专利名称：委陵菜有效成分黄酮化合物提取分离方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种委陵菜有效成分黄酮化合物提取分离方法和应用，属于中药有效成分提取分离及应用技术。
背景技术：
中药委陵菜，(Potentilla chinesis Ser.)2000，2005年药典均有记载[3]，性寒。有清热解毒、凉血止血的功能。用于痢疾、痔疮出血、吐血、咳血、痈疮肿毒、咽喉炎、百日咳。现代研究表明，委陵菜属植物含有三萜类、黄酮类、鞣质和维生素等。药理实验表明，委陵菜对痢疾杆菌有抑制作用外，对体内的溶组织阿米巴原虫有一定的抑制作用，还有镇痛作用和保肝作用。
经对天津蓟县地区的中药委陵菜的民间应用情况进行了调查，发现民间应用委陵菜治疗糖尿病，疗效显著，许多人使用委陵菜代茶饮用治疗糖尿病。
发明内容
本发明的目的是提供一种委陵菜有效成分黄酮化合物提取分离方法和应用，该方法过程简单，所提取的黄酮类化合物具有抗糖尿病的作用。
本发明是通过下述技术方案加以实现的，一种委陵菜(Potentilla chinesis Ser.)有效成分黄酮化合物，其结构式为式1和式2所示 上述的黄酮化合物的提取分离方法，其特征在于包括以下过程(1)将委陵菜粉碎，以委陵菜的质量10-12倍的质量浓度70％-95％乙醇加热回流提取5-7小时，过滤的滤渣，再以委陵菜的质量10-12倍的质量浓度70-95％乙醇加热回流提取5-7小时，如此提取三次后，合并滤液，减压蒸发浓缩至浸膏状物；(2)将步骤(1)得到的膏状物用质量浓度30-50％乙醇溶解，以100-200目的聚酰胺柱色谱分离，然后依次用乙醇体积浓度为30％、40％、50％、60％、70％、80％和95％的乙醇-水的洗脱液进行梯度洗脱，收集乙醇体积浓度50％-70％乙醇-水洗脱的流份，减压蒸发浓缩至浸膏状物；(3)将步骤(2)得到的膏状物在常压下用十八烷基键合(C-18)反相色谱柱分离，然后依次用乙醇体积浓度为50％、60％、70％、80％和95％的乙醇-水的洗脱液进行梯度洗脱，收集乙醇体积浓度60％-80％乙醇-水的洗脱液的洗脱的流份，合并减压蒸发浓缩，得到有效成分山柰酚-3-氧-β-D-(6”-反式-对-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷和山柰酚-3-氧-β-D-(6”-顺式-对-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷。
上述的山柰酚-3-氧-β-D-(6”-反式-对-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷和山柰酚-3-氧-β-D-(6”-顺式-对-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷有效成分的应用，用于制备抗糖尿病的口服剂型或非口服剂型药物。
本发明的优点在于本发明采用溶剂提取萃取方法具有处理容量大工艺简单的特点，使用的聚酰胺和反相C-18硅胶填料可再生使用、以水和乙醇作溶剂、经济简便、易于工业化。制成的抗糖尿病有效部位，可单独或与适宜的赋形剂等结合，按照常规方法制成口服剂型或非口服剂型(针剂、喷雾剂、贴剂等)用于制备治疗糖尿病的药物。
具体实施例方式
实施例1取干燥、切成2-3厘米的天津蓟县产委陵菜1.2kg，加入15kg70％乙醇浸渍过夜，加热回流提取6小时，再加入12kg95％乙醇回流提取2次，每次6小时，合并提取液，减压浓缩得乙醇浸膏175g。将乙醇浸膏以40％乙醇溶解，滤过，以400g的聚酰胺装柱(100-200目)进行色谱分离，乙醇-水梯度洗脱(40％、50％、60％、70％、80％和95％的乙醇，每个梯度溶剂量为800mL)，收集50-70％乙醇洗脱的流份，减压浓缩，得到的浸膏再以250g(50-80μm)常压C-18反相色谱柱分离，乙醇-水(50％、60％、70％、80％和95％乙醇，每个梯度溶剂量为250mL)洗脱，收集60％至70％洗脱的流份，合并减压蒸发浓缩，得有效成分(化合物1和2)0.35g。高效液相色谱法测定总含量为90.5％。
实施例2取干燥、切成2-3厘米的天津蓟县产中药委陵菜2.5kg，加入32kg的质量浓度95％乙醇浸渍过夜，加热回流提取三次，每次6小时，合并提取液，减压浓缩的乙醇浸膏326g。将乙醇浸膏以质量浓度50％乙醇溶解，滤过，以800g的聚酰胺装柱(100-200目)进行色谱分离，乙醇-水梯度洗脱(40％、50％、60％、70％、80％和95％的乙醇，每个梯度溶剂量为1500mL，收集乙醇体积浓度为50-60％乙醇洗脱的流份，减压浓缩，得到的浸膏常压下再以400g(50-80μm)反相C-18装柱进行分离，乙醇-水(50％、60％、70％和95％的乙醇，每个梯度溶剂量为500mL)洗脱，收集60％至70％洗脱的流份，合并减压蒸发浓缩，得有效成分(化合物1和2)0.75g。高效液相色谱法测定总含量为82.5％。
实施例3取干燥、切成2-3厘米的天津蓟县产中药委陵菜5kg，加入60kg70％乙醇浸渍过夜，加热回流提取6小时，再加入50kg70％乙醇回流提取2次，每次6小时，合并提取液，减压浓缩得乙醇浸膏595g。将乙醇浸膏以50％乙醇溶解，滤过，以1500g聚酰胺装柱(60-100目)进行色谱分离，乙醇-水梯度洗脱(50％、60％、70％、80％和95％的乙醇，每个梯度溶剂量为3000mL)，收集50-60％乙醇洗脱的流份，减压浓缩，得到的浸膏再以650g常压C-18反相色谱柱分离，乙醇-水(50％、60％、70％、80％和95％的乙醇，每个梯度溶剂800mL)洗脱，收集60％至80％洗脱的流份，合并减压蒸发浓缩，得有效成分(化合物1和2)2.45g。高效液相色谱法测定总含量为72.5％。
药理实验1实验材料委陵菜黄酮(化合物1和2，质量比2∶1，本实验室自制，具体实施例1)。四氧嘧啶(Sigma公司)，盐酸苯乙双胍片，血糖试剂盒(中生北控生物科技有限公司)，低速自动平衡离心机(河北省安新县离心机厂)。UV-240紫外分光光度计(日本岛津)，昆明种小鼠(天津医科大学动物室提供，♀♂兼用，24±2g)。
2方法(1)四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立将小鼠禁食(不禁水)约12h后，尾静脉注射新配置的四氧嘧啶溶液(15mg/mL)，剂量为75mg/kg(0.05mL/10g)。于60h后再禁食(不禁水)12h，眼眶取血。用葡萄糖氧化酶法测血糖值，大于11.1mmol/L为合格的实验性糖尿病小鼠模型。
(2)阳性对照液的制备取50片苯乙双胍(25mg/片)，研碎，以煮沸过的蒸馏水溶解，配成7.5mg/mL的水溶液。
(3)黄酮化合物的药效实验选取正常小鼠，建立高血糖模型。挑选合格的小鼠，按血糖值均匀分成5组，每组11只。分别给予具体实施例1所提取的有效成分，剂量组1(0.4mg/kg)、剂量组2(0.1mg/kg)、模型对照组及苯乙双胍阳性对照液(75mg/kg)。连续灌胃15天，末次给药前禁食不禁水12h，给药后禁食不禁水1h后断头取血，以GOD法测血糖值。
3结果表1委陵菜黄酮化合物1和2对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响
**与模型组比较p＜0.01剂量组1和2的实验结果于模型对照组相比，具有显著性差异，p＜0.01，其作用强度与阳性对照组比较，强于盐酸苯乙双胍。
权利要求
1.一种委陵菜有效成分黄酮化合物提取分离方法，所述的委陵菜的有效化学成分，其结构式为式1和式2所示 上述的黄酮化合物的提取分离方法，其特征在于包括以下过程(1)将委陵菜粉碎，以委陵菜的质量10-12倍的质量浓度70％-95％乙醇加热回流提取5-7小时，过滤的滤渣，再以委陵菜的质量10-12倍的质量浓度70-95％乙醇加热回流提取5-7小时，如此提取三次后，合并滤液，减压蒸发浓缩至浸膏状物；(2)将步骤(1)得到的膏状物用质量浓度30-50％乙醇溶解，以100-200目的聚酰胺柱色谱分离，然后依次用乙醇体积浓度为30％、40％、50％、60％、70％、80％和95％的乙醇-水的洗脱液进行梯度洗脱，收集乙醇体积浓度50％-70％乙醇-水洗脱的流份，减压蒸发浓缩至浸膏状物；(3)将步骤(2)得到的膏状物在常压下用十八烷基键合(C-18)反相色谱柱分离，然后依次用乙醇体积浓度为50％、60％、70％、80％和95％的乙醇-水的洗脱液进行梯度洗脱，收集乙醇体积浓度60％-80％乙醇-水的洗脱液的洗脱的流份，合并减压蒸发浓缩，得到有效成分山柰酚-3-氧-β-D-(6″-反式-对-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷和山柰酚-3-氧-β-D-(6″-顺式-对-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷。
2.按权利要求1所述的委陵菜有效成分黄酮化合物的应用，该化合物用于制备抗糖尿病的口服剂型或非口服剂型药物。
全文摘要
本发明公开了一种委陵菜有效成分黄酮化合物提取分离方法和应用，属于中药有效成分提取分离及应用技术。所述化合物如结构式1和2所示，该化合物的提取分离方法，其过程包括将委陵菜粉碎，加乙醇加热回流提取，过滤，合并滤液，减压蒸发浓缩至浸膏状物；将得到的膏状物加乙醇溶解，以聚酰胺柱色谱分离，然后用乙醇－水梯度洗脱，收集洗脱物，减压蒸发浓缩至浸膏状物；将得到的膏状物在常压下用十八烷基键合相色谱柱分离，然后用乙醇－水梯度洗脱，收集洗脱物，减压蒸发浓缩得到有效成分1和2。分离提取得到的黄酮化合物用于制备治疗糖尿病的药物。本发明的优点在于使用的聚酰胺和C－18填料可反复再生使用、以水和乙醇作溶剂、经济简便、易于工业化。
文档编号A61P3/00GK1916012SQ20061001559
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月6日 优先权日2006年9月6日
发明者段宏泉, 刘普, 乔卫, 滕杰, 张彦文 申请人:天津医科大学