专利名称：含不同长度b细胞活化因子基因启动子的重组质粒及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及五种含不同长度B细胞活化因子(BAFF)基因启动子的重组质粒及其制备方法和用途。
背景技术：
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一类常见病、多发病，主要表现为B细胞过度增殖活化、产生抗双链DNA抗体等多种自身抗体，并通过免疫复合物等途径，造成几乎周身每一系统、器官的受累。该病多发于20～50岁的中青年女性，据报道，我国SLE的患病率接近1‰，全国患病总人数高达100万。如果诊疗不及时，70～80％的SLE患者将出现肾功能衰竭，严重影响了劳动力质量。
迄今为之，SLE的发病机理仍若明若暗，在医学上尚缺乏特异、理想的诊疗方法，更无合理、有效的阻断手段。近10年来随着分子免疫病理学的发展，证实在众多可能的发病机制中，B细胞过度激活是SLE发病的关键之所在。目前，作为一种新型的B淋巴细胞刺激分子，B细胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)对B细胞激活的调控作用已得到广泛认可。
B细胞活化因子又名B细胞刺激因子(B-Lymphocyte stimulator，BlyS)，是1999年发现的一种多功能的免疫新分子，属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族。BAFF主要特异表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等骨髓系细胞，以及K562、HL-60、THP-1等骨髓单核细胞起源的肿瘤细胞株；而且细胞因子INF-γ、IL-10、IL-4能显著增强或抑制骨髓系细胞对BAFF的表达和分泌。BAFF通过它的三种特异性细胞膜受体，在促进B淋巴细胞分化发育、激活和免疫球蛋白产生，调节免疫反应，特别是在SLE等自身免疫性疾病的发病过程中扮演着重要角色。由于BAFF对B细胞激活及SLE等自身免疫病的重要调控作用，从被发现至今，BAFF就一直是国际免疫学界的研究热点之一。
但是，近几年来国内外有关BAFF的研究进展和趋势，主要集中于从蛋白质和核酸水平对BAFF与SLE免疫病理的关系进行探索，明显缺乏有关BAFF基因启动子的结构、功能分析和转录调控的研究。而启动子是基因表达所必需的，它决定了外源基因表达的空间、时间和表达的强度等，启动子水平的任何结构异常、或转录调控元件的变化，必将会直接影响mRNA转录的异常，导致下游蛋白质水平的表达异常。
因此，在分子水平研究BAFF基因启动子的结构、功能、转录调控元件的准确定位、及相应的DNA结合蛋白的鉴定，对于研究在不同条件下BAFF基因如何被激活转录，确切阐述BAFF对SLE的致病作用，寻找新的、有效阻断乃至逆转狼疮病变的手段/方法有特别重要的意义。所以，制备BAFF基因启动子也具有特别重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供五种含不同长度B细胞活化因子(BAFF)基因启动子的重组质粒及其制备方法和用途。
本发明根据Genebank(AB730224)中的人BAFF基因上游5’侧翼区-1349～-329bp的片段，经程序DNAassist1.0模拟分析该序列可能存在的主要核因子位点后，选择设计出5个不同长短的启动子，逐段研究人BAFF基因1020bp的启动子序列。以正常人全血基因组DNA为模板，经PCR扩增，定向克隆入不含启动子，但含SV40增强子、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的pCAT3-Enhancer载体，构建出3’系列缺失的重组质粒。转化入大肠杆菌JM109以扩增，酶切、测序鉴定后，抽提质粒DNA并定量，培养人骨髓白血病细胞株HL-60，采用脂质体转染试剂，将该重组体质粒DNA转染入靶细胞中培养48小时，对细胞裂解物进行蛋白定量，用CAT报告基因ELISA检测试剂盒测定重组体的CAT活性。
重组质粒名称启动子序列phBAFF1 -1349～-1099bpphBAFF2 -1349～-893bp
phBAFF3-1349～-743bpphBAFF4-1349～-431bpphBAFF5-1349～-329bp经分析以上五个重组体的活性特点，发现全长型重组启动子phBAFF5(-1349～-329bp)的转录活性最强，其余各重组启动子的转录活性的强弱依次为phBAFF3、phBAFF4、phBAFF2、phBAFF1。
本发明所构建的含不同长度BAFF基因启动子的重组质粒准确、可靠，为进一步研究人BAFF基因激活的转录调控机制奠定了基础；而且报告基因测活比较重组启动子转录活性的方法简单、可以定量，是一个在转录水平筛选拮抗/治疗SLE的药物的简便方法，也为探索SLE的防治提供了新靶向。
图1是本发明pCAT3-enhancer载体质粒结构2-A、B、C、D、E是本发明五个重组质粒酶切后电泳结果图3-A、B、C、D、E是本发明五个重组质粒的测序结果图4是人BAFF基因的基因组结构图5是计算机模拟分析可能的主要核因子结合位点(DNAassist1.0)具体实施方式
现结合实施例及附图，对本发明作进一步的描述。
实施例1含不同长度BAFF基因启动子的重组质粒的制备及其活性检测国外研究报道，人的BAFF基因位于染色体13q34上，包括含285aa的编码区、上游5’侧翼区长约1020bp的启动子区域、3’和5’端的两个非编码区、六个外显子。而且，BAFF启动子区域中还存在四个多态性位点，分别位于-1283G＞A、-871C＞T、-514T＞C和-353G＞C(见图4)。据此，本发明对人BAFF基因上游1020bp的启动调控序列进行逐段的转录活性分析。本发明采用计算机软件(DNA assist1.0)对Genebank所报道的1020bp的人BAFF基因启动子序列(AccessionAB730224)进行主要核蛋白结合模拟分析提示，存在6个Sp-1(-329bp、-355bp、-521bp、-1157bp、-1323bp、-1349bp)、5个NF-1(-329bp、-362bp、-1316bp、-1332bp、-1349bp)、4个Ap-1(-329bp、-500bp、-1178bp、-1349bp)结合区(见图5)，并考虑到已有报道的4个多态性位点-1283G＞A、-871C＞T、-514T＞C和-353G＞C，以此将人BAFF基因上游5’侧翼区-1349～-329bp的启动序列划分为-1349～-1099bp、 -1349～-893bp、 -1349～-743bp、 -1349～-431bp、-1349～-329bp这5个不同长度的启动片段，与含报告基因CAT但不含启动子的载体组成五个不同长度的重组体，分别命名为phBAFF1、phBAFF2、phBAFF3、phBAFF4、phBAFF5。通过基因转染、报告基因测定活性，比较各个重组体的启动子活性差异，寻找调控人BAFF基因的高启动活性片段，为研究人BAFF基因激活调控机制奠定基础。
材料与方法1材料1)主要试剂全血基因组DNA提取试剂盒、ProofSart高保真PCR试剂盒、质粒抽提试剂盒为美国QIAGEN公司产品；限制性内切酶MluI、Xhol，T4DNA连接酶，DNAmarker均购自大连TakaRa生物工程公司；小量胶回收试剂盒购自MBI公司；Fugene6脂质体转染试剂、CAT ELISA检测试剂盒为美国Roche公司产品；小牛血清、GI1640培养基购自美国Gibco公司；50ml细胞培养瓶，六、十二孔细胞培养板为美国Corning公司产品；引物合成、DNA测序分析均由上海联合基因生物技术公司完成。
2)载体、菌株、细胞株表达载体pCAT3-enhancer Vector、CAT表达阳性质粒、β-gal质粒、大肠杆菌JM109均购自美国Promega公司；人骨髓白血病细胞株HL-60购自中国科学院上海细胞研究所。
3)主要仪器PE-9600 PCR扩增仪(美国PE Biosystems公司)，紫外分光光度计Du-600(美国Backman公司)，水平电泳仪(瑞典Bio-Rad公司)，KUBOTA5420台式高速离心机(日本Kubota公司)，550型酶联免疫检测仪(Model550 Microplate Reader，Bio-Rad公司生产)。
2实验方法(一)含不同长度BAFF基因启动子的重组质粒的制备1)重组体的构建pCAT3-enhancer Vector载体质粒不含启动子，但含有SV增强子、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因(见图1)。重组体内所插入的目的片段即为所要研究的BAFF的启动子片段。
2)引物设计根据Genebank所报道的人BAFF的启动子序列(AccessionAB730224)，应用程序DNA assist1.0模拟分析该序列可能存在的主要核因子位点、Primer Premier 5.0引物设计软件设计引物。
在引物的两端分别加入限制性内切酶MluI、Xhol的酶切位点，拟插入的片段长度分别为250bp、456bp、606bp、918bp、1020bp，依此构建不同长短的人BAFF基因5’侧翼序列(启动子)与pCAT3-enhancer连接的重组体phBAFF1、phBAFF2、phBAFF3、phBAFF4、phBAFF5，分别相当于人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-1099bp、-1349～-893bp、-1349～-743bp、-1349～-431bp、-1349～-329bp序列。扩增各重组启动子片段的3’端引物分别为phBAFF15’-ATGTCTACGCGTGCTGGTCGGGAGAAGAGG-3’phBAFF25’-ATGTCTACGCGTCGCAAAGCCACAGCGCATCT-3’phBAFF35’-ATGTCTACGCGTGGTCGCAGGGTGTTGAGT-3’phBAFF45’-ATGTCTACGCGTAGATCGGCCTGCTGCTCC-3’phBAFF55’-ATGTCTACGCGTAGATCACTTTGGCTGCTGT-3’而5’端的共同引物为5’-AGCCTACTCGAGAGCCTGGGTCTGGAGTTC-3’引物的5’端分别含有6个保护碱基和限制性内切酶MluI或Xhol识别位点(下划线部分)。引物由联合基因公司合成。
3)基因组DNA的提取取正常人全血200μl，按照QINGEN公司的“QIAamp DNA blood minikit”试剂盒说明书操作以提取基因组DNA，在紫外分光光度计上对提取的基因组DNA进行定量，分装-80℃保存备用。
4)目的片段的获得以基因组DNA为模板，用QINGEN公司的“ProofStart高保真PCR试剂盒”扩增各重组体目的片段，通过预实验对反应条件进行调整，具体如下10×PCR buffer5μl2.5mM dNTP6μl10μM正向引物 5μl10μM反向引物 5μlProofStart DNA聚合酶 1μl人基因组DNA(100ng/μl)3μl共计 50μl反应参数 5)PCR产物的纯化PCR产物的纯化按MBI公司“小量胶回收试剂盒”说明书操作，预先按标签提示在Washing Buffer液中加入19倍体积的无水乙醇。
A.DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳分离；B.对应分子量Marker，将欲回收片段的凝胶条切下，放入1.5ml离心管中，加入3倍体积的Bind Solution；C.55℃水浴5分钟，每2分钟混匀一次；D.按2μl悬液/μg DNA，加入Silica Powder Suspension悬液，55℃水浴5分钟，每2分钟涡悬一次；
E.高速离心1分钟后，形成片状沉淀，去除上清；F.加入500μl冰预冷的Washing Buffer，混匀后离心30秒，去除上清，重复三次；G.加入50μl TE液，温和重悬沉淀后，55℃水浴5分钟；H.离心30秒，收集上清，-20℃保存备用；I.取10μl DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；取7μl DNA用纯水稀释10倍，用于紫外分光光度仪定量检测。
6)酶切、连接目的片段和载体质粒用限制性内切酶MluI、Xhol同时用酶切各个目的片段产物和载体pCAT3-enhancer Vector，酶切反应体系和参数如下DNA片段30μlMluI(10U) 2μlXhol(10U) 2μl10×Buffer 4μl去离子H2O 2μl共计 40μl载体质粒 1μlMluI(10U) 2μlXhol(10U) 2μl10×Buffer 4μl去离子H2O 31μl共计 40μl37℃作用2小时，琼脂糖电泳鉴定酶切效率后，切胶回收酶切后的质粒和目的片段，定量。酶切后的目的片段和线性pCAT3-enhancer Vector具有相同的粘末端，经T4连接酶连接。连接反应体系T4DNA连接酶 1μl质粒 300ng目的片段 150ng10×连接反应缓冲液 2.5μl补足反应体积(25μl)，16℃连接过夜。
7)感受态细菌的制备和转化A.将大肠杆菌JM109接种于LB培养基，振荡培养过夜；B.按1∶10比例接种过夜的细菌培养物于2ml LB培养基中，振荡培养3小时；8000g离心后弃上清，加入400μl 0.1mol/L CaCl2(初始培养物量的1/5)，混匀置冰上冰浴10min；C.4000g离心10min，小心弃去上清回收细菌。加入初始培养物体积的1/25的0.1mol/L CaCl2，分装50μl/管；D.加入上述连接产物5μl，混匀，冰浴30分钟；E.42℃冲击90秒，冰浴5分钟，加入800μl LB培养基，37℃培养40分钟，振荡培养3小时；F.离心，弃部分上清，剩余部分混匀，接种于含抗生素的LB平板培养基上，37℃培养12～16h；G.同时作载体质粒、无质粒连接产物、酶切质粒的对照。
8)重组质粒、CAT阳性表达质粒和载体质粒的大量扩增经氨苄青霉素抗性筛选，小量MluI、Xhol双酶切初步鉴定、基因测序正确后；将转化有重组质粒、CAT阳性表达质粒、载体质粒的大肠杆菌JM109在含有氨苄青霉素的100ml LB培养基中大量扩增阳性克隆。
9)重组质粒、CAT阳性表达质粒和载体质粒的大量提取由于质粒用于下述的细胞转染，因此，提取的过程需要严格无菌操作。用QIAGEN公司的“QIAfilter Plasmid Midi Kits”试剂盒大量提取各重组质粒，操作均按说明进行。预先将RNaseA加入P1液中至终浓度为100μg/ml，将P3液在4℃预冷。
A.以50ml无菌离心管收集LB菌液，4500rpm、4℃离心25min，倒尽管内沉淀并扣干；B.各管中分别加入P1液4ml，反复吹打混匀；C.各管中分别加入P2液4ml，温和颠倒混匀4～6次，室温静置5min；D.将QIAGEN收集管的管口用盖子塞住，并将其放入一合适的离心管中，在含细菌裂解液的各管中分别加入P3液4ml，温和颠倒混匀4～6次；E.立即将上述裂解液倒入准备好的QIAGEN收集管中，室温静置10min；F.各用QBT液4ml平衡QIAGEN-tip100柱；G.待此柱完全沥干时，取下收集管的盖子，将收集管连接到QIAGEN-tip100柱上；H.以活塞加压轻推收集管，使裂解液的上清部分完全流入tip100柱中；I.待裂解液完全从tip100柱中滤出，各用10ml的QC液分别洗脱tip柱两次；J.换用15ml无菌离心管作收集管，以5ml的QF液洗脱tip柱；K.在上述各15ml无菌离心管中各加0.7倍体积的异丙醇沉淀DNA，混匀后4100rpm、4℃离心1小时，吸除上清；L.再分别用2ml的70％乙醇浓缩DNA，4100rpm、4℃离心1小时，仔细吸除上清，防止破坏DNA沉淀；M.在空气中干燥10分钟后，各用2ml的灭菌的TE液(pH8.0)溶解DNA；N.紫外分光光度计进行DNA定量。
(二)不同长度BAFF基因启动子的活性分析1)HL-60细胞的培养人骨髓白血病细胞株HL-60用含10％小牛血清的1640培养基，在37℃，5％CO2条件下进行培养、传代，选择第3～8代培养细胞进行实验。
2)重组DNA转染DNA转染采用FuGENE6(Roche)脂质体转染试剂法，操作按试剂使用说明进行。转染前一天，HL-60细胞以3×105细胞/孔接种于6孔培养板。细胞生长至60％～80％融合时，换新鲜培养基。将1μg上述5中重组质粒、1μg作内对照的β-gal阳性表达质粒pSVβ-gal及FuGENE6转染试剂以复合物形式转染至HL-60细胞。同时设置转染1μg的CAT阳性表达质粒作为阳性对照；1μg的pCAT3-enhancer载体质粒作为阴性对照。转染后48小时，转染的细胞裂解、待测CAT报告基因活性。
3)蛋白定量HL-60细胞转染重组体后48h，终止培养的细胞，用预冷的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤3遍，以裂解缓冲液(Roche)裂解细胞，细胞裂解液以紫外分光光度计进行蛋白定量。
4)β-gal活性测定100μl细胞裂解液中加入100μl“β-gal assay 2×buffer”(Promega)混匀，置37℃12小时，再加入1M碳酸钠混匀，酶标仪420nm测定光密度。
5)CAT活性测定以ELISA试剂盒(Roche)检测CAT报告基因的活性，操作按使用说明进行。将200μl细胞裂解液加入已包被抗体的96孔板，反应结束后加入底物显色，酶标仪405nm和492nm测定光密度值。
6)数据处理所有CAT测定结果均用相应的转染质粒的摩尔数、蛋白浓度和β-gal活性进行校正，实验重复4次，采用4次实验的均值计算各重组体的相对活性。实验数据的统计处理均采用SAS6.12软件，计量资料用t检验和方差分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。
3结果1)含不同长度BAFF基因启动子的重组质粒的鉴定以人BAFF基因上游5’侧翼区-1349～-329bp片段为靶序列，模板采用正常健康人全血基因组DNA，PCR扩增获得5个具有相同5’端的长短分别为250bp、456bp、606bp、918bp、1020bp的片段分别作为启动子，与不含启动子的载体pCAT3-enhancer分别组成重组体phBAFF1、phBAFF2、phBAFF3、phBAFF4、phBAFF5，这些重组体经限制性内切酶MluI和Xhol酶切鉴定正确(见图2-A、B、C、D、E)。即载体均为4.3kb的pCAT3-enhancer，插入启动子的长度分别为250bp、456bp、606bp、918bp、1020bp，相应于人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-1099bp、-1349～-893bp、-1349～-743bp、-1349～-431bp、-1349～-329bp片段。经测序，插入片段与GenBank报道的序列(AccessionAB730224)完全一致(见图3-A、B、C、D、E)。
图2中相对分子量指示Marker均为wide range DNA marker(TakaRa)，A、B、C、D、E分别为phBAFF1(250bp)、phBAFF2(456bp)、phBAFF3(606bp)、phBAFF4(918bp)、phBAFF5(1020bp)阳性克隆经MluI、Xhol双酶切后的条带。
图3中A、B、C、D、E分别为重组体phBAFF1、phBAFF2、phBAFF3、phBAFF4、phBAFF5的正向测序结果。
2)CAT报告基因分析不同长度BAFF基因启动子的活性人骨髓白血病细胞HL-60在转染上述5种含长短不一的启动子的重组体转染后48小时，ELISA方法测定细胞CAT表达量。同时测定细胞裂解液的蛋白浓度及β-gal活性，β-gal活性作为内对照以保持转染效率相同条件下比较CAT表达量。CAT测定结果用相应的转染质粒的摩尔数、蛋白浓度和β-gal活性校正后，以phBAFF5转染细胞后CAT表达量为1，其余重组体转染后细胞的CAT相对表达量的结果见表1。结果表明，全长型重组启动子phBAFF5(-1349～-329bp)的转录活性最强，其余各重组启动子的转录活性的强弱依次为phBAFF3、phBAFF4、phBAFF2、phBAFF1。而且重组体phBAFF1、phBAFF2、phBAFF3、phBAFF4与重组体phBAFF5相比，CAT表达活性的差异具有显著性(P＜0.05)。
表1含不同启动子的重组体转染人骨髓白血病细胞HL-60后CAT的相对表达量(n＝4，x±s)
权利要求
1.含B细胞活化因子基因启动子的重组质粒，其特征在于它由人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-1099bp、-1349～-893bp、-1349～-743bp、-1349～-431bp、-1349～-329bp片段和不含启动子、但含氯霉素乙酰基转移酶CAT报告基因的载体组成。
2.权利要求1所述的含B细胞活化因子基因启动子的重组质粒的制备方法，包括如下步骤I.扩增不同长度的、人B细胞活化因子基因上游启动子序列的-1349～-1099bp、-1349～-893bp、-1349～-743bp、-1349～-431bp、-1349～-329bp片段的引物设计正向引物为5’-AGCCTACTCGAGAGCCTGGGTCTGGAGTTC-3’反向引物分别为-1349～-1099bp5’-ATGTCTACGCGTGCTGGTCGGGAGAAGAGG-3’-1349～-893bp5’-ATGTCTACGCGTCGCAAAGCCACAGCGCATCT-3’-1349～-743bp5’-ATGTCTACGCGTGGTCGCAGGGTGTTGAGT-3’-1349～-431bp5’-ATGTCTACGCGTAGATCGGCCTGCTGCTCC-3’-1349～-329bp5’-ATGTCTACGCGTAGATCACTTTGGCTGCTGT-3’引物的5’端分别含有6个保护碱基和限制性内切酶Mlu I或Xhol识别位点，即下划线部分；II.以正常人全血基因组DNA为模板，对人B细胞活化因子基因上游启动子序列的-1349～-1099bp、-1349～-893bp、-1349～-743bp、-1349～-431bp、-1349～-329bp片段的进行PCR扩增、酶切及纯化，将上述目的片段插入不含启动子，但含有SV增强子、氯霉素乙酰基转移酶CAT报告基因的pCAT3-enhancer Vector载体质粒，构建重组启动子质粒。
3.权利要求1所述的含B细胞活化因子基因启动子的重组质粒在转录水平筛选治疗系统性红斑狼疮的药物方面的应用。
4.权利要求1所述的含B细胞活化因子基因启动子的重组质粒在研究人B细胞活化因子基因激活的转录调控机制方面的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医药工程技术领域。目前有关B细胞活化因子(BAFF)基因启动子的结构、功能分析和转录调控的研究尚属空白，本发明提供五种含不同长度B细胞活化因子(BAFF)基因启动子的重组质粒，它由人BAFF基因上游启动子序列的－1349～－1099bp、－1349～－893bp、－1349～－743bp、－1349～－431bp、－1349～－329bp片段和不含启动子，但含氯霉素乙酰基转移酶CAT报告基因的载体组成。本发明还提供了该重组质粒的制备方法和用途。本发明构建的含不同长度BAFF基因启动子的重组质粒准确、可靠，为进一步研究人BAFF基因激活的转录调控机制奠定了基础；而且报告基因测活比较重组启动子转录活性的方法简单、可以定量，是一个在转录水平筛选拮抗/治疗SLE的药物的简便方法，也为探索SLE的防治提供了新靶向。
文档编号A61P37/00GK1844400SQ200610025719
公开日2006年10月11日 申请日期2006年4月14日 优先权日2006年4月14日
发明者周琳, 仲人前, 孔宪涛, 王皓, 屠小卿, 朱烨, 郝婉莹 申请人:中国人民解放军第二军医大学