专利名称：基于复制型痘苗病毒载体的艾滋病疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗病毒免疫学领域。更具体地，本发明涉及基于复制型痘苗病毒载体的抗人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的疫苗及其制备方法和用途。本发明的艾滋病疫苗能够诱导高水平的抗HIV的体液和细胞免疫应答。
背景技术：
获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)简称艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(Human ImmunodeficiencyVirus，HIV)感染引起的一种传染性疾病。自从1981年发现第一例病例以来，艾滋病一直以惊人的速度在全球蔓延，成为世界上危害人类生命和健康最严重的病毒性疾病之一。艾滋病的流行给世界的社会和经济发展带来了巨大影响。在一些发展中国家，HIV感染已造成了人均寿命缩短、劳动力减少、食品短缺，使经济和社会发展倒退了20年。HIV在中国的流行经历了传入期(1 985-1988)、播散期(1989-1994)和增长期(1995年至今)三个阶段。近年来，中国HIV流行形势日趋严峻。截止2003年底，估计中国HIV感染者已达84万，全人群感染率为0.07％，累计死于艾滋病的人数已达到16万。目前中国艾滋病的流行趋势处于世界第14位，在亚洲排名第2位，而且，HIV感染者数目以每年40％的速度在递增。
近年来抗HIV病毒药物的研制和应用取得了很大进展，部分感染者得到了较好的治疗。然而，耐药株的出现使这些药物不是对每个病人都有效，复杂的服药过程使部分病人不能坚持按时服药而导致治疗失败，昂贵的费用也使治疗难以大规模推广。历史经验证明，控制疾病流行最经济有效的方法就是应用疫苗，成功的实例如天花、脊髓灰质炎、麻疹、肝炎等，因此，研制安全有效的艾滋病疫苗一直是科学工作者们奋斗的目标。
各国科学家一致认为有效的艾滋病疫苗必须能够诱导机体产生HIV特异性的CD8+细胞毒T淋巴细胞反应(CTL)和中和抗体反应。目前各单一疫苗难以实现这一目标，需要采用不同类型疫苗联合免疫的策略才能提高艾滋病疫苗的免疫效果。可供选择的候选疫苗包括下列几种传统疫苗(灭活疫苗和减毒活疫苗)、合成肽和蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗以及活载体疫苗。
与其它类型疫苗相比，活载体疫苗的优势体现在(1)能主动感染靶组织或细胞，提高了外源基因进入细胞的效率；(2)载体自身有佐剂效应，能诱导细胞因子和趋化因子的产生；(3)多数能诱导长期的免疫应答。
其中以痘苗病毒为载体的活载体疫苗研究进行得最为深入和广泛，但目前进入临床试验阶段的多为非复制型载体，如MVA、NYVAC和ALVAC。但临床试验显示非复制型载体免疫原性相对较弱，而且同一种疫苗在人体中诱导的免疫反应明显弱于猴体内的免疫应答。这可能与其非复制的特性有关。非复制型载体疫苗感染宿主细胞后，只能进行一个周期的抗原表达、加工和呈递过程，无法产生有感染性的病毒并开始新一轮的感染，因而它对免疫系统的刺激是有限的和短暂的。有鉴于此，国际上活载体疫苗的研究重点已从非复制型转向复制型，以充分发挥活载体能够复制的特点，更好地刺激机体产生免疫反应。
发明内容
本发明提供了针对HIV感染的新的疫苗和免疫接种方法，其中采用复制型痘苗病毒为载体构建了表达HIV抗原的活载体艾滋病疫苗。
本发明提供了一种表达HIV抗原的活载体艾滋病疫苗，其包含复制型痘苗病毒作为载体，其中所述痘苗病毒基因组的胸苷激酶(TK)区插入了至少一种编码HIV抗原的多核苷酸。
在本发明的艾滋病疫苗中，所述复制型痘苗病毒例如是痘苗病毒天坛株。优选地，所述重组的复制型痘苗病毒，不含有选择标记基因。
优选地，在本发明的艾滋病疫苗中，所述至少一种编码HIV抗原的多核苷酸来源于中国HIV主要流行毒株97CN54。
可用于构建本发明的疫苗的HIV抗原例如为gag-pol和/或gp140TM。因此，在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种复制型的艾滋病活载体疫苗，所述疫苗通过将中国HIV主要流行毒株97CN54的gag-pol和gp140TM基因整合入痘苗病毒天坛株的TK区构建而成。
优选地，可以对疫苗中的编码HIV抗原的多核苷酸进行修饰，例如同义突变和/或部分删除的修饰。本发明的艾滋病疫苗还可包含药用可接受的佐剂和/或载体。
本发明还提供了一种艾滋病免疫试剂盒，所述试剂盒包含多个成份和指示免疫程序的说明书，其中一个成份为本发明的上述艾滋病疫苗。
图1显示转移载体质粒pVTT1.0的构建路线。
图2显示载体pVTT1.0经KpnI、NdeI和EcoRV酶切分析结果。泳道M显示为DNA分子量MarkerDL15000的；泳道1、pVTT1.0/KpnI 2、pVTT1.0/NdeI 3、pVTT1.0/EcoRV。
图3显示质粒pVTT-gagpol的酶切电泳图。质粒pVTT-gagpol分别用PstI、XbaI、NcoI酶切进行鉴定，泳道1.λDNA/HindIII+EcoRI marker；2.pVTT-gagpol/PstI；3.pVTT-gagpol/XbaI；4.pVTT-gagpol/NcoI；5.λDNA/HindIII marker；6.DL15000marker。
图4显示质粒pVTT-mgp140TM的酶切电泳图。质粒pVTT-mgp140TM分别进行NdeI，SalI酶切分析，冰道1.marker DL2000；2.pVTT-mgp140TM质粒；3.pVTT-mgp140TM/NdeI；4.pVTT-mgp140TM/SalI。
图5显示质粒pVTT-gagpolenv的构建流程。pVTT-gagpol经PmeI和PacI双酶切之后，补平并回收3.0kb的pE/L-gagpol片段；质粒pVTT-mgp140TM用PmeI单酶切后，与片段pE/L-gagpolΔ连接。
图6显示质粒pVTT-gagpolenv的酶切电泳图。质粒pVTT-gagpolenv经HindIII、PstI酶切鉴定分析，泳道1.pVTT-gagpolenv/HindIII；2.pVTT-gagpolenv/pstI；3.Marker DL2000；4.Marker DL15000。
图7显示重组病毒筛选原理。
图8显示抗体染色法筛选重组病毒，A痘苗病毒天坛株形成的噬斑(阴性对照)；BHIV抗原表达阳性的噬斑。
图9显示VTKgagpolenv的PCR鉴定结果，泳道1.VTKgagpolenv/gagpol；2.天坛株/gagpol；3.VTKgagpolenv/gp140TM；4.天坛株/gp140TM；5.Marker DL2000。
图10显示VTKgagpolenv的WB鉴定结果，泳道1.BENCHMARKTMPrestained protein Ladder；2-3.VTKgagpolenv感染的细胞。
图11显示Dot Blotting检测筛选标记丢失的结果。1.VTKgagpolenv；2.阴性对照痘苗病毒天坛株；3.阳性对照质粒pVI-gagpol。
图12显示重组病毒VTKgagpolenv免疫家兔后诱导的HIV特异性免疫应答。
图13显示DNA疫苗初始免疫-VTKgagpolenv加强免疫诱导恒河猴产生针对Env蛋白的细胞免疫应答。
图14显示DNA疫苗初始免疫-VTKgagpolenv加强免疫诱导恒河猴产生针对Gag蛋白的细胞免疫应答。
图15显示DNA疫苗初始免疫-VTKgagpolenv加强免疫诱导恒河猴产生针对HIV的特异性体液免疫应答。
保蔵转移质粒pVTT 1.0，于2005年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.1458。
质粒pSC65，于2004年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号是CGMCC No.1097。
大肠埃希氏菌PT-gp140TM/DH5α，于2005年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCCNo.1439。
大肠埃希氏菌PT-gagpol/DH5α，于2005年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCCNo.1438。
具体实施方案本发明的针对艾滋病疫苗是基于复制型痘苗病毒载体而构建的，其不同于目前常规使用的非复制型痘苗病毒载体，如MVA、NYVAC和ALVAC。在本发明的疫苗中，所述复制型痘苗病毒的TK区插入了至少一种编码HIV抗原的多核苷酸，经施用后能够引发个体产生针对HIV的保护性免疫应答。
术语“复制型”是指可以在人体内复制的痘苗病毒载体。在本发明的一个优选的实施方式中，所述复制型痘苗病毒载体是痘苗病毒天坛株(vaccine virus TianTan strain，VTT)。痘苗病毒天坛株由中国科学家自上世纪二十年代分离后，曾作为天花疫苗在中国广泛接种，并最终在中国消灭了天花。天坛株的接种人数达十多亿，其安全性在实践中得到了长期和充分验证。天坛株疫苗的副反应发生率明显低于国际上使用的其它天花疫苗毒株，包括美国近年在生物反恐中使用的纽约株。天坛株载体具有安全性高，免疫原性好，可在体内诱导较强的体液免疫和细胞免疫，而且免疫反应的持续时间也远长于非复制型载体。
可以选择合适的HIV抗原基因用于构建本发明的疫苗，例如，可以根据具体的流行病学研究结果，选择作为当地的主要流行株的HIV的抗原基因。在本发明的一个具体实施方式
中，根据中国分子流行病学研究结果，选择中国自行分离和克隆的，占中国流行毒株38.4％的B’/C重组株97CN54(CRF07)作为设计艾滋病疫苗的病原模型。在本发明的疫苗中，在复制型痘苗病毒的TK区插入了至少一种编码HIV抗原的多核苷酸，优选地，所插入的多核苷酸是编码HIV-1抗原env、gag和pol的多核苷酸。Gag蛋白是十分保守的衣壳蛋白，在自然感染者中有针对Gag的CTL应答和T辅助细胞增殖反应(Van Baalen CA，et al.Fine-specificityof cytotoxic T lymphocytes which recognize conserved epitopes of the Gagpritein of human immunodeficiency virus type-1.J Gen Virol 1996；771659-1665、Betts MR，et al.Cross-clade human immunodeficiency virus(HIV)-specific cytotoxic T-lymphcyte responses in HIV-infected Zambians.JVirol 1997；718908-8911和Duradi D，et al.Cross-reactions between thecytotoxic T lymphocyte responses of human immunodeficiency virus-infectedAfrican and European patients.J Virol 1998；723547-3553)。Env蛋白是HIV的外膜蛋白，也是中和抗体识别的主要靶点，是HIV疫苗中不可缺少的组分。Pol蛋白虽然表达量比较低，但它富含CTL表位和T辅助细胞表位，因此其作为免疫原的潜力正日益被人们所认识(Walker BD et al.HIV-1 reverse transcriptase is a target for cytotoxic T lymphocytes in infectedindividuals.Science 1988 Apr 1；240(4848)64-6)。为了提高疫苗的安全性和免疫原性，可以对所述编码HIV-1抗原的多核苷酸的序列进行了修饰及优化。例如，可缺失pol基因中编码整合酶和RNaseH的序列，以排除外源基因被错误整合入细胞基因组的可能。env基因则可选择gp140TM区域，包括gp120和蛋白的穿膜区，能将膜蛋白锚定在细胞膜上，提高其免疫原性。实现这些修饰及优化的方法是本领域已知的。
在一个具体的实施方式中，所述编码HIVgagpol的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，而所述编码gp140TM的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
在本发明中，编码HIV抗原的多核苷酸通过合适的方法例如同源重组而被插入至痘苗病毒基因组中的胸苷激酶(TK)基因中，以形成携带目的基因的重组的复制型痘苗病毒。优选地，本发明的疫苗，即所述重组的复制型痘苗病毒，不含有选择标记基因。
为此，本发明提供了一种痘苗病毒的通用转移载体，以便将目的基因重组到痘苗病毒基因组DNA的TK区中。在一个具体的实施方式中，本发明的痘苗病毒通用转移载体是含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的转移质粒pVTT 1.0(CGMCC No.1458)。该转移质粒载体含有以下元件①三个筛选标记Amp抗性基因、lacZ基因和neo基因。由p7.5启动子启动的lacZ基因用于重组痘苗病毒的蓝白斑筛选，由PE6启动子启动的neo基因用于既带有筛选标记又带有目的基因的重组痘苗病毒的纯化(在G418的作用下痘苗病毒野毒株的增殖将被抑制)，为了使neo基因能够更好的发挥作用，neo基因的尾部带有200bp的poly(A)序列。②同源臂tkL和tkR序列tkL和tkR是痘苗病毒胸腺苷激酶(TK)的部分片段，是痘苗病毒和转移质粒发生分子间同源重组的同源序列。③lacZ’序列200bp的lacZ’序列与lacZ基因尾部的200bp的序列完全同源，使带有筛选标记和目的基因的重组痘苗病毒发生分子内同源重组，从而丢掉筛选标记。④痘苗病毒的早晚期启动子pE/L。⑤多克隆位点，位于启动子pE/L的下游。
采用本发明的通用转移载体pVTT 1.0，可将目的基因重组到痘苗病毒基因组DNA的TK区中，并使得痘苗病毒基因组中不含有选择标记基因。因此，本发明还提供了用于构建基于复制型痘苗病毒的针对SARS-CoV的疫苗的方法，所述方法包括使用转移质粒pVTT 1.0(CGMCC No.1458)将编码HIV抗原gagpol和gp140TM的多核苷酸置于pVTT 1.0的启动子pE/L下，构建重组质粒pVTT-gagpolenv；pVTT-gagpolenv在鸡胚细胞内与痘苗病毒天坛株发生同源重组，使HIV主要抗原基因与含neo基因和lacZ基因的双重筛选标记一同重组到痘苗病毒基因组DNA的TK区中。在抗生素G418选择压力下，用加有X-gal和中性红的低熔点琼脂糖铺斑，挑取既含有目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒，共经过三轮单斑纯化；然后在无G418压力选择下，蓝色重组痘苗病毒自身会因为转移质粒中一小段约200bp的lacZ’片段与完整的lacZ基因发生分子内的同源重组，从而丢失neo基因和lacZ基因而得到只含有HIV gagpol和gp140TM的编码序列的重组痘苗病毒天坛株(图7)。
本发明的疫苗可进一步包含药用可接受的合适的佐剂、载体和/或赋形剂，合适的佐剂、载体和赋形剂是本领域已知的。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及在构建天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗基础上，先用HIV DNA疫苗(刘颖等，表达HIV多价抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫效果的研究.病毒学报2003，Vol19(3)205-209)初始免疫，再用本发明的天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗进行加强免疫的免疫方案(即Prime-boost策略)，能够成功诱导机体产生高水平的体液和细胞免疫反应及高滴度中和抗体。
以下结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例实施例1痘苗病毒通用转移载体pVTT 1.0的构建1.重组质粒pSC-neo的构建质粒pIRESneo(购自Clontech公司)先用XhoI酶切，再用SmaI酶切(反应温度为25℃)，Klenow酶补平，回收1.2kb的目的片段neo-polyA；过渡载体质粒pSC65(保藏号CGMCC No.1097)用BglII酶切，Klenow酶补平，去磷酸化酶(CIAP)处理，回收载体；二者16℃连接4h，转化大肠杆菌TOP10。挑取多个单菌落，小量提取质粒，用XbaI和PstI鉴定，正确重组克隆命名为pSC-neo。
2.人工合成痘苗病毒载体早期启动子PE6和lacZ融合片段。
采用重叠PCR(Overlaping PCR)的方法合成基因。首先把序列PE6和lacZ融合多核苷酸片段的正链和负链分别列出，然后根据基因长度把正链和负链序列分割成长度为50bp的寡核苷酸(两条链最5’端的一条长度为25bp左右)，除两端的序列外，每条正链和负链序列都与两条互补链的寡核苷酸有25bp左右的互补。每10条左右的寡核苷酸都与同样数目的互补寡核苷酸混合成一个退火体系，在PCR管中先升温再慢慢退火。以退火产物为模板，以配对的上下游引物进行PCR扩增，得到500bp左右的基因片段。多个重叠的片段先混合，然后升温、退火，以退火体系为模板，以两端引物进行PCR扩增，可以得到更长的基因片段。合成的痘苗载体早期启动子PE6和lacZ融合片段连接到T-easy通用测序载体，得到质粒pT-lacZ’-PE6，测序结果符合预期设计(SEQ ID NO7)。
3.获得痘苗病毒转移载体pVTT 1.0。
质粒pT-lacZ’-PE6经SmaI+HindIII消化，回收0.4kb的lacZ’-PE6片段；连接到质粒pSC-neo，得到痘病毒转移载体pVTT 1.0(构建过程见图1)。
经KpnI、NdeI和EcoRV鉴定，结果见图2。
实施例2转移质粒pVTT-gagpolenv的构建质粒pVTT-gagpolenv的构建分三步进行(1)质粒pVTT-gagpol的构建质粒pT-gagpol(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号CGMCC No.1438)由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心构建，含有gagpolΔ基因，该质粒经EcoRI和XmnI消化，Klenow酶补平，回收2.9kb目的片段；载体pVTT 1.0经SmaI酶切，CIAP去磷酸化，回收线性化载体。载体和片段连接并转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落提取质粒进行酶切鉴定，正确克隆命名为pVTT-gagpol。分别用PstI、XbaI、NcoI酶切质粒pVTT-gagpol进行鉴定，酶切电泳图如图3所示。
(2)质粒pVTT-gp140TM构建质粒pT-gp140TM(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号CGMCC No.1439)由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心构建，含有gp140TM基因。该质粒经SacI和SacII双酶切后，Klenow酶削平，回收约2.2kb的gp140TM片段。载体pVTT 1.0用SmaI酶切后，用CIAP去磷酸化，回收线性化载体pVTT 1.0。线性化载体pVTT1.0与片段gp140TM连接，转化大肠杆菌DH5 α。挑取单菌落提取质粒进行NdeI，SalI酶切分析，如图3所示。鉴定阳性克隆命名为pVTT-gp140TM。
(3)转移质粒pVTT-gagpolenv的构建质粒pVTT-gagpolenv的构建流程如图5所示。pVTT-gagpol经PmeI和PacI双酶切之后，补平并回收3.0kb的pE/L-gagpol片段；质粒pVI75-mgp140TM用PmeI单酶切后，与片段pE/L-gagpolΔ连接。转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，质粒命名为pVTT-gagpolenv。质粒经HindIII、PstI酶切鉴定，如图6所示。
实施例3重组病毒的筛选转移质粒pVTT-gagpolenv的tkL和tkR区与痘苗病毒天坛株发生同源重组，使目的基因gagpolΔ和gp140TM与标记基因neo和lacZ一同重组到痘苗病毒基因组的TK序列中。在G418存在的条件下，由于选择压力分子内未发生同源重组，标记基因neo和lacZ暂时保留在基因组中，用加有X-gal和中性红的低熔点琼脂糖铺斑，可以挑取既含目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒(未发生重组的病毒因G418的存在而被抑制生长)。接着在无G418的条件下筛选，蓝色重组痘苗病毒自身会因为转移质粒带入的一小段约200bp的lacZ’片段与完整的lacZ基因发生分子内的二次同源重组，从而丢失neo基因和lacZ基因而得到了只含目的基因的重组痘苗病毒，用加有X-gal和中性红的低熔点琼脂糖铺斑，就能挑取只含目的基因的白色重组病毒。原理如图7所示。
(1)转染痘苗病毒天坛株感染80-90％成片的鸡胚成纤维细胞(CEF)MOI＝0.01～0.1，37℃吸附1小时后，弃去培养上清，并用无血清Eagle’s培养基洗细胞2次。用重组质粒pVTT-gagpolenv转染病毒感染的CEF细胞，方法见试剂盒说明书(Invitrogen，Lipofectin Reagent Cat.18292-011)。37℃ CO2孵箱培养48h，冻融三次后收获转染的病毒液。
(2)病毒筛选成片的CEF细胞先用含0.4mg/ml G418的Eagle’s培养基预培养24h，收获的转染病毒液300μl接种到预处理的CEF细胞(Eagle’s培养基仍含有0.4mg/mL G418)，37℃培养48h后铺斑(Eagle’s含10mg/mL X-gal和1％中性红，1％低熔点琼脂糖)。出现2个蓝色噬斑，分别挑取蓝色噬斑至1mlEagle’s维持液中。反复冻融3次，再取100μl接种到G418预处理的CEF细胞上。重复上述过程，单斑连续纯化2代，得到第三代蓝斑共12株。此时挑取的病毒含有HIV目的基因、标记基因lacZ和neo。
将12株第三代蓝斑病毒冻融三次后，分别取100μl感染未经G418处理的CEF细胞，37℃培养48h，铺斑。其中有2株病毒未出现白色噬斑，其余10株病毒同时出现蓝色噬斑和白色噬斑。共挑取白色噬斑27个。27株白斑冻融3次后，分别取100μl接种CEF细胞(24孔板)，48h后免疫组化检测抗原表达，方法如下
a)培养48小时后倾去培养上清；b)甲醇∶丙酮(1∶1)溶液固定细胞2min；c)PBS漂洗两次；d)用含3％胎牛血清的PBS稀释P24抗血清(兔源)；e)稀释度是1∶1000。每孔加入0.5ml；f)摇摆平台上室温孵育1h；g)PBS漂洗两次；h)每次2min。加入含3％胎牛血清PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶5000)；i)摇摆平台上室温孵育30-45min；j)PBS漂洗两次；k)每次2min。加入显色底物DAB；1)室温孵育5-10min。噬斑显色后终止反应。
经过筛选共有4株白色噬斑病毒抗原表达呈阳性(如图8所示)，这4株病毒再次分别接种CEF细胞，经过三轮单斑纯化，每轮挑取的白斑都经过抗体染色筛选，最终获得重组病毒VTKgagpolenv。
实施例4重组病毒VTKgagpolenv的鉴定提取重组病毒VTKgagpolenv和天坛株的基因组DNA，PCR扩增目的基因gagpolΔ和mgp140TM。引物序列如下Gagpol-for5’-GCG GAG GCT AGA AGG AGA GAG ATG G-3’(SEQ ID NO3)；Gagpol-rev5’-CTA CTA GCC TTC CAT GGC TAT TTT CTG CAC-3’(SEQ ID NO4)；Gp140-for5’-AGC GGA TCC ACC ATG AGA GTG ACG GGG ATC-3’(SEQ ID NO5)；Gp140-rev5’-GTC GGA TCC GAC TAA GGT CAG TAT CCT G-3’(SEQ ID NO6)。
结果显示VTKgagpolenv特异性扩增出2.9kb和2.1kb的片段，证实重组病毒VTKgagpolenv含有目的基因gagpolΔ和mgp140TM，如图9所示。
Western Blotting检测VTKgagpolenv HIV基因的表达，VTKgagpolenv以0.1～0.01pfu/细胞的剂量感染CEF细胞，培养48小时后收获细胞，加入1ml的蛋白提取缓冲液(1％SDS，1mmol/L PMSF，20mmol/L Tris-ClpH7.0，1％β-巯基乙醇)，立即混匀，反复冻融三次。PAGE电泳并转膜，5％的脱脂奶室温封闭2h。5％的脱脂奶稀释一抗(来自NIH AIDS Research&Reference Reagent Programm，HIV-1 SF2 GP160抗血清(羊源)，1∶1000稀释；HIV-1 Gag P24抗血清(兔源)，1∶2000稀释)。室温孵育2h。PBS洗膜3次，每次10min。加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，5％的脱脂奶按1∶5000稀释，室温孵育1h。PBS洗膜3次，每次1 0min。DAB显色后，结果如图10所示，VTKgagpolenv表达的Gag蛋白分子量为55KDa，此外还有一条约41KDa的条带，此为Gag蛋白加工不完全的产物。VTKgagpolenv表达的gp140TM蛋白的大小则在140～80 KDa范围之间，这显示了gp140TM蛋白从未糖基化到完全糖基化不同阶段的不同分子量。
提取重组病毒VTKgagpolenv和天坛株的DNA，紫外交联将DNA固定到硝酸纤维素膜上，以地高辛探针标记试剂盒(DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit Cat.1745832，Roche)标记neo和LacZ基因探针，进行Dot blot检测，详细方法见试剂盒说明。结果显示，除阳性对照出现蓝紫色斑点外，VTKgagpolenv和752-1反应均为阴性，说明重组痘苗病毒已经丢失了标记基因neo和LacZ，结果如图11。
各项鉴定结果表明VTKgagpolenv能够正确表达HIV目的蛋白，并且标记基因已被完全删除。因此VTKgagpolenv被确定为重组天坛痘苗病毒艾滋病疫苗。
实施例5重组天坛痘苗病毒艾滋病疫苗在动物体内诱导HIV特异性免疫的效力(1)家兔实验
3只家兔分别在0，10周背部皮肤划痕接种VTKgagpolenv，免疫剂量分别1.6×104pfu，1.6×105pfu，1.6×106pfu；1只家兔在0，10周肌肉注射VTKgagpolenv(1.6×106pfu)。接种后每2周经耳缘静脉采血检测HIV抗体。结果如图12所示，划痕接种1.6×106pfu的家兔在4周时开始出现HIV特异性抗体，加强免疫后抗体水平显著升高；接种1.6×104pfu，1.6×105pfu的家兔诱导抗体水平低，持续时间短。肌肉免疫的家兔6周后开始产生抗体，加强免疫后抗体水平也显著提高。本实验证实VTKgagpolenv在家兔能诱导HIV特异性抗体，且加强免疫能提高免疫效果。
(2)小鼠实验本例中使用6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠(体重19-25克，购自中国药品生物制品检定所)检测本发明疫苗的效力。小鼠皮内多点注射50μl的VTKgagpolenv(1.6x107pfu/ml)，对照组注射相同剂量痘苗病毒天坛株。6周后检测细胞内IFN-γ的分泌。取小鼠脾脏制备单细胞悬液。调整细胞浓度至5×106，96孔板每孔加入细胞100μl。刺激肽(p24肽，env2肽库和Pol肽)终浓度5μg/ml，刺激1h后，加入BFA(终浓度10μg/ml)继续培养18h。以CD8/PE，CD3/PE-cy5，IFN-γ/FITC染色后上流式细胞仪检测，检测分泌IFN-γ的CD8细胞占总CD8细胞的比率。VTKgagpolenv皮内免疫小鼠后，诱导的HIV特异性的IFN-r分泌细胞占CD8细胞总数的0.659％，与对照组有显著性差异，表明VTKgagpolenv能在小鼠体内诱导HIV特异性细胞免疫。
将VTKgagpolenv(1.6x107pfu/ml)倍比连续稀释，共5个稀释度。小鼠双侧胫骨前肌注射，每组20只，第6周时检测HIV特异性抗体。使用本室纯化的Gag蛋白包被ELISA板，包被浓度为0.1μg/ml，一抗是免疫小鼠血清，1∶50稀释；二抗是辣根过氧酶标记的羊抗小鼠。采用Bliss方法计算ED50值。疫苗的ED50是8.5×105pfu。表明VTKgagpolenv能在小鼠体内诱导HIV特异性细胞免疫。
(3)猴体实验本例中使用的恒河猴(体重约3Kg，猴龄约3岁)来源于中国医学科学院医学生物学研究所灵长类中心。试验组4只猴子(5#--8#)，对照组2只(11#，12#)。免疫程序采用初始-加强免疫的方式，即在0周，4周，10周进行3次DNA疫苗免疫，每次三角肌注射pGP140和pGPNEF等比例(各1mg/0.5ml)混合的DNA疫苗2mg。第18周皮肤划痕接种重组痘苗病毒VTKgagpolenv 5×105pfu。对照组接种时间和途径与试验组相同，区别在于用同样剂量的痘苗病毒天坛株和DNA疫苗空载体。
用ELISPOT法检测HIV抗原特异性细胞免疫反应，试验所用的肽由NIH艾滋病研究和参比试剂项目(NIH AIDS Research&ReferenceReagent Program)免费提供。Env区87条肽(Cat#4830 to 4913)被分成两个肽库(env-14830-4871；env-24872-4913)，Gag区121条肽(Cat#EVA7080.1-7080.121)被分成3个库(gag-17080.1-7080.40；gag-2；7080.41-7080.80；gag-37080.8 1-7080.121)。用商品化的HIV抗体检测试剂盒(biomerieux公司)测定HIV特异的抗体反应。
实验结果表明，重组痘苗病毒能在恒河猴体内诱导HIV特异性的细胞免疫和体液免疫，特别是在DNA疫苗初始免疫之后，重组痘苗病毒加强免疫能显著提高免疫反应的强度。实验结果见图13，14，15。
以上实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，本领域人员可以对本发明作出多种改动和变化，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
序列表<110>中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心<120>基于复制型痘苗病毒载体的艾滋病疫苗<130>I200501572CB<160>7<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2145<212>DNA<213>Human immunodeficiency virus<400>1atgagagtga cggggatcag gaagaattat cggcatttat ggagatgggg caccatgctc 60cttgggatgt tgatgatcag tagtgctgta ggaaacttgt gggtcacagt ctattatggg 120gtacctgtat ggaaagaggc aaccaccact ttattttgtg catcagatgc taaagcatat 180gatacagagg tacataatgt ttgggctaca catgcctgtg tacccgcaga ccccaaccca 240caagaaatgg ttttggaaaa tgtaacagaa aattttaaca tgtggaaaag tgaaatggta 300aatcagatgc aggaagatgt aatcagttta tgggatcaaa gcctaaaacc atgtgcaaag 360ttgaccccac tctgtgtcac tttagaatgt agaaatgtta gcagtaatag taatgatacc 420taccatgaga cctaccatga gagcatgagg gaaatgaaaa attgcccttt caatgcaacc 480acagtagtaa gagataggaa gcagacagtg tatgcacttt tctatagact tgatatagta 540ccacttacta agaagaacta tagtgagaat tctagtgagt attatagatt aataaattgt 600aatacctcag ccataacaca agcctgtcca aaggtcactt ttgatccaat tcctatacac 660tattgcactc cagctggtta tgcaattcta aagtgtaatg ataagatatt caatgggaca 720ggaccatgcc ataatgttag cacagtacaa tgtacacatg ggattaagcc agtggtatca 780
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权利要求
1.一种表达HIV抗原的活载体艾滋病疫苗，其包含复制型痘苗病毒作为载体，其中所述痘苗病毒基因组的胸苷激酶(TK)区插入了至少一种编码HIV抗原的多核苷酸。
2.权利要求1的艾滋病疫苗，其中所述复制型痘苗病毒是痘苗病毒天坛株。
3.权利要求1或2的疫苗，其中所述疫苗不含有选择标记基因。
4.权利要求1至3中任一项的艾滋病疫苗，其中所述至少一种编码HIV抗原的多核苷酸来源于中国HIV主要流行毒株97CN54。
5.权利要求1至4中任一项所述的艾滋病疫苗，其中所述HIV抗原选自gag-pol和gp140TM。
6.权利要求5所述的艾滋病疫苗，其中编码gp140TM的多核苷酸进行了同义突变和部分删除的修饰，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
7.权利要求5所述的艾滋病疫苗，其中编码gag-pol的多核苷酸进行了部分删除的修饰，具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
8.权利要求6所述的艾滋病疫苗，其中编码gag-pol的多核苷酸进行了部分删除的修饰，具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
9.权利要求1-8中任一项的艾滋病疫苗，其还包含药用可接受的佐剂和/或载体。
10.一种艾滋病免疫试剂盒，所述试剂盒包含多个成份和指示免疫程序的说明书，其中一个成份为权利要求1-9中任一项的艾滋病疫苗。
全文摘要
本发明涉及表达人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原的复制型艾滋病活载体疫苗及其用途，所述疫苗基于复制型痘苗病毒如痘苗病毒天坛株而构建。本发明的复制型活载体疫苗能够诱导高水平的抗HIV的体液和细胞免疫应答。本发明提供了用于构建所述艾滋病疫苗的载体。本发明还涉及使用所述艾滋病疫苗的免疫接种方案。
文档编号A61P31/18GK101020052SQ20061000756
公开日2007年8月22日 申请日期2006年2月16日 优先权日2006年2月16日
发明者邵一鸣, 刘颖, 刘建元 申请人:中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心