 1(cont’) /* * trace back the best path，count matches */ static getmat(lx，ly，firstgap，lastgap) getmat int lx，ly； /*″core″(minus endgaps) */ int firstgap，lastgap； /*leading trailing overlap */ { intnm，i0，i1，siz0，siz1； char outx[32]； double pct； register n0，n1； register char *p0，*p1； /* get total matches，score */ i0＝i1＝siz0＝siz1＝0； p0＝seqx
+pp[1].spc； p1＝seqx[1]+pp
.spc； n0＝pp[1].spc+1； n1＝pp
.spc+1； nm＝0； while(*p0 && *p1){ if(siz0){ p1++； n1++； siz0--； } else if(siz1){ p0++； n0++； siz1--； } else{ if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′]) nm++； if(n0++＝＝pp
.x[i0]) siz0＝pp
.n[i0++]； if(n1++＝＝pp[1].x[i1]) siz1＝pp[1].n[i1++]； p0++； p1++； } } /* pct homology * if penalizing endgaps，base is the shorter seq * else，knock off overhangs and take shorter core */ if(endgaps) lx＝(len0＜len1)？len0len1； else lx＝(lx＜ly)？lxly； pct＝100.*(double)nm/(double)lx； fprintf(fx，″\n″)； fprintf(fx，″＜％d match ％s in an overlap of％d％.2f percent similarity\n″， nm，(nm＝＝1)？″″″es″，lx，pct)；Table 1(cont’) fprintf(fx，″＜gaps in first sequence％d″，gapx)；...getmat if(gapx){ (void)sprintf(outx，″(％d％s％s)″， ngapx，(dna)？″base″″residue″，(ngapx＝＝1)？″″″s″)； fprintf(fx，″％s″，outx)； fprintf(fx，″，gaps in second sequence％d″，gapy)； if(gapy){ (void)sprintf(outx，″(％d ％s ％s)″， ngapy，(dna)？″base″″residue″，(ngapy＝＝1)？″″″s″)； fprintf(fx，″％s″，outx)； } if(dna) fprintf(fx， ″\n＜score％d(match＝％d，mismatch＝％d，gap penalty＝％d+％d per base)\n″， smax，DMAT，DMIS，DINS0，DINS1)； else fprintf(fx， ″\n＜score％d(Dayhoff PAM 250 matrix，gap penalty＝％d+％d per residue)\n″， smax，PINS0，PINS1)； if(endgaps) fprintf(fx， ″＜endgaps penalized.left endgap％d％s％s，right endgap％d ％s ％s\n″， firstgap，(dna)？″base″″residue″，(firstgap＝＝1)？″″″s″， lastgap，(dna)？″base″″residue″，(lastgap＝＝1)？″″″s″)； else fprintf(fx，″＜endgaps not penalized\n″)； } static nm； /* matches in core--for checking */ static lmax； /* lengths of stripped file names */ static ij[2]； /* jmp index for a path */ static nc[2]； /* number at start of current line */ static ni[2]； /* current elem number--for gapping */ static siz[2]； static char *ps[2]； /* ptr to current element */ static char *po[2]； /* ptr to next output char slot */ static char out[2][P_LINE]； /* output line */ static char star[P_LINE]； /* set by stars() */ /* *print alignment of described in struct path pp[] */ static pr_align()pr_align { intnn； /*char count*/ intmore； register i； for(i＝0，lmax＝0；i＜2；i++){ nn＝stripname(namex[i])； if(nn＞lmax) lmax＝nn； nc[i]＝1； ni[i]＝1； siz[i]＝ij[i]＝0； ps[i]＝seqx[i]； po[i]＝out[i]； }Table 1(cont’) for(nn＝nm＝0，more＝1；more；){...pr_align for(i＝more＝0；i＜2；i++){ /* * do we havemore of this sequcnce？ */ if(！*ps[i]) continue； more++； if(pp[i].spc){ /*leading space*/ *po[i]++＝″； pp[i].spc--； } else if(siz[i]){ /*in a gap*/ * po[i]++＝′-′； siz[i]--； } else{ /*we′re putting a seq element */ * po[i]＝*ps[i]； if(islower(*ps[i])) *ps[i]＝toupper(*ps[i])； po[i]++； ps[i]++； /* * arewe at next gap for this seq？ */ if(ni[i]＝pp[i].x[ij[i]]){ /* * we need to merge all gaps * at this location */ siz[i]＝pp[i].n[ij[i]++]； while(ni[i]＝pp[i].x[ij[i]]) siz[i]+＝pp[i].n[ij[i]++]； } ni[i]++； } } if(++nn＝olen||！more && nn){ dumpblock()； for(i＝0；i＜2；i++) po[i]＝out[i]； nn＝0； } } } /* *dump a block of lines，including numbers，starspr_align() */ static dumpblock() dumpblock { register i； for(i＝0；i＜2；i++) *po[i]-＝′\0′；Table 1(cont’) ...dumpblock (void)putc(′\n′，fx)； for(i＝0；i＜2；i++){ if(*out[i] && (*out[i]！＝″||*(po[i])！＝″)){ if(i＝0) nums(i)； if(i＝0 && *out[1]) stars()； putline(i)； if(i＝0 && *out[1]) fprintf(fx，star)； if(i＝1) nums(i)； } } } /* *put out a number linedumpblock() */ static nums(ix) nums int ix； /* index in out[] holding seq line*/ { char nline[P_LINE]； register i，j； register char *pn，*px，*py； for(pn＝nline，i＝0；i＜lmax+P_SPC；i++，pn++) *pn＝″； for(i＝nc[ix]，py＝out[ix]；*py；py++，pn++){ if(*py＝″||*py＝′-′) *pn＝″； else{ if(i％10＝0||(i＝1 && nc[ix]！＝1)){ j＝(i＜0)？-ii； for(px＝pn；j；j/＝10，px--) *px＝j％10+′0′； if(i＜0) *px＝′-′； } else *pn＝″； i++； } } *pn＝′\0′； nc[ix]＝i； for(pn＝nline；*pn；pn++) (void)putc(*pn，fx)； (void)putc(′\n′，fx)； } /* * put out a line(name，[num]，seq，[num])dumpblock() */ static putline(ix) putline intix； {Table 1(cont’) ...putline int i； register char *px； for(px＝namex[ix]，i＝0；*px && *px！＝′′；px++，i++) (void)putc(*px，fx)； for(；i＜lmax+P_SPC；i++) (void)putc(″，fx)； /*these count from 1 * ni[] is current element(from 1) * nc[] is number at start of current line */ for(px＝out[ix]；*px；px++) (void)putc(*px & 0x7F，fx)； (void)putc(′\n′，fx)； } /* *put a line of stars(seqs always in out
，out[1])dumpblock() */ static stars() stars { int i； register char *p0，*p1，cx，*px； if(！*out
||(*out
＝″&& *(po
)＝″)|| ！*out[1]||(*out[1]＝″&& *(po[1])＝″)) return； px＝star； for(i＝lmax+P_SPC；i；i--) *px++＝″； for(p0＝out
，p1＝out[1]；*p0 && *p1；p0++，p1++){ if(isalpha(*p0) && isalpha(*p1)){ if(xbm[*p0-′A′] & xbm[*p1-′A′]){ cx＝′*′； nm++； } else if(！dna &&_day[*p0-′A′][*p1-′A′]＞0) cx＝′.′； else cx＝″； } else cx＝″； *px++＝cx； } *px++＝′\n′； *px＝′\0′； }Table 1(cont’) /* * strip path or prefix from pn，return lenpr_align() */ static stripname(pn) char *pn；/* file name(may be path) */ { register char *px，*py； py＝0； for(px＝pn；*px；px++) if(*px＝′/′) py＝px+1； if(py) (void)strcpy(pn，py)； return(strlen(pn))； }Table 1(cont’) /* * cleanup()--cleanup any tmp file * getseq()--read in seq，set dna，len，maxlen * g_calloc()--calloc()with error checkin * readjmps()--get the good jmps，from tmp file if necessary * write jmps()--write a filled array ofjmps to a tmp filenw() */ #include″nw.h″ #include＜sys/file.h＞ char*jname＝″/tmp/homgXXXXXX″； /* tmp file for jmps */ FILE*fj； int cleanup()； /* cleanup tmp file */ longlseek()； /* * remove any tmp file if we blow */ cleanup(i) cleanup int i； { if(fj) (void)unlink(jname)； exit(i)； } /* * read，return ptr to seq，set dna，len，maxlen * skip lines starting with′；′，′＜′，or′＞′ * seq in upper or lower case */ char * getseq(file，len) getseq char*file； /* file name */ int *len；/* seq len */ { char line，*pseq； register char *px，*py； int natgc，tlen； FILE *fp； if((fp＝fopen(file，″r″))＝0){ fprintf(stderr，″％scan′t read ％s\n″，prog，file)； exit(1)； } tlen＝natgc＝0； while(fgets(line，1024，fp)){ if(*line＝′；′||*line＝′＜′||*line＝′＞′) continue； for(px＝line；*px！＝′\n′；px++) if(isupper(*px)||islower(*px)) tlen++； } if((pseq＝malloc((unsigned)(tlen+6)))＝0){ fprintf(stderr，″％smalloc()failed to gct ％d bytes for ％s\n″，prog，tlen+6，file)； exit(1)； } pseq
＝pseq[1]＝pseq[2]＝pseq[3]＝′\0′；Table 1(cont’) ...getseq py＝pseq+4； *len＝tlen； rewind(fp)； while(fgets(line，1024，fp)){ if(*line＝′；′||*line＝′＜′||*line＝′＞′) continue； for(px＝line；*px！＝′\n′；px++){ if(isupper(*px)) *py++＝*px； else if(islower(*px)) *py++＝toupper(*px)； if(index(″ATGCU″，*(py-1))) natgc++； } } *py++＝′\0′； *py＝′\0′； (void)fclose(fp)； dna＝natgc＞(tlen/3)； return(pseq+4)； } char * g_calloc(msg，nx，sz) g_calloc char *msg； /* program，calling routine */ int nx，sz；/* number and size of elements */ { char*px，*calloc()； if((px＝calloc((unsigned)nx，(unsigned)sz))＝0){ if(*msg){ fprintf(stderr，″％sg_calloc()failed ％s(n＝％d，sz＝％d)\n″，prog，msg，nx，sz)； exit(1)； } } return(px)； } /* * get final jmps from dx[] or tmp file，set pp[]，reset dmaxmain() readjmps()readjmps { int fd＝-1； int siz，i0，i1； register i，j，xx； if(fj){ (void)fclose(fj)； if((fd＝open(jname，O_RDONLY，0))＜0){ fprintf(stderr，″％scan′t open()％s\n″，prog，jname)； cleanup(1)； } } for(i＝i0＝i1＝0，dmax0＝dmax，xx＝len0；；i++){ while(1){ for(j＝dx[dmax].ijmp；j＞＝0 && dx[dmax].jp.x[j]＞＝xx；j--) ；Table 1(cont’) ...readjmps if(j＜0 && dx[dmax].offset && fj){ (void)lseek(fd，dx[dmax].offset，0)； (void)read(fd，(char *) & dx[dmax].jp，sizeof(struct jmp))； (void)read(fd，(char *) & dx[dmax].offset，sizeof(dx[dmax].offset))； dx[dmax].ijmp＝MAXJMP-1； } else break； } if(i＞＝JMPS){ fprintf(stderr，″％stoo many gaps in alignment\n″，prog)； cleanup(1)； } if(j＞＝0){ siz＝dx[dmax].jp.n[j]； xx＝dx[dmax].jp.x[j]； dmax+＝siz； if(siz＜0){ /*gap in second seq*/ pp[1].n[i1]＝-siz； xx+＝siz； /* id＝xx-yy+len1-1 */ pp[1].x[i1]＝xx-dmax+len1-1； gapy++； ngapy-＝siz； /*ignore MAXGAP when doing endgaps*/ siz＝(-siz＜MAXGAP||endgaps)？-sizMAXGAP； i1++； } else if(siz＞0){ /* gap in first seq */ pp
.n[i0]＝siz； pp
.x[i0]＝xx； gapx++； ngapx +＝siz； /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz＝(siz＜MAXGAP||endgaps)？sizMAXGAP； i0++； } } else break； } /* reverse the order of jmps */ for(j＝0，i0--；j＜i0；j++，i0--){ i＝pp
.n[j]；pp
.n[j]＝pp
.n[i0]；pp
.n[i0]＝i； i＝pp
.x[j]；pp
.x[j]＝pp
.x[i0]；pp
.x[i0]＝i； } for(j＝0，i1--；j＜i1；j++，i1--){ i＝pp[1].n[j]；pp[1].n[j]＝pp[1].n[i1]；pp[1].n[i1]＝i； i＝pp[1].x[j]；pp[1].x[j]＝pp[1].x[i1]；pp[1].x[i1]＝i； } if(fd＞＝0) (void)close(fd)； if(fj){ (void)unlink(jname)； fj＝0； offset＝0； } }Table 1(cont’) /* * write a filled jmp struct offset of the prev one(if any)nw() */ writejmps(ix) writejmps intix； { char *mktemp()； if(！fj){ if(mktemp(jname)＜0){ fprintf(stderr，″％scan′t mktemp()％s\n″，prog，jname)； cleanup(1)； } if((fj＝fopen(jname，″w″))＝0){ fprintf(stderr，″％scan′t write ％s\n″，prog，jname)； exit(1)； } } (void)fwrite((char*) & dx[ix].jp，sizeof(struct jmp)，1，fj)； (void)fwrite((char*) & dx[ix].offset，sizeof(dx[ix].offset)，1，fj)； }]]></pre>
表2PRO XXXXXXXXXXXXXXX(长度＝15个氨基酸)对照蛋白 XXXXXYYYYYYY(长度＝12个氨基酸)氨基酸序列同一性％＝(两个多肽序列之间用ALIGN-2测定的相同匹配氨基酸残基的数量)除以(PRO多肽中氨基酸残基的总数)＝5除以15＝33.3％表3PRO XXXXXXXXXX(长度＝10个氨基酸)对照蛋白 XXXXXYYYYYYZZYZ(长度＝15个氨基酸)氨基酸序列同一性％＝(两个多肽序列之间用ALIGN-2测定的相同匹配氨基酸残基的数量)除以(PRO多肽中氨基酸残基的总数)＝5除以10＝50％表4PRO-DNA NNNNNNNNNNNNNN(长度＝14个核苷酸)对照DNA NNNNNNLLLLLLLLLL(长度＝16个核苷酸)核酸序列同一性％＝(两个核酸序列之间用ALIGN-2测定的相同匹配核苷酸的数量)除以(PRO-DNA核酸序列中核苷酸的总数)＝6除以14＝42.9％表5PRO-DNA NNNNNNNNNNNN(长度＝12个核苷酸)对照DNA NNNNLLLVV(长度＝9个核苷酸)核酸序列同一性％＝(两个核酸序列之间用ALIGN-2测定的相同匹配核苷酸的数量)除以(PRO-DNA核酸序列中核苷酸的总数)＝4除以12＝33.3％II.本发明的组合物和方法A.全长FGF-19多肽本发明提供编码本申请称为FGF-19的多肽的新鉴定和分离的核苷酸序列(或者也称为UNQ334)。更具体而言，如下面的实施例进一步详细公开的那样，已经鉴定和分离出编码FGF-19多肽的cDNA。应注意到在不同表达循环中产生的蛋白可能具有不同的PRO数，但是，任何特定DNA和其编码的蛋白的UNQ数是独一无二的，而且将不会变化。然而，为了简明起见，在本说明书中将DNA49435-1219编码的蛋白以及前述定义的FGF-19(有时也称PR0533)的所有其它天然同系物和变体均称为″FGF-19″，而不论其来源或制备模式如何。
如下面的实施例所公开的那样，本文的DNA49435-1219 cDNA克隆已经在ATCC保藏。该克隆的实际核苷酸序列，可由本领域熟练技术人员使用本领域常规方法通过对保藏克隆进行序列分析而很容易地测得。使用本领域常规技术可以预测该核苷酸序列编码的氨基酸序列。关于本文所述FGF-19多肽和其编码核酸，申请人已经确定此时在阅读框上什么是与现有序列信息最一致的。
使用上述ALIGN-2序列对比计算机程序，业已发现全长天然FGF-19序列(见图2和SEQ ID NO2)与AF007268_1具有一定的氨基酸序列同一性。因此，目前据信本申请公开的FGF-19多肽是成纤维细胞生长因子蛋白家族的新成员，而且可能具有该蛋白家族通常具有的一种或多种生物学和/或免疫学活性或者特性。
B.FGF-19变体除了本文描述的全长天然序列的FGF-19多肽外，还可以制备FGF-19变体。通过在FGF-19DNA中引入适当的核苷酸改变和/或合成所需FGF-19多肽，可制备FGF-19变体。本领域技术人员懂得，氨基酸变化将会改变FGF-19的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量和位置或者改变膜锚着特性。
使用例如在美国专利5364934号中阐述的保守和非-保守突变的任一技术和指导路线，可以在天然全长序列FGF-19或者在本文所述FGF-19的各种结构域中制造变化。变化可以是取代、缺失或插入编码FGF-19的一个或多个密码子，它们导致相对于天然序列FGF-19的FGF-19氨基酸序列变化。任选地，变化是FGF-19一个或多个结构域中的至少一个氨基酸被任何其它氨基酸取代。将FGF-19序列与已知同源蛋白分子进行比较，并使高度同源区氨基酸序列数量变化最小，可以建立决定哪个氨基酸残基可以被插入、取代或缺失而对所需活性无负面影响的指导原则。氨基酸取代可以是一个氨基酸被另一个具有类似结构和/或类似化学特性的氨基酸代替的结果，如丝氨酸置换亮氨酸，即保守氨基酸置换。插入或缺失可任选地在约1～5个氨基酸的范围内。通过系统地在氨基酸序列中进行插入、缺失或取代并检测所得变体显示全长或成熟天然序列的活性的情况，可以确定能允许的变化。
本文提供FGF-19多肽片段。该类片段可以是，例如，与全长天然蛋白相比，在N-末端或C-末端截短的或者是缺乏内部残基的片段。某些片段缺乏那些对于FGF-19多肽预期生物活性非必要的氨基酸残基。
FGF-19片段可以按照大量常规技术中的任何一个来制备。可以化学合成所需肽片段。另一方法涉及通过酶消化产生FGF-19片段，例如，用已知在特定氨基酸残基所限定的位点裂解蛋白的酶处理蛋白，或用适宜的限制性内切酶消化DNA并分离所需片段。另一适宜的技术包括分离并用聚合酶链反应(PCR)扩增编码所需多肽片段的DNA片段。将限定DNA片段所需末端的寡核苷酸用于PCR引物的5′和3′端。优选地，FGF-19多肽片段具有图2(SEQ ID NO2)所示天然FGF-19多肽的至少一种生物学和/或免疫学活性。
在特定实施方案中，目标保守取代冠以优选取代的名称示于下表6中。如果这类取代导致生物活性变化，则可引入起更多实质性改变并筛选产物，所述改变在表6中命名为示范性取代，或者如下文有关氨基酸种类的详述。
表6原始残基示范性取代优选取代Ala(A) val；leu；ile valArg(R) lys；gln；asn lysAsn(N) gln；his；lys；argglnAsp(D) glu gluCys(C) ser serGln(Q) asn asnGlu(E) asp aspGly(G) pro；ala alaHis(H) asn；gln；lys；argargIle(I) leu；val；met；ala；phe；norleucineleuLeu(L) norleucine；ile；val；met；ala；phe ileLys(K) arg；gln；asn arg
Met(M)leu；phe；ileleuPhe(F)leu；val；ile；ala；tyr leuPro(P)ala alaSer(S)thr thrThr(T)ser serTrp(W)tyr；phe tyrTyr(Y)trp；phe；thr；ser pheVal(V)ile；leu；met；phe；ala；norleucine leu对FGF-19多肽的生物学特性的实质性修改可通过选择性取代来完成，所述取代的效应在维持(a)取代区多肽骨架的结构，例如片层结构或螺旋构象，(b)该分子靶位点的电荷或疏水性，(c)侧链的大小这几方面有显著差异。天然残基根据共有的侧链特性可分为(1)疏水性正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性亲水性cys，ser，thr；(3)酸性asp，glu；(4)碱性asn，gln，his，lys，arg；(5)影响链取向的残基gly，pro；和(6)芳香族trp，tyr，phe。
非保守取代将限定上述某一类的成员被另一类取代。也可将取代的残基引入到保守取代位点，或者更优选地引入其余(非-保守)位点。
可以使用本领域已知方法如寡核苷酸-介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变技术来产生变异。可以对克隆的DNA进行定点诱变[Carter等，Nucl.Acids Res.，134331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.，106487(1987)]、盒式诱变[Wells等，Gene，34315(1985)]、限制选择诱变[Wells等，Philos.转.R.Soc.London SerA，317415(1986)]或其它已知技术以产生FGF-19变体DNA。
扫描氨基酸分析也可沿邻接序列确定一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸是相对小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸，甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。通常，丙氨酸是此组中优选的扫描氨基酸，因为它的β-碳上无侧链并且不太可能改变变体的主链构象[Cunningham和Wells，Science，2441081-1085(1989)]。优选丙氨酸的另一原因是因为它是最常用氨基酸。而且，它常常既出现在掩蔽位置也出现在暴露位置[Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，1501(1976)]。如果丙氨酸取代不能产生足够量的变体，则可使用isoteric氨基酸。
C.FGF-19的修饰本发明包括FGF-19的共价修饰。一种共价修饰包括使FGF-19多肽的靶氨基酸残基与能够与FGF-19的选定侧链或N-或C-末端残基发生反应的有机衍生化剂进行反应。具有双官能剂的衍生化是非常有用的，例如，FGF-19与纯化抗-FGF-19抗体方法中所用水溶性载体基质或表面交联，反之亦然。通常使用的交联剂包括例如，1，1-双(二偶氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟琥珀酰亚胺酯如与4-叠氮基水杨酸的酯，高双官能亚胺基酯，包括二琥珀酰亚胺酯如3，3′-连二硫酸双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、双官能马来酰亚胺酯如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛酯和化学试剂如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫]丙炔亚胺酯。
其它修饰包括谷氨酰胺和天冬酰残基脱酰胺分别成为相应的谷氨酰和门冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基甲基化[T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983)]，胺的N-末端乙酰化，和任何C-末端羧基的酰胺化。
本发明还包括FGF-19多肽的另一类共价修饰，所述共价修饰包括改变多肽的天然糖基化模式。″改变天然糖基化模式″，在这里的目的是为了删除天然序列FGF-19中一个或多个碳水化合物部分(或者通过除去发生糖基化的位点或者通过化学和/或酶手段而删除糖基化)，和/或在天然序列FGF-19中加入一个或多个本不存在的糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白糖基化的性质变化，包括不同碳水化合物部分在性质和比例上的变化。
通过改变氨基酸序列可以实现在FGF-19多肽中加入糖基化位点。此变更可以例如，通过向天然序列FGF-19(为了O-连接的糖基化位点)中加入、或者取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基而完成。任选地，可以通过DNA水平的变化，特别是通过使编码FGF-19多肽的DNA中预先选定的碱基发生突变从而产生将会翻译成期望氨基酸的密码子，来改变FGF-19氨基酸序列。
在FGF-19多肽上增加碳水化合物部分数量的另一方法是，将配糖体化学性或酶性地与多肽偶联。现有技术有此类方法的描述，例如1987年9月11日公布的WO 87/05330，以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.第259-306页(1981)。
用化学或酶方法，或者通过突变性取代编码作为糖基化靶点的氨基酸残基的密码子，来实现去除FGF-19多肽中的碳水化合物部分。化学性去糖基化技术为本领域所公知，并描述在例如下述文献中Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.，25952(1987)和Edge等，Anal.Biochem.，118131(1981)。使用Thotakura等在Meth.Enzvmol.，138350(1987)中描述的各种内-和外-糖苷酶，可以完成多肽中碳水化合物部分的酶裂解。
FGF-19的另一类共价修饰，包括以美国专利4640835、4496689、4301144、4670417、4791192或4179337中所述方式，将FGF-19多肽连与各种非蛋白类聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙烯二醇或聚氧化亚烷基。
本发明FGF-19也可被修饰成嵌合分子，包括将FGF-19与另一异源多肽或氨基酸序列融合。
在一实施方案中，嵌合分子含有FGF-19与标记多肽的融合体，其中的标记多肽具有抗-标记抗体可选择性结合的表位。表位标记一般位于FGF-19的氨基-或羧基-末端。使用抗标记多肽的抗体，可以检测到此类表位-标记型FGF-19的存在。另外，表位标记的提供，使得利用抗-标记抗体或另一类与表位标记结合的亲和基质来亲和纯化FGF-19变得非常容易。各种标记多肽及其各自抗体是本领域众所周知的。实例包括聚-组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标记；flu HA标记多肽及其抗体12CA5[Field等，Mol.Cell.Biol.，82159-2165(1988)]；c-myc标记和它的8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗体[Evan等，Molecular and Cellular Biology，53610-3616(1985)]；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体[Paborsky等，Protein Engineering，3(6)547-553(1990)]。
其它标记多肽包括Flag-肽[Hopp等，BioTechnology，612041210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science，255192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.，26615163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白肽标记[Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876393-6397(1990)]。
在另一实施方案中，嵌合分子可包括FGF-19与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合。对于二价形式的嵌合分子(也指″免疫粘附素″)，融合可以是与IgG分子Fc区的融合。Ig融合优选包括FGF-19多肽的可溶形式(跨膜结构域缺失或失活)取代Ig分子内至少一个可变区。在一特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合包括IgG1分子的铰链区、CH2和CH3区，或铰链区、CH1、CH2和CH3区。免疫球蛋白融合体的制备也参见1995年6月27日发布的美国专利5428130。
D.制备FGF-19下面的描述主要涉及通过培养转化或转染了含FGF-19核酸的载体的细胞来制备FGF-19。因此，当然考虑到本领域熟知的供选择方法可用于制备FGF-19。例如，通过利用固相合成技术的直接合成肽的方法来制备FGF-19序列或其一部分[参见例如，Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，，852149-2154(1963)]。使用手工或自动操作技术，进行蛋白体外合成。例如，按照制造商的指示，使用实用生物系统肽合成仪(Foster City，CA)，可以完成自动合成。可以分别化学合成FGF-19的各部分，然后利用化学或酶学方法制得全长FGF-19。
1.编码FGF-19的DNA的分离可以从cDNA文库获得编码FGF-19的DNA，所述cDNA文库是从据信具有FGF-19mRNA并且以可测得水平表达FGF-19的组织制备的。相应地，如实施例中所描述的那样，从人组织制备的cDNA文库中可以很方便地得到人的FGF-19DNA。也可以从基因组文库或者通过已知合成方法(例如自动核酸合成)获得FGF-19-编码基因。
使用为识别目标基因或其编码的蛋白而设计的探针(如FGF-19抗体或至少约20-80个碱基的寡核苷酸)，可以筛选文库。使用标准操作，如Sambrook等在Molecular CloningA Laboratory Manual(New YorkCold Spring HarborLaboratory，1989出版)中所描述的方法，用选择的探针进行cDNA或基因组文库的筛选。分离FGF-19编码基因的另一个可选用方法是使用PCR方法[Sambrook等，出处同上；Dieffenbach等，PCR PrimerA LaboratorvManual(Cold Spring Harbor Laboratory，1995出版)]。
下述实施例描述cDNA文库筛选技术。选作探针的寡核苷酸序列应当具有足够的长度并且足够清晰，以便使假阳性出现机率最小。寡核苷酸优选是标记的，这样通过与正在筛选的文库中的DNA杂交而可被检测到。标记方法为本领域所公知，包括使用放射性标记物如32P-标记的ATP、生物素或酶标记。包括中等严格和高度严格的杂交条件，见Sambrook等出处同上。
可将在筛选文库方法中鉴定的序列与其它已知的保藏序列或公共数据库如GenBank或其它私有序列数据库中的序列进行比较。使用本领域已知的和本文描述的方法，可以测定分子中限定区域或全长序列的序列同一性(无论在氨基酸水平还是在核苷酸水平)。
使用本文首次公开的推定氨基酸序列和如果必要，使用Sambrook等，出处同上描述的常规引物延伸程序，以检测没有被逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工中间体，可以从选定的cDNA或基因组文库获得具有蛋白编码序列的核酸。
2.宿主细胞的选择和转化用生产本文所述FGF-19的表达或克隆载体转染或转化宿主细胞，并在常规营养培养基中培养宿主细胞，对所述培养基进行改良使之适宜于诱导增强子、选择性转化体或扩增编码所需序列的基因。无需繁琐的试验，本领域熟练技术人员就可以选择培养条件如培养基、温度、pH等。通常，使细胞培养物产量最大化的原则、方案和实用技术见于Mammalian CellBiotechnologya Practical Approach，M.Butler编著(IRL出版，1991)和Sambrook等出处同上。
转染真核细胞和转化原核细胞的方法为本领域熟练技术人员所已知，例如，CaCl2、CaPO4、脂质体-介导的方法和电穿孔法。根据所用的宿主细胞，使用适合于该宿主细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等出处同上所述的使用氯化钙的钙处理，或电穿孔法一般用于原核生物。如Shaw等在Gene，23315(1983)和1989年6月29日公布的WO 89/05859中描述的那样，根癌农杆菌的感染用于转化某些植物细胞。对于没有细胞壁的哺乳动物来说，可以使用Graham和van derEb在Virology，52456-457(1978)中所述的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的总的情况在美国专利4399216中已有描述。根据Van Solingen等，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，763829(1979)所述方法，通常可以完成向酵母的转化。然而，也可使用将DNA引入细胞的其它方法，例如通过核的显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合，或者聚阳离子如polybrene、聚鸟氨酸。转化哺乳动物细胞的各种方法见Keown等，Methods in Enzymology，185527-537(1990)和Mansour等，Nature，336348-352(1988)。
克隆或表达本文所述载体中DNA的适宜的宿主细胞包括原核生物、酵母或高等真核细胞。适宜的原核生物包括但不限于革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌等真细菌，譬如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如大肠杆菌。各种大肠杆菌株均是公众可以得到的，如大肠杆菌K12株MM294(ATCC 31446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31537)；大肠杆菌株W3110(ATCC 27325)和K5 772(ATCC53635)。其它适宜的原核宿主细胞包括肠杆菌科如埃希氏杆菌属，例如，大肠杆菌，肠杆菌属，欧文菌属，克雷白菌属，变形菌杆属，沙门菌属(如鼠伤寒沙门菌)，沙雷菌属(如粘质沙雷菌)和志贺菌属等，以及芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如1989年4月12日出版的DD 266710中所述地衣芽孢杆菌41P)等，假单胞菌属的铜绿菌假单胞菌，及链霉菌。这些实例是用于说明而并非限制于此。W3110株是一个特别优选的宿主或母宿主，因为它是重组DNA产物发酵的常用宿主株。优选地，宿主细胞分泌少量蛋白水解酶。例如，修饰W3110株以使编码宿主内源性蛋白的基因发生遗传突变，此类宿主的实例包括大肠杆菌W3110株1 A2，该株具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110株9E4，该株具有完整基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110株27C7(ATCC 55244)，该株具有完整基因型tonA ptr3 phoAE15(argF-lac)169 degP ompT kanr；大肠杆菌W3110株37D6，该株具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kant；大肠杆菌W3110株40B4，它是37D6发生非-卡那霉素耐药degP缺失突变的株；和具有1990年8月7日发布的美国专利4946783中披露的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌株。或者，克隆的体外方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应，是适宜的。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适于使编码FGF-19的载体克隆或表达的宿主。酿酒酵母，或常用的面包酵母，在低等真核宿主微生物中最为常用。其它真核微生物包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature，290140；1985年5月2日公布的EP 139383)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利4943529；Fleer等，Bio/Technologv，9968-975(1991))，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2)737-742)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeraml1)(ATCC24178)、K.waltii(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906；Van den Berg等，Bio/Technology，8135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和克鲁维氏酵母属(K.marxianus)等；yarrowia(EP 402226)；巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(EP 183070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28265-278)；念珠菌属；Trichoderma reesia(EP 244234)；粗糙链孢霉(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，765259-5263)；许旺氏酵母属(schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公布的EP 394538)等；和丝状真菌，例如链孢霉属、青霉属、Tolypocladium(1991年1月10日公布的WO 91/00357)以及曲霉属宿主如构巢曲霉(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112284289；Tilburn等，Gene，26205-221；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811470-1474)和黑曲霉等(Kelly和Hynes，EMBO J.，4475-479)。在本文中嗜甲基(Methylotropic)酵母是适宜的，包括但不限于选自下述属的能够在甲醇中生长的酵母汉逊氏酵母属(Hansenula)，念珠菌属(Candida)，克勒克酵母属(Kloeckera)，毕赤酵母属(Pichia)，酵母属，球拟酵母属和红酵母属。此类酵母的例证性特定酵母属的清单见C.Anthony，The Biochemistrvof Methylotrophs，269(1982)。
用于表达糖基化FGF-19的适合宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞(例如果蝇属S2和草地夜蛾Sf9)和植物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和COS细胞。更特异的实例包括转化了SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)的猴肾CV1细胞系；人胚肾细胞系(293细胞或亚克隆培养成在悬浮培养液中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.3659(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；鼠赛尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝脏细胞(Hep G2，HB 8065)；和鼠乳腺癌细胞(MMT 060562，ATCCCCL51)。选择合适宿主细胞是本领域常识。
3.复制型载体的选择和应用可将编码FGF-19的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入复制型载体中以进行克隆(DNA扩增)或表达。各种载体是公众可以获得的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。使用各种方法可将合适的核酸序列插入载体。通常，利用本领域已知技术将DNA插入到合适的限制性核酸内切酶位点。载体组成部分一般包括但不限于一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。使用本领域熟练技术人员熟知的标准连接技术，构建包括这些组成部分中一个或多个元件的适宜载体。
FGF-19不仅可直接重组制备，而且还可制备成与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特异性裂解位点的其它多肽。通常，信号序列是载体的一个组分或者是被插入载体的FGF-19-编码DNA的一部分。信号序列可以是选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素II前导区的原核信号序列。对于酵母分泌，可以是例如酵母转化酶前导区、α因子前导区(包括糖酵母属和克鲁维酵母属的α因子前导区，后者在美国专利5010182中有述)，或酸性磷酸酶前导区、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导区(1990年4月4日公布的EP 362179)，或者1990年11月15日公布的WO90/13646中所述信号序列。在哺乳动物细胞表达时，可使用哺乳动物信号序列以直接分泌蛋白，如得自相同物种或相关物种分泌型多肽的信号序列以及病毒分泌前导区。
表达载体和克隆载体均含有使载体在一个或多个选定宿主细胞中复制的核酸序列。在多种细菌、酵母和病毒中，这样的序列众所周知。来自质粒pBR322的复制起点适宜于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒复制起始点适于酵母，各种病毒复制起始点(SV40，多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)适宜于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达载体和克隆载体通常包含筛选基因，也称为可筛选标记。典型的筛选基因编码蛋白，该蛋白(a)提供对抗生素或其它毒素，如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素等的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供从复合培养基中不能得到的关键营养物质，例如编码芽孢杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。
适于哺乳动物细胞的筛选标记实例是那些使能接纳FGF-19核酸的细胞得到鉴定的标记，例如DHFR或胸苷激酶。当使用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是按照Urlaub等在Pric.Natl.Acad.Sci.USA 774216(1980)中描述的方法制备和繁殖的DHFR活性缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。适用于酵母的合适筛选基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因[Stinchcomb等，Nature，28239(1979)；Kingsman等，Gene，7141(1979)；Tschemper等，Gene，10157(1980)]。trp1基因为不能在色氨酸中生长的酵母突变株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了筛选标记[Jones，Genetics，8512(1977)]。
表达和克隆载体通常含有可操作地连接于FGF-19-编码核酸序列的启动子，以指导mRNA合成。被各种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子，包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等，Nature，275615(1978)；Goeddel等，Nature，281544(1979)]，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel，Nucleic acids Res.，84057(1980)；EP36776]，和杂化启动子如tac启动子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983)]。适用于细菌系统的启动子，也含有可操作地连接于编码FGF-19的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
适用于酵母宿主的启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7149(1968)；Holl和Biochemistrv，174900(1978)]的启动子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母启动子，即那些具有由生长条件控制转录的优点的诱导型启动子，是下述基因的启动子区，即乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73657中进一步描述了用于酵母表达系统的适当载体和启动子。
在哺乳动物宿主细胞中，由载体转录FGF-19可受下述启动子调控，所述启动子来自病毒基因组如多瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公布的UK2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的启动子，或者来自异源哺乳动物的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子等，和来自热休克启动子，前提是这些启动子与宿主细胞系统相容。
在载体中插入增强子序列，可以增加编码FGF-19的DNA在高等真核生物中的转录。增强子是作用于启动子以增加转录的DNA的顺式作用元件，一般约10～300bp。目前已经知道了很多哺乳动物基因(珠蛋白，弹性蛋白酶、白蛋白、α胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，人们通常使用真核细胞病毒的增强子。实例包括在其复制起始点晚期侧的SV40增强子(bp100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在其复制起始点晚期侧的多形瘤增强子，和腺病毒增强子。所述增强子可以剪接入FGF-19编码序列的5’或3’端，但优选位于启动子的5’端。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)的表达载体，还包括对转录终止和稳定mRNA结构所必须的序列。这些序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶尔为3’)非翻译区。这些区域包含转录为编码FGF-19的mRNA的非翻译区中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。
在重组脊椎动物细胞培养中适应FGF-19合成的其它适宜方法、载体和宿主细胞，见Gething等，Nature，293620-625(1981)；Mantei等，Nature，28140-46(1979)；EP 117060；和EP 117058中的描述。
4.检测基因扩增/表达使用基于本文提供的序列的合适标记的探针，利用常规技术如Southern印迹、测定mRNA转录量的Northern印迹[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980)]、点印迹(DNA分析)或原位杂交，可以直接在样品中测定基因扩增和/或表达。或者，使用能够识别特异双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂化双链体或者DNA-蛋白双链体。依次标记抗体，对双链体与表面哪个部位结合进行分析，从而基于双链体在表面的形成，探测到与双链体结合的抗体。
或者，为直接定量测定表达的基因产物，用免疫学方法测定基因表达，所述方法如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液分析。适用于免疫组化染色和/或样品液分析的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以在任何哺乳动物中制备抗体。可以方便地制备抗天然序列FGF-19多肽的抗体，或抗基于本文提供的DNA序列的合成肽的抗体，或者抗与FGF-19DNA融合并编码特异抗体表位的外源序列的抗体。
5.多肽纯化可从培养基或宿主细胞裂解物中回收FGF-19。如果FGF-19与膜结合，那么使用适宜去垢剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶裂解使之自细胞膜释放。使用各种物理或化学手段，如冻融循环、超声、机械破裂或细胞溶解剂，使表达FGF-19所用的细胞破裂。
可以期望从重组细胞蛋白或多肽中纯化FGF-19。下述程序是例证性适宜的纯化步骤在离子-交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石或阳离子-交换树脂如DEAE上层析；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如交联葡聚糖(Sephadex)G-75进行凝胶过滤；过蛋白A琼脂糖柱以除去污染物如IgG；和结合表位-标记形式FGF-19的金属螯合剂柱。可以使用蛋白纯化的各种方法，这些方法是本领域熟知的，并在例如Deutscher，Methodsin Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein PurificationPrincipes and Practice，Springer-Verlag，NewYork(1982)中作了描述。纯化步骤的选择，取决于例如，生产方法的性质和所产生的特定FGF-19。
E.FGF-19的应用编码FGF-19的核苷酸序列(或其互补链)在分子生物学领域具有多种用途，包括用作杂交探针，在染色体和基因图谱和在制备反义RNA和DNA中的用途。FGF19核酸对于通过本文所述重组技术来制备FGF-19多肽，也是非常有用的。
全长天然序列FGF-19基因(SEQ ID NO1)或其部分，可用作cDNA文库的杂交探针以分离出全长FGF-19Cdna，或分离出与图1(SEQ ID NO1)中公开的FGF-19序列具有期望序列同一性的其它cDNA(例如，那些编码天然FGF-19变体或来自其它种属的FGF-19的cDNA)。任选地，探针长度是约20～约50个碱基。杂交探针可源自于SEQ ID NO1核苷酸序列的至少部分新区，其中所述新区是那些不需要十分繁琐实验就可确定的区域，或从包括启动子、增强子元件和内含子的天然序列FGF19基因组序列中确定的区域。举例来说，筛选方法包括使用已知DNA序列合成约40个碱基的选定探针，来分离FGF-19基因的编码区。杂交探针可标记上各种标志，包括放射性核苷酸如32p或35S或酶标记，所述酶标记如通过亲和素/生物素偶联系统将碱性磷酸酶与探针耦合。具有与本发明FGF-19基因互补序列的标记探针，可用于筛选人cDNA文库、基因组DNA或mRNA，以测定探针与哪一文库发生杂交。下面的实施例将进一步详细描述杂交技术。
使用本文披露的方法，本申请公开的EST序列可类似地用作探针。
FGF-19核酸的其它有用片段，包括含有能与靶FGF-19mRNA(正义)或FGF-19DNA(反义)序列结合的单链核酸序列(RNA或DNA)的反义或正义寡核苷酸。根据本发明，反义或正义寡核苷酸包括FGF-19DNA编码区的片段。该片段一般含有至少约14个核苷酸，优选地由约14～30个核苷酸。基于编码一给定蛋白的cDNA序列得到反义或正义寡核苷酸的能力，在例如Stein和Cohen(Cancer Res.482659，1988)及van der Krol等(BioTechniques 6958，1988)的文章中有描述。
反义或正义寡核苷酸与靶核酸序列的结合，导致通过一种或多种方式阻断靶序列转录或翻译的双螺旋形成，所述阻断方式包括增加双螺旋降解、转录或翻译的成熟前终止或者其它方式。因此，反义寡核苷酸可用于阻断FGF-19蛋白的表达。反义或正义寡核苷酸进一步包括具有修饰过的糖磷酸二酯主链的寡核苷酸(或其它糖链接，如WO 91/06629中描述的那些)，其中此类糖链接是耐内源性核酸酶的。具有抗性糖链接的寡核苷酸在体内是稳定的(即，能够抗酶降解)，同时保留序列与靶核苷酸序列结合特异性。
正义或反义寡核苷酸的其它实例包括那些与有机分子共价键合的寡核苷酸，如WO 90/10048中描述的那些寡核苷酸，和其它增加寡核苷酸与靶核酸序列亲和力的分子，如聚-(L-赖氨酸)。另外，嵌入剂(如椭圆玫瑰树碱)和烷基化剂或金属络合物可挂接在正义或反义寡核苷酸上，以修饰反义或正义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。
使用任何基因转移方法可将反义或正义寡核苷酸引入到含有靶核酸序列的细胞中，所述方法包括例如，CaPO4-介导的DNA转染、电穿孔、或使用基因转移载体如Epstein-Barr病毒。在一优选的方法中，将反义或正义寡核苷酸插入到一适宜的逆转录病毒载体中，在体内或体外使含有靶核酸序列的细胞与重组逆转录病毒载体接触。适宜的逆转录病毒载体包括但不限于，得自小鼠逆转录病毒M-MuLV、N2(得自M-MuLV的逆转录病毒)，或称为DCT5A、DCT5B和DCT5C(见WO 90/13641)的双倍复制病毒。
也可以通过使正义或反义寡核苷酸与配体结合分子形成共轭物的形式，而将正义或反义寡核苷酸引入到含有靶核苷酸序列的细胞中，见WO91/04753的描述。适宜的配体结合分子包括但不限于细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子或能与细胞表面受体结合的其它配体。优选地，配体结合分子的共轭基本上不干扰配体结合分子与其相应分子或受体结合的能力，或阻断正义或反义寡核苷酸或其共轭型进入细胞。
或者，按照WO 90/10448描述的方法，通过形成寡核苷酸-脂复合物，而将正义或反义寡核苷酸引入到含有靶核酸序列的细胞中。优选地，正义或反义寡核苷酸-脂复合物是使用内源性脂酶而与细胞分离的复合物。
也可在PCR技术中使用探针，以产生用于鉴定最接近FGF-19编码序列的一组序列。
编码FGF-19的核苷酸序列还可用于构建在描绘编码FGF-19的基因图谱和对患有遗传病个体进行基因分析中使用的杂交探针。使用已知技术，如原位杂交、抗已知染色体标记物的连锁分析和与文库的杂交筛选技术，可将本文提供的核苷酸序列整入到染色体和染色体的特定区域。
FGF-19的编码序列编码能与另一蛋白结合的蛋白时(例如，当FGF-19是受体时)，FGF-19可用在鉴定参与结合反应的其它蛋白或分子的分析中。使用此类方法，可以鉴定受体/配体结合反应的抑制剂。还可将参与此结合反应的蛋白用于筛选肽或结合反应的小分子抑制剂或激动剂。而且，受体FGF-19可用于分离相关配体。筛选分析可用于设计寻找模拟天然FGF-19生物活性或FGF19受体的主要化合物。此类筛选分析包括使用化学用数据库进行高-通过量筛选分析，使之特别适宜于鉴定小分子侯选药物。小分子包括合成的有机或无机化合物。可使用各种形式的分析法，包括蛋白-蛋白结合分析，生化筛选分析，免疫测定和以细胞为基础的分析，这些分析法均是本领域公知的。
编码FGF-19或其修饰形式的核酸，也可用于生产转基因动物或″剔除″动物，所得动物反过来对于开发和筛选适合的治疗剂是非常有用的。转基因动物(例如小鼠或大鼠)是含有转基因细胞的动物，所述转基因被引入到动物或孕期祖代动物中，例如胚胎期。转基因是整合入细胞基因组的DNA，由所述细胞发展为转基因动物。在一实施方案中，使用已经建立的技术和用于生产含有表达编码FGF-19DNA的细胞的转基因动物的基因组序列，编码FGF-19的cDNA可用于克隆编码FGF-19的基因组DNA。生产转基因动物的方法，特别是诸如小鼠或大鼠这样的动物，已经成为本领域常规技术，并在例如美国专利4736866和4870009中有描述。通常，带有组织-特异增强子的FGF-19转基因被整合入特定细胞中。包含在胚胎期被整合入动物干细胞一个拷贝编码FGF-19转基因的转基因动物，可用于检测增加编码FGF-19DNA表达的效果。此类动物可用作检测认为有可能对与过度表达有关的病理病症具有保护作用的药剂的试验动物。根据本发明的一个方面，与未经治疗的携带转基因的动物相比，用药剂治疗的动物，其病理病症的发生率降低，这表明药剂对于病理病症具有潜在的治疗干预作用。
或者，非-人源性FGF-19用于构建FGF19的″剔除″动物，该动物具有缺陷的或改变的FGF-19基因编码，这是将内源性FGF-19基因编码和改变的编码FGF-19基因组DNA之间的同源重组物引入动物胚胎干细胞的结果。例如，按照已经建立的技术，可将编码FGF-19的cDNA用于克隆编码FGF-19的基因组DNA。编码FGF-19基因组DNA的一部分，可被删除或用其它基因替换，如被用于监控整合的选择性标志的基因编码替换。通常，将数千碱基对未被改变的侧面DNA(5′或3′末端)引入到载体中[参见例如Thomas和Capecchi，Cell，51503(1987)对同源重组载体的描述]。将载体引入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，并选出引入了已经与内源性DNA同源重组的DNA的细胞[参见例如，Li等，Cell，69915(1992)]。接着，将选出的细胞注入动物(例如小鼠或大鼠)的胚囊中，以形成to form聚集嵌合体[参见例如，Bradley，in Teratocarcinomas和Embryonic Stem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson编著(IRL，Oxford，1987)，113-152页]。将嵌合胚胎植入适宜的假妊娠雌性养育动物体内，胚胎生长到足月即成为″剔除″动物。使用标准技术，鉴定出在其干细胞中携带有同源重组DNA的子代动物，用这些子代动物繁殖出在所有动物细胞中均含有同源重组DNA的动物。剔除动物的特征在于，例如，抵御某些病理病症的能力和由于动物缺乏FGF-19多肽而发生病理病症。
也可将编码FGF-19多肽的核酸用于基因治疗。在基因治疗应用中，将基因引入细胞以便达到在体内合成治疗有效的基因产物，例如置换缺陷基因。″基因治疗″既包括经单次治疗就可获得永久效果的常规基因治疗，也包括基因治疗剂的给药，后者涉及一次或重复多次施用治疗有效量的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可用作阻断体内特定基因表达的治疗剂。业已证明，短链反义寡核苷酸可整合入细胞中，在所述细胞中，短链反义寡核苷酸起抑制剂的作用，而不论由于细胞膜的限制性摄取所导致其低细胞内浓度如何。(Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834143-4146)。可修饰寡核苷酸以增强其摄取，例如永不带电荷的基团取代带阴性电荷的磷酸二酯。
有各种可利用的技术来把核酸引入到活细胞中。技术依是否将核酸转移进体外培养细胞或意欲的宿主体内细胞中而异。将核酸转移入哺乳动物体外细胞的适宜技术包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。目前流行的体内基因转移技术包括用病毒(通常为逆转录病毒)载体转染和用病毒包衣蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等，Trends inBiotechnology 11，205-210)。有些情况下，希望提供带有针对靶细胞的物质的核酸源，所述物质如对细胞表面的膜蛋白具有特异性的抗体，或靶细胞上受体的配体等。使用脂质体时，将与参与胞吞的细胞表面膜蛋白结合的蛋白用作靶向和/或促进摄取的物质，例如对特定型细胞具有向性的病毒壳体蛋白或其片段、在循环中发生内化的蛋白的抗体、靶向于细胞内定位(localization)并增加细胞内半衰期的蛋白。有关受体-介导的胞吞的技术在例如Wu等，J.Biol.Chem.262，4429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)中有描述。关于基因标志和基因治疗方案的综述，请参见Anderson等，Science 256，808-813(1992)。
本文所述FGF-19多肽也可用作电泳中蛋白的分子量标志。
本文所述编码FGF-19多肽或其片段的核酸分子在染色体鉴定中非常有用。在此方面，由于基于实际序列数据只有相对少数几个可利用的染色体标志剂，因而一直存在着对于鉴定新染色体标志的需求。
本发明FGF-19核酸分子可用作染色体标志。
本发明FGF-19多肽和核酸分子也可用于组织分型，其中本发明FGF-19多肽在不同组织间有差别地表达。FGF-19核酸分子还可用于制备PCR、Northern分析、Southern分析和Western分析用的探针。
本文所述FGF-19多肽和其调节剂也可用作治疗剂。按照已知制备有益药物组合物的方法，可制得本发明FGF-19多肽和其调节剂，所制得的FGF-19产品与可药用载体成呈混合物结合。为了治疗制剂贮存方便，将具有所需纯度的活性组分与任选的可药用载体、赋形剂或稳定剂混合(Reminaton′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编著(1980))，制备成冷冻干燥制剂或水溶液形式。可接受的载体、赋形剂或稳定，在所用剂量和浓度范围对接受者没有毒性，其包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物如葡萄糖甘露糖或糊精；螫合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。
本文的治疗组合物一般盛放在具有无菌存取口的容器中，例如该容器是静脉注射袋或带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的小瓶。
给药途径与已知方法一致，例如注射或静脉输注、腹膜内、颅内、肌内、眼内、动脉内或损伤内给药，局部用药或使用持续释放系统给药。
本发明药物组合物的剂量和所需药物浓度将依预想的特定用途而异。决定适宜剂量或给药途径是普通内科医师完全能够很好胜任的事情。动物试验为决定治疗人类患者所用剂量提供可靠指导。可按照Yacobi等编著的Toxicokinetics and New Drug Development(Pergamon Press，New York 1989)一书中，Mordenti，J.和Chappell在W.″The use of interspecies scaling intoxicokinetics″第42-96页所给出的方法换算种属间有效剂量的比例。
体内施用FGF-19多肽或其激动剂或拮抗剂时，取决于给药途径，每日标准剂量范围为约10ng/kg至高达100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选地约1μg/kg/日～10mg/kg/日。文献提供了有关特定剂量的指导和释放方法，参见例如美国专利4657760；5206344；或5225212。对于不同治疗化合物和不同病症而言，可以预期不同制剂能够奏效，例如，那些施用于器官或组织的制剂使得以不同于施用于其它器官或组织的方式进行释放成为必需。
当期望FGF-19多肽或调节剂在具有适宜于治疗需要施用FGF-19多肽或调节剂的任何疾病或病症的释放特性的制剂中持续释放给药时，考虑使用微囊包封。持续释放用的重组蛋白微囊包封已被成功地用于人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白介素-2和MN rgpl20的持续释放。Johnson等，Nat.Med.，2795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，271221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technologv8755-758(1990)；在Powell和Newman编著的Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach(Plenum PressNew York，1995)一书中第439-462页，Cleland，″Design and Production of Single Immunization VaccinesUsing Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems″；WO 97/03692，WO96/40072，WO 96/07399；和美国专利5654010。
由于聚lactic-coglycolic acid(PLGA)聚合物具有生物相容性很宽范围的生物降解特性，所以使用该聚合物来制备蛋白的持续释放制剂。PLGA的降解产物，即乳酸和羟基乙酸，在体内被快速清除。而且，可以根据该聚合物的分子量和构成来调节其降解特性，可以是数月到数年不等。在M.Chasin和R.Langer(编著)，Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(MarcelDekkerNew York，1990)一书中第1-41页，Lewis，″Controlled release of activeagents from lactide/glycolide polymer″。
本文提供的含有FGF-19治疗剂和组合物，可具有多种用途。这些用途包括治疗肥胖个体或与肥胖有关的病症。一方面，将有效量FGF-19施用于需要FGF-19的个体，从而治疗病症。优选地，病症是需要治疗的至少一种下述病症代谢增加、体重下降、机体脂肪减少、甘油三酯减少、游离脂肪酸减少、葡萄糖自脂肪细胞释放增加和/或leptin自脂肪细胞释放增加。使用标准方法，可以测定其中的每一项参数，例如，通过测定耗氧量来测定代谢速率，使用秤测量体重，以及通过测量尺寸来测定脂肪情况。
另外，使用标准方法，可以测定甘油三酯、游离脂肪酸、葡萄糖和leptin的含量。在下面的特定实施例中，例证性给出了每一项参数的测定情况。
FGF-19和含FGF-19组合物，优选在体内使用。但是，如下面所述的那样，也可在体外给药，例如在下述筛选FGF-19调节剂的方法中使用时。此外，应当懂得，也可通过使用动物模型和采自患者的样品来鉴定FGF-19的调节剂。
发明包括筛选化合物的方法，以鉴定那些模拟或增强FGF-19多肽(激动剂)或者阻止或抑制FGF-19多肽(拮抗剂)效果的化合物。在本文中，把激动剂和拮抗剂称作调节剂。拮抗剂侯选药物筛选试验，目的是鉴定与由本文确定的基因编码的FGF-19多肽结合或复合的化合物，或者相反，鉴定那些干扰基因编码的多肽与其它细胞蛋白相互作用的化合物。此类筛选试验包括使用高通过量化学数据库筛选分析，使之特别适于鉴定小分子侯选药物。
试验可按照任何方式进行，包括蛋白-蛋白结合分析、生化筛选分析、免疫测定和基于细胞的分析，这些分析方法在本领域已被很好描述。
拮抗剂试验共同的方面是，它们使侯选药物与由本文确定的核酸编码的FGF-19多肽接触足够时间以使得这两种组分相互作用。
在结合试验中，相互作用是结合，形成的复合物可被分离或在反应混合物中被检测。一特定实施方案中，通过共价或非-共价地附着，而把由本文确定的基因编码的FGF-19多肽或侯选药物固定在固相上，例如，固定在微量滴定盘上。非-共价附着，一般通过用FGF-19多肽溶液包封固体表面并进行干燥而实现。或者，固定抗体，例如，固定的对FGF-19多肽具有特异性的单克隆抗体，可用于使FGF-19多肽固定到固体表面。试验这样进行向固定组分中加入非固定组分，所述非固定组分可以标记上可检测的标记物，譬如，包衣表面含有使FGF-19多肽固定的组分。当反应完成时，除去未反应的组分(例如，通过洗涤方式)，并检测固定在固体表面的复合物。当原来非固定组分带有可检测标记物时，检测到固定在表面的标记物，就表明复合物形成。如果原来非-固定组分没有携带标记物，则可以检测到复合，例如，通过使用与固定复合物特异结合的抗体。
如果侯选化合物与本文确定的基因编码的特定FGF-19多肽相互作用但是又不与之结合，那么，使用已知的检测蛋白-蛋白相互作用的方法来分析与那个多肽的相互作用。此类分析方法包括惯常的方法，例如，交联、共-免疫沉淀和通过梯度或层析柱的共-纯化。此外，按照Fields与其同事(Fields和Song，Nature(340245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578-9582(1991))和Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895789-5793(1991)公开的方法，使用酵母-基遗传系统可以检测蛋白-蛋白相互作用。许多转录激活剂，如酵母GAL4，它由两个完全分散的分子结构域构成，其一作为DNA-结合区，另一个作为激活转录的区。前述出版物中描述的酵母表达系统(一般指″二因子杂合系统″)利用此特性，并使用两个杂交蛋白，其一的靶蛋白与GAL4的DNA-结合区融合，另一个的候选激活蛋白与激活区融合。在GAL4-激活的增强子控制下GAL1-lacZ报告基因的表达，依赖于通过蛋白-蛋白相互作用重建的GAL4活性。用对-半乳糖苷酶的显色底物检测含有相互作用多肽的菌丛。从Clontech可以商购利用二因子杂合技术鉴定两个特异蛋白间蛋白-蛋白相互作用的全套试剂盒(MATCHMAKER)。该系统也可被扩展到描绘参与特异蛋白相互作用的蛋白结构域，以及对于这些相互作用起关键作用的精确的氨基酸残基。
干预本文鉴定的基因编码的FGF-19多肽与其它细胞内或细胞外组分相互作用的化合物可如下测定通常在控制条件下，制备含有产物基因和细胞内或细胞外组分产物的反应混合物，使两种产物相互作用和结合一定时间。为了测试候选化合物抑制结合的能力，在含有和不含有受试化合物的条件下进行反应。另外，可把安慰剂加入到第三反应混合物中，作为阳性对照。按照上述方法，监测混合物中受试化合物与细胞内或细胞外组分之间的结合(复合物形成)。在对照反应中有复合物形成，而在含有受试化合物的反应混合物中没有复合物形成，表明受试复合物干预受试化合物与其配伍化合物之间的相互作用。
为分析拮抗剂，可将FGF-19多肽与被筛选化合物一起加入到细胞中，一定活性和能力的化合物抑制共存的FGF-19多肽的有关活性，则表明化合物是FGF-19多肽的拮抗剂。或者，在适当条件下使FGF-19多肽和潜在拮抗剂与结合在膜上的FGF-19多肽受体或重组受体结合，通过竞争性抑制实验来检测拮抗剂。可标记FGF-19多肽，如放射性标记，这样，结合在受体上的FGF-19多肽分子数量，就可用于测定潜在拮抗剂的效力。使用本领域已知的众多方法，例如，配体panning和FACS排序，可以鉴定编码受体的基因。Coligan等，Current Protocols in Immun.，1(2)Chapter 5(1991)。优选使用表达克隆，其中多聚腺苷酸化RNA是从对FGF-19多肽易感细胞中制备的，由该RNA建立的cDNA文库被分成数个库，用于转染COS细胞或其它对FGF-19多肽不易感的细胞。使玻璃载波片上生长的转染细胞与标记的FGF-19多肽接触。可用各种方法标记FGF-19多肽，包括碘化或位点特异蛋白激酶的识别位点的包埋。固定和温育后，载玻片接受放射自显影分析。鉴定阳性库，制备亚-库，并使用交互作用的亚-库进行再转染，重新进行筛选过程，直至得到编码推定受体的单个克隆。
作为受体鉴定的另一途径，可使标记的FGF-19多肽与细胞膜或表达受体分子的提取制品光亲和连接。用PAGE除去交联材料，暴露于X-线胶片。可切除含受体的标记复合物，分解为肽片段，接受蛋白微测序。从微测序得到的氨基酸序列，用于设计一套筛选cDNA文库的简并寡核苷酸探针，以鉴定编码推定受体的基因。
在拮抗剂另一分析方法中，在侯选化合物存在的条件下，哺乳动物细胞或表达受体的膜制品与标记的FGF-19多肽温育。然后测定化合物增强或阻断相互作用的能力。
潜在拮抗剂的更特异实例包括与免疫球蛋白和FGF-19多肽的融合物结合的寡核苷酸，特别是抗体包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片段、单链抗体、抗-独特型抗体，和嵌合抗体或人源化抗体或抗体片段，以及人抗体和抗体片段。或者，潜在拮抗剂是密切相关的蛋白，例如，FGF-19多肽的变种，后者识别受体但不引起效应，从而竞争性抑制FGF-19多肽的作用。
在本文的一实施方案中，做了竞争性结合实验，FGF受体4或FGF-19抗体用作竞争剂。
另一潜在FGF-19多肽拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体，其中例如，反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交和阻止蛋白翻译，起着直接阻断mRNA翻译的作用。反义技术可用于控制通过三链螺旋结构或反义DNA或RNA的基因表达，两种方法均建立在多聚核苷酸与DNA或RNA结合的基础上。例如，多聚核苷酸序列的5′编码部分，该部分编码本文所述成熟FGF-19多肽，被用于设计约10～40个碱基对长度的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计成参与转录基因区的互补链(三链螺旋参见Lee等，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney等，Science，241456(1988)；Dervan等，Science，2511360(1991))，由此阻止转录和FGF-19多肽产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，阻断mRNA分子翻译成FGF-19多肽(反义，见Okano，Neurochem.，56560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(CRC PressBoca Raton，FL，1988)。也可把上述寡核苷酸释放入细胞中，这样反义RNA或DNA可在体内表达，而抑制FGF-19多肽的产生。当使用反义DNA时，优选衍生自翻译起始位点寡脱氧核苷酸，例如，靶基因核苷酸序列的约-10和+10位。
潜在的拮抗剂包括与活性位点结合的小分子、受体结合位点、或生长因子或FGF-19多肽其它相关结合位点，从而阻断FGF-19多肽的正常生物活性。
小分子的实例包括但不限于，小肽或类-肽分子，优选溶解的肽和合成的非-肽有机或无机化合物。
核酶是能够催化RNA特异性裂解的具有酶性质的RNA分子。核酶通过序列-特异性杂交于靶RNA互补链，接着通过核酸内裂解而发挥作用。使用已知技术，可以鉴定位于潜在RNA靶内的特异核酶裂解位点。进一步的细节请参见例如Rossi，Current Biology，4469-471(1994)，和PCT出版物WO97/33551(1997年9月18日公布)。
用于抑制转录的三链螺旋构型的核酸分子，应当是单链并由脱氧核苷酸构成。这些寡核苷酸碱基组成是设计好的，这样它通过Hoogsteen碱基对原则促进三链螺旋的形成，这一般需要双螺旋中一条链上的嘌呤或嘧啶相当大的延伸。更详细情况请参见例如，PCT出版物WO 97/33551，出处同上。
用上述讨论的筛选试验的任何一个或多个分析方法，和/或使用本领域技术人员熟知的任何其它筛选技术，可以鉴定这些小分子。
值得欣慰的是，本文提供的分析方法可用于筛选多种侯选生物活性剂。本文使用的术语″侯选生物活性剂″、″侯选剂″或″侯选药物″或语法上的等价物，是指为了筛选能够直接或间接改变细胞活性表型或FGF-19序列表达(既包括核酸序列也包括蛋白序列)的生物活性剂，而被测试的任何分子，例如蛋白、寡肽、小的有机分子、多糖、多核苷酸、嘌呤类等，。
尽管代表性的侯选剂是有机分子，但是侯选剂可以包括众多化学种类，优选分子量大于100而小于约2500道尔顿(d)的小有机化合物。本文可进一步限定分子量为50d～2000d的小分子。在另一实施方案中，小分子的分子量小于1500、或小于1200、或小于1000、或小于750、或小于500d。在一实施方案中，本文使用的小分子分子量为约100～200d。侯选剂包括与蛋白相互作用所必需的结构上的官能团，特别是氢键，和通常包括至少一个氨基、羰基、羟基或羧基，优选至少两个化学官能团。侯选剂常常包含被一个或多个上述官能团取代的环碳或杂环结构和/或芳香或多芳香结构。侯选剂也见于生物分子，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或它们的组合。特别优选肽。
侯选剂得自广泛的各种来源，包括合成或天然化合物库。例如，有大量方法可用于随机和定向合成各种有机化合物和生物分子，方法包括随机化寡核苷酸的表达。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库是可以利用或很方便制造的。另外，通过常规的化学、物理和生化学方法，可以很容易地修饰天然或合成制造的库和化合物。可对已知的药剂进行定向或随机化学修饰，如酰化、烷化、酯化、amidification，以产生结构类似物。
在一优选的实施方案中，侯选生物活性剂是蛋白。这里″蛋白″是指至少2个共价连接的氨基酸，它包括蛋白、多肽、寡肽和肽。蛋白由天然氨基酸和肽键构成，或由合成的类肽结构(peptidomimetic structures)构成。因此，本文所述″氨基酸″或″肽残基″，既指天然氨基酸，也指合成的氨基酸，例如，为了本发明的目的，高-苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被认为是氨基酸。″氨基酸″也包括亚基残基如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是(R)或(S)构型。在一优选的实施方案中，氨基酸是(S)或L-构型。如果使用非天然侧链，则可以使用非-氨基酸取代基，例如为预防或阻止体内降解。
在一优选的实施方案中，侯选生物活性剂是天然蛋白或天然存在蛋白的片段。因此，例如可以使用含有蛋白的细胞提取物，或者随机或定向消化的蛋白性细胞提取物。以这种方式，可以制备用于本发明筛选方法的原核生物和真核生物蛋白库。此实施方案中，特别优选细菌、真菌、病毒和哺乳动物蛋白库，以后者为优选，特别优选人蛋白。
在一优选的实施方案中，侯选生物活性剂是约5～约30个氨基酸的肽，优选约5～约20个氨基酸，特别优选约7～约15个氨基酸。肽可能是如上略述的天然存在蛋白的消化产物、随机肽或″边缘″随机肽。这里的″随机肽″或语法上的等价物是指每一个核酸和肽基本上分别由随机核苷酸和氨基酸构成。既然这些随机肽(或核酸，见下述)通常是化学合成的，那么它们可在任何位置整合入任意核苷酸或氨基酸。可设计合成路线以产生随机蛋白或核酸，使得沿着序列长度形成所有或大多数可能的结合，由此形成随机候选活性蛋白剂库。
在一实施方案中，文库是完全随机的，在任何位置均没有序列优先或恒定。在一优选的实施方案中，文库是偏倚性的，也即序列内的某些位置或者保持恒定，或者只选自有限数目的可能性。譬如，在一优选的实施方案中，核苷酸或氨基酸残基在限定种类内是随机的，例如，是疏水氨基酸、亲水残基、空间位阻性偏倚(小的或大的)残基，目的是为了产生核酸结合域，为产生交联用的半胱氨酸，为了SH-3区的脯氨酸，为了磷酸化位点的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或组氨酸等，或为了与嘌呤结合等。
在一优选的实施方案中，侯选生物活性剂是核酸。本文所述″核酸″或″寡核苷酸″或语法上的等价物是指至少2个核苷酸共价连接。本发明核酸通常含有磷酸二酯键，尽管在某些情况下，如下面提到的那样，包括具有可变主链的核酸类似物，后者含有例如磷酰胺(Beaucage等，Tetrahedron 49(10)1925(1993)和其中的引用文献；Letsinger，J.Org.Chem.353800(1970)；Sprinzl等，Eur.J.Biochem.81579(1977)；Letsinger等，Nucl.Acids Res.143487(1986)；Sawai等，Chem.Lett.805(1984)，Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.1104470(1988)；和Pauwels等，Chemica Scripta 26141 91986))，硫代磷酸酯(Mag等，Nucleic acids Res.191437(1991)；和美国专利5644048)，二硫代磷酸酯(Briu等，J.Am.Chem.Soc.1112321(1989)，氧-甲基磷酰胺酯(phophoroamidite)连接(参见Eckstein，Oligonucleotide and AnaloguesAPractical Approach，Oxford University Press)，和肽核酸主链及连接(见Egholm，J.Am.Chem.Soc.1141895(1992)；Meier等，Chem.Int.Ed.Engl.311008(1992)；Nielsen，Nature，365566(1993)；Carlsson等，Nature 380207(1996)，所有这些文献均引入参考)。其它类似核酸包括那些带正电主链的核酸(Denpcy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926097(1995)；非-离子主链(美国专利5386023，5637684，5602240，5216141和4469863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.Ed.English 30423(1991)；Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.1104470(1988)；Letsinger等，Nucleoside & glycoside 131597(1994)；Chapters 2和3，ASC Symposium Series 5 80，″Carbohydrate Modifications inantisense Research″，Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook；Mesmaeker等，Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4395(1994)；Jeffs等，J.BiomolecularNMR 3417(1994)；Tetrahedron Lett.37743(1996))和非-核糖主链，包括在美国专利5235033、5034506以及Chapters 6和7，ASC Symposium Series 580，″Carbohydrate Modifications in antisense Research″，Ed.Y.S.Sanghui P.DanCook中描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义中(参见Jenkins等，Chem.Soc.Rev.(1995)pp169-176)。数种核酸类似物在Rawls，C & E News June 2，1997 page 35中作了描述。所有这些文献均以其全部在此引入参考。对核糖-磷酸酯主链进行的这些修饰，是为了便利于添加附加部分如标记物，或者为了增加分子在生理环境中的稳定性和半衰期。此外，可以制备天然核酸与类似物的混合物。或者，制备不同核酸类似物的混合物，和天然存在核酸与类似物的混合物。按指明的那样，核酸可以是单链或双链，或者既含有双链也含有单链序列部分。核酸可以是DNA(既可是基因组也可是cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸含有脱氧核糖和核糖核苷酸的任何组合，和碱基任意组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、次黄苷、xathanine hypoxathanine、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。
如上面对蛋白所作的总括性描述那样，核酸侯选生物活性剂可以是天然存在核酸、随机核酸或″偏倚的″随机核酸。例如，如上面对蛋白所作描述那样，可使用原核或真核基因组的消化产物。
在一优选的实施方案中，侯选生物活性剂是有机化学分子，文献中记载了可利用的各种有机化学分子。
如上所述，在一优选的实施方案中，可对单个基因和基因产物(蛋白)进行筛选。在一优选的实施方案中，按照下面实施例中所描述的，已经鉴定出与特定组织差异地表达的基因有关的基因或蛋白，因而所述病症与这些组织相关。因此，在一实施方案中，把筛选设计成首先找到与FGF-19结合的候选剂，然后将寻找到的这些试剂用于评价调节FGF-19活性的候选剂活性的试验中。所以，正如将被本领域技术人员领会的那样，可以进行大量不同的试验。
也可对调节FGF-19活性的试剂进行筛选。在一优选的实施方案中，能够调节FGF-19生物活性剂的筛选方法，包括将候选生物活性剂加入到FGF-19的样品中，并测定FGF-19生物活性的改变。″FGF-19活性的调节″，包括活性增加、活性降低或者活性类型的变化。因此，在该实施方案中，候选剂应当既与FGF-19结合(尽管这可能是不必要的)又影响FGF-19的所述生物学或生化学活性。方法既包括上述体外筛选方法，也包括体内改变FGF-19存在、表达、分布、活性或含量的细胞的筛选方法。
因此，在该实施方案中，方法包括将样品与候选生物活性剂结合，并评价对FGF-19活性的影响。″FGF-19蛋白活性″或语法上的等价物，在这里是指FGF-19蛋白的至少一种上述生物活性。
在一优选的实施方案中，FGF-19蛋白的活性增加；在另一优选实施方案中，FGF-19蛋白的活性下降。因而，在某些实施方案中优选作为拮抗剂的生物活性剂，在其它实施方案中优选作为激动剂的生物活性剂。
本发明的一个方面，药物筛选试验中使用含FGF-19序列的细胞，检测候选药物对FGF-19的影响。细胞类型包括正常细胞、肿瘤细胞和脂肪细胞。
评定FGF-19活性的方法为本领域所已知，并且在下述实施例中作例证性描述，所述活性如在葡萄糖摄取、leptin释放、代谢、甘油三酯和游离脂肪酸水平、体重和机体脂肪方面的变化。
在一优选的实施方案中，方法包括将上述候选生物活性剂加入到含有FGF-19的细胞中。优选的细胞类型包括几乎任何细胞。细胞含有编码FGF-19蛋白的核酸，优选重组物。在一优选的实施方案中，候选剂库在多细胞中进行检测。
一方面，试验在存在或缺乏生理信息物的情况下或者在暴露于生理信息物之前或之后进行评定，所述生理信息物例如激素、抗体、肽、抗原、细胞因子、生长因子、动作电位，药理学试剂包括化疗剂、放疗剂、致癌剂或其它cells(即细胞-细胞接触)。在另一实例中，在细胞周期进程的不同期进行测定。
本文提供的FGF-19序列也可在诊断方法中使用。
FGF-19的过度表达表明不正常代谢率，而其低表达则表明肥胖倾向。而且，可以分析取自患者的样品中FGF-19是否变异或失去功能。通常，此类方法包括将采自患者的样品以及FGF-19的表达与对照进行比较。
F.抗-FGF-19抗体本发明进一步提供抗-FGF-19抗体。示范性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、双特异抗体和异源偶联抗体。
1.多克隆抗体抗-FGF-19抗体包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法为本领域熟练技术人员所已知。多克隆抗体可在哺乳动物中产生，例如，通过一次或多次注射致免疫剂，如果需要，可加入佐剂。通常，对哺乳动物皮下或腹膜内多次注射致免疫剂和/或佐剂。致免疫剂可包括FGF-19多肽或其融合蛋白。将致免疫剂与针对所免疫的哺乳动物具有免疫原性的蛋白进行偶联是有效的。所述致免疫蛋白的实例包括但不限于匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷脂酰脂质A，合成的海藻糖双白喉菌酸酯(dicorynomycolate))。无需繁琐的试验，本领域技术人员就可选择致免疫方案。
2.单克隆抗体或者，抗-FGF-19抗体是单克隆抗体。可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，如Kohler和Milstein在Nature，256495(1975)中描述的方法。在杂交瘤方法中，通常用致免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它适宜宿主动物，以引发产生或能够产生将与致免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，在体外致敏淋巴细胞。
致免疫剂通常包括FGF-19多肽或其融合蛋白。一般而言，如果需要来源于人的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBLs”)，如果需要非人哺乳动物来源的细胞，那么就使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用适宜的融合试剂如聚乙二醇，将淋巴细胞与无限增殖细胞系融合，从而形成杂交瘤细胞[Goding，单克隆抗体Principles和Practice，Academic Press，(1986)59-103页]。无限增殖细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人类起源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在适宜培养基中培养杂交瘤细胞，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的无限增殖细胞生长或生存的物质。例如，母代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷(″HAT培养基″)，这些物质抑制HGPRT-缺陷细胞生长。
优选的无限增殖细胞系，是那些有效融合、支持筛选出的抗体-生成细胞稳定地高水平表达抗体，并且对培养基如HAT敏感的细胞系。更优选的无限增殖细胞系是鼠骨髓瘤系，后者可得自例如Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California和美国模式培养物保藏所，Manassas，Virginia。人骨髓瘤和鼠-人杂交骨髓瘤细胞系也已用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等，Monoclone antibodyProduction Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，(1987)pp.51-63]。
接下来，可以检定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在直接抗FGF-19的单克隆抗体。优选地，用免疫沉淀或体外结合试验如放免分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)，来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。这些技术和试验分析方法是本领域所已知的。使用例如Scatchard analysisof Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107220(1980)公开的方法，可以测定单克隆抗体的结合亲和力。
鉴定出所需的杂交瘤细胞之后，经有限稀释法将克隆进行亚克隆处理并采用标准方法使之生长[Goding，出处同上]。用于此目的适宜的培养基包括例如，Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内以腹水形式生长。
使用常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、渗析或亲和层析，可以从培养基或腹水中分离或纯化由亚克隆分泌的单克隆抗体。
也可使用重组DNA方法生产单克隆抗体，例如在美国专利4816567中描述的方法。使用常规技术(例如，使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)，很容易地分离编码本发明单克隆抗体的DNA并进行序列测定。本发明的杂交瘤细胞作为此DNA的优选来源。一旦分离出该DNA，就可将其植入到表达载体中，然后用后者转染宿主细胞，所述宿主细胞如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。也可对DNA进行修饰，例如人重链和轻链恒定区的编码序列被相应的鼠序列置换[美国专利4816567；Morrison等，出处同上]，或者将非-免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白的编码序列上。此类非-免疫球蛋白多肽可取代本发明抗体的恒定区，或可取代本发明抗体一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体。
抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法为本领域所已知。例如，有一个方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰后重链的重组表达。通常在Fc区的任何位点将重链截短，从而防止重链交联。或者，用其它氨基酸残基代替相关的半胱氨酸残基或者半胱氨酸残基缺失以防止交联。
体外方法也适于制备单价抗体。使用本领域常规技术可以完成抗体消化而产生抗体片段，特别是Fab片段。
3.人抗体和人源化抗体本发明抗-FGF-19抗体进一步包括人源化抗体或人抗体。非-人(例如，鼠)的人源化抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗体的其他抗原结合亚序列)，它们包含非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)中受者互补决定区(CDR)残基被具有所需特异性、亲和力和性能的小鼠、大鼠、家兔等非人源物种抗体(供体抗体)的CDR残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区残基由相应的非人类残基所取代。人源化抗体也可包含受者抗体或供体CDR或框架序列中均不存在的残基。通常，人源化抗体基本上包括至少一个、通常两个可变区的全部，其中CDR的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗体还任选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
人源化非-人抗体的方法是本领域技术人员所已知的。通常，人源化抗体中已导入一或多个源自非人类的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科学，2391534-1536(1988))所述，用一个或多个CDR序列取代人类抗体的相应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4816567)，其中完整人类可变区的很少一部分被非人类物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中一些CDR残基且可能有部分FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
使用本领域已知的各种技术可以制备人抗体，所述方法包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991)]。也可使用Cole等和Boerner等描述的技术制备人单克隆抗体[Cole等，Monoclonal Antibody and Cancer Therapy，Alan R.Liss，(1985)第7页，和Boerner等，J.Immunol.，147186-95(1991)]。类似地，通过把人免疫球蛋白的基因座插入转基因动物例如鼠来生产人抗体，所述宿主动物的内源性免疫球蛋白基因已被部分或全部灭活。攻击后，观察到人抗体产生，这在各个方面均与在人体所见的极为相似，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分。有关进展在例如下列专利和科学出版物中作了描述美国专利5545807；5545806；5569825；5625126；5633425；5661016；Marks等，Bio/Technologv 10，779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368 856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnologv 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。
4.双特异抗体双特异抗体是单克隆抗体，优选具有针对至少两种不同抗原的结合特异性的人抗体或人源化抗体抗体。在本发明中，一种结合特异性针对FGF-19，另一种针对其它抗原，优选针对细胞表面蛋白或受体或受体亚单位。
制备双特异抗体的方法为本领域所已知。双特异性抗体的传统制备方法，是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein等，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤(quadroma))可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法见WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)。
可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区的至少一部分、CH2及CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。产生双特异抗体的进一步细节内容，请参见例如Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。
根据WO 96/27011所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异源二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这使得异二聚体的产量比不想要的终产物如同型二聚体的高。
双特异抗体可以制备全长抗体或抗体片段(如F(ab’)2双特异抗体)。从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，科学22981(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab’片段被转化为硫硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。其中一种Fab’-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab’-硫醇，再与等分子量的其它Fab’-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。
近期的进展促进了Fab’-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，实验医学杂志，175217-225(1992)中描述了完全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。每一Fab’片段分别从大肠杆菌中分泌出来，体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过度表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤细胞的裂解活性。
直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志，148(5)1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体的同型二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同型二聚体。由Hollinger等，美国国家科学院学报，906444-6448(1993))描述的“二价抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(VH)，其通过接头与轻链可变区(VL)相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，免疫学杂志，1525368(1994)。还考虑了二价以上的抗体。如可制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志，14760(1991)。
例证性双特异性抗体可与本文指定的FGF-19多肽上的两种不同表位结合。或者，可将抗-FGF-19多肽臂与白细胞上引发分子的臂结合，从而强化针对表达特定FGF-19多肽细胞的细胞防御机制，所述引发分子如T细胞受体分子(CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG Fc受体(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。双特异性抗体还可用于将细胞毒制剂定位至表达特定FGF-19多肽的细胞上。这些抗体具有FGF-19-结合臂和结合细胞毒制剂或放射性同位素半抗原的臂，如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA。另一有关的双特异抗体结合FGF-19多肽并且进一步结合组织因子(TF)。
5.异源偶联抗体异源偶联抗体也包括在本发明范围之内。异源偶联的抗体由两个共价连接的抗体组成。有观点认为，这类抗体可用于将免疫细胞导向不想要的细胞(美国专利4676980)，也可用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。可考虑使用蛋白化学合成中已知方法，包括涉及使用交联剂，在体外制备异源偶联抗体。举例来说，使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键，可以构建免疫毒素。用于此目的适当试剂的实例，包括免疫硫醇盐和甲基-4-巯基，巯基butyrimidate以及例如在美国专利4676980中描述的那些。
6.效应物功能的工程改造在效应物功能方面可能希望改进本发明的抗体，以增强在治疗(例如治疗癌症)时的效果。例如，可在Fc区域中引入半胱氨酸残基，从而在该区域中形成链间二硫键。这样制得的同型二聚体可能有改进的内化能力和/或提高的补体介导细胞杀伤能力及依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)。也可如Wolff等，Cancer Research 532560-2565(1993)描述的那样，用异二聚功能性交联剂来制备抗肿瘤活性增强的同型二聚抗体。或者，可将抗体经工程化改造成具有双Fc区，从而可能增强补体裂解和ADCC能力。见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。
7.免疫偶联物本发明还涉及免疫偶联物，其中含有与细胞毒药物偶联的抗体，所述细胞毒药物如化疗剂、毒素(例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体)或放射性同位素(即放射偶联物)。
适用于制备这类免疫偶联物的化疗剂在上文已作描述。可以应用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。多种放射性同位素可用于制备放射性偶联的抗体，实例包括Bi212、I131、In131、Y90和Re186。
抗体与细胞毒制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(如亚氨基己二酸二甲酯盐酸盐)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科学2381098(1987)所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的偶联剂之一。见WO94/11026。
在另一实施方案中，抗体可与肿瘤预靶向中应用的“受体”(如亲和素)偶联，将该抗体-受体偶联物施用于患者，之后用清除剂除去循环中未结合的偶联物，再给予已偶联了细胞毒制剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如抗生物素蛋白)。
8.免疫脂质体本文公开的抗体还可制成免疫脂质体。含抗体的脂质体可通过本领域已知方法制备，如Epstein等，美国国家科学院学报823688(1985)；Hwang等，美国国家科学院学报774030(1980)；美国专利4485045和4544545及1997年10月23日公开的WO97/38731。在美国专利5013566中公开了循环时间已增加了的脂质体。
特别有用的脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发法而制得。脂质体挤压通过限定孔径的滤膜，获得具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可如Martin等，生物学化学杂志，257286-288(1982)所述的那样，经二硫化物交换反应与脂质体偶联。可任选在所述脂质体中包含一种化疗剂。见Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
9.抗体的药学组合物与本文鉴定的FGF-19多肽特异性结合的抗体，以及用前述公开的筛选试验鉴定的其它分子，可以药学组合物的形式施用来治疗各种病症。
如果FGF-19多肽是在细胞内并且使用完整抗体作为抑制剂，则优选内化抗体。然而，也可用脂质转染物或脂质体将抗体或抗体片段递送至细胞内。使用抗体片段时，优选与靶蛋白结合结构域特异结合的最小抑制剂片段。例如，基于抗体可变区序列，可把肽分子设计为保留与靶蛋白序列结合的能力。此类肽可以化学合成和/或用重组DNA技术产生。参见例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907889-7893(1993)。这里所述制剂也包含一种以上对于所治特定适应征而言必要的活性化合物，优选具有彼此之间无不利影响的互补活性的那些化合物。或者或另外，组合物可含有增强其功能的试剂，诸如细胞毒素剂、细胞因子、化疗剂或生长抑制剂。这些分子适宜以对所治疗目的而言有效的量联合。
也可将活性组分包封在按照例如凝聚技术或界面聚合技术制备的微胶囊中，例如，分别在胶态药物递送系统(例如脂质体，白蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳化剂中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开在Remington′s PharmaceuticalSciences，出处同上中。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过除菌滤膜过滤而轻易实现。
也可制备控释制剂。控释制剂的适当实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半通透性基质，所述基质为具有一定形状的制品，如膜或微胶囊。控释制剂实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3,773,919)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和酸酸亮丙瑞林(leuprolide)组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化的抗体长时间停留在体内时，它们会由于暴露在37℃水分下而变性或凝聚，从而导致生物活性损失，且免疫原性可能会改变。可以根据涉及的机理来设计稳定化的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成了分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、自酸性溶液中冻干、控制湿度程度、采用合适的添加剂和开发特殊的聚合物基质组合物来达到稳定化。
G应用抗-FGF-19抗体本发明抗-FGF-19抗体具有多种用途。例如，抗-FGF-19抗体可用于FGF-19的诊断分析，譬如，检测FGF-19在特定细胞、组织或血清的表达。可使用本领域已知的各种诊断分析试验，如竞争性结合试验、直接和间接夹心试验，及免疫沉淀试验。Zola，单克隆抗体技术指南，147-158页(CRCPress，Inc.1987)。还可将所述抗体标记上可检测部分。可检测部分应当能够直接或间接产生可测得信号。例如，可测得部分是放射性同位素如3H、14C、32p、35S或125I，荧光或化学发光化合物如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素，或者酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。本领域已知的将抗体与可检测部分偶联的任何方法均可使用，包括在Hunter等，Nature，144945(1962)；David等，Biochemistry，131014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.，40219(1981)；和Nygren，J.Histochem.和Cytochem.，30407(1982)中描述的方法。
抗-FGF-19抗体也适用于从重组细胞培养物或天然来源中亲和纯化FGF-19。在该过程中，使用本领域已知方法将抗FGF-19抗体固定在适当载体如Sephadex树脂或滤纸上。然后，将固定的抗体用含有欲纯化的FGF-19的样品包被，接下来用能够基本上将样品中与固定载体结合的FGF-19之外的所有物质去除的适宜溶剂洗涤载体。最后，用能从抗体中释出FGF-19的另一适宜溶剂洗涤载体。
下述实施例只是为了描述的目的而提供，并非旨在以任何方式限定本发明的保护范围。
本说明书中引证的所有专利和参考文献，以其全部在此引入作为参考。
实施例除非另外声明，否则实施例中所提到的可商购试剂，按照制造商的说明使用。在下述实施例和整个说明书中用ATCC登记号定义的细胞的来源是在美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA进行保藏。
实施例1分离编码人FGF-19的cDNA克隆EST序列登记号为AF007268的鼠成纤维细胞生长因子(FGF-15)用于检索各种公用EST数据库(如GenBank，Dayhoff等)。使用计算机程序BLAST或BLAST2[Altschul等，Methods In Enzymology，266460-480(1996)]比较EST序列6框架翻译与ECD蛋白序列来进行检索。检索结果击中GenBank ESTAA220994，后者已被鉴定为STRATAGENE NT2神经元前体937230。AA220994的序列在这里也称为DNA47412。
基于DNA47412序列，合成寡核苷酸1)以便用PCR方法识别含有目标序列的cDNA文库，和2)用作分离FGF-19全长编码序列的克隆的探针。正向和反向PCR引物一般含有20～30个核苷酸，并且常被设计成产生长度约100-1000bp的PCR产物。探针序列长度通常为40-55bp。有些情况下，当共有序列大于约1-1.5kbp时，则合成另外的寡核苷酸。为了筛选数个全长克隆的文库，按照Ausubel等在Current Protocols in Molecular Biology，出处同上中描述的方法，采用PCR扩增法用PCR引物对从文库中筛选DNA。然后，使用探针寡核苷酸和引物对之一，用阳性文库分离编码目标基因的克隆。
合成PCR引物(正向和反向)正向PCR引物5′-ATCCGCCCAGATGGCTACAATGTGTA-3′(SEQ ID N03)，和反向PCR引物5′-CCAGTCCGGTGACAAGCCCAAA-3′(SEQ ID NO4)。
另外，由具有下述核苷酸序列的DNA47412序列构建合成性寡核苷酸杂交探针杂交探针5′-GCCTCCCGGTCTCCCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCAGTGTA-3′(SEQ ID NO5)。
用于构建cDNA文库的RNA，是从人胎儿视网膜组织分离出来的。用于分离cDNA克隆的cDNA文库，可使用商购试剂采用标准方法进行构建，所述试剂如购自Invitrogen，San Diego，CA。用含有NotI位点的寡dT引导cDNA，将其钝端与SalI半激酶化衔接子连接，用NotI裂解，用凝胶电泳分出适当大小，并按规定方向克隆入适合的克隆载体中独一无二的XhoI和NotI位点(如pRKB或pRKD；pRK5B是不含SfiI位点的pRKSD前体；见Holmes等，Science，2531278-1280(1991))处。
对上述分离的克隆进行DNA测序，得到全长FGF-19多肽的全长DNA序列(本文定为DNA49435-1219[图1，SEQ ID NO1])和FGF-19多肽的衍生的蛋白序列。
上述鉴定的全长克隆含有单个开放阅读框，其在核苷酸464-466处有明显的翻译起始位点，并在核苷酸1112-1114处有终止信号(图1，SEQ ID NO1)。该预测的多肽前体长216个氨基酸，理论分子量约24003道尔顿，估计pI约6.99。示于图2(SEQ ID NO2)的全长FGF-19序列的分析证明，图2所示序列中存在多个重要的多肽结构域，其中那些重要的多肽结构域的位置与上面所述是接近的。染色体绘图证明，FGF-19-编码核酸对应于人染色体11q13.1，q13.1带。克隆DNA49435-1219已经于1997年11月21日在ATCC保藏，ATCC保藏号为209480。
Dayhoff数据库(version 35.45 SwissProt 35)分析，利用了对图2(SEQ IDNO2)所示全长序列的ALIGN-2序列对比分析，其证明FGF-19氨基酸序列和下述Dayhoff序列之间具有序列同一性AF007268_1、S54407、P_W52596、FGF2_XENLA、P_W53793、AB002097_1、P_R27966、HSU67918_1、S23595和PR_70824。
实施例2FGF-19作为杂交探针的应用下述方法描述编码FGF-19的核苷酸序列作为杂交探针的应用。
包括全长或成熟FGF-19的编码序列的DNA，用作筛选人组织cDNA文库或人组织基因组文库中同源DNA(如编码FGF-19的天然变体的那些)的探针。
在高度严格条件下进行杂交，并洗涤含有任何一个文库DNA的膜。得自FGF-19的放射标记探针与滤膜的杂交，是于42℃在下述溶液中进行的50％甲酰胺，5x SSC，0.1％SDS，0.1％焦磷酸钠，50mM磷酸钠，pH6.8，2x Denhardt′s溶液，和10％葡聚糖硫酸酯，杂交20小时。滤膜洗涤则是于42℃在0.1x SSC和0.1％SDS的水溶液中进行。
然后，使用本领域已知标准技术，可以鉴定那些相对于编码全长天然序列FGF-19的DNA具有预期序列同一性的DNA。
实施例3FGF-19在大肠杆菌中的表达该实施例描述通过在大肠杆菌中的重组表达制备未糖基化形式的FGF-19。
使用选定的PCR引物，对编码FGF-19的DNA序列进行初步扩增。引物应当含有对应于所选表达载体中限制性酶切位点的限制性内切酶位点。可使用各种表达载体。适宜载体的一个实例是pBR322(得自大肠杆菌；见Bolivar等，Gene，295(1977))，它含有氨苄青霉素和四环素抗药性基因。该载体用限制性内切酶消化并脱磷酸化。然后把PCR扩增的序列连接到该载体中。载体优选包括下列序列编码抗生素抗性基因的序列、trp启动子、多聚组氨酸前导序列(包括第一个6 STII密码子、多聚组氨酸序列和肠激酶裂解位点)、FGF-19编码区、λ转录终止子和argU基因。
接着，使用Sambrook等，出处同上描述的方法，用连接混合物转化所选大肠杆菌株。转化体通过其在LB平皿上的生长能力来鉴定，然后选出抗生素抗性菌落。分离质粒DNA，并用限制性分析和DNA测序确认。
选出的克隆可在液体培养基(如添加了抗生素的LB肉汤)中生长过夜。随后，过夜培养物用于接种更大规模的培养。然后细胞生长至所需光密度，在此期间表达启动子被打开。
培养细胞数小时后，离心收获细胞。使用本领域已知的各种试剂可以溶解离心所得细胞小团，然后，使用金属螫合柱在允许紧密结合蛋白的条件下纯化已溶解的FGF-19蛋白。
经下述操作，FGF-19可在大肠杆菌以多聚组氨酸标记形式表达。使用选定的PCR引物，初步扩增编码FGF-19的DNA。引物含有对应于所选表达载体中限制性酶切位点的限制性酶切位点和其它对于提供有效、可靠翻译起始、在金属螯合柱上快速纯化、并用肠激酶进行蛋白水解去除有用的序列。接下来，将PCR扩增的多聚组氨酸标记的序列连接到表达载体中，后者用于转化基于菌株52的大肠杆菌宿主(W3110 fuhA(tonA)Ion galErpoHts(htpRts)clpP(lacIq)。转化体首先于30℃在含有50mg/ml羧苄青霉素的LB中振荡培养，直至O.D.600达到3-5。接着，把培养物用CRAP培养基(在500mL水中混合3.57g(NH4)2SO4，0.71g柠檬酸钠·2H2O，1.07g KCI，5.36g Difco酵母提取物，5.36g Sheffield hycase SF，以及110mM MPOS、pH7.3、0.55％(w/v)葡萄糖和7mM MgSO4)稀释50-100倍，于30℃振荡培养约20-30小时。取样用SDS-PAGE分析证实表达，把大批量培养物离心成细胞团。冷冻细胞团直至纯化和重折叠(refolding)。
在10倍体积(w/v)的7M胍、20mM Tris、pH8缓冲剂中，重新悬浮得自0.5～1L发酵物(6-10g小团)的大肠杆菌糊状物。加入固体亚硫酸钠和连四硫酸钠使终浓度分别为0.1M和0.02M，在4℃搅拌溶液过夜。该步骤产生变性蛋白，后者的所有半胱氨酸残基被sulfitolization封闭。溶液在Beckman超速离心机(Ultracentifuge)上40000rpm离心30分钟。上清液用3-5倍体积的金属螯合柱缓冲液(6M胍，20mM Tris，pH7.4)稀释，并通过0.22微米滤器过滤以使上清液澄清。将澄清的提取液上样至已用金属螯合柱缓冲液平衡的5ml Qiagen Ni-NTA金属螯合柱上。用另一含有50mM咪唑(Calbiochem，Utrol grade)的pH7.4缓冲液洗柱。用含250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白。汇集含有所需蛋白的级分并于4℃贮存。利用基于蛋白氨基酸序列计算出的消光(extinction)系数，通过280nm处的吸收度估算蛋白浓度。
将样品用新鲜配制的重折叠缓冲液缓慢稀释，从而使蛋白重折叠，所述重折叠缓冲液的构成是pH8.6 20mM Tris、0.3M NaCl、2.5M尿素、5mM半胱氨酸、20mM甘氨酸和1mM EDTA。选择重折叠液的体积以使蛋白终浓度为50～100微克/ml。于4℃轻轻搅拌重折叠液12-36小时。加入TFA至终浓度为0.4％(pH约为3)来淬灭重折叠液。进一步纯化白质之前，溶液通过0.22微米滤器过滤，加入乙腈至终浓度为2-10％。在Poros R1/H反相柱上对重折叠的蛋白进行层析分析，使用的流动相缓冲液为0.1％TFA，用10～80％乙腈梯度洗脱。有A280处吸收的等份试样在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分析，收集含有均匀重折叠的蛋白的级分。通常，大多数正确重折叠的蛋白在最低乙腈浓度时洗脱下来，这是由于这些类蛋白是最紧密的，它们的疏水内部被掩蔽因而避免与反相树脂相互作用。聚集型蛋白通常在高乙腈浓度时洗脱下来。除了能将所需形式的蛋白与错误折叠的蛋白区分开来，该反相步骤还可从样品中去除内毒素。
收集含有所需折叠的FGF-19多肽的级分，用氮气流直接轻吹溶液而去除乙腈。用0.14M氯化钠和4％甘露醇经透析或通过用配制缓冲液平衡的G25 Superfine(Pharmacia)树脂进行凝胶过滤，而将蛋白配制成pH6.8的20mM Hepes溶液，并进行过滤除菌。
实施例4FGF-19在哺乳动物细胞中的表达该实施例描述通过在哺乳动物细胞中的重组表达制备潜在糖基化形式的FGF-19。
载体pRK5(见EP 307247，
公开日为1989年3月15日)用作表达载体。任选地，使用诸如Sambrook等，出处同上中描述的连接方法，将FGF-19DNA连接至具有选定的限制酶的pRK5中，所述限制酶允许插入FGF-19DNA。由此产生的载体称为pRK5-FGF-19。
在一实施方案中，所选宿主细胞是293细胞。人293细胞(ATCC CCL1573)在组织培养板上的培养基中生长至融合，所述培养基如添加了胎牛血清和任选的营养成分和/或抗生素的DMEM。约10μg pRK5-FGF-19DNA与约1μg编码VA RNA基因[Thimmappaya等，Cell，31543(1982)]的DNA混合，溶于500μl 1mM Tris-HCI、0.1mM EDTA、0.227M CaCl2中。向该混合物中滴加500μl 50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCI、1.5mM NaPO4，25℃10分钟形成沉淀。悬浮该沉淀物，加入293细胞，37℃静置约4小时。吸出培养基，用30秒的时间加入20％甘油的PBS溶液2ml。然后用不含血清培养基洗涤293细胞，加入新鲜培养基，保温细胞约5天。
转染后约24小时，弃除培养基，代之以培养基(单独)或含有200μCi/ml35S-半胱氨酸和200μCi/ml35S-蛋氨酸的培养基。保温12小时后，收集条件培养液，在旋转滤器上浓缩，上样至15％SDS凝胶上。电泳后使凝胶干燥，并于胶片上曝光一段时间，从而揭示FGF-19多肽的存在。可进一步温育含有转染型细胞的培养物(在无血清培养基中)，在所选择的生物鉴定法中检测培养物。
在另一技术中，使用Somparyrac等在Proc.Natl.Acad.Sci.，127575(1981)中描述的硫酸葡聚糖法，可将FGF-19瞬时引入293细胞。293细胞在旋转烧瓶中生长至最大密度，加入700μg pRK5-FGF-19DNA。采自旋转烧瓶的细胞通过离心进行第一次浓缩，用PBS洗涤。在细胞小团上将DNA-葡聚糖沉淀物温育4小时。细胞用20％甘油处理90秒，用组织培养基洗涤，再次装入含有组织培养基，5μg/ml牛胰岛素和0.1μg/ml牛运铁蛋白的旋转烧瓶中。约4天后，离心该调整的培养液，过滤去除细胞和碎片。然后，含有表达的FGF-19的样品可用任何所选择的方法，如透析和/或柱层析进行浓缩和纯化。
在另一实施方案中，FGF-19可在CHO细胞中表达。使用已知试剂如CaPO4或DEAE葡聚糖，可将pRK5-FGF19转染入CHO细胞。如上所述，温育细胞培养物，培养基用培养基(单独)或含有放射标记物如35S-蛋氨酸的培养基替换。测定了FGF-19多肽的存在后，可用无血清培养基替换该培养基。优选地，培养物温育约6天后，收获调整的培养液。接着，用任何选择的方法浓缩并纯化该含有表达的FGF-19的培养液。
也可在宿主CHO细胞中表达表位-标记的FGF-19。FGF-19可以从pRK5载体中亚克隆出来。可对该亚克隆插入物进行PCR，使之与选择的表位标记如多聚组氨酸-标记融合在杆状病毒表达载体上的同一读码框中。接着，可将多聚组氨酸标记的FGF-19插入物亚克隆入含有选择标志(如用于选择稳定克隆的DHFR)的SV40驱动型载体中。最后，用该SV40驱动型载体转染CHO细胞(如上所述)。可按上述进行标记，以证实表达。然后，用任何选择的方法，如用Ni2+-蝥合剂亲和层析法，可以浓缩并纯化含有已表达的多聚组氨酸标记的FGF-19的培养基。
还可通过瞬时表达方法在CHO和/或COS细胞中表达FGF-19，或通过另一稳定表达方法在CHO细胞中表达FGF-19。
在CHO细胞中的稳定表达可使用如下方法。将蛋白表达为IgG构建体(免疫粘附素)，其中编码每种蛋白的可溶形式(例如细胞外结构域)的序列与IgG1恒定区序列融合，所述IgG1恒定区包括铰链区、CH2区和CH2区和/或为多聚组氨酸标记的形式。
PCR扩增后，使用Ausubel等在Current Protocols of Molecular Biology.Unit 3.16，John Wiley和Sons(1997)中所述标准技术，将各个DNA亚克隆入CHO表达载体中。构建CHO表达载体，使其具有目标DNA的5′和3′相容性限制酶切位点，以便于cDNA的往返穿梭。在CHO细胞中使用载体的表达在Lucas等，Nucl.Acids Res.249(1774-1779(1996)中有描述，并且使用SV40早期启动子/增强子来驱动目标cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR表达允许选择转染后维持稳定的质粒。
使用商购转染试剂Superfect(Quiagen)、Dosper或Fugene(Boehringer Mannheim)，将12微克所需质粒DNA引入约1千万个CHO细胞。按Lucas等，出处同上所述方法培养细胞。在每一安瓿中冷冻约3×107个细胞以备如下所述进一步生长和增殖。
把含有质粒DNA的安瓿放入水浴中解冻并涡旋混合。用移液管将内容物移入盛有10mL培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟。吸出上清液，用10mL选择性培养基(0.2μm过滤的PS20和5％0.2μm渗滤的胎牛血清)悬浮细胞。然后将细胞等分至含有90mL选择性培养基的100mL旋转器中。1-2天后，将细胞转移至盛有150mL选择性生长培养基的250mL旋转器中，并于37℃温育。再过2-3天，在250mL、500mL和2000mL旋转器中接种3×105细胞/mL。离心后用新鲜培养基替换细胞培养基，在生产培养基中重悬浮。尽管可以使用任何适宜的CHO培养基，但是实际使用的是1992年1月16日颁布的美国专利5122469中所述生产培养基。3L生产旋转器中接种1.2×106细胞/mL。在0天，测定细胞数pHie。第1天，从旋转器取样，开始喷雾过滤的空气。第2天，从旋转器中取样，温度调至33℃，加500g/L葡萄糖30mL和10％止泡剂0.6mL(例如35％聚二甲基硅氧烷乳液，DowCorning 365 Medical Grade Emulsion)。整个生产过程中，必要时调整pH使之保持在7.2左右。10天后，或直至活力降至70％以下时，离心收获细胞培养物并通过0.22μm滤膜过滤。滤出液贮于4℃或立即上柱纯化。
对于多聚组氨酸标记的构建体，使用Ni-NTA柱(Qiagen)纯化蛋白。纯化前，向调整的培养液中加入咪唑至浓度为5mM。于4℃，将该调整的培养液以4-5ml/min速度泵到6ml Ni-NTA柱上，后者已用含0.3M NaCl和5mM咪唑的缓冲液20mM Hepes、pH7.4平衡。装柱后，用另外的平衡缓冲液洗柱，用含有0.25M咪唑的平衡缓冲液洗脱蛋白。随后，用25ml G25Superfine(Pharmacia)柱使高度纯化的蛋白脱盐至含有10mM Hepes、0.14MNaCl和4％甘露醇pH6.8的贮藏缓冲液中，并贮于-80C。
按照下述步骤，从调整的培养液中纯化免疫粘附素(含Fc)构建体。将调整的培养液泵入5ml蛋白A柱(Pharmacia)，后者已经用pH6.8的20mM磷酸钠缓冲液平衡。装柱后，在用pH3.5 100mM柠檬酸洗脱前，先用平衡液彻底洗柱。通过将1ml级分集中到含有275μL pH9 1M Tris缓冲液的试管中，而将洗脱的蛋白立即中和。接着，按照前面针对poly-his标记的蛋白的描述将高度纯化的蛋白脱盐至贮存缓冲液中。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和用Edman降解技术进行N末端氨基酸测序，来测定同质性。
实施例5FGF-19在酵母中的表达下述方法方法描述FGF-19在酵母中的重组表达。
首先，构建酵母表达载体，以使FGF-19受ADH2/GAPDH启动子的驱动而在细胞内产生或分泌。将编码FGF-19的DNA和启动子插入所选质粒的适宜限制性酶切位点，以引导FGF-19的细胞内表达。为了分泌FGF-19，可将编码FGF-19的DNA克隆入所选质粒中，与DNA一起插入的还有编码ADH2/GAPDH启动子的DNA、天然FGF-19信号肽或哺乳动物其它信号肽，或者例如酵母α-因子或转化酶分泌信号/前导序列以及连接序列(如果需要)以使FGF-19表达。
然后，可用上述表达质粒转化酵母细胞如酵母株AB 110，并在选择的发酵培养基中培养。通过用10％三氯醋酸沉淀和用SDS-PAGE分离，接着用考马斯蓝染色凝胶，可以检测转化酵母的上清液。
随后，经离心而从发酵培养基中除去酵母细胞，接着使用选择的柱式滤器浓缩培养基，由此而分离和纯化重组FGF-19。使用选择的柱层析树脂，可以进一步纯化含FGF-19的浓缩物。
实施例6FGF-19在杆状病毒-感染的昆虫细胞中的表达下述方法描述重组FGF-19在杆状病毒-感染的昆虫细胞中的表达。
FGF-19的编码序列融合在杆状病毒表达载体所含的表位标记的上游。这类表位标记包括多聚组氨酸标记和免疫球蛋白标记(如IgG的Fc区)。可使用各种质粒，包括商购质粒如pVL1393(Novagen)。简言之，使用与5′和3′区互补的引物经PCR扩增FGF-19的编码序列或FGF-19编码序列的所需部分如编码跨膜蛋白细胞外结构域的序列或如果蛋白是胞外蛋白，编码成熟蛋白的序列。5′引物可添加侧翼(选择的)限制性酶切位点。然后用那些选择的限制性内切酶消化产物并亚克隆入表达载体中。
重组杆状病毒是这样产生的使用脂质转染试剂(购自GIBCO-BRL)，将上述质粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)共-转染入草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(″Sf9″)细胞(ATCC CRL 1711)中。28℃温育4-5天后，收获释放出的病毒，用于进一步扩增。病毒性感染和蛋白表达按照O′Reilley等在Baculovirus Express VectorsA Laboratory Manual，OxfordOxfordUniversity Press(1994)中的描述进行。
接下来，可纯化表达的多聚组氨酸标记的FGF-19，例如，通过如下Ni2+-螯合亲和层析法进行。重组病毒-感染的Sf9细胞的提取物的制备，按照Rupert等在Nature，362175-179(1993)中所述方法进行。简要讲，洗涤Sf9细胞，在超声缓冲液(25mL Hepes，pH7.9；12.5mM MgCl2；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4M KCl)中重悬浮，冰浴中超声2次，各20秒钟。离心清除超声后的产物，上清液用填充缓冲液(50mM磷酸盐，300mM NaCl，10％甘油，pH7.8)50倍稀释，经0.45μm滤器过滤。制备Ni2+-NTA琼脂糖柱(购自Qiagen)，床体积5mL，用25mL水洗涤，用25mL填充缓冲液平衡。以每分钟0.5mL的速度将已过滤的细胞提取液上柱，用填充缓冲液洗柱至A280基线，在此点开始收集级分。接着，用第二洗涤缓冲液(50mM磷酸盐；300mM NaCl，10％甘油，pH6.0)洗柱，此过程洗脱出非特异结合的蛋白。重又达到A280基线后，用第二洗涤缓冲液中0～500mM的咪唑梯度洗柱。收集1mL级分，用SDS-PAGE和银染色或用碱性磷酸酶(Qiagen)偶联型Ni2+-NTA进行Western印迹，进行分析。汇总含洗脱的组氨酸10-标记的FGF-19的级分，针对填充缓冲液透析。
或者，使用已知层析技术，包括例如蛋白A或蛋白G柱层析法，对IgG标记(或Fc标记)的FGF-19进行纯化。
实施例7制备结合FGF-19的抗体该实施例描述能够与FGF-19特异结合的单克隆抗体的制备。
生产单克隆抗体的技术为本领域技术人员所已知，并在例如Goding，出出处同上中有描述。可以使用的免疫原包括纯化的FGF-19、含有FGF-19的融合蛋白，和在细胞表面表达重组FGF-19的细胞。无需繁琐实验，本领域熟练技术人员就可对免疫原作出选择。
小鼠如Balb/c经皮下或腹膜内注射1-100微克在完全Freund′s佐剂中乳化的FGF-19免疫原来免疫。或者，免疫原在MPL-TDM佐剂(RibiImmunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化，注射入动物的后足垫。10～12天后，再次用在所选佐剂中乳化的免疫原对免疫后的鼠进行加强免疫。此后数周，还可增加免疫注射而对小鼠加强免疫。经后-眼眶放血方式定期采集小鼠血清样品，进行ELISA分析，以检测抗-FGF-19的抗体。
已经检测到适宜的抗体滴度后，对抗体“阳性”动物最后一次静脉注射FGF-19。3或4天后，处死小鼠，取其脾细胞。然后将脾细胞与所选鼠骨髓瘤细胞系(如P3×63 AgU.1，得自ATCC CRL 1597号)融合(使用35％聚乙二醇)。将融合产生的杂交瘤细胞接种到96孔组织培养板上，所述培养板上含有HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷)培养基以抑制非-融合细胞、骨髓杂合体和脾细胞杂合体的增殖。
根据ELISA中的抗FGG-19活性来筛选杂交瘤细胞。筛选能分泌所需抗FGF1-19单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞的测定，是本领域常识。
可给同系Balb/c小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞，以产生含有抗-FGF-19单克隆抗体的腹水。或者，使杂交瘤细胞在组织培养烧瓶或滚瓶中生长。使用硫酸铵沉淀，继之用凝胶排阻层析法，可以完成对腹水中产生的单克隆抗体的纯化。或者，使用基于抗体与蛋白A或蛋白G的结合的亲和层析法。
实施例8使用特异抗体纯化FGF-19多肽可使用蛋白纯化领域的各种标准技术，进行天然或重组FGF-19多肽的纯化。譬如，使用目的FGF-19多肽的特异性抗体的免疫亲和层析法可纯化原-FGF-19多肽、成熟FGF-19多肽或前-FGF-19多肽。总体上讲，免疫亲和柱是通过将抗-FGF-19多肽的抗体与活化的层析树脂共价偶联而构建的。
使用硫酸铵沉淀或者通过在固相化蛋白A(Pharmacia LKBBiotechnology，Piscataway，N.J.)上的纯化，可以从免疫血清制备多克隆免疫球蛋白。同样地，用硫酸铵沉淀或在固相化蛋白A上的层析，可从小鼠腹水中制备单克隆抗体。将部分纯化的免疫球蛋白共价附着于层析树脂如CnBr-活化的SEPHAROSETM(Pharmacia LKB Biotechnology)。抗体与树脂共价偶联，从而封闭树脂，按照制造商的指示洗脱所产生的树脂。
通过制备含有可溶性FGF-19多肽的细胞级分，可在FGF-19多肽的纯化中使用此免疫亲和柱。该制备通过溶解经加入去污剂的差异离心或使用本领域公知方法获得的完整细胞或亚细胞级分而实现。或者，含有信号序列的可溶性FGF-19多肽可以以有效量分泌到细胞生长所在的培养基中。
使含有可溶性FGF-19多肽的制剂流经免疫亲和柱，在使得优先吸收FGF-19多肽的条件下(例如，存在去污剂时的高离子强度缓冲液)洗柱。然后，在使抗体/FGF-19多肽的结合分裂的条件下(例如，低pH缓冲液如pH约2-3，或高浓度离液剂如尿素或硫氰酸盐离子)洗脱，并收集FGF-19多肽。
实施例9药物筛选通过在多种药物筛选技术中使用FGF-19多肽或其结合片段，本发明对于筛选化合物特别有用。这类检测所用FGF-19多肽或片段可以是溶液中的游离形式，也可以是固定在固体载体上、产生于细胞表面或位于细胞内。药物筛选方法之一是利用已被表达FGF-19多肽或片段的重组核酸稳定转化的真核或原核宿主细胞。在竞争性结合试验中筛选抗此类转化细胞的药物。活细胞或是固定形式的此类细胞，无论为有活性的或已固定的，均可用于标准结合试验。可以测定例如FGF-19多肽或其片段与被测试剂之间的复合物的形成。或者，可以检验由被测试剂造成的FGF-19多肽与其靶细胞或靶受体之间复合物形成的减少。
因此，本发明提供筛选药物或任何其它可影响FGF-19多肽-相关疾病或病症的试剂的方法。这些方法包括将这类试剂与FGF-19多肽或其片段接触，并使用本领域熟知方法分析(I)该试剂与FGF-19多肽或片段之间复合物的存在，或(ii)FGF-19多肽或片段与细胞之间的复合物的存在。在此类竞争性结合试验中，FGF-19多肽或片段通常被标记。适宜温育之后，游离FGF-19多肽或片段与结合形式FGF-19多肽或片段分开，游离或未形成复合物的标记物的量，可以衡量特定试剂与FGF-19多肽的结合能力或者对FGF19多肽/细胞复合物的阻碍能力。
用于药物筛选的另一技术提供高效率筛选具有针对多肽的适宜结合亲和力的化合物，详细描述见1984年9月13日公开的WO 84/03564中。简要讲，在固体基底(如塑料钉或其它表面)上合成大量不同的小肽检试化合物。如用于FGF-19多肽的那样，将肽检试化合物与FGF-19多肽反应并洗涤。用本领域熟知方法检测结合的FGF-19多肽。也可将纯化的FGF-19多肽直接包被在前述药物筛选技术所用的板上。此外，非-中和抗体可用于捕获所述肽并将所述肽固定在固体载体上。
本发明也考虑了使用竞争性药物筛选试验，在所述试验中，能够与FGF-19多肽特异性结合的中和抗体与被测化合物竞争地同FGF-19多肽或其片段结合。以这种方式，抗体可用于检测与FGF-19多肽具有一个或多个相同表位的任何肽的存在。
实施例10合理的药物设计合理药物设计的目标是生产目标生物活性多肽(即FGF-19多肽)的结构类似物或与多肽相互作用的小分子例如激动剂、拮抗剂或抑制剂。其中任何实例可用于形成药物，所述药物是更具活性或更稳定形式的FGF-19多肽，或者药物增强或干扰FGF-19多肽体内功能(参见Hodgson，Bio/Technologv，919-21(1991))。
在一种方法中，用x-射线晶体照相术、计算机模型设计或者最通常这二者的结合，来测定FGF-19多肽或FGF-19多肽-抑制剂复合物的三维结构。为描述结构和测定分子的活性位点，必须确定FGF-19多肽的形状和电荷。不常用的方法是，通过基于同源蛋白结构的模型，来获取关于FGF-19多肽结构的有用信息。两种情况均使用相关的结构信息来设计类似的FGF-19多肽样分子或用于鉴定有效抑制剂。合理药物设计的有用实例包括Braxton和Wells，Biochemistrv，317796-7801(1992)所证实的具有改进活性或稳定性的分子，或者Athauda等，J.Biochem.，113742-746(1993)所述作为天然肽的抑制剂、激动剂或拮抗剂的分子。
还有一种可能是分离靶特异抗体，通过如上所述的功能分析进行筛选，然后解决其晶体结构。大体而言，这种途径产生药物母核(pharmacore)，可基于该母核设计药物。通过产生针对功能性、药理活性抗体的抗-独特型抗体(抗-独特型)，可完全绕开蛋白晶体构象。作为镜象的镜象，预计抗-独特型抗体的结合位点是原始受体的类似物。因此，抗-独特型抗体可用于从化学或生物学产生的肽库中鉴定和分离肽。随后，分离的肽可用作药物母核。
本发明可提供足够量的FGF-19多肽来完成诸如X-线晶体照相术此类的分析研究。另外，本文提供的FGF-19多肽氨基酸序列的信息，将对那些使用计算机模型技术代替x-射线晶体照相术或除使用x-射线晶体照相术之外还使用计算机模型技术的人员提供指导。
实施例11FGF-19转基因鼠的体重、Leptin水平、摄食量、排尿量、耗氧量以及甘油三酯和游离脂肪酸水平的研究如上所述，FGF-19最近被确定为与成纤维细胞生长因子有关的分泌蛋白生长因子家族中的一员。本文中FGF-19的特征是与FGF受体4相互作用但不表现为促分裂原。为进一步研究该蛋白的功能，生产了表达人FGF-19的转基因鼠。
更具体而言，将编码人FGF-19的cDNA克隆入含有肌球蛋白轻链启动子的质粒中。该启动子足以使该转基因发生肌肉特异性转录。FGF-19cDNA的5′端也包括剪接受体和供体以增加表达水平，FGF-19cDNA的3′端包括剪接供体和剪接受体以及多聚腺苷酸附加信号，以增加转录水平和提供转录终止位点。
使用适宜的限制性内切酶，从细菌载体序列中释放出包括MLC启动子、5′剪接受体和供体、FGF-19cDNA，3′剪接受体和供体以及转录终止位点的DNA(转基因)，随后在琼脂糖凝胶上通过分级分离而纯化。纯化的DNA注射入受精鼠卵的一个原核中，产生转基因鼠，并按文献所述方法进行鉴定(Genetic Modification of Animals；Tim Stewart；In Exploring GeneticMechanisms第565-598页；1997年M Singer和P Berg编著；University ScienceBooks；Sausalito，Calif)。小鼠长至6周龄后如下测量水摄取、食物消耗、排尿量和血细胞比容。相同小鼠长至8周龄后测量leptin、甘油三酯和游离脂肪酸。
由下述结果讨论所见，这些鼠的耗氧率表明其食物摄取和代谢率增加。尽管摄食增加，但是这些鼠的体重较其它未转基因同窝鼠的体重显著减少。体重降低似乎是肥胖症减轻的结果，因为leptin与人和啮齿动物的脂肪组织的量密切相关，而leptin在转基因鼠中是减少的。为更进一步支持这一点，从鼻子到臀部的长度测量评定表明，转基因鼠呈常态线性增长。至于体温、身长(骨长)和血液学检测值，这些动物均正常。与增加摄食一致的是，转基因鼠的排尿量增加。由于这些鼠并没有表现出饮用更多水，而且经正常血细胞比容测定证实也没有表现脱水，那么增加的排尿量可能是源自对增加的摄食的代谢。由于FGF-19减少肥胖而不改变肌肉质量或长骨形成，所以表明FGF-19是肥胖和相关病症治疗中的有效治疗剂。
更具体地，在不同禁食和摄食条件下，在各种时间点称量MLC-FGF-19转基因鼠的体重。特别是，6周龄时对各组雌性FGF-19转基因鼠和其非-转基因同窝鼠，在随意进食、禁食6小时和24小时以及结束24小时禁食后24小时时进行称重。如图3A所示，所有条件下，FGF-19转基因鼠(实心棒)体重低于其野生型、未转基因同窝鼠(点彩棒)。
图3B显示对图3A所示同组鼠的血清中leptin的分析。FGF-19转基因小鼠中降低的leptin与其由于肥胖症减轻而致的体重减轻(图3A)是一致的。
监测一组6周龄转基因鼠的摄食(图4A)、摄水(图4B)、排尿(图4C)和血细胞比容(图4D)情况。如图所见，FGF-19转基因鼠(实心棒)较野生型同窝鼠消耗更多食物，但摄水量并不增加。尽管水消耗量没有变化，但是转基因鼠产尿量增加(图4C)。尽管产尿量增加，但是通过正常血细胞比容可以证明转基因鼠并未出现脱水(图4D)。
可以用代谢速率增加来解释体重下降(图3)伴有食物消耗增加(图4)。通过测定耗氧量来测定代谢速率。如图5所示，在禁食24小时和在结束24小时禁食后24小时的明、暗光周期中，FGF-19转基因鼠的代谢速率均见增加。
肥胖和甘油三酯与游离脂肪酸的升高是心血管疾病的危险因素。由于FGF-19减少心血管疾病危险因素中的一个因素(肥胖(图3))，因此，对于FGF-19是否也降低其它危险因素也进行了研究。如图6所见，FGF-19转基因鼠中甘油三酯和游离脂肪酸(FFA)水平也下降。
实施例12FGF-19输注导致食物摄取增加和耗氧量增加为了证实在FGF-19转基因鼠所见到的效果是由FGF-19蛋白引起，通过渗透压驱动型植入泵给药方式，给各组非-转基因FvB鼠输入重组FGF-19(1mg/kg/日，静脉)。如图7A-B所示，与单纯输入载液的鼠相比，施用重组人FGF-19引起摄食增加。而且，耗氧量测定显示FGF-19输入还导致代谢速率增加。
实施例13FGF-19 降低葡萄糖摄取和增加Leptin自脂肪细胞释放为进一步研究FGF-19改变代谢的机制，将重组人FGF-19加入到大鼠脂肪细胞原代培养中，并检测葡萄糖摄取和leptin自这些细胞释放的情况。如图8A、B所示，FGF-19增加原代大鼠脂肪细胞中leptin的释放，并减少葡萄糖摄入。
实施例14高脂饮食FGF-19转基因鼠的葡萄糖耐量和脂肪垫重量的研究通常，高脂饮食的鼠(和人)体重将会增加并变得肥胖，而且葡萄糖耐量下降或者患上糖尿病。为了检验接受FGF-19是否对肥胖和葡萄糖耐量有影响，基本上按照Rebuffe-Scrive等在Metabolism 1993年第42卷第11期第405-1409页和Surwit等在Metabolism 1995年第44卷第5期第645-651页中描述的方法，只是将钠含量改变为符合正常饮食标准(饮食来自ResearchDiets Inc.Catalog no.D12330N)，使一群转基因小鼠和其未转基因的同窝鼠(鼠龄和性别相当)进食高脂饮食。
正常鼠粮或高脂饮食喂养10周后，小鼠(雌性转基因鼠和其未转基因同窝鼠)接受葡萄糖耐量测试。这样每只鼠腹腔内注射1.0mg葡萄糖/kg体重，注射后，按照一定时间间隔测定血液中葡萄糖浓度。图10中的曲线显示鼠体内葡萄糖水平，证明8/9的进食高脂饮食的雌性未转基因鼠被确定为糖尿病(2小时葡萄糖水平大于200mg/dl；(World Book of Diabetes in Practice.Vo]3；Ed Krall，L.P.；Elsevier))，而0/5的进食相同饮食的转基因鼠患糖尿病。
高脂饮食喂食雄性鼠6或10周后处死动物，通过测量特定脂肪积存的重量来测定肥胖程度。如图9所示，进食高脂饮食的转基因鼠较未转基因同窝鼠具有显著少的脂肪。
材料保藏下述材料已经在美国典型培养物保藏中心(the American Type CultureCollection，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA)(ATCC)保藏材料ATCC保藏号保藏日DNA49435-1219 209480 1997.11.21该保藏是按照国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约及其章程(布达佩斯条约)进行的。这确保自保藏日起30年的时间内保藏培养物保持存活。这使得通过ATCC可以获得在布达佩斯条约期限内的保藏物，并服从Genentech，Inc.与ATCC之间的协议，后者确保公众基于颁布的相关美国专利或者基于对任何美国或外国专利申请者开放，而可以永久性和无限制利用保藏培养物的传代物，无论哪一个先来，根据美国专利商标委员会35 USC 122和所依据的委员会规则(包括37 CFR 1.14，特别参见886 OG 638)规定授予的权利，确保个体得到传代培养物。
本申请的委托人已经同意，如果保藏培养物材料在适宜条件下培养过程中死亡或丢失或遭到破坏，应当在接到通知后迅速用另一相同材料替换保藏材料。按照专利法的规定，保藏材料的可获得性，不得解释为是对违背任何政府当局所赋予权利而实施发明的许可。
前面撰写的说明书已经足以能够使本领域技术人员实施本发明。本发明不受保藏构建体范围的限制，因为保藏方案旨在作为本发明一个特定方面的说明，具有等同功能的任何构建体也包括在本发明范围之内。本文的保藏材料既不构成准许本书面说明书所包含的不足以使本发明任何方面(包括其最佳模式)实施的内容的加入，也不解释为将权利要求的保护范围限定为特定的例证说明。事实上，除了本文所示和所述之外，对前面所描述的本发明进行各种变改，对于本领域技术人员而言是显而易见的，并落入本发明的保护范围。
序列表<110>杰南技术公司(Genentech，Inc.)Stewart，Timothy A.
Tomlinson，Elizabeth<120>成纤维细胞生长因子-19(FGF-19)的核酸和多肽以及用于治疗肥胖的方法<130>P1219P1PCT<140>PCT/US00/06471<141>2000-03-09<150>PCT/US99/20594<151>1999-09-08<150>PCT/US99/21090<151>1999-09-15<150>PCT/US99/30999<151>1999-12-20<150>PCT/US00/04414<151>2000-02-22<160>5<210>1<211>2137<212>DNA<213>人(Homo Sapien)<400>1gctcccagcc aagaacctcg gggccgctgc gcggtgggga ggagttcccc 50gaaacccggc cgctaagcga ggcctcctcc tcccgcagat ccgaacggcc 100tgggcggggt caccccggct gggacaagaa gccgccgcct gcctgcccgg 150gcccggggag ggggctgggg ctggggccgg aggcggggtg tgagtgggtg 200tgtgcggggg gcggaggctt gatgcaatcc cgataagaaa tgctcgggtg 250tcttgggcac ctacccgtgg ggcccgtaag gcgctactat ataaggctgc 300cggcccggag ccgccgcgcc gtcagagcag gagcgctgcg tccaggatct 350agggccacga ccatcccaac ccggcactca cagccccgca gcgcatcccg 400gtcgccgccc agcctcccgc acccccatcg ccggagctgc gccgagagcc 450
ccagggaggt gccatgcgga gcgggtgtgt ggtggtccac gtatggatcc 500tggccggcct ctggctggcc gtggccgggc gccccctcgc cttctcggac 550gcggggcccc acgtgcacta cggctggggc gaccccatcc gcctgcggca 600cctgtacacc tccggccccc acgggctctc cagctgcttc ctgcgcatcc 650gtgccgacgg cgtcgtggac tgcgcgcggg gccagagcgc gcacagtttg 700ctggagatca aggcagtcgc tctgcggacc gtggccatca agggcgtgca 750cagcgtgcgg tacctctgca tgggcgccga cggcaagatg caggggctgc 800ttcagtactc ggaggaagac tgtgctttcg aggaggagat ccgcccagat 850ggctacaatg tgtaccgatc cgagaagcac cgcctcccgg tctccctgag 900cagtgccaaa cagcggcagc tgtacaagaa cagaggcttt cttccactct 950ctcatttcct gcccatgctg cccatggtcc cagaggagcc tgaggacctc 1000aggggccact tggaatctga catgttctct tcgcccctgg agaccgacag 1050catggaccca tttgggcttg tcaccggact ggaggccgtg aggagtccca 1100gctttgagaa gtaactgaga ccatgcccgg gcctcttcac tgctgccagg 1150ggctgtggta cctgcagcgt gggggacgtg cttctacaag aacagtcctg 1200agtccacgtt ctgtttagct ttaggaagaa acatctagaa gttgtacata 1250ttcagagttt tccattggca gtgccagttt ctagccaata gacttgtctg 1300atcataacat tgtaagcctg tagcttgccc agctgctgcc tgggccccca 1350ttctgctccc tcgaggttgc tggacaagct gctgcactgt ctcagttctg 1400cttgaatacc tccatcgatg gggaactcac ttcctttgga aaaattctta 1450tgtcaagctg aaattctcta attttttctc atcacttccc caggagcagc 1500cagaagacag gcagtagttt taatttcagg aacaggtgat ccactctgta 1550aaacagcagg taaatttcac tcaaccccat gtgggaattg atctatatct 1600ctacttccag ggaccatttg cccttcccaa atccctccag gccagaactg 1650actggagcag gcatggccca ccaggcttca ggagtagggg aagcctggag 1700ccccactcca gccctgggac aacttgagaa ttccccctga ggccagttct 1750
gtcatggatg ctgtcctgag aataacttgc tgtcccggtg tcacctgctt 1800ccatctccca gcccaccagc cctctgccca cctcacatgc ctccccatgg 1850attggggcct cccaggcccc ccaccttatg tcaacctgca cttcttgttc 1900aaaaatcagg aaaagaaaag atttgaagac cccaagtctt gtcaataact 1950tgctgtgtgg aagcagcggg ggaagaccta gaaccctttc cccagcactt 2000ggttttccaa catgatattt atgagtaatt tattttgata tgtacatctc 2050ttattttctt acattattta tgcccccaaa ttatatttat gtatgtaagt 2100gaggtttgtt ttgtatatta aaatggagtt tgtttgt 2137<210>2<211>216<212>PRT<213>人(Homo Sapien)<400>2Met Arg Ser Gly Cys Val Val Val His Val Trp Ile Leu Ala Gly1 5 10 15Leu Trp Leu Ala Val Ala Gly Arg Pro Leu Ala Phe Ser Asp Ala20 25 30Gly Pro His Val His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Arg35 40 45His Leu Tyr Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu50 55 60Arg Ile Arg Ala Asp Gly Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln Ser65 70 75Ala His Ser Leu Leu Glu Ile Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val80 85 90Ala Ile Lys Gly Val His Ser Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala95 100 105Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu Leu Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys110 115 120Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Arg125 130 135Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser Leu Ser Ser Ala Lys Gln
140 145 150Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro Leu Ser His Phe155 160 165Leu Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro Glu Asp Leu Arg170 175 180Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu Glu Thr Asp185 190 195Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg200 205 210Set Pro Ser Phe Glu Lys215<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工合成的寡核苷酸探针<400>3atccgcccag atggctacaa tgtgta 26<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工合成的寡核苷酸探针<400>4ccagtccggt gacaagccca aa 22<210>5<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工合成的寡核苷酸探针<400>5gcctcccggt ctccctgagc agtgccaaac agcggcagtg ta 4
权利要求
1.分离的核酸分子，其包括与(a)1997年11月21日在ATCC保藏的ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)的人蛋白cDNA的全长多肽编码序列的DNA分子，或者(b)(a)所述编码序列的互补链，具有至少约80％序列同一性的DNA。
2.权利要求1所述分离的核酸分子，其包括1997年11月21日在ATCC保藏的ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)的人蛋白cDNA的全长多肽编码序列。
3.编码FGF-19多肽的分离的核酸分子，其包括能与编码图2(SEQ IDNO2)中1或约23至约216位氨基酸的核酸序列的互补链杂交的DNA。
4.权利要求3所述分离的核酸分子，其中编码图2(SEQ ID NO2)中1或约23至约216位氨基酸的核酸包括图1(SEQ ID NO1)所示464或约530至约1111位的核苷酸。
5.权利要求3所述分离的核酸分子，其中杂交发生在严格杂交和洗涤条件下。
6.分离的核酸分子，其含有(a)编码与图2(SEQ ID NO2)中从1或约23至约216氨基酸残基的序列相比时，阳性评分至少80％的多肽的DNA，或(b)(a)所述DNA的互补链。
7.含有至少约22个核苷酸的分离的核酸分子，其如下产生在严格杂交条件下，使测试DNA分子与(a)编码含有图2(SEQ ID NO2)中从1或约23至约216氨基酸残基序列的FGF-19多肽的DNA分子，或(b)(a)所述DNA分子的互补链进行杂交，并分离该测试DNA分子。
8.权利要求7所述分离的核酸分子，其与(a)或(b)具有至少约80％的序列同一性。
9.分离的核酸分子，其包含与(a)编码FGF-19多肽的DNA分子，所述多肽包括图2(SEQ ID NO2)中约1或约23至约216位氨基酸残基的序列，或(b)(a)所述DNA分子的互补链，具有至少约80％序列同一性的DNA。
10.权利要求9所述分离的核酸分子，包括图1(SEQ ID NO1)中约464或约530至约1111位的核苷酸序列。
11.权利要求9所述分离的核酸分子，包括图1(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列。
12.权利要求9所述分离的核酸分子，包括编码图2(SEQ ID NO2)中约1或约23至约216位氨基酸残基的序列的核苷酸序列。
13.分离的核酸分子，其包括与(a)编码由1997年11月21日在ATCC保藏的ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)的人蛋白cDNA所编码的相同成熟多肽的DNA分子，或者(b)(a)所述DNA分子的互补链，具有至少约80％序列同一性的DNA。
14.权利要求13所述分离的核酸分子，其包括编码由1997年11月21日在ATCC保藏的ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)的人蛋白cDNA所编码的相同成熟多肽的DNA。
15.含有权利要求1至14中任一核酸分子的载体。
16.权利要求15所述载体，其中所述核酸分子与能被用该载体转化了的宿主细胞识别的控制序列可操作相连。
17.以ATCC登记号209480(DNA49435-1219)保藏的核酸分子。
18.含有权利要求15所述载体的宿主细胞。
19.权利要求18所述宿主细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
20.权利要求18所述宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌。
21.权利要求18所述宿主细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
22.制备FGF-19多肽的方法，包括在适宜表达所述FGF-19多肽的条件下培养权利要求18所述宿主细胞，并从细胞培养物中回收所述FGF-19多肽。
23.分离的FGF-19多肽，包括与图2(SEQ ID NO2)中从1或约23至约216位氨基酸残基的序列至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
24.权利要求23所述分离的FGF-19多肽，其含有图2(SEQ ID NO2)中从1或约23至约216位的氨基酸残基。
25.分离的FGF-19多肽，其与1997年11月21日在ATCC以ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)保藏的载体中的cDNA插入子所编码的多肽具有至少约80％的序列同一性。
26.权利要求25所述分离的FGF-19多肽，其是由1 997年11月21日在ATCC以ATCC保藏号为209480(DNA49435-1219)保藏的载体中的cDNA插入子编码的。
27.分离的FGF-19多肽，当与图2(SEQ ID NO2)中1或约23至约216位的氨基酸序列比较时，其具有至少80％的阳性评分。
28.分离的FGF-19多肽，其含有足以提供抗-FGF-19抗体结合位点的图2(SEQ ID NO2)中1或约23至约216位氨基酸残基的序列或其片段。
29.分离的多肽，其由如下制备(i)在严格条件下，使测试DNA分子与(a)编码含有图2(SEQ ID NO2)中1或约23至约216位氨基酸残基的序列的FGF-19多肽的DNA分子，或(b)(a)所述DNA分子的互补链进行杂交，(ii)在适宜表达所述多肽的条件下培养含有所述测试DNA分子的宿主细胞，和(iii)从细胞培养物中回收所述多肽。
30.权利要求29所述分离的多肽，其中所述测试DNA与(a)或(b)具有至少约80％的序列同一性。
31.含有FGF-19多肽与异源氨基酸序列融合的嵌合分子。
32.权利要求31所述嵌合分子，其中所述异源氨基酸序列是表位标记序列。
33.权利要求31所述嵌合分子，其中所述异源氨基酸序列是免疫球蛋白的Fc区。
34.与FGF-19多肽特异性结合的抗体。
35.权利要求34所述抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
36.权利要求34所述抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
37.权利要求34所述抗体，其中所述抗体是抗体片段。
38.FGF-19多肽的激动剂。
39.FGF-19多肽的拮抗剂。
40.物质组合物，含有与可药用载体以混合物形式存在的(a)FGF-19多肽，(b)FGF-19多肽的激动剂，(c)FGF-19多肽的拮抗剂，或(d)抗-FGF-19抗体。
41.能够与FGF19结合的生物活性剂的筛选方法，包括a)向FGF-19样品中加入候选生物活性剂；和b)检测所述候选试剂与所述FGF-19的结合，其中发生结合则表明是能够与FGF-19结合的生物活性剂。
42.能够调节FGF-19活性的生物活性剂的筛选方法，所述方法包括下述步骤a)向FGF-19样品中加入候选生物活性剂；和(b)检测FGF-19生物活性的改变，其中发生改变则表明是能够调节FGF-19活性的生物活性剂。
43.权利要求42所述方法，其中所述生物活性是减少脂肪细胞对葡萄糖的摄取。
44.权利要求42所述方法，其中所述生物活性是增加leptin自脂肪细胞释放。
45.鉴定FGF-19受体的方法，所述方法包括使FGF-19与含有细胞膜物质的组分结合，如果所述FGF-19与所述细胞膜物质上的受体形成复合物，则确定所述受体是FGF-19受体。
46.权利要求45所述方法，其中FGF-19与所述受体结合，并且所述方法进一步包括所述FGF-19与受体交联的步骤。
47.权利要求45所述方法，其中所述组分是细胞。
48.权利要求45所述方法，其中所述组分是细胞膜提取物制品。
49.诱导leptin自脂肪细胞释放的方法，所述方法包括向所述细胞施用能诱导leptin释放的有效量的FGF-19。
50.权利要求49所述方法，其中所述FGF-19以蛋白形式施用。
51.权利要求49所述方法，其中所述FGF-19以核酸形式施用。
52.诱导脂肪细胞减少葡萄糖摄取的方法，所述方法包括向所述细胞施用能诱导葡萄糖摄取减少的有效量的FGF-19。
53.权利要求52所述方法，其中所述FGF-19以蛋白形式施用。
54.权利要求52所述方法，其中所述FGF-19以核酸形式施用。
55.治个体肥胖的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗所述肥胖有效量的含有FGF-19的组合物。
56.权利要求55所述方法，其中所述肥胖治疗进一步导致对与肥胖相关病症的治疗。
57.权利要求55所述方法，其中所述FGF-19以蛋白形式施用。
58.权利要求55所述方法，其中所述FGF-19以核酸形式施用。
59.权利要求55所述方法，其中所述组合物进一步包括可药用载体。
60.权利要求55所述方法，其中所述FGF-19与图2(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列具有至少约85％的氨基酸序列同一性。
61.减轻个体总体重的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量FGF-19。
62.权利要求61所述方法，其中所述FGF-19以蛋白形式施用。
63.权利要求61所述方法，其中所述FGF-19以核酸形式施用。
64.权利要求61所述方法，其中所述FGF-19与可药用载体一起施用。
65.权利要求61所述方法，其中所述总体重减轻包括所述个体脂肪减少。
66.权利要求61所述方法，其中所述FGF-19与图2(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列具有至少约85％的氨基酸序列同一性。
67.降低个体中至少一种甘油三酯和游离脂肪酸水平的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的FGF-19。
68.权利要求67所述方法，其中所述FGF-19以蛋白形式施用。
69.权利要求67所述方法，其中所述FGF-19以核酸形式施用。
70.权利要求67所述方法，其中所述FGF-19与可药用载体一起施用。
71.权利要求67所述方法，其中所述FGF-19与图2(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列具有至少约85％的氨基酸序列同一性。
72.增加个体代谢率的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的FGF-19。
73.权利要求72所述方法，其中所述FGF-19以蛋白形式施用。
74.权利要求72所述方法，其中所述FGF-19以核酸形式施用。
75.权利要求72所述方法，其中所述FGF-19与可药用载体一起施用。
76.权利要求72所述方法，其中所述FGF-19与图2(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列具有至少约85％的氨基酸序列同一性。
77.含有包括编码FGF-19的转基因的基因组的啮齿动物。
全文摘要
本发明涉及成纤维细胞生长因子家族的新多肽和编码这些多肽的核酸分子。本发明也提供包含这些核酸序列、含有本发明多肽与异源多肽序列融合的嵌合多肽分子、与本发明多肽结合的抗体的载体和宿主细胞，以及涉及本发明多肽的生产方法。另外，也提供治疗肥胖的方法。
文档编号A61K48/00GK1560249SQ20041004653
公开日2005年1月5日 申请日期2000年3月9日 优先权日1999年9月8日
发明者蒂莫西·A·斯图尔特, 蒂莫西 A 斯图尔特, 伊丽莎白·汤姆林森, 白 汤姆林森 申请人:杰南技术公司