专利名称：噻唑烷酮衍生物作为抗血管生成剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够抑制HIF-1α转录因子与其辅激活物p300之间相互作用并防止血管内皮细胞生长因子生成的噻唑烷酮化合物。
背景技术：
血管内皮细胞生长因子在生理和生理病理性血管生成过程中扮演关键角色。众多机制牵涉于VEGF基因的调节中，其中基本的角色由组织氧张力扮演，如在体内和体外低氧条件下VEGF mRNA水平的可逆增加所证明。VEGF mRNA的表达增加主要通过转录因子HIF-1(低氧诱导型因子-1)来介导，其结合于VEGF基因启动子区域的结合位点。
大量试验资料显示HIF-1是氧体内平衡的总体调节剂，HIF-1的活性受损促进肿瘤细胞的存活、增殖、侵袭和转移(1)。因此已经建议集中于抑制HIF-1活性的治疗策略可能增加癌症患者的存活率(2)。
HIF-1是一种杂二聚体，由HIF-1α和HIF-1β亚单位组成，它们发生二聚化并通过bHLH-PAS结构域结合于DNA(3)。HIF-1α亚单位的表达受到组织氧张力的严格调节(4)，其通过由VHL蛋白与HIF-1α的结合所介导的遍在蛋白化和蛋白酶体降解过程调节。这类相互作用仅当HIF-1α已经在402和564脯氨酸残基处被羟化时发生。氧是修饰HIF-1α的脯氨酰-羟化酶的限制性底物(5)。HIF-1α的表达随着O2浓度降低呈指数方式增加，并且决定HIF-1的总体活性水平。
HIF-1α反式激活域的功能还受到由氧部分压力控制的负性调节。N-末端反式激活域通过VHL和结合于VHL和HIF-1α二者的HIF-1抑制因子(FIH-1)对组蛋白脱酰酶的募集而受到负性调节(6)。
HIF-1活化通过p300/CBP辅激活物而发生，所述p300/CBP辅激活物以物理方式与HIF-1结构域的活化相互作用，促进基因如VEGF的转录(7)。p300和CBP还都是其他转录因子如Stat-3、NF-κB、p53的辅激活物。
p300/CBP和HIF-1的相互作用对于转录是必不可少的，近期的出版物已经证实了HIF-1/p300相互作用对肿瘤生长的重要性(8)。HIF-1α C-末端反式激活域(C-TAD)结合于被称为CH1的p300和CBP结构域。CBP和p300与HIF-1α的结合通过FIH-1对C-末端激活域中天冬酰胺83的氧依赖性羟化作用而受到负性调节。由此，低氧可引起对蛋白酶体降解的稳定化和HIF-1的转录活性。
HIF-1α TAD-C和p300或CBP的CH1结构域之间相互作用的结构细节已有阐述(9，10)。p300/CBP和被认为是Hif-1α活性负性调节剂(11)的CITED2蛋白(也称为p35srj)之间相互作用的细节也已公开。
HIF-1活化诱导众多基因的转录，所述基因涉及于血管生成因子、葡萄糖载体、糖酵解酶、存活、迁移和侵袭因子的生成，而这些对于肿瘤进展特别重要。
Hif-1α的异常表达可见于超过70％的人类肿瘤和它们的转移中，并且与血管形成增加和肿瘤进展相关联(12-14)。在临床实践中，Hif-1α的异常表达与众多肿瘤病变的治疗失败和死亡率增加相关，如非小细胞肺癌(15)、口咽鳞状细胞癌(16)、早期宫颈癌(17)、头颈癌(18)、突变p53卵巢癌(19)、少突神经胶质细胞瘤(20)和BCL-2阳性食道癌(21)。
在文献中已经描述了抑制HIF-1活性的各种方法。它们中的一些提示使用Hif-1α的反义寡核苷酸或Hif-1α的显性阴性形式。
在药理学方法中，已经描述了通过间接机制发挥作用的Hif-1α活性抑制剂，如PI3K-mTOR抑制剂(22-23)和MEKK(24)抑制剂，其作用于控制Hif-1α活性的信号转导；HSP90侣伴蛋白质抑制剂(25)；硫氧还蛋白还原酶抑制剂，其修饰细胞的氧化还原状态发挥作用(26)；使微管去稳定化的分子，如2-甲氧基雌二醇(27)和埃坡霉素(28)。近期，裸鼠中移植的人肿瘤中PX-478(美法仑N-氧化物)对Hif-1α水平的组成型和低氧诱导型抑制已有报道。该化合物显示显著的抗肿瘤效果。但是，该化合物的作用机制尚不完全清楚(29)。
最后，近期已报道毛壳菌素——毛壳菌属(Chaetomium sp)真菌的二硫代二氧代哌嗪代谢物——干扰Hif-1α与p300的结合。该化合物改变p300CH1结构域的结构，从而防止其与Hif-1α相互作用。向荷有肿瘤的小鼠施用毛壳菌素可抑制肿瘤中低氧诱导型转录和肿瘤生长(30)。因此，提供能够抑制HIF-1α与p300结合的进一步化合物将是有利的。
US 2004/002526 A1公开了用作磷酯酶D抑制剂的噻唑烷酮化合物，WO 98/53790公开了可用作抗肿瘤剂的噻唑烷酮类化合物。
发明内容
现已发现一些噻唑烷酮类化合物抑制Hif-1α和p300之间的相互作用并防止低氧条件下肿瘤细胞中VEGF的生成。所述化合物因此可用于控制血管生成和肿瘤生长。
相应地，本发明涉及通式(I)化合物在制备用于治疗其中抑制HIF-1α和p300之间相互作用是有益的病变的药物组合物中的用途， 其中R1是芳基或杂芳基；R2是烷基、链烯基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；X是氧或硫。
对于本申请的目的“烷基”是包含1至10个碳原子、优选1至8个碳原子的直链或支链烃，任选被一个或多个独立地选自以下的基团取代环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、巯基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基和取代的氨基；“芳基”是包含6至14个碳原子的不饱和环状芳族烃，任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代烷基、芳基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、巯基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基。
“杂芳基”是含有一个或多个优选选自氮、氧和硫的原子的5-至10-元单环或稠合芳族环，任选被一个或多个独立地选自以下的基团取代烷基、芳基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、巯基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“环烷基”表示含有3至8个碳原子的环状烷基，任选被一个或多个选自以下的取代基取代烷基、芳基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、巯基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“杂环烷基”是饱和或部分不饱和的单环或稠合环，含有一个或多个优选选自氮、氧和硫的原子，且任选被一个或多个独立地选自以下的基团取代烷基、芳基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、巯基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“链烯基”是直链、环状或支链的单价烃基，包含至少一个碳碳双键，任选被一个或多个独立地选自以下的基团取代烷基、酰基、环烷基、杂环烷基、芳基、卤代烷基、烷氧基和取代的氨基；“烷氧基”是直链或支链C1-C4烷氧基；“取代的氨基”是-NRR基团，其中每个R基团独立地选自氢、酰基、烷基、环烷基、芳基，或R基团可与氮原子一起形成5-或6-元杂环；“卤素”或前缀“卤代”表示氟、氯、溴和碘；“酰基”表示-C(O)-R”基团，其中R”优选选自氢、羟基、烷基、卤代烷基、环烷基；芳基，任选被一个或多个烷基、卤代烷基、烷氧基、卤素和取代的氨基取代；杂芳基，任选被一个或多个烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代和取代的氨基取代；以及任选被一个或多个烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代和取代的氨基取代的环。根据本发明的优选化合物为那些化合物，其中R1是取代或未取代的呋喃；R2是取代或未取代的苯基或苄基，或(2-噻吩基)-甲基、吗啉基-丙基、苯基乙基和(3，4-二甲氧基苯基)乙基且X是硫。
“取代的呋喃”优选表示被苯基取代的呋喃基，苯基任选被一个或多个选自上述的基团取代，优选羧基、甲氧基羰基、氰基、磺酰氨基和羟基乙氧基。“取代的苯基或苄基”优选表示被一个或多个选自甲基、三氟甲基、甲氧基、亚甲二氧基的基团取代的苯基或苄基。
最优选以下化合物2-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]苯甲酸甲基酯(1)；4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(2)；4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(3)；4-{5-[3-(2-三氟甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(4)；4-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)呋喃-2-基]苄腈(5)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]呋喃-2-基-}苄腈(6)；4-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]苯磺酰胺(7)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(8)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(9)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(10)；4-{5-[3-(3，4-亚甲二氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(11)；4-{5-[3-(3，4-亚甲二氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(12)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(13)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苄腈(14)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(15)；4-{5-[3-(吗啉-4-基-丙基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(16)；4-{5-[3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(17)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苄腈(18)；4-{5-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苄腈(19)；4-{5-[3-[2-(苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(20)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(21)；2-{5-[4-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基]苯氧基}乙醇(22)；3-苄基-5-[[5-(2-甲氧基苯基)呋喃-2-亚基甲基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷(23)；2-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]苯甲酸(24)。
在这些化合物中，最优选2-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯。
除了化合物1和16外，上述化合物是本发明的另一目的。
本发明的化合物可根据已知方法合成，例如US 2004/0002526 A1所述的方法，其包括缩合3位适当取代的2-硫代-噻唑烷-4-酮和适当取代的呋喃甲醛，或根据Tetrahedron Lett.，44，4257(2003)，Bioorg.Med. Chem.Lett.，12，2681(2002)，J.Med.Chem.，41，2390(1998)所述方法合成。
以下方案具体阐述了4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯的合成。
方案1 方案2 其中M是Li，Zn或Bu3Sn且DBA是二亚苄基丙酮作为替代选择，化合物(III)可根据以下方案合成
方案3 方案4 方案5 方案1至5中所报告的所有试剂可利用已知方法合成且市售可得。
本发明的化合物抑制HIF-1α和p300之间的相互作用，IC50范围为0.5至25μM，并抑制低氧条件下肿瘤细胞中VEGF的生成，IC50范围为0.10至100μM。
所述化合物因此可用于制备用于治疗其中抑制HIF-1α和p300之间相互作用是有益的病变的药物组合物。所述组合物可以是固体、半固体或液体，优选为溶液、混悬液、粉末、颗粒、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、气雾剂或控释系统形式。所述组合物可以通过不同途径施用，特别是通过口服、透皮、皮下、静脉内、肌肉内、直肠和鼻内途径。每剂量单位中活性成分的量取决于形式和施用途径、化合物、所治疗疾病，但通常为0.1至1000mg、优选1至600mg。制备药物组合物的原则和方法对于本领域技术人员而言是已知的并且例如在Remington’s PharmaceuticalScience，Mack Publishing Company，Easton(PA)中述及。
适当配制的本发明化合物可用于治疗其中血管生成作为致病因素参予的多种病变，例如不同形式的实体肿瘤、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎、银屑病、emangioma、硬皮病、新血管生成性青光眼。特别敏感于式(I)化合物的实体肿瘤包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、黑素瘤、中枢神经系统癌症、鳞状细胞口咽癌、宫颈癌、卵巢、食道、肾、结肠、头颈癌和少突神经胶质细胞瘤。
因此，本发明还涉及抑制细胞中VEGF生成的方法，该方法包括使所述细胞与有效量的式(I)化合物相接触。
以下试验部分将更为详细地阐述本发明。
实验部分化合物的合成通用工艺A实施例-4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯将5-溴呋喃甲醛(2.43g，13.9mmole)、4-(甲氧基羰基)苯基代硼酸(2.50g，13.9mmole)、三(二亚苄基丙酮)钯(0)(192mg，0.2mmole)和氟化钾(2.42g，41.7mmole)在1，4-二烷(100ml)中的溶液添加至三叔丁基膦在己烷中的溶液(以重量计10％，101mg，0.5mmole)。在65-70℃加热4小时后，将混合物冷却至室温并用二氯甲烷(150ml)处理。搅拌10分钟后，混合物经硅藻土过滤，在减压下浓缩滤液。残余物经快速硅胶色谱纯化，用乙酸乙酯-己烷混合物(1∶1)洗脱，得到4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(2.6g，81％产率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.70(s，1H)，8.10(d，2H)，7.90(d，2H)，7.35(d，1H)，6.95(d，1H)，3.98(s，3H)。
通用工艺B实施例-3-(3-吗啉代-4-基-丙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮将三硫代碳酸二(羧甲基)酯(498mg，2.2mmole)、碳酸钾(138mg，1.0mmole)和4-(3-氨基丙基)吗啉(288mg，2.0mmole)在水(20ml)中的悬液回流12小时。加入水(10ml)后，将混合物冷却至室温，用10％甲醇-二氯甲烷萃取(3×50ml)。合并萃取液，经无水硫酸镁干燥，在减压下浓缩。残余物经快速硅胶色谱纯化，用10％甲醇-二氯甲烷洗脱，得到3-(3-吗啉代-4-基-丙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮(252mg，48％产率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ4.10(dd，2H)，3.95(s，2H)，3.55-3.70(m，4H)，2.30-2.50(m，6H)，1.70-1.90(m，2H)。
通用工艺C实施例-4-{5-[3-(3-吗啉代-4-基-丙基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}-苯甲酸甲基酯将4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(59mg，0.27mmole)和3-(3-吗啉代-4-基-丙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮(72mg，0.27mmole)在乙醇(10ml)中的溶液添加哌啶(1滴)。回流下加热6小时后，在减压下浓缩混合物。残余物经快速硅胶色谱纯化，用10％甲醇-二氯甲烷洗脱，得到标题化合物(32mg，25％产率)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.15(d，2H)，7.75(d，2H)，7.50(s，1H)，6.95-7.05(m，2H)，4.20(t，2H)，3.95(s，3H)，3.90(t，2H)，3.58-3.75(m，2H)，2.30-2.60(m，6H)，1.80-2.00(m，2H)。
4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)苯磺酰基酰胺将4-(三丁基甲锡烷基)苯磺酰基酰胺(2.77g，6.21mmole)和二(三苯基膦)氯化钯(II)(436mg，0.62mmole)在乙醇(65ml)中的混合物在氩气氛下回流18小时。冷却至室温后，加入乙醚(200ml)，混合物经硅藻土真空过滤。在减压下浓缩滤液，残余物经快速硅胶色谱纯化，用20％乙酸乙酯-己烷洗脱，得到标题化合物(450mg，29％产率)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.70(s，1H)，7.90-8.10(m，4H)，7.40(d，1H)，7.00(d，1H)，4.90(br s，2H)。
3-苄基-2-硫代-噻唑烷-4-酮按照通用工艺B，使三硫代碳酸二(羧甲基)酯(2.50g，11.0mmole)与苄胺(1.07g，10.0mmole)反应。用70％二氯甲烷-己烷洗脱经快速硅胶色谱处理后，获得标题化合物(960mg，43％产率)。
4-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]-苯磺酰胺将4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)苯磺酰基酰胺(50mg，0.2mmole)和3-苄基-2-硫代-噻唑烷-4-酮(44.6mg.0.2mmole)在乙醇(5ml)中的溶液添加哌啶(1滴)，将混合物回流30分钟。冷却至0-5℃后，过滤固体，用冷乙醇洗涤(2×5ml)，在真空下干燥，得到标题化合物(73mg，80％产率)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)d7.95-8.25(m，4H)，7.75(s，1H)，7.20-7.55(m，10H)，5.25(s，2H)。
4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苄腈按照通用工艺A，使5-溴呋喃甲醛(3.50g，0.2mole)与4-氰基代硼酸(2.94g，0.2mole)反应。常规处理混合物并经50％乙酸乙酯-己烷洗脱的硅胶柱色谱纯化后，获得标题化合物(2.60g，66％产率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.70(s，1H)，8.00(d，2H)，7.80(d，2H)，7.40(d，1H)，7.00(d，1H)。
2-硫代-3-(3，4-二甲氧基-苯基乙基)-噻唑烷-4-酮按照通用工艺B，使硫代碳酸二(羧甲基)酯(905mg，4.0mmole)与3，4-二甲氧基-苄基胺(363mg，2.0mmole)反应，经快速硅胶色谱、用70％二氯甲烷-己烷洗脱后，获得标题化合物(420mg，71％产率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.70-6.90(m，3H)，4.20(t，2H)，4.00(s，2H)，3.90(s，3H)，3.85(s，3H)，2.95(t，2H)。
4-(5-{3-[2-(3，4-二甲氧基-苯基)-乙基]-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基}-呋喃-2-基)-苄腈按照通用工艺C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苄腈(39.4mg，0.2mmole)与2-硫代-3-(3，4-二甲氧基-苄基)-噻唑烷-4-酮(59.4mg，0.2mmole)反应，得到标题化合物(58mg，61％产率)。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.95-8.25(m，4H)，7.75(s，1H)，7.60(d，1H)，7.40(d，1H)，6.7-6.90(m，3H)，4.25(t，2H)，3.75(s，3H)，3.70(s，3H)，2.95(s，2H)。
3-(2-苯基乙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮按照通用工艺B，使三硫代碳酸二(羧甲基)酯(905mg，4.0mmole)与2-苯基乙基胺(242.4mg，2.0mmole)反应。经70％二氯甲烷-己烷洗脱的快速硅胶色谱处理后，获得标题化合物(246mg，52％产率)。
1HMR(300MHz，CDCl3)δ7.15-7.40(m，5H)，4.20(t，2H)，3.95(s，2H)，3.00(t，2H)。
4-[5-(4-氧代-3-(2-苯基乙基)-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]-苄腈按照通用工艺C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苄腈(39.4mg，0.2mmole)与3-(2-苯基乙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮(47.4mg，0.2mmole)反应，得到标题化合物(64mg，76％产率)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.95-8.25(m，4H)，7.75(s，1H)，7.55(d，1H)，7.40(d，1H)，7.10-7.35(m，5H)，4.24(t，2H)，3.00(t，2H)。
3-噻吩甲基-2-硫代-噻唑烷-4-酮按照通用工艺B，使三硫代碳酸二(羧甲基)酯(905mg，4.0mmole)与2-(氨基甲基)噻吩(226.4mg，2.0mmole)反应，得到标题化合物(320mg，70％产率)。
1HNMR(CDCl3)δ7.15-7.35(m，2H)，6.85-7.05(m，1H)，5.35(s，2H)，4.00(s，2H)。
4-[5-(4-氧代-3-噻吩-2-基-甲基-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]-苯甲酸甲基酯按照通用工艺C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(46.0mg，0.2mmole)与3-噻吩甲基-2-硫代-噻唑烷-4-酮(45.8mg，0.2mmole)反应，得到标题化合物(38.7mg，44％产率)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.15(d，2H)，7.85(d，2H)，7.50(s，1H)，7.20-7.30(m，2H)，6.90-7.05(m，3H)，5.50(s，2H)，3.98(s，3H)。
4-[5-(4-氧代-3-(2-苯基乙基)-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]-苯甲酸甲基酯按照通用工艺C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(46.0mg，0.2mmole)与3-(2-苯基乙基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮(47.4mg，0.2mmole)反应，得到标题化合物(39.2mg，44％产率)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.00(d，2H)，7.65(d，2H)，6.70-7.15(m，8H)，4.15(t，2H)，3.88(s，3H)，2.85(t，2H)。
4-(5-{3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)-乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基}-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯按照通用工艺C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(46.0mg，0.2mmole)与2-硫代-3-[2-(3，4-二甲氧基-苯基乙基)]-噻唑烷-4-酮(59.4mg，0.2mmole)反应，得到标题化合物(46.7mg，46％产率)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.20(d，2H)，7.85(d，2H)，7.50(s，1H)，6.85-7.05(m，5H)，4.45(t，2H)，4.00(s，3H)，3.88(s，3H)，3.85(s，3H)，2.95(t，2H)。
3-(4-甲基-苄基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮按照通用工艺B，使三硫代碳酸二(羧甲基)酯(905mg，4.0mmole)与4-甲基-苄基胺(242mg，2.0mmole)反应，得到标题化合物(250mg，53％产率)。
1HNMR(CDCl3)δ7.40(d，2H)，7.15(d，2H)，5.20(s，2H)，4.00(s，2H)，2.35(s，3H)。
4-{5-[3-(4-甲基-苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}-苯甲酸甲基酯按照通用工艺C，使4-(5-甲酰基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲基酯(46.0mg，0.2mmole)与3-(4-甲基-苄基)-2-硫代-噻唑烷-4-酮(47.4mg，0.2mmole)反应，得到标题化合物(46.7mg，46％产率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.20(d，2H)，7.85(d，2H)，7.50(s，1H)，7.40(d，1H)，7.15(d，1H)，6.90-7.05(m，4H)，5.30(s，2H)，3.95(s，2H)，2.30(s，3H)。
Biot-HIF-1α786-826/GST-p300323/423抑制的初步生物化学试验利用荧光测定法(DELFIATM)评价了化合物抑制Hif-1α和p300之间相互作用的能力。对Freedman SJ等人，Nature Structural Biology 2003，10(7)，504-512所述方法进行适当改进。
对应于C-末端786-826氨基酸的人生物素化Hif-1α片段(生物素化Hif-1α786-826)得自AnaSpec Inc(San Josè，California，USA)并未经进一步纯化使用。
将表达GST-p300323-423片段的构建体在E.coli的BL21株(DE3)中转化。所述构建体通过在表达载体pGEX-4T-1(Amersham No.27-45-80-01)中克隆编码氨基酸323至423的p300区域的DNA序列而获得；所述DNA序列通过PCR(聚合酶链发应)获得。用1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)诱发蛋白表达。在适合的缓冲液(50mM Tris.HCl pH 8.00、100mM NaCl、0.1mM ZnSO4、1mM DTT、0.1mg/ml溶菌酶和一片完全无EDTA蛋白酶抑制剂合片(Roche，目录号1 873 580))存在下通过超声溶解细菌，将存在于可溶级分中的GST融合蛋白用谷胱干肽-琼脂糖4B树脂(Amersham Biosciences；no.27-4574-01)纯化。按照Bradford的Biorad测定法(Bradford M.，Anal.Biochem.，72，248，(1976))测定蛋白最终浓度，通过SDS-PAGE评价样品纯度。将样品贮存于-80℃的50％甘油中。
利用NUNC Maxisorp 96-孔板如下进行试验。
将C96 NUNC Maxisorp板(得自Nunc，产品编号446612)与链酶抗生物素蛋白(Sigma；产品编号S 4762)孵育过夜，所述链酶抗生物素蛋白在PBS缓冲液(磷酸缓冲的盐水10mM磷酸钠、150mM氯化钠pH 7.4)中的终浓度为1μg/ml。随后将每孔用3×300μl TBST缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、0.05％(v/v)Tween 20)洗涤。然后每孔添加生物素化Hif-1α786-826在TBSB(50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、5％(w/v)BSA(Sigma，产品编号A 2153))中的100μl10nM溶液，并在25℃孵育1小时。在每张板的最后一排，仅加入TBSB缓冲液。随后用3×300μl TBST缓冲液洗涤每孔。如此制备的板作为试验板。
另外，制备每孔含有10μl浓度10μM的每种供试化合物的DMSO溶液的板(子板)。向该板添加100μl用孵育缓冲液(TBSB，添加有0.1％(v/v)Tween 20、0.5mM DTT、10μM ZnCl2)稀释的111pM GST-p300323-423溶液，并混合全部物质。将100μl子板所含混合物立即转移至试验板。
用浓度为10μM的80种不同的化合物制备每张子板，最后两排孔除外，其中每孔添加10μl DMSO。这两排代表阳性(11排，+Hif-1)和阴性(12排，-Hif-1)对照。
在25℃孵育1小时后，将各孔用3×300μlTBST缓冲液(50mMTris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、0.05％(v/v)Tween 20)洗涤。然后向各孔添加溶于100μl含10μM ZnCl2的TBST缓冲液中的60.8ng铕-标记的抗-GST抗体(DELFIA Eu-N1标记的；Perkin Elmer；产品编号A D 0251)。在室温孵育1小时后，用3×300μlTBST缓冲液洗涤各孔，然后加入100μl信号扩增溶液(增强溶液，Perkin Elmer产品编号1244-105)。
然后利用FUSION alpha-FP-HT读数仪(Perkin Elmer)、以时间分辨的荧光模式对各板进行读数。
如下计算化合物的活性从所有其他各孔的荧光值中减去平板试验第12排阴性对照的荧光平均值。然后将所得每孔的荧光值除以第11排阳性对照的荧光平均值(其代表最大信号值100％)并表示为百分数值。抑制值表示为相对于所计算每孔的100信号百分值的差异。
利用化合物于每排中以90μM至0.178μM之间的10种不同浓度存在的子板可计算剂量-响应曲线，从中获得IC50值(抑制信号50％所必须的化合物浓度)。仅含有载体的第11和12排是对照。
表1中报告了本发明某些化合物所获得的IC50值。数据为两次独立试验的平均值。
表1
对VEGF生成的抑制作用利用细胞试验评价了在上述Hif-1α/p300试验中具有抑制活性的化合物，所述细胞试验使用基因修饰的人肝癌Hep3B细胞(Hep3B-VEGF荧光素酶)，以稳定表达其中萤火虫荧光素酶的可读框处于大鼠VEGF基因启动子控制下的载体。
Hif-1经去铁胺(导致低氧)诱导，通过活化VEGF启动子而诱导荧光素酶转录，继而增加荧光素酶活性，这可用市售可得的试剂盒测定。干扰Hif-1α/p300复合体的化合物可抑制Hif-依赖型荧光素酶活化，导致荧光素酶活性降低。因此，该试验可以评价化合物对VEGF启动子的活性，后者对于VEGF生成和随后的肿瘤血管生成均是必不可少的。
Hep-3B-VEGF荧光素酶细胞系按照以下方法获得。
将人肝癌细胞Hep-3B(ATCC参考号HB-8064)以2.5×105细胞/孔的浓度接种于6-孔板中的2ml DMEM/10％FCS中，次日用Fugene 6(RocheBiochemicals)转染。在每孔中，转染混合物含有6μl转染试剂Fugene 6、1μg pxp2-VEGF-荧光素酶报道基因质粒(VEGF大鼠启动子，NCBIGenBank编号U22373，Levy等人，J.Biol.Chem.270(22)，13333-13340，1995)和使细胞耐受新霉素的10ng pcDNA3.1(+)质粒(INVITROGEN)。按照制造商的说明进行转染。
借助基于“稀释限”方法的克隆法(Sambrook J.、Fritsch E.F.和Maniatis T.(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratories)选择适合的细胞群(表型耐新霉素)。用稳定转染的所选细胞进行随后的荧光素酶表达/活性试验(荧光素酶试验)和上清液中所分泌的VEGF的定量试验(ELISA VEGF分泌试验)。
使用以下试验方案第1天将Hep-3B-VEGF荧光素酶细胞以1×104细胞/孔/125μl培养基的密度接种于“空白”96-孔板(Greiner)中，然后放置于恒温器(37℃/5％CO2)中粘附过夜。
第2天将75μl化合物的“3.2x工作溶液”(预先用培养基制备，使DMSO浓度为1.6％v/v)加至各孔(部分体积/孔＝200μl，化合物部分浓度＝1.2x，DMSO部分浓度＝0.6％)。在恒温器中孵育1小时后，通过添加40μl/孔的6x(600μM)去铁胺储备溶液(终体积/孔＝240μl，化合物终浓度＝1x，DMSO终浓度＝0.5％，去铁胺终浓度＝1x≈100μM)化学诱导低氧。然后将各板恒温另外18-20小时。
第3天如下进行荧光素酶试验和VEGF分泌的ELISA试验。
VEGF分泌的ELISA试验使用“DuoSet Elisa Development System人VEGF”试剂盒(R&DSystems)定量所分泌的VEGF。将来自含有Hep3B/VEGF荧光素酶克隆细胞的“空白”96-孔板的100μl/孔上清液转移至透明的96-孔板(Maxisorp)中并按照试剂盒制造商的指示进行试验。
荧光素酶试验借助Bright Glo试剂(Promega)对荧光素酶报道基因的表达进行定量。除去上清液并用PBS洗涤一次后，将40μl/孔Bright Glo试剂加至含有Hep3B/VEGF-荧光素酶细胞的空白96-孔板。用发光计阅读各板，测定报道基因的表达水平。
一些本发明化合物的IC50值(引起荧光素酶信号抑制50％或VEGF分泌减少50％必需的化合物浓度)报告于表2。
表2
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权利要求
1.通式(I)化合物在制备用于治疗其中抑制HIF-1α和p300之间相互作用是有益的病变的药物组合物中的用途， 其中R1是芳基或杂芳基；R2是烷基、链烯基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；X是氧或硫，且其中“烷基”是含有1至10个碳原子、优选1至8个碳原子的直链或支链烃，任选被一个或多个独立地选自以下的基团取代环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、巯基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基和取代的氨基；“芳基”是6至14个碳原子的不饱和环状芳族烃，任选被一个或多个独立地选自以下的取代基取代烷基、芳基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、巯基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“杂芳基”是含有一个或多个优选选自氮、氧和硫的原子的单环或稠合5-至10-元芳族环，任选被一个或多个独立地选自以下的基团取代烷基、芳基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、巯基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“环烷基”表示含有3至8个碳原子的环状烷基，任选被一个或多个选自以下的取代基取代烷基、芳基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、巯基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“杂环烷基”是饱和或部分不饱和的单环或稠合环，含有一个或多个优选选自氮、氧和硫的原子，且任选被一个或多个独立地选自以下的基团取代烷基、芳基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、巯基、氰基、磺酰氨基、氨基磺酰基、酰基、酰氧基、硝基和取代的氨基；“链烯基”是直链、环状或支链的单价烃基，包含至少一个碳碳双键，任选被一个或多个独立地选自以下的基团取代烷基、酰基、环烷基、杂环烷基、芳基、卤代烷基、烷氧基和取代的氨基；“烷氧基”是直链或支链C1-C4烷氧基；“取代的氨基”是-NRR基团，其中每个R基团独立地选自氢、酰基、烷基、环烷基、芳基，或R基团可与氮原子一起形成5-或6-元杂环；“卤素”或“卤代”前缀表示氟、氯、溴和碘；“酰基”是-C(O)-R”基团，其中R”优选选自氢、羟基、烷基、卤代烷基、环烷基；芳基，任选被一个或多个烷基、卤代烷基、烷氧基、卤素和取代的氨基取代；杂芳基，任选被一个或多个烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代和取代的氨基取代；以及任选被一个或多个烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代和取代的氨基取代的环。
2.权利要求1所述的用途，其中在式(I)化合物中，R1是呋喃，任选被苯基或取代的苯基取代，所述苯基取代基是一个或多个选自羧基、甲氧基羰基、氰基、磺酰氨基和羟基乙氧基的基团；R2是苯基或苄基，任选被一个或多个选自以下的基团取代甲基、三氟甲基、甲氧基、亚甲二氧基，或为(2-噻吩基)-甲基、吗啉基-丙基、苯基乙基和(3，4-二甲氧基苯基)乙基，且X是硫。
3.权利要求2所述的用途，其中式(I)化合物选自2-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]苯甲酸甲基酯(1)；4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(2)；4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(3)；4-{5-[3-(2-三氟甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(4)；4-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)呋喃-2-基-]苄腈(5)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]呋喃-2-基-}苄腈(6)；4-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]苯磺酰胺(7)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(8)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(9)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(10)；4-{5-[3-(3，4-亚甲二氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(11)；4-{5-[3-(3，4-亚甲二氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(12)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(13)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苄腈(14)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(15)；4-{5-[3-(吗啉-4-基-丙基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(16)；4-{5-[3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(17)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苄腈(18)；4-{5-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苄腈(19)；4-{5-[3-[2-(苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(20)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(21)；2-{5-[4-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚-基甲基]-呋喃-2-基]苯氧基}乙醇(22)；3-苄基-5-[[5-(2-甲氧基苯基)呋喃-2-亚基甲基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷(23)；2-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]苯甲酸(24)。
4.根据权利要求1至3任一项的用途，用于制备抗血管生成药物。
5.根据权利要求1至4任一项的用途，用于制备用于治疗实体肿瘤的药物。
6.权利要求5所述的用途，其中所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、黑素瘤、中枢神经系统癌症、鳞状细胞口咽癌、宫颈癌、卵巢、食道、肾、结肠、头颈癌症和少突神经胶质细胞瘤。
7.抑制细胞中VEGF生成的方法，包括使所述细胞与有效量的式(I)化合物接触。
8.化合物，选自4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(2)；4-{5-[3-(3，4，5-三甲氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(3)；4-{5-[3-(2-三氟甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(4)；4-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)呋喃-2-基]苄腈(5)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]呋喃-2-基}苄腈(6)；4-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]苯磺酰胺(7)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(8)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(9)；4-{5-[3-(4-甲基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(10)；4-{5-[3-(3，4-亚甲二氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(11)；4-{5-[3-(3，4-亚甲二氧基苄基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(12)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(13)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苄腈(14)；4-{5-[3-(2-噻吩基)甲基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯磺酰胺(15)；4-{5-[3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(17)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苄腈(18)；4-{5-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苄腈(19)；4-{5-[3-[2-(苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸(20)；4-{5-[3-[2-(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基}苯甲酸甲基酯(21)；2-{5-[4-[3-(2-苯基)乙基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基]-呋喃-2-基]苯氧基}乙醇(22)；3-苄基-5-[[5-(2-甲氧基苯基)呋喃-2-亚基甲基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷(23)；2-[5-(3-苄基-4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]苯甲酸(24)。
全文摘要
本发明涉及通式(I)化合物在制备用于治疗其中抑制HIF－1α和p300之间相互作用是有益的病变的药物组合物中的用途，所述药物组合物尤其是作为抗血管生成药物用于治疗实体肿瘤，其中R
文档编号A61P17/06GK101083989SQ200580044005
公开日2007年12月5日 申请日期2005年12月19日 优先权日2004年12月23日
发明者M·卡辛, G·科莱拉, S·德穆纳里, M·格鲁尼 申请人:欧洲细胞治疗责任有限公司