专利名称：蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂抗肿瘤侵袭与转移作用及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学生物领域，具体的说是一种蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂抗肿瘤侵袭与转移作用及应用。
背景技术：
据临床统计，有80％以上的肿瘤患者死于侵袭与转移，若肿瘤没有侵袭与转移，预后一般较好，如卵巢囊肿、脂肪瘤等可长到十几千克或更重，手术切除后病人可完全恢复健康。因此，肿瘤侵袭与转移是影响癌症病人生存期的最重要因素之一。
肿瘤细胞的侵袭与转移是肿瘤细胞与宿主细胞、细胞外基质之间一系列复杂的、多步骤的、多因素相互作用的动态过程。已有许多资料证明肿瘤细胞分泌的蛋白水解酶包括金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶在肿瘤的侵袭与转移过程中起着重要的作用。因此，这些水解酶类的抑制剂很可能具有抗肿瘤侵袭与转移的作用。近几年来，随着对肿瘤侵袭与转移机制的不断深入研究，发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)家族成员与肿瘤的侵袭和转移密切相关，并已得到许多实验的支持，因此Cystatin抗肿瘤侵袭与转移作用的研究在近几年逐渐引起人们重视。
1997年，Sager等人研究发现，在原发性乳腺癌向转移性乳腺癌细胞发展过程中，Cystatin超家族成员Cystatin M表达水平下调，在转移性乳腺癌细胞中甚至检测不到Cystatin M表达，这提示Cystatin M可能是乳腺癌细胞恶性化的抑制因子之一。
1998年，德国学者采用Matrigel方法评价从鸡蛋清中分离的Cystatin(chCys)对肿瘤细胞体外转移能力的影响，发现其具有抑制肿瘤细胞体外转移的能力。
2000年和2003年，德国的研究者们通过基因重组方法，将chCys与uPA或TIMP-1分别重组成双功能或三功能的肿瘤相关的蛋白水解酶抑制剂，并表明其具有抑制人卵巢癌细胞在裸鼠腹腔内的生长，从而进一步证明Cystatin具有抗肿瘤侵袭与转移作用。
80年代中期，Barret等从非洲咝蝰蛇毒和长鼻蝰蛇毒中分离到Cystatin，1998年Moreau等从东南亚眼镜蛇毒中发现新的Cystatin。通过氨基酸序列分析发现，三种蛇毒Cystatin与在乳腺癌患者中低表达的Cystatin M具有共同的特征序列，Moreau等人提议将具有该序列特征的Cystatin归为一类Cystatin亚家族。
从包括中国专利在内的有关资料检索表明，蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-Cystatin)具有抗肿瘤侵袭与转移作用及应用于肿瘤转移的预防与治疗方面尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-Cystatin)具有抗肿瘤侵袭与转移作用及应用于预防与治疗肿瘤的侵袭与转移。
本发明根据中华眼镜蛇毒Cystatin蛋白的99个氨基酸序列，依照酵母优势密码子，设计与人工合成其基因序列，克隆到分泌性载体pPICZαA中，转化毕赤酵母，筛选稳定、高效表达的基因工程菌GS115-sv-Cystatin。经诱导表达及纯化，体外生物学活性分析结果表明重组蛋白sv-Cystatin具有抑制木瓜蛋白酶活性，体外侵袭模型实验进一步证明重组蛋白sv-Cystatin具有明显抑制肿瘤细胞侵袭与转移作用。因此，本发明可作为基因工程生产应用于预防与治疗肿瘤侵袭与转移的蛋白药物。
本发明还提供重组蛋白sv-Cystatin的制备方法及其应用。
本发明通过构建sv-Cystatin真核表达载体(pcDNA-sv-Cystatin)，建立稳定、高效表达sv-Cystatin的B16F1细胞株，体外侵袭模型实验和小鼠实验性肺转移实验再次证明sv-Cystatin具有明显抗肿瘤侵袭与转移作用。因此，本发明还可作为基因治疗应用于预防与治疗肿瘤的侵袭与转移。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂抗肿瘤侵袭与转移作用及应用，其特征是
1.构建pPICZ-sv-Cystatin毕赤酵母分泌型表达载体根据中华眼镜蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-Cystatin)蛋白的99个氨基酸序列(SEQ ID NO.1)，依照酵母优势密码子，推导其cDNA序列(SEQ IDNO.2)；依据SEQ ID NO.2序列，设计与人工合成相对应的四条部分互补的寡核苷酸C1、C2、C3和C4，以及4对PCR引物P1、P2、P3和P4(DNA序列见实施例1)；利用PCR缓慢退火PCR扩增sv-Cystatin cDNA(297bp)(图1)。
以sv-Cystatin cDNA作为PCR模板，上游引物F1(5’-CGGAATTCATCCCAGGTGGTTTGTCTCC-3’，下划线为EcoR I酶切位点)和下游引物R1(5’-GCTCTAGAAACCAAACTTGGAAACCAC-3’，下划线为Xba I酶切位点)PCR扩增含相应酶切位点的sv-Cystatin DNA片段。
ECOR I/Xba I双酶切sv-Cystatin DNA片段和毕赤酵母表达载体pPICZαA，连接转化E.coli.Top10，筛选阳性重组子，提取质粒，DNA测序结果表明插入片段序列及读码框完全正确，构建的载体命名为pPICZ-sv-Cystatin。
2.重组蛋白sv-Cystatin在毕赤酵母中的表达、纯化及鉴定SacI酶切pPICZ-sv-Cystatin载体使之线性化，电击转化毕赤酵母菌GS115感受态细胞。经抗生素ZeosinTM和MMH/MDH平板培养初筛以及菌落PCR鉴定获得阳性重组子GS115-sv-Cystatin菌株。
毕赤酵母GS115-sv-Cystatin菌株经甲醇诱导表达、SDS-PAGE及Western Blot分析等筛选稳定高表达sv-Cystatin重组蛋白的基因工程菌株。
基因工程菌GS115-sv-cystatin扩大培养，经诱导表达72h，收集诱导培养的上清，蔗糖透析浓缩至原液体积的1/10及ProBondTM蛋白纯化系统纯化sv-Cystatin重组蛋白，SDS-PAGE和Western Blot分析结果显示纯化的sv-Cystatin重组蛋白纯度达95％以上。BCA蛋白浓度测定及保存于-80℃以备用。
3.重组蛋白sv-Cystatin抑制木瓜蛋白酶的生物学活性分析根据木瓜蛋白酶水解底物Nα酵母-Benzoyl-L-Arginine p-Nitroanilide(L-BAPNA)产生的对硝基甲胺呈黄色，在405nm处有明显的光吸收值，而底物L-BAPNA在405nm处几乎无光吸收值，因此可以通过检测水解产物对硝基甲胺的生成量达到检测酶活力的目的。
建立木瓜蛋白酶反应体系及初速度标准曲线(具体见实施例5)，从图2中可以看出，在反应开始的30min以内，木瓜蛋白酶与底物L-BAPNA的反应斜率不变，处在一级反应阶段。因此在30min以内，可作为酶反应的初速度范围。
sv-Cystatin重组蛋白抑制木瓜蛋白酶活性分析结果显示sv-Cystatin重组蛋白浓度分别为0.29mg/ml、0.41mg/ml、0.51mg/ml、0.67mg/ml时，木瓜蛋白酶的剩余活力分别为80％、68.1％、60％、56％(图3)。
4.重组蛋白sv-Cystatin抗肿瘤侵袭与转移作用的检测采用改良的Boyden小室分析方法评价sv-Cystatin重组蛋白处理后B16F1细胞体外侵袭能力。
实验结果显示浓度为0.25mg/ml和0.5mg/ml的sv-cystatin重组蛋白处理B16F1细胞后，细胞穿越重建基底膜侵袭至小室滤膜下表面的能力明显降低，其抑制率分别为36％和51％(图4)。
5.构建pcDNA-sv-Cystatin载体及其稳定转染B16F1细胞系的筛选常规分子生物学技术将sv-Cystatin克隆到pcDNA3.1/HisC质粒中，构建pcDNA-sv-Cystatin载体，脂质体法将pcDNA-sv-Cystatin和pcDNA3.1/HisC质粒转染小鼠恶性黑色素瘤B16F1细胞，经G418初步筛选稳定转染细胞株。
G418筛选的阳性克隆细胞株通过RT-PCR及Western Blot分析鉴定sv-Cystatin的mRNA与蛋白表达。从中筛选了3株较高表达sv-Cysatin的克隆细胞株，命名为B16F1/sv-Cysatin-1，B16F1/sv-Cysatin-2和B16F1/sv-Cysatin-3。
6.B16F1/sv-Cysatin-2稳定转染细胞的体外侵袭能力分析采用改良Boyden小室分析B16F1/sv-Cysatin-2稳定转染细胞体外侵袭与转移的作用。结果显示B16F1/sv-Cysatin-2细胞侵袭至小室下室表面的细胞数为56.83±5.44，明显低于空载体组(116.45±4.27，P＜0.01，)和未转染组(111.17±4.32，P＜0.01，)，P＜0.01，说明sv-Cystatin可明显抑制B16F1细胞的体外侵袭与转移，然而对B16F1细胞的体外运动能力没有影响。
7.B16F1/sv-Cystatin-2细胞的小鼠实验性肺转移实验建立B16F1/sv-cystatin-2细胞的小鼠实验性肺转移模型参照文献颜春洪，韩锐 异黄酮genistein对小鼠恶性黑色素瘤转移的实验性治疗.药学学报，1999；34(11)814-817.并略作修改。C57BL/6小鼠40只，随机分为3组，其中B16F1/sv-cystatin-2细胞组17只，空载转染组17只和未转染组6只。分别取对数生长期的B16F1/sv-Cystatin-2细胞、B16F1/pcDNA3.1细胞以及未转染的B16F1细胞，于C57BL/6小鼠尾静脉注射瘤细胞悬液。注射后21天处死全部小鼠，取肺部组织进行检测。
结果显示三组注射21天后，肿瘤的肺转移率均为100％(17/17、6/6、17/17)；B16F1/pcDNA3.1细胞、B16F1细胞对照组小鼠肺部可见大量散在肿瘤转移灶，以肺周围部多见；光镜下肿瘤出血坏死明显，多数肺部转移灶呈片状融合，形成巨大肺转移瘤灶，转移灶内瘤细胞体积大，细胞形状各异，核异型性明显，可见多量黑色素颗粒；B16F1/sv-Cystatin-2细胞组小鼠肺脏转移瘤灶数目明显少于B16F1/pcDNA3.1组和B16F1细胞对照组，而且其小鼠肺脏重量亦显著小于B16F1/pcDNA3.1组、B16F1细胞对照组(见图5、表-2)，差异具有高度显著性(P＜0.01)。这说明sv-Cystatin可明显抑制B16F1细胞的实验性肺转移。
本发明的有益效果是在综合分析前人的研究结果的基础上，我们提出蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-Cystatin)具有抗肿瘤侵袭与转移作用的潜能，并首次证明了sv-Cystatin具有抗肿瘤侵袭与转移作用；我们也曾从中国湖南产眼镜蛇毒中分离纯化了小分子量的sv-Cystatin并初步证明其具有抑制小鼠B16细胞的体外侵袭能力，然而蛇毒中sv-Cystatin含量少、生化分离步骤复杂等缺陷限制了sv-Cystatin的应用。由于本发明是首次通过体外、体内实验证明sv-Cystatin重组蛋白及其基因具有明显的抗肿瘤侵袭与转移作用；因此，通过生物工程技术，一方面可大量制备sv-Cystatin重组蛋白，作为基因工程蛋白药物应用于预防与治疗肿瘤的侵袭与转移；另一方面，构建相应的sv-Cystatin基因表达载体或病毒，作为基因治疗应用于预防和治疗肿瘤的侵袭与转移。由此可见，sv-Cystatin将在预防和治疗肿瘤的侵袭与转移方面具有巨大的应用前景和社会经济效益。
图1sv-Cystatin cDNA扩增示意图。
图2木瓜蛋白酶水解L-BAPNA的反应动力学曲线(横坐标为时间分钟；纵坐标为A405nm的吸光度)。
图3sv-Cystatin重组蛋白抑制木瓜蛋白酶的生物学活性分析结果(横坐标为sv-Cystatin蛋白浓度(mg/ml)，纵坐标为木瓜蛋白酶残余活性(100％))。
图4sv-Cystatin重组蛋白处理对B16F1细胞侵袭Matrigel的影响(横坐标中1为对照，2为0.25mg/ml sv-Cystatin蛋白，3为0.5mg/ml sv-Cystatin蛋白；纵坐标为侵袭的细胞数)。
图5接种B16F1/sv-Cystatin-2细胞或B16F1/pcDNA3.1细胞的C57BL/6小鼠肺脏转移瘤灶图(A为C57BL/6小鼠正常肺脏；B，C为B16F1/sv-Cystatin-2细胞接种的C57BL/6小鼠肺脏；D、E、F为B16F1/pcDNA3.1细胞接种的C57BL/6小鼠肺脏)。
具体实施例方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明实施例1克隆sv-Cystatin cDNA根据中华眼镜蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-Cystatin)蛋白的99个氨基酸序列(SEQ ID NO.1)，依照酵母优势密码子，推导其cDNA序列(SEQID NO.2)；依据SEQ ID NO.2序列，设计与人工合成相对应的四条部分互补的寡核苷酸C1、C2、C3和C4，以及4对PCR引物P1、P2、P3和P4。
其序列如下C1序列ATCCCAGGTGGTTTGTCTCCAAGATCTGTTTCTGACCCAGACGTTC 46
AAAAGGCTGCIGCIITCGCTGTTCAAGAAATACAACGCTGGTTCTG 91C2序列ACTTTTCACCAGCAACAGATTGAGATTGAGCTTCAACAACTCTCAA 46TTCCTTGTAGTAGTGAGCGTTAGCAGAACCAGCGTTGTATTCTTG 91C3序列ATCTGTTGCTGGTGAAAAGTACTTCTTGATGATGGAATTGGTTAAG 46ACTAAGTGTGCTAAGACTGCTGGTAAGCCAAAGGTTTACAAGGA90C4序列CCAAACTTGGAAACCACACAACTTTTCTTCTTGTTGCTTGATTGGT 46GGCAATTCACAGTTTTGGATTTCCTTGTAAACCTTTGGCTTAC 89P15’-ATC CCA GGT GGT TTG TCT CC-3’P25’-ACT TTT CAC CAG CAA CAG AT-3’P35’-ATC TGT TGC TGG TGA AAA GT-3’P45’-CCA AAC TTG GAA ACC AC-3’片段C1、C2和C3、C4经缓慢退火PCR拼接扩增后分别获得C12、C34，琼脂糖凝胶电泳均显示150bp左右的cDNA片段；继而C12、C34片段以P1、P4为引物进行缓慢退火PCR扩增后获得sv-cystatin cDNA(297bp)，片段的大小与设计结果相符。克隆sv-Cystatin cDNA示意图见图1。
实施例2构建pPICZ-sv-Cystatin毕赤酵母分泌型表达载体以sv-Cystatin cDNA作为PCR模板，上游引物F1(5’-CGGAATTCATCCCAGGTGGTTTGTCTCC-3’，下划线为EcoR I酶切位点)和下游引物R1(5’-GCTCTAGAAACCAAACTTGGAAACCAC-3’，下划线为Xba I酶切位点)PCR扩增含相应酶切位点的sv-Cystatin DNA片段。
ECOR I/Xba I双酶切sv-Cystatin DNA片段和毕赤酵母表达载体pPICZαA，连接转化E.coli.Top10，筛选阳性重组子，提取质粒进行DNA测序鉴定结果表明sv-Cystatin DNA插入片段序列及读码框完全正确，构建的载体命名为pPICZ-sv-Cystatin。
实施例3筛选稳定高效表达sv-Cystatin的毕赤酵母基因工程菌SacI酶切pPICZ-sv-Cystatin载体，使之线性化，电击转化1M山梨醇制备的毕赤酵母菌GS115感受态细胞，转化菌液涂布含抗生素ZeosinTM(100μlg/ml)的YPDS平板上(YPD培养基1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)，30℃倒置培养，2-4天后观察重组菌落形成。
用灭菌牙签将转化单菌落分别依次对应地点种在MMH和MDH平板(MMH培养基1.34％酵母培养基YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇，4×10-4组氨酸MDH培养基1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％葡萄糖，4×10-4组氨酸)，30℃倒置培养2-3天。
根据菌落在MMH和MDH平板生长速度的不同判断其表型在MMH平板和MDH平板上均生长正常的菌落为阳性重组子；在MMH平板上生长缓慢或不生长，而在MDH平板上生长正常的菌落为阴性重组子。以α-Factor(5’-TATTGCCAGCATTGCTGC-3’)和3’AOX1(5’-GCA AATGGCATTCTGACATCC-3’)为引物进行菌落PCR法进一步鉴定阳性重组子的酵母染色体是否整合目的基因片段。
毕赤酵母GS115-sv-Cystatin菌株经甲醇诱导表达、SDS-PAGE及Western Blot分析等筛选稳定高表达sv-Cystatin重组蛋白的基因工程菌株。
实施例4sv-Cystatin重组蛋白的诱导表达及分离、纯化与鉴定将GS115-sv-cystatin菌株接种于盛有25ml BMGH培养液的摇瓶中，300rpm30℃摇床振荡培养16h-18h，OD600达3-4。室温下1500g/min离心5min沉淀菌体，弃上清，用约200ml的BMMH培养液重悬菌体至OD600为1，30℃300rpm摇床振荡诱导培养，每隔24h添加100％甲醇至终浓度为1％以维持诱导。分别于诱导0h、24h、48h、72s、96h，收集1ml培养物，12000rpm/min离心取上清，16.5％的Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达产物，分析结果表明1％甲醇诱导24h后即有表达产物出现，诱导72h后，目的蛋白表达量最高，目的蛋白占分泌蛋白的11.4％。
收集72h诱导培养的上清，经蔗糖透析浓缩至原液体积的1/10及ProBondTM蛋白纯化系统纯化sv-Cystatin重组蛋白，SDS-PAGE和Western Blot分析结果显示纯化的sv-Cystatin重组蛋白纯度达95％以上。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纯化的重组sv-cystatin蛋白浓度，保存于-80℃以备用。
实施例5sv-Cystatin重组蛋白抑制木瓜蛋白酶的生物学活性分析木瓜蛋白酶反应体系及初速度标准曲线的建立96孔板每孔中加入10μl木瓜蛋白酶溶液(0.7mg/ml)，再加入磷酸氢钠/磷酸氢二钠缓冲液(3×磷酸氢钠/磷酸氢二钠缓冲液0.1mol/L Na2HPO4/NaH2PO4PH6.8，6mmol/L DTT，3mmol/L EDTA)。每次实验均三复孔，37℃反应2min使酶激活。加入30μl底物Nα酵母-BENZOYL-L-ARGININE p-NITROANILIDE(L-BAPNA)(1.5mg/ml)。在2h内每隔5min用Bio-Rad550酶标仪测量波长为405nm的吸光值。绘制“时间-反应产物”标准曲线(见图2)，结果表明在反应开始的30min以内，木瓜蛋白酶与底物L-BAPNA的反应斜率不变，处在一级反应阶段。因此在30min以内，酶水解底物的速度可以作为初速度进行检测。
sv-Cystatin重组蛋白抑制木瓜蛋白酶活性分析在96孔板每孔中加入10μl木瓜蛋白酶溶液(papin，0.7mg/ml)，再加入30μl酶活力测定缓冲液(0.1mol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液，内含6mmol/L DTT和3mmol/L EDTA，pH6.8)，37℃反应2min使酶激活。测试孔加入50μl不同浓度的纯化sv-cystatin蛋白，对照孔中加入50μl 0.02mol/L磷酸氢钠/磷酸氢二钠缓冲液(pH6.8)。37℃5min后各孔加入30μl 1.5mg/ml底物L-BAPNA，37℃孵育15min后加入40％乙酸溶液20μl中止反应。用Bio-Rad550酶标仪测量波长为405nm的吸光值。结果显示sv-Cystatin重组蛋白浓度分别为0.29mg/ml、0.41mg/ml、0.51mg/ml、0.67mg/ml时，木瓜蛋白酶的剩余活力分别为80％、68.1％、60％、56％(图3)。
实施例6sv-Cystatin重组蛋白体外抗肿瘤侵袭作用的生物学功能检测采用改良的Boyden小室分析方法评价sv-Cystatin重组蛋白处理后B16F1细胞体外侵袭能力。
在Transwell侵袭小室(Corning Costar 3422型，USA)聚碳酸酯膜外侧滴加10μl Fibronectin(0.5mg/ml，BD公司)室温1h风干，膜内侧加入20μl Matrigel(2.7mg/ml)，37℃1h使Matrigel形成凝胶状。处于对数生长期的B16F1细胞经胰酶消化，PBS洗涤，重悬于0.1％BSA-无血清1640培养液中，配制成2×106个细胞/ml，加入不同浓度的重组sv-cystatin蛋白，37℃和5％CO2温育2h后加入侵袭小室上室，下室加600μl含0.1％BSA的无血清1640液，置37℃，5％CO2培养24h。取出小室弃除上室液体，用棉签擦尽上室膜面未穿膜的细胞及Matrigel，室温下甲醇固定5min，苏木素染色，中性树胶封片，400倍光镜下计数5个视野的侵袭细胞数，取其平均值，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。每组实验重复3次。
实验结果显示浓度为0.25mg/ml和0.5mg/ml的sv-cystatin重组蛋白处理B16F1细胞后，细胞穿越重建基底膜侵袭至小室滤膜下表面的能力明显降低，其抑制率分别为36％和51％(图4)。
实施例7构建pcDNA-sv-Cystatin真核表达载体以步骤1的sv-Cystatin cDNA为模板进行PCR扩增，上游引物为5’-TTGGTACCAATCCCAGGTGGTTTGTCTCC-3’(下划线为Kpn I酶切位点)，下游引物为5’-CCTCTAGACTACCAAACTTGGAAACCAC-3’(下划线为Xba I酶切位点)。
Kpn I/Xba I双酶切PCR产物及pcDNA3.1/His C质粒，连接转化E.coli.Top10，筛选阳性重组子，提取质粒进行DNA测序鉴定结果表明sv-CystatinDNA插入片段序列及读码框完全正确，构建的载体命名为pcDNA-sv-Cystatin。
实施例8pcDNA-sv-Cystatin转染B16F1细胞及稳定转染细胞系的筛选取对数生长期B16F1细胞用含10％新生牛血清的RPMI-1640培养液培养至60～70％融合作为待转染细胞，转染前4h更换上述培养液1次。以脂质体法将pcDNA-sv-Cystatin和pcDNA3.1/His质粒转染入小鼠恶性黑色素瘤B16F1细胞，分别命名为转染组B16F1/sv-Cystatin细胞和空载对照组B16F1/pcDNA-HisC。
转染6h后更换细胞培养液继续培养。转染24h后换含G418(600μg/ml)的培养液进行筛选，2周后，转染组、空载体组均有抗性细胞克隆形成，而未转染组B16F1细胞全部死亡。挑选阳性单细胞克隆，再换含G418(300μg/ml)的培养液扩大培养以防止转入基因丢失。
G418筛选的阳性克隆细胞株通过RT-PCR及Western Blot分析鉴定sv-Cystatin的mRNA与蛋白表达。从中筛选了3株较高表达sv-Cysatin的克隆细胞株，命名为B16F1/sv-Cysatin-1，B16F1/sv-Cysatin-2和B16F1/sv-Cysatin-3。
实施例9sv-Cystatin的表达对B16F1细胞体外侵袭能力的影响在Transwell侵袭小室(Corning Costar 3422型，USA)聚碳酸酯膜外侧滴加10μl Fibronectin(0.5mg/ml，BD公司)并风干，膜内侧加入20μl Matrigel(原液10.8mg/ml，用无血清RPMI-1640培养液按1∶3稀释)，风干。于小室上室内分别加入200μl重悬于0.1％BSA-无血清1640培养液的上述B16F1/sv-cystatin细胞、B16F1/pcDNA3.1细胞以及未转染的B16F1细胞(含2×105个细胞)，下室加600μl含0.1％BSA-无血清1640液，置37℃，5％CO2培养24h。取出小室弃除上室液体，用棉签擦尽上室膜面未穿膜的细胞，室温下甲醇固定5min，常规HE染色，中性树胶封片，400倍光镜下计数5个视野的侵袭细胞数，取其平均值，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力，每组实验重复3次。
结果如表-1所示，B16F1/sv-Cystatin-2细胞侵袭至小室下室表面的细胞数为56.83±5.44，明显低于空载体组(116.45±4.27，P＜0.01，)和未转染组(111.17±4.32，P＜0.01，)，P＜0.01，差异有高度显著性。这提示sv-Cystatin的表达可明显抑制B16F1细胞的体外侵袭与转移，而对B16F1细胞的体外运动能力没有影响。
表-1 B16F1/sv-cys-2克隆细胞株体外迁移及侵袭能力
实施例10B16F1/sv-Cystatin-2细胞的小鼠实验性肺转移实验B16F1/sv-cystatin-2细胞的小鼠实验性肺转移模型建立参照文献颜春洪，韩锐 异黄酮genistein对小鼠恶性黑色素瘤转移的实验性治疗.药学学报，1999；34(11)814-817.并略作修改。C57BL/6小鼠40只，随机分为3组，其中B16F1/sv-cystatin-2细胞组17只，空载转染组17只和未转染组6只。分别取对数生长期的B16F1/sv-Cystatin-2细胞、B16F1/pcDNA3.1细胞以及未转染的B16F1三组细胞，反复吹打并离心沉淀细胞，PBS液清洗细胞2次，用PBS液重悬细胞，调整浓度为1×106个/ml的单细胞悬液，于C57BL/6小鼠尾静脉注射200μl瘤细胞悬液。注射后21天处死全部小鼠，取肺组织。在解剖镜下计数肺转移灶结节数并称取肺组织重量。组织经中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜下观察其病理变化。
结果显示，三组注射后21天处死小鼠，肺转移率均为100％(17/17、6/6、17/17)；B16F1/pcDNA3.1细胞、B16F1细胞对照组小鼠肺部可见大量散在肿瘤转移灶，以肺周围部多见；光镜下肿瘤出血坏死明显，多数肺部转移灶呈片状融合，形成巨大肺转移瘤灶，转移灶内瘤细胞体积大，细胞形状各异，核异型性明显，可见多量黑色素颗粒；B16F1/sv-Cystatin-2细胞组小鼠肺脏转移瘤灶数目明显少于B16F1/pcDNA3.1组和B16F1细胞对照组，而且其小鼠肺脏重量亦显著小于B16F1/pcDNA3.1组、B16F1细胞对照组(见图5、表-2)，差异具有高度显著性(P＜0.01)。这说明sv-Cystatin可明显抑制B16F1细胞的实验性肺转移。
表-2 B16F1/sv-Cytatin-2细胞注射C57BL/6小鼠肺脏转移瘤灶数及肺脏重量
序列表(1)一般信息(I)申请人福建医科大学(II)发明名称蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂抗肿瘤侵袭与转移作用及其应用(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度99个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)序列描述SEQ ID NO1IPGGLSPRSVSDPDVQKAAAFAVQEYNAGSANAHYYKELRVVEAQSQSVA50GEKYFLMMELVKTKCAKTAGKPKVYKEIQNCELPPIKQQEEKLCGFQVW 90(2)SEQ I D NO2的信息(i)序列特征(A)长度297碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(iii)序列描述SEQ ID NO2ATCCCAGGTGGTTTGTCTCCAAGATCTGTTTCTGACCCAGACGTTCAAAAGGCTGCTGCT60TTCGCTGTTCAAGAATACAACGCTGGTTCTGCTAACGCTCACTACTACAAGGAATTGAGA 120GTTGTTGAAGCTCAATCTCAATCTGTTGCTGGTGAAAAGTACTTCTTGATGATGGAATTG 180GTTAAGACTAAGTGTGCTAAGACTGCTGGTAAGCCAAAGGTTTACAAGGAAATCCAAAAC 240TGTGAATTGCCACCAATCAAGCAACAAGAAGAAAAGTTGTGTGGTTTCCAAGTTTGG 29权利要求
1.一种蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-Cystatin)，其特征在于具有抗肿瘤侵袭与转移作用。
2.按权利要求1所述的蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于所述的蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有序列1的氨基酸序列和序列2的cDNA序列。
3.根据权利要求1和2所述的蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于利用基因工程生产的蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组蛋白主要应用于预防和治疗肿瘤的侵袭与转移。
4.根据权利要求1和2所述的蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于通过构建表达sv-Cystatin载体或病毒主要应用于基因治疗和预防肿瘤的侵袭与转移。
5.一种制备抗肿瘤侵袭与转移的重组蛋白sv-Cystatin的方法，其特征在于采用下列步骤(1)采用人工寡核苷酸合成与PCR扩增技术，克隆sv-Cystatin cDNA片段；(2)将sv-Cystatin基因片段克隆到pPICZαA表达载体中，构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ-sv-Cystatin；(3)用pPICZ-sv-Cystatin重组载体转化毕赤酵母GS115感受态细胞；(4)利用选择性培养及菌落PCR法筛选染色体上整合目的基因sv-Cystatin的阳性酵母重组子；(5)阳性重组子经诱导表达sv-Cystatin重组蛋白；(6)利用SDS-PAGE和Western Blot鉴定sv-Cystatin重组蛋白及其表达效率，筛选稳定、高效表达的阳性重组子，GS115-sv-cystatin菌株；(7)发酵培养GS115-sv-Cystatin菌，诱导sv-Cystatin重组蛋白的分泌表达；(8)收集培养液的上清，经蔗糖透析浓缩及ProBondTM蛋白纯化系统等分离、纯化sv-Cystatin重组蛋白。
6.根据权利要求5的方法，制备的sv-Cystatin重组蛋白其特征在于具有明显抑制木瓜蛋白酶活性作用。
7.根据权利要求5的方法，制备的sv-Cystatin重组蛋白其特征在于具有明显的体外抗肿瘤细胞侵袭与转移作用。
8.根据权利要求5的方法，其中所述的表达载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述DNA片段重组，形成适宜的表达质粒。
9.根据权利要求5的方法，其中所述的宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组质粒。
10.根据权利要求3和5～9所述制备的sv-Cystatin重组蛋白其特征在于可作为基因工程蛋白药物，应用于预防和治疗肿瘤的侵袭与转移。
11.根据权利要求2所述的sv-Cystatin基因序列，采用基因重组技术，克隆目的基因sv-Cystatin到pcDNA3.1/HisC中，构建一种pcDNA-sv-Cystatin真核表达载体。
12.根据权利要求11所述的pcDNA-sv-Cystatin真核表达载体，其特征在于具有在动物细胞中表达sv-Cystatin重组蛋白。
13.根据权利要求12所述的sv-Cystatin重组蛋白，其特征在于具有明显抑制肿瘤细胞的体外侵袭与转移作用。
14.根据权利要求12所述的sv-Cystatin重组蛋白，其特征在于具有明显抑制肿瘤细胞的体内侵袭与转移作用。
15.根据权利要求11的方法，其中所述的表达载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述DNA片段重组，形成适宜表达的质粒或病毒。
16.根据权利要求15所述的sv-Cystatin表达质粒或病毒，其特征在于可作为基因治疗，应用于预防和治疗肿瘤的侵袭与转移。
全文摘要
本发明公开了一种蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂抗肿瘤侵袭与转移作用及应用，属于医学生物领域。根据中华眼镜蛇毒Cystatin蛋白的99个氨基酸序列，设计与合成sv－Cystatin cDNA，克隆到pPICZαA载体中，转化毕赤酵母，筛选稳定、高表达的工程菌GS115－sv－Cystatin。经诱导表达及纯化，体外生物学活性实验表明sv－Cystatin重组蛋白具有抑制木瓜蛋白酶活性及明显抑制肿瘤细胞侵袭与转移作用。本发明还构建了pcDNA－sv－Cystatin真核表达载体，体内实验亦证明sv－Cystatin具有明显抑制肿瘤侵袭与转移。本发明应用于预防与治疗肿瘤的侵袭与转移，具有巨大应用前景。
文档编号A61P35/02GK1781551SQ20051007453
公开日2006年6月7日 申请日期2005年5月26日 优先权日2005年5月26日
发明者林建银, 林旭, 万榕 申请人:福建医科大学