Pyy激动剂及其用途的制作方法

专利名称：：Pyy激动剂及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及PYY激动剂，更具体地涉及？￥￥3.36变体以及PYY^和￥￥3.36变体的聚乙二醇化衍生物，并涉及含有这种激动剂的组合物、编码这种PYY激动剂的分离核酸以及这种激动剂或组合物在治疗肥胖及其并发症和降低哺乳动物的食欲、减少食物摄取或热量摄取中的用途。
背景技术：
：肥胖由于流行率上升并危害健康而成为一个主要的公共健康问题。而且，肥胖可能通过限制活动性、降低身体耐力以及社交、就学和就业歧视来影响个人的生活质量。肥胖和超重通常由体重指数(BMI)定义，该指数与身体脂肪总量相关并用来衡量某些疾病的风险。BMI(kg/m2)是由体重(以千克计)除以身高(以米计)的平方来计算。超重通常定义为BMI为25-29.9kg/m2,而肥胖通常定义为BMI为30kg/m2或更高。参见例如NationalHeart,Lung,andBloodInstitute,ClinicalGuidelinesontheIdentification,Evaluation,andTreatmentofOverweightandObesityinAdults,TheEvidenceReport,Washington,DC:U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHpublicationno.98-4083(1998)。最近的研究发现，肥胖及与其相关的健康风险并不限于成人，也以令人惊讶的程度影响儿童和青少年。根据疾病控制中心(theCenterforDiseaseControl)，从1970年代初起，被界定为超重的儿童和青少年的比率已增长l倍还多，而且目前有约15。^的儿童和青少年超重。与年龄类似的正常体重个体相比，超重的儿童和青少年发生心脏病的风险因子(诸如高胆固醇和高血压)的频率增加。而且，过去被视为成人病的2型糖尿病在儿童和青少年中增加程度惊人。超重情况及肥胖与2型糖尿病关系密切。最近估计，超重的青少年有70%的几率成为超重或肥胖的成人。如果父母至少一方超重或肥胖的话，该几率增大到约80Q^。儿童本身所意识到的超重的最直接结果是社交歧视。超重或肥胖的个体更易患病，这些疾病例如是高血压、脂血代谢障碍、2型(非胰岛素依赖性)糖尿病、胰岛素抗性、不耐葡萄糖性、高胰岛素血症、冠状动脉心脏病、胸绞痛、充血性心脏衰竭、中风、胆结石、胆囊炎、胆石病、痛风、骨关节炎、梗阻性睡眠窒息及呼吸问题、胆囊病、某些形式的癌症(例如子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌)和心理障碍(例如抑郁、饮食障碍、体像扭曲和自卑)。肥胖的负面健康后果使其成为美国可预防性死亡的第二主因，并给社会带来显著的经济和心理影响。参见McGinnisM,FoegeWH.，"ActualCausesofDeathintheUnitedStates,"270:2207-12，1993。肥胖现在被视为一种需要治疗的慢性疾病，以减少与其相关的健康风险。尽管减轻重量是重要的治疗结果，但肥胖控制的主要目标之一是改善心血管和代谢值，以减少与肥胖相关的疾病和降低死亡率。体重减轻5—10%显示出可明显改善代谢值，例如血糖、血压和脂质浓度。因此，通常认为体重减轻5—10%可减少疾病和死亡率。目前可使用的控制肥胖的处方药一般通过如下方式减重减少饮食脂肪吸收(例如，使用奥利司他(orlistat))来减重，或通过减少食物摄入和/或增加能量消耗(例如，使用西布曲明)来产生能量逆差。寻找目前可使用的抗肥胖剂的替代品有数种途径，其中一种致力于某些涉及调节饱足感的肠肽，例如肽YY(PYY)。PYY为荷尔蒙胰腺多肽(PP)家族中的一员(与PP和神经肽Y(NPY)—起)。与其它同族成员相同，PYY为一种C端酰胺化的含36个氨基酸的肽。它是一种肠内分泌肽，其最初从猪肠中分离(Tatemoto和Mutt，Nature285:417-418,1980)，据随后的报导，其在外周施用后能减少大鼠中高脂肪食物的摄入(Okada等，EndocrinologySupplement180,1993)并在外周施用后引起小鼠体重减轻(Morley和Flood,LifeSciences41:2157-2165,1987)。已知存在多种储存和循环分子形式的PYY(Chen等，Gastroenterology87:1332-1338,1984和Roddy等，RegulPept18:201-212,1987)。这种类型之一的PYY3-36是从人结肠粘膜提取物中分离所得(Eberlein等，Peptides10:797-803，1989)，并发现是人餐后血浆中最主要形式的PYY(Grandt等，Regul.Pept.51:151-159,1994)。据报导，PYY3—36*高亲和力NPYY2受体(Y2R)选择性激动剂(Keire等，Am.J.Physiol.Gasrointest,LiverPhysiol.279:G126-G131，2000)。据报导，外周施用PYY3-36可显著减少大鼠的食物摄入和体重增加，可降低人的食欲和食物摄入，并减少小鼠的食物摄入，但在Y2R无效的小鼠中无此作用，据称这提示了食物摄入作用必需Y2R。在人类研究中，发现注入？￥￥3.36可在24小时中显著降低食欲并减少33%的食物摄入。注入PYYw6达到正常的肽餐后循环浓度引起15分钟内？￥￥3.36达到血清水平峰值，然后在30分钟内迅速降至基底水平。据报导，注入PYY^6后12小时内存在显著的食物摄入抑制，但是在12小时到24小时的时间段内则实质上对食物摄入没有影响。在大鼠研究中，重复施用PYY3.36IP(每天两次注射7天)减少累积的食物摄入(Batterham,等，Nature418:650-654,2002)。基于多肽的药物通常共价地连接在聚合物(如聚乙二醇)上以延长它们的体内半衰期。然而，这常常引起生物活性或药学活性的彻底损失(Shechter等，FEBSLetters579:2439-2444,2005;Fuerteges和Abuchowski,J.ControlRelease11:139-148，1990;Katre，Adv.DrugDel.Sys.10:91-114,1993;Bailon和Berthold，Pharm.Sci.Technol.Today1:352-356，1996;Nucci等，Adv.DrugDeliveryRev.6,1991;Delgado等，CriticalRev.Ther.DrugCarrierSyst.9:249-304,1992;Fung等，Polym.Preprints38:565-566,1997;Reddy,Ann.Pharmacother.34:915-923，2000;Veronese,Biomaterials22:405-417,2001)。例如Shechter等(出处同上)报导了用标准化学通过形成稳定键(40kDPEG-PYY3.36)将PYY3.36进行40kDa聚乙二醇化使其在小鼠食物摄入研究中完全失活(皮下注射)。他们还报导了PYY3-36的可逆的聚乙二醇化(40kDPEG-FMS-PYY3-36)引起功能性半衰期增长至八倍(24小时对3小时)。还可参阅WO2004/089279和WO03/026591号PCT专利中请。发明概述本发明涉及PYY激动剂，其为PYYw6的变体。在本发明的一个方面，PYY激动剂是哺乳动物PYY3.36的变体，其中残基IO(谷氨酸)或残基ll(天冬氨酸)被替换为氨基酸"X"，该x选自半胱氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和非天然氨基酸，具有能够与亲水聚合物如聚乙二醇(PEG)缀合的官能团(例如酮基、硫醇、羟基、羧基或游离氨功能团)，这类变体分别称为(E10X)PYY3.36或(DllX)PYY3-36。残基"X"优选半胱氨酸，因此其对应的变体为^10<:)￥￥3.36和(DllC)PYY3-36。在本发明优选的实施方案中，PYY激动剂为人PYYw60iPYY3.36)、犬PYY3.36、猫PYY3—36、或马？￥￥3.36的变体，更优选hPYY3.36。在本发明优选的实施方案中，PYY激动剂为具有氨基酸序列IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[S￡QIDN0:3]的多肽(E10C)hPYY3.36，或其药学可接受的盐。在另一个优选的实施方案中，PYY激动剂为具有氨基酸序列IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQIDNO:4]的多肽(DllC)hPYY3.36，或其药学可接受的盐。最优选激动剂为(E10C)hPYY3—36。本发明的PYY激动剂优选与亲水聚合物(优选PEG)缀合。激动剂优选被单聚乙二醇化(即激动剂与PEG的比例为约1:1)，聚合物连接在(E10X)PYY3-36和(D11X)PYY3.36中"X"的可缀合官能团例如酮基、硫醇、羟基、羧基或游离氨官能团上。PEG可以是线性的、支化的或侧链的；更优选线性或支化的；最优选线性的。在线性PEG中，PEG的一端被一个基团(例如醚基，优选甲醚基)封盖，所述基团在PEG与激动剂偶联的条件下是惰性的。以此种方式(用甲醚基)封端的PEG通常称为mPEG。另一端被活化用于与PYY激动剂偶联。类似的，本发明使用支化的PEG时，除一端之外所有端均用醚封盖，未用醚封盖的末端被活化用于偶联。在一个实施方案中，未用醚覆盖的PEG端用连接PEG与官能团的接头部分("L")部分覆盖，该接头部分可与(E10X)PYY3—36或(D11X)PYY3.36中的氨基酸X的缀合官能团反应产生缀合物，所述缀合物中PEG共价结合在X的缀合官能团上。在另一实施方案中，PEG直接结合在反应基团上而不包含接头部分。这类PEG通常称为"无接头"PEG。对(E10C)PYY3.36和(0110￥￥3.36多肽而言，未用醚覆盖的PEG端优选与接头结合，所述接头将PEG与马来酰亚胺或能够与半胱氨酸残基的硫醇反应产生缀合物的其他基团相连，所述缀合物中PEG与半胱氨酸硫醇基团共价结合。可用于(E10C)hPYY3.36或(DllC)PYYw6的合适的反应性PEG包括下式的PEG:o优选地，PEG为如上所述包含接头部分-L-的mPEG马来酰亚胺。无接头的PEG马来酰亚胺也适用于本发明，特别适用于(E10C)hPYY3.36或(D11C)PYY3.36。这类无接头PEG马来酰亚胺可如Goodson和Katre,历o/rec/mofogy8:343-346，1990所述制备。通过将(E10C)hPYY3.36或(011(3，￥￥3.36多肽与如上所述的mPEG偶联产生的缀合物描述于下式中，其中-SR为(E10C)hPYY3.36或(D11C)PYY3—36多肽，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>mPEG~S02CH2CH2SRmPEG—HN-COCH2SR禾卩mPEG—S-SR.接头-L-仅用来将PEG与反应官能团相连，因此不受具体限制，但是优选包括含有酯键、尿烷键、酰胺键、醚键、碳酸酯键或仲氨基团的亚垸基。在优选的实施方案中，特别是对于线性PEG而言，接头是如下式的基团-0(CH2)pNHC(0)(CH2)r-其中p为l到6的整数，优选1到3，更优选2或3，更优选3，而r是从1到6的整数，优选1到3，更优选2或3，更优选2。优选的接头为基团-CH2CH2CH2NHCOCH2CH2-。在另一个优选的实施方案中，特别是对于支化的PEG而言，接头为如下式的基团-NHC(0)(CH2)s-其中s为l到6的整数，优选1到3，更优选2或3，最优选2。优选的接头为基团-NHC(0)CH2CH2-。PEG可以是线性的或非线性的，例如支化的或侧链的。优选地，PEG为线性的或支化的，优选线性或支化的mPEG马来酰亚胺。甘油支化的mPEG马来酰亚胺为优选的支化PEG。优选地，PEG为线性mPEG马来酰亚胺。PEG应具有约1kD到约50kD范围内的重均分子量。优选地，平均分子量在约5kD到约45kD的范围内；更优选约10-12kD到约40-45kD，或约20kD到约40-45kD。特别值得注意的为如1式所示的线性mPEG，具有约20kD或约30kD的重均分子量。2式的甘油支化的mPEG也很值得注意并优选具有约20kD或约43kD的重均分子量。优选的PEG(其被适当地活化用于同(E10C)hPYY3.36或(D11C)PYY3.36的半胱氨酸硫醇基缀合)为1式和2式的化合物。在1式的线性mPEG中，n为约175到800范围内的整数；优选约375到525或约600到750，或约425到475或约650到700，或约437到463或675到700。在2式的甘油支化的mPEG中，各m大致相同并为约150到500范围内的整数；优选约160到285或约400到525，或约200到250或450到500。多种PEG(其被适当的活化用于缀合肽氨基酸侧链中的靶官能团，例如酮基、硫醇、羟基、羧基或游离氨基官能团)可从大量供应商处购得，例如从NOFCorporation,Tokyo,Japan或NektarTherapeuticsCorporation:CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2CH2NHCOCH2CH2N(OCH2CH2)mOCHHuntsville,AL购得。本发明的另一方面涉及本PYY3-36变体和聚乙二醇的缀合物。在一个实施方案中，缀合物为3式的化合物其中mPEG部分为线性的或支化的，并具有约lkD到50kD范围内的重均分子量，优选5kD到约45kD，更优选约IOkD或12kD到约40kD或45kD，或约20kD到约40kD或45kD，L为如下式的基团-0(CH2)pNHC(0)(CH2)r-其中p为l到6的整数；优选1到3;更优选2或3;最优选3;(如下文4式所描述)；且r为l到6的整数；优选1到3;更优选2或3;最优选2;或L为如下式的基团-NHC(0)(CH2)s-其中S为1到6的整数；优选1到3;更优选2或3;最优选2;并且，{11为多肽(￡10(:)1^￥￥3.36或(011(:)1^￥￥3_36，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子。本发明优选的实施方案为4式的线性mPEG-PYY3—36变体缀合物或其药学可接受的盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中n为约175到800范围内的整数；优选约375到525或约600到750，或约437到463或约675到700;且-SR为多肽(E10C)hPYY3.36或(D1lC)hPYY3.36，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子。优选地，(CH2CH20)。部分具有约20kD或30kD的重均分子量。其中-511为多肽(丑10(:)11￥￥3.36的缀合物特别值得注意。本发明的另一方面涉及其中PEG部分为支化的缀合物。该类中优选的缀合物包含甘油-支化的PEG部分。特别值得注意的是5式的缀合物或其药学可接受的盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中每个m大致相同且为在约150到550范围内的整数；优选约160到285或约400到525，或约200到250或约450到500，且-SR为(E10C)hPYYw6或(DllC)hPYY3.36多肽，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子。优选地，各(CH2CH20)m部分具有约9-11kD或约20-22kD范围内的重均分子量。优选地，多个(CH2CH20)m部分的组合重均分子量为约20kD或约43kD。其中-SR为多肽(E10C)hPYY3-36的缀合物特别值得注意。本发明还提供与包含SEQIDN0:3或SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽特异结合的单克隆抗体。在本发明这方面的一个实施方案中，多肽在其半胱氨酸残基上被聚乙二醇化。另外，本发明提供编码本发明多肽序列的多核苷酸序列，优选地，它们编码SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。在本发明的另一实施方案中，提供含有本发明PYY激动剂和药学可接受的载体的药物组合物。在另一实施方案中，该组合物还包含至少一种额外的药剂，其可以是用于治疗该组合物主要适应证或主要适应证共病的药剂。所述额外药剂优选为抗肥胖剂。该组合物优选包含治疗有效量的本发明PYY激动剂或治疗有效量的本发明PYY激动剂与额外药剂的组合。还提供了在哺乳动物中治疗由Y2R激动剂介导的疾病、病症或失调的方法，包括向需要这类治疗的哺乳动物外周施用治疗有效量的本发明PYY激动剂。本发明的PYY激动剂可单独使用或与至少一种额外药剂组合使用，所述额外药剂可用于治疗上述疾病、病症或失调，所述上述疾病、病症或失调的共病。在哺乳动物中由Y2R激动剂介导的疾病、病症或失调包括肥胖和超重。这类疾病、病症或失调的共病很可能被对这类疾病、病症或失调的治疗附带地改善。还提供了在需要治疗的哺乳动物中治疗肥胖的方法，包括向哺乳动物外周施用治疗有效量的本发明PYY激动剂。还提供了用于在哺乳动物中减少体重或促进体重减轻(包括预防或抑制体重增加)的方法，包括向哺乳动物外周施用能控制重量或减少重量数量的本发明PYY激动剂。还提供了减少哺乳动物食物摄入的方法，包括向哺乳动物外周施用能减少食物摄入的数量的本发明PYY激动剂。还提供了在哺乳动物中诱导饱足感的方法，包括向哺乳动物外周施用能诱导饱感的数量的本发明PYY激动剂。还提供了在哺乳动物中减少热量摄入的方法，包括向哺乳动物外周施用能减少热量摄入的数量的本发明PYY激动剂。PYY激动剂可单独施用或与至少一种额外药剂(优选抗肥胖剂)组合施用。在本文描述的各方法和所附权利要求书中，PYY激动剂可单独施用或与至少一种额外药剂(优选抗肥胖剂)组合施用。该PYY激动剂和含有它们的组合物也可用于制造用于本文所述的治疗应用的药物。定义和縮写短语"药学可接受的"是指物质或组合物必须在化学上和/或毒物学上与形成制剂的其他成分和/或用其治疗的哺乳动物相容。术语"PYY激动剂"是指能够在体内或体外引起一种或多种由PYY(优选PYY3-36)引起的效果的任何化合物。短语"治疗有效量"是指相对于治疗前确定的或在载体治疗组中的对照值而言，能够减少热量摄入、减少体重和/或减少体脂的本发明PYY激动剂的量。术语"哺乳动物"是指人以及拥有哺乳动物纲中的稳态机制的动物界中所有其他温血成员，如陪伴哺乳动物、动物园哺乳动物和食用哺乳动物。陪伴哺乳动物的一些实例为犬(例如狗)、猫科动物(例如猫)和马；食用哺乳动物的一些实例为猪、牛、羊等。优选地，哺乳动物为人或陪伴哺乳动物。最优选地，哺乳动物为人，男性或女性。术语"治疗"包含预防性治疗和缓解治疗。术语"外周施用"是指在中枢神经系统外施用。外周施用不包括直接施用至脑。外周施用包括但不限于血管内、肌肉内、皮下、吸入、口服、舌下、肠内、直肠内、经皮的或鼻内施用。适用于本发明的非天然氨基酸通常为除20种天然氨基酸(Cantor和Shimmel，5—A戸'ca/C7^w^^y,Part1,WHFreeman&Sons,SanFransisco，42-431980)外的任何下式氨基酸，其中Ri为任何取代基，包括酮基、硫醇、羧基、羟基或游离氨基官能团，例如美国专利申请公开号2005/0208536(其通过引用被全文并入本文中)中所公开的那些。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>这类非天然氨基酸包括例如硫代酪氨酸、鸟氨酸，3-巯基苯丙氨酸、3-或4-氨基苯丙氨酸、3-或4-乙酰基苯丙氨酸、2-或3-羟基苯丙氨酸(o-或m-酪氨酸)、羟甲基甘氨酸、氨乙基甘氨酸、l-甲基-l-巯乙基甘氨酸、氨乙基硫乙基甘氨酸和巯乙基甘氨酸。可用于本发明的许多非天然氨基酸可商业购得。其他的可通过本领域已知方法制备。例如，硫代酪氨酸可通过Lu等，j附.CAe附.5bc.119:7173-7180,1997(其通过引用并入本文)所述的方法制备。术语"人PYY"或"hPYY"是指具有以下氨基酸序列的36-氨基酸C端酰胺化的多肽YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQIDNO:l]。术语"hPYY3.36"是指具有以下氨基酸序列的C端34-merhPYY:IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQIDN0:2]。术语""(E10C)hPYY3—36"是指其中该hPYY的谷氨酸残基10被替换为半胱氨酸残基的C端34-merhPYY，其具有以下氨基酸序列IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQIDNO:3]。术语"(DllC)hPYY3_36"是指其中该hPYY的天冬氨酸残基ll被替换为半胱氨酸的C端34-merhPYY，其具有以下氨基酸序列IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQIDNO:4]。图l是纯化的(E10C)hPYY3-36肽在ZorbaxEclipseXDB-C8柱上的反相HPLC图。图2是线性的30KmPEG马来酰亚胺加上(E10C)hPYY3.36的反应混合物在Shodex804SEC柱上的尺寸排除HPLC图。图3是来自线性30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36的SPHitrap纯化的级分的SDSPAGE照片。MW-分子量标准；L-柱负荷；FT-流通物；4-23=洗脱级分。图4是纯化的(DllC)hPYY3.36肽在ZorbaxEclipseXDB-C8柱上的反相HPLC图。图5是线性的30KmPEG马来酰亚胺加上(DllC)hPYY3.36的反应混合物在Shodex804SEC柱上的尺寸排除HPLC图。图6是尺寸排除HPLC图，示出了纯化的线性30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36产物在Shodex804SEC柱上的洗脱曲线。图7是尺寸排除HPLC图，示出了纯化的线性30KmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYY3.36产物在Shodex804SEC柱上的洗脱曲线。图8是甘油支化的43KmPEG马来酰亚胺加上(E10C)hPYY3.36的反应混合物在Shodex804SEC柱上的尺寸排除HPLC图。图9是尺寸排除HPLC图，示出了纯化的甘油支化的43KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36产物在Shodex804SEC柱上的洗脱曲线。图10是腹膜内(IP)注射后禁食小鼠中对累积的食物摄入抑制的图线。图10A示出了与载体组相比，天然PYY3.36的剂量效果。图10B示出了线性30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36的剂量效果。图ll示出了与载体和线性30KmPEG马来酰亚胺(E10C)PYY3-36相比，在禁食小鼠中IP注射甘油支化43KmPEG马来酰亚胺(E10C)PYY3—36对食物摄入的效果。图11A是示出了注射后6小时内反应的线形图。图11B是比较注射后24小时内效果的柱形图。图12示出了IP注射载体、PYY3.36和线性30KmPEG马来酰亚胺(E10C)PYY3-36对自发摄食小鼠的效果。图12A示出了对食物摄入的效果，图12B示出了对体重的效果。图13示出了皮下(SC)注射载体、PYY3—36和线性30KmPEG马来酰亚胺(El0C)hPYY3—36对自发摄食小鼠的效果。图13A示出了对食物摄入的效果，图13B示出了对体重的效果。图14示出了IP注射0.1mg/kg后小鼠中PYY对血浆的影响。图14A示出了注射hPYY3.36后血浆PYY水平，图14B示出了注射线性30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36后血浆PYY水平。图15为得自闪烁迫近分析法(SPA)的PYY3.36或线性30KmPEG马来酰亚胺(￡10(:)￥￥3.36浓度响应曲线图，其中配体与"I-PYYw6竞争，以结合到表达在KAN-TS细胞上的Y2R。图16是用表达在KAN-TS膜上的Y2R进行的GTP7fSS]结合测定法获得的？￥￥3.36或线性30&mPEG马来酰亚胺(E10C)PYY3.36浓度响应曲线图。发明详述本发明涉及PYY激动剂(其为？￥￥3.36的变体)及其聚乙二醇化缀合物，其可具有至少一种改善的化学或生理学特性，所述特性选自(但不限于)降低的清除率、提高的血浆存留时间、延长的体内活性、提高的效能、提高的稳定性、提高的溶解度和降低的抗原性。本发明优选的PYY3.36变体为(El0C)hPYY3.36。另一优选的变体为(DllC)hPYY3.36。本发明的这些变体和其他变体可以以合成方式，通过如下文和本文实施例中所述重组方法和其他方法，或通过类似的方法产生。除了上述取代(例如E10C和D11C)夕卜，本发明的PYY激动剂还可包含其他氨基酸位置上一种或多种保守的氨基酸取代。保守性取代可以例如根据下表制造。脂肪族非极性的、极性不带电荷的和极性带电荷的氨基酸可分别取代另一非极性的、极性不带电荷的或极性带电荷的氨基酸。优选地，这类取代在下表中第三列中同行的氨基酸间发生。保守性氨基酸取代也可在下表所列芳香族氨基酸间进行。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>合成制备本发明的PYY3.36变体如(E10C)hPYY3.36和(01101^￥￥3.36可使用本领域己知的标准肽合成技术制备，例如使用自动肽合成仪(如型号433A;AppliedBiosystems,FosterCity,CA)利用tBoc或Fmoc化学通过固相肽合成法制备。可用的多种肽合成技术的概述可见于5b/W^"汰a^2nded.(Stewart,J.M.andYoung，J.D.,PierceChemicalCompany,Rockford,IL,1984)。还可参阅51。//^/05￡O"g纖'cS少威as7's(Burgess，K.，JohnWiley&Sons,NewYork,NY,2000)—书和Engels等，4wgew.CAew.i^/.28:716-34，1989—文。所有上述参考资料通过引用并入本文。本发明的PYY3-36变体优选与PEG缀合。缀合反应(称为聚乙二醇化反应)传统上在聚合物摩尔数过量的溶液中进行，并不考虑聚合物结合在蛋白质上的位置。然而，这类通用技术通常已被证明不适合用于将生物活性蛋白质与非抗原性聚合物缀合而保留足够的生物活性。在聚乙二醇化后保持￥￥3.36激动剂变体生物活性的一种方法为在偶联过程中基本上避免变体上与激动剂和靶受体结合相关的任何反应性基团的缀合。本发明的一个方面提供将聚乙二醇在特异反应性位点上缀合到本发明？￥￥3.36变体激动剂的方法，所述位点基本上不干扰受体结合位点，从而保留了高水平的活性。本发明的另一方面是向PYY3-36中插入反应性残基，以提供其激动剂变体，所述变体与聚乙二醇缀合时活性改变有限。通过共价键的化学修饰可在任何合适的条件下进行，所述条件通常适用于生物活性物质和活化的PEG的缀合反应。缀合反应在相对温和的条件下进行以避免PYY3.36变体激动剂失活。温和条件包括反应溶液的pH维持在约3到10的范围内，且反应温度在约(TC到4CTC的范围内。PYY3-36变体中在聚乙二醇化条件下与活化的PEG反应的非靶官能团优选使用合适的保护基团保护，所述保护基团在靶官能团聚乙二醇化后可去除。用如PEG醛或PEG琥珀酰亚胺的试剂聚乙二醇化游离氨基时，通常维持约3到10范围内的pH，优选约4到7.5。偶联反应优选在合适的缓冲液(pH3到10)如磷酸盐、MES、柠檬酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐或HEPES中，在约4匸到4(TC范围内进行约1到48小时。在用如PEG马来酰亚胺、PEG乙烯砜或PEG邻吡啶基二硫化物聚乙二醇化硫醇基时，优选维持约4到8范围内的pH。PEG胺可用于酮基团(如p-乙酰苯丙氨酸)中的聚乙二醇化中，并可如Pillai等，,Org.a柳.45:5364-5370,1980所述制备。本发明的缀合反应一般提供反应混合物或合并液，其中含有所需的单聚乙二醇化的？￥￥3.36变体以及未反应的？￥￥3.36变体肽、未反应的PEG和通常少于约20%的高分子量物质，所述高分子量物质可包含含有多于一条PEG链和/或聚集体物质的缀合物。除去未反应的物质和高分子量物质后，回收含有基本上单聚乙二醇化的？￥￥3.36变体的组合物。鉴于该缀合物通常包含单一的聚合物链，该缀合物基本上是同质的。所需的PEG-PYY3-36变体缀合物可通过一般用于蛋白质纯化的常规方法从反应混合物中纯化，所述方法例如为透析、盐析、超滤、离子交换色谱、疏水作用色谱(HIC)、凝胶色谱和电泳。离子交换色谱在去除任何未反应的？￡0或未反应的？￥￥3.36变体时特别有效。分离所需的PEG变体缀合物可通过将含有混合物质的反应混合物置于具有约4到约10pH值(优选低于8以避免脱酰胺作用)的缓冲溶液中来实现。缓冲溶液优选含有一种或多种选自(但不限于)KC1、NaCl、K2HP04、KH2P04、Na2HP04、NaH2P04、NaHC03、NaB04和CH3C02Na的缓冲盐。如果聚乙二醇化反应中使用的缓冲体系与分离过程中使用的不同，则将聚乙二醇化的反应混合物进行缓冲液交换/透析或用足量的初始分离缓冲液稀释。将缀合物分级分离成含有所需物质的合并液优选使用离子交换色谱介质进行。这类介质能够通过电荷差异选择性结合？￡04￥￥3.36变体缀合物，所述电荷差异以一定程度上可预测的方式变化。例如，？￥￥3.36变体的表面电荷通过肽表面上可用的带电基团的数量确定，所述基团能够与柱支撑物相互作用而不受PEG存在的影响。这些带电基团通常作为PEG聚合物的结合的可能位点。因此，？￡0^￥￥3.36变体缀合物会具有与其他存在物质种类不同的电荷，允许其选择性的分离。离子交换树脂特别优选用于纯化本发明的PEG-PYY3.36变体缀合物。阳离子交换树脂如磺丙基树脂用于本发明的纯化方法中。适用于本发明的非限制性的阳离子交换树脂包括SP-hitrap⑧、SPSepharoseHP⑧和SPSepharosefastflow。也可使用其他合适的阳离子交换树脂例如S和CM树脂。阳离子交换树脂优选装填在柱中，并通过常规手段平衡。使用与PEG-缀合的PYY3—36变体溶液具有相同pH和重量摩尔渗透压浓度的缓冲液。洗脱缓冲液优选含有一种或多种选自(但不限于)CH3C02Na、HEPES、KC1、NaCl、K2HP04、KH2P04、Na2HP04、NaH2P04、NaHC03、NaB04、和,4)2(:03的盐。然后含有缀合物的溶液吸附在柱上，而未反应的PEG和一些高分子量物质不会被保留。上样完成时，向柱中加入具有渐增盐浓度的洗脱缓冲液梯度琉以洗脱所需的？￡0-缀合的？"3.36变体级分。阳离子交换分离步骤后，洗脱合并的级分优选限于均一的聚合物缀合物。然后可通过常规技术从柱上洗脱任何未缀合的PYY3-36变体物质。需要时可通过额外的离子交换色谱或尺寸排除色谱将单或多聚乙二醇化的￥￥3.36变体种类和更高分子量的种类进一步彼此分离。可使用采用多个浓度逐渐增加的等度步骤的技术代替线性梯度。多个浓度逐渐增加的等度洗脱步骤会引起多聚乙二醇化/聚集的PYY3-36变体缀合物和随后单聚乙二醇化的PYY3-36变体缀合物的相继洗脱。也可使用基于pH梯度的洗脱技术。洗脱的温度范围一般在约4"C到约25T:之间。通过28011111处的紫外吸光度监测？￡0-￥￥3.36变体的洗脱。可通过单一时间洗脱图谱完成级分的收集。重组表达核酸分子编码(E10C)hPYY3.36多肽的核酸分子可包含下列核酸序列之一(E10C取代的密码子突变用下划线标出)3tcaaacccg3ggctcccggc盟gacgcctcgccgg绍gagctgaaccgctactacgcctccctgcgcc3ctacctcaacctggtcacccggcagcggtat(SEQIDNO:5);或atcaaacccgaggctcccggc躯gacgcctcgccggaggagctgaaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggcagcggtat(SEQIDNO:6)。编码(DllC)hPYY3-36多肽的核酸分子可包含下列核酸序列之一(D11C取代的密码子突变用下划线标出)atcaaacccgaggctcccggcgaa迪gcctcgccggaggagctgaaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggcagcggtat(SEQIDNO:7);或atcaaacccgaggctcccggcgaa躯gcctcgccggaggagctgaaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggcagcggtat(SEQIDNO:8)。这些序列也可在C末端包含终止密码子(例如tga、taa、tag)，并可以多种方法容易地获得，所述方法包括(但不限于)化学合成、从cDNA或基因组文库筛选获得的野生型hPYY多核苷酸序列遗传突变、表达文库筛选、和/或聚合酶链式反应(PCR)扩增cDNA。编码(E10C)hPYY3_36和(011(3)1^￥￥3.36变体的核酸分子可使用位点定向诱变、PCR扩增或其他合适的方法产生，其中引物具有期望的点突变。本文描述的重组DNA方法禾口诱变方法一般为Sambrook等，Mo/ecw/arC7麵'"gv爿丄a60rato7Mawwa/(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)禾口Cw^rewf尸ratocofeAfo/ecw/ar伤o/ogy(Ausubel等编，GreenPublishersInc.禾口WileyandSons1994)中公开的那些。当需要另一非天然存在氨基酸取代E10或D11时，可使用如美国专利申请公开号2005/0208536(其通过引用并入本文)中公开的方法重组表达这样的肽。编码hPYY氨基酸序列的核酸多核苷酸可通过表达克隆鉴定，其根据表达的蛋白质的性质检测阳性克隆。通常通过抗体或其他结合配偶体(例如受体或配体)与表达并显示在宿主细胞表面的克隆的蛋白质的结合来筛选核酸文库。用可检测标签修饰抗体或结合配偶体以鉴定这些表达目的克隆的细胞。可按照根据下文描述进行的重组表达技术产生编码(E10C)hPYY3.36和(011(:)1^￥￥3.36的多核苷酸并表达编码的多肽。例如，通过向合适的载体中插入编码(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3—36变体氨基酸序列的核酸序列，本领域技术人员可容易地大量制造目的核苷酸序列。然后可使用该序列产生检测探针或扩增引物。或者，可向表达载体中插入编码(￡10(3)11￥￥3.36或(011(:)11￥￥3_36多肽氨基酸序列的多核苷酸。通过将所述表达载体引入适当的宿主细胞，可大量产生编码的(E10C)hPYY3.36或(011(3)1^￥￥3.36变体。用于获得合适核酸序列的另一方法是聚合酶链式反应(PCR)。在该方法中，由多聚(A)+RNA或总RNA使用反转录酶制备cDNA。然后向cDNA中加入通常与编码(E10C)hPYY3-36或(DllC)hPYY3—36变体氨基酸序列的cDNA的两个独立区域互补的两个引物，同时加入聚合酶如Taq聚合酶，该聚合酶扩增两个引物之间的cDNA区域。制备编码(E10C)hPYY3.36或(011<3)11￥￥3.36变体氨基酸序列的核酸分子的其他方法为使用本领域技术人员熟知的方法(如Engels等，j"gevv.a，./w,/.28:716-34，1989中所述方法)的化学合成。这些方法包括用于核酸合成的磷酸三酯、亚磷酰胺和H-磷酸酯方法。用于这类化学合成的优选的方法为使用标准亚磷酰胺化学的聚合物支撑合成法。通常，编码(E10C)hPYY3-36氨基酸序列的DNA应为约一百核苷酸长度。大于100核苷酸的核酸可使用这些方法合成为若干片段。然后可将所述片段连接在一起形成(E10C)hPYY3.36基因的全长核苷酸序列。编码多肽氨基端的DNA片段可具有编码甲硫氨酸残基的ATG。该甲硫氨酸可出现或不出现在成熟形式的(E10C)hPYY^6或(DIIC)LP443-36中，这取决于宿主细胞中产生的多肽是否被设计从该细胞中分泌出。编码异亮氨酸的密码子也可用作起始位点。也可使用本领域技术人员己知的其他方法。在某些实施方案中，核酸变体含有经过改造以便(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3-36在给定的宿主细胞中最佳表达的密码子。特定的密码子改造将取决于(E1OC)hPYY3.36或(D11C)hPYY3.36和选择用于表达的宿主细胞。这类"密码子最优化"可通过多种方法完成，例如通过选择在给定的宿主细胞中高度表达的基因中优选使用的密码子。可使用计算机算法，其引入了高表达细菌基因密码子偏好性的密码子频率表(例如"EcoJiigh.Cod")，并由威斯康星大学软件包9.0版(GeneticsComputerGroup,Madison，Wis.)提供。其他有用的密码子频率表包括"Celegans—high.cod,""Celegans一low.cod，""Drosophila一high.cod,""Human—high.cod,""Maize一high.cod，"和"Yeast一high.cod."。载体和宿主细胞使用标准连接技术，将编码(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36氨基酸序列的核酸分子插入适当的表达载体中。通常选择在使用的特定宿主细胞中能够作用的载体(即载体与宿主细胞机制相容，使得基因的扩增和/或基因的表达能够发生)。可在原核宿主细胞、酵母、昆虫(杆状病毒体系)和/或真核宿主细胞中扩增/表达编码(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3-36氨基酸序列的核酸分子。表达载体的综述参见Me仇第185巻(D.V.Goeddel编，AcademicPress,1990)。通常，任何宿主细胞中使用的表达载体含有用于质粒维持和用于克隆和表达外源核苷酸序列的序列。这类在某些实施方案中总称为"侧翼序列"的序列通常包含一个或多个下列核苷酸序列启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整的内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码要表达的多肽的核酸分子的多接头区、及可选择的标记元件。这些序列各讨论如下。任选地，载体可含有"标签"编码序列，即位于(E10C)hPYY3—36或(DllC)hPYY3—36编码序列5'或3'端的寡核苷酸分子；该寡核苷酸序列编码多聚His(如六His)或另一"标签"如FLAG、HA(血凝素流感病毒)或myc(可购得其抗体)。该标签通常在表达多肽时融入多肽，并可作为从宿主细胞中亲和纯化(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36的手段。可通过例如柱色谱使用针对该标签的抗体作为亲和基质进行亲和纯化。任选地，标签可随后从纯化的(E1OC)hPYY3.36或(D11C)hPYY3—36中通过多种手段去除，如使用用于切割的某些肽酶，例如肠激酶消化FLAG标签序列的3'端，其为SEQIDNOs:3-4中所示氨基酸序列之一的上游。侧翼序列可以是同源的(即来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即来自除宿主细胞物种或菌株外的其它物种)、杂种(即来自多于一种来源的侧翼序列的组合)或合成的，或侧翼序列可以是通常作用于调节hPYY3—36表达的天然序列。侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物，任何脊椎或无脊椎生物、或任何植物，只要侧翼序列在宿主细胞机制中能够作用并可以被其激活。有用的侧翼序列可通过本领域公知的多种方法中的任一种来获得。通常，本文使用的侧翼序列(除PYY基因侧翼序列外)先前已通过基因定位和/或通过限制性内切酶消化鉴定，并因此可以使用适当的限制性内切酶从适当的组织来源中分离。在一些情况下可以知道侧翼序列的全长核苷酸序列。在此，可使用本文所述用于核酸合成或克隆的方法合成侧翼序列。当已知所有的或仅部分侧翼序列时，可使用PCR和/或通过用来自相同或另一物种的合适的寡核苷酸和/或侧翼序列片段筛选基因组文库获得。当未知侧翼序列时，含有侧翼序列的DNA片段可从更大段的DNA中分离，所述更大段DNA可包含例如编码序列或甚至另一基因或多个基因。分离可通过如下操作完成限制性内切酶消化产生合适的DNA片段，然后通过使用琼脂糖凝胶纯化、Qiagen⑧柱色谱(Chatsworth，CA)或其他的本领域技术人员已知的方法进行分离。选择合适的酶以完成该目的对本领域技术人员是显而易见的。一复制起点通常为市售购得的原核表达载体的一部分，并且该起点帮助载体在宿主细胞中扩增。在一些情况下，载体扩增至一定拷贝数对于(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36的最佳表达是重要的。如果选择的载体不含有复制起点，可以基于己知序列化学合成复制起点并连接进载体中。例如，来自质粒pBR322(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)的复制起点适用于大部分革兰氏阴性菌，而哺乳动物细胞中克隆载体可使用多种起点(例如SV40、多瘤、腺病毒、泡状口腔炎病毒(VSV)或乳头瘤病毒如HPV或BPV)。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点部件(例如通常使用SVO起点仅仅因为其含有早期启动子)。转录终止序列通常位于多肽编码区的3'端并用于终止转录。原核细胞中的转录终止序列通常为富含G-C的片段，其后接着多聚T序列。虽然该序列很容易从文库中克隆或甚至作为载体的一部分商业购买，但是其也可使用如本文所述的用于核酸合成的方法容易地合成。可选择的标记基因元件编码对宿主细胞在选择性培养基上存活并生长所必须的蛋白质。通常选择标记基因编码的蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素(如氨苄青霉素、四环素或用于原核宿主细胞的卡那霉素)的抗性；(b)补足细胞营养缺陷的不足；或(c)提供不能从复合培养基中获得的关键营养。优选的可选择标记为卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。也可使用新霉素抗性基因用于在原核和真核宿主细胞中的选择。其他选择基因可用于扩增要表达的基因。扩增是这样一个过程其中生产生长必需蛋白质时需求更大的基因在重组细胞染色体连续世代中串联重复。用于哺乳动物的合适的可选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中只有转化体由于载体中存在选择基因所以适应而唯一地存活。选择压力的施加通过将转化的细胞在如下条件下培养培养基中选择剂的浓度连续改变，从而使得选择基因和编码(E10C)hPYY3-36或(DllC)hPYY3-36的DNA均扩增。因此，由扩增的DNA合成数量提高的(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36。核糖体结合位点通常对mRNA的翻译起始是必须的，并且其特征为Shine-Dalgamo序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。该元件通常位于要表达的(El0C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36的启动子3'和编码序列5'。Shine-Dalgamo序列可以变化，但通常为聚嘌呤(即具有高A-G含量)。已经鉴定了许多Shine-Dalgamo序列，其各可使用本文公开的方法容易地合成并用于原核载体。前导序列或信号序列可用于将(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3—36导出宿主细胞。通常，编码信号序列的核苷酸序列位于(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36核酸分子的编码区，或直接位于(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3-36编码区的5'端。已经鉴定了许多信号序列，并且能在所选的宿主细胞中作用的任何信号序列可与(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36核酸分子结合使用。因此，信号序列与(E10C)hPYY3一36或(DllC)hPYY3.36核酸分子可以是同源(天然存在的)或异源的。另外，可使用本文所述方法化学合成信号序列。在多数情况下，(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3-36通过信号肽的存在从宿主细胞中分泌会引起信号肽而从分泌的(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36上被去除。信号序列可以是载体的部件，或其可以是插入载体的(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36核酸分子的一部分。编码天然hPYY3.36信号序列的核苷酸序列可并入(E1OC)hPYY3-36或0)1101^￥￥3.36编码区，或编码异源信号序列的核苷酸序列可并入(E10C;)hPYY3_36或(011(:)1^￥￥3.36编码区。所选的异源信号序列应是被宿主细胞识别并加工(即信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工天然hPYY信号序列的原核宿主细胞而言，信号序列被选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列所取代。对于酵母分泌而言，天然hPYY信号序列可被酵母转化酶、a因子或酸性磷酸酶前导序列取代。在哺乳动物细胞表达中，天然信号序列就符合要求，但是其他哺乳动物信号序列可以是合适的。在许多情况下，通过载体中一个或多个内含子的存在促进核酸分子转录，这特别适用于在真核宿主细胞(特别是哺乳动物宿主细胞)中产生多肽的情况。使用的内含子可以是hPYY基因中天然存在的内含子，尤其当使用的基因为全长基因组序列或其片段时。当内含子并非天然存在于基因中时(如对于多数cDNA而言)，内含子可以从另一来源获得。内含子相对于侧翼序列和hPYY基因的位置通常很重要，因为内含子必须通过转录生效。因此，当编码(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYYs.36的cDNA分子被转录时，内含子优选的位置为转录起始位点3'和多聚A转录终止序列5'。优选地，内含子位于cDNA的一侧或另一侧(即5'或3')使得其不干扰编码序列。可使用来自任何来源，包括病毒、原核和真核(植物或动物)生物的任何内含子，只要该内含子与其被插入的宿主细胞相容。本文还包括合成的内含子。任选地，载体中可使用多于一种内含子。表达和克隆载体通常包含被宿主生物识别并有效连接在编码(E10C)hPYY3.36或(D11C)hPYY3.36的分子上的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(即5，)(通常在约100到1000bp之内)，调控结构基因转录的非转录序列。传统上将启动子分为两种类别之一诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子对培养条件中的一些改变(如营养物的存在或缺失，或温度的改变)做出应答时，启动它们调控下的DNA的提高的转录水平。另一方面，组成型启动子启动持续的基因产物制造，即对基因表达存在很少或不存在调控。巳知被多种可能的宿主细胞识别的大量启动子。通过限制性酶消化将启动子从来源DNA上取下并将所需启动子序列插入载体，将合适的启动子有效连接在编码(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36的DNA上。天然hPYY3.36启动子序列可用于指导(E10C)hPYY3.36或DllC)hPYY3.36核酸分子的扩增和/或表达。然而，如果与天然启动子相比，异源启动子允许更多转录和产生更多表达的蛋白质，且如果其可与选择使用的宿主细胞体系相容，则优选异源启动子。适用于原核宿主的启动子包括3内酰胺酶和乳糖启动子体系；大肠杆菌T7诱导型RNA聚合酶；碱性磷酸酶；色氨酸(TRP)启动子体系和杂交启动子体系，如tac启动子。其他已知的细菌启动子也是合适的。它们的序列已经被公开，从而使本领域技术人员能够使用提供所需的任何有用的限制性位点的接头或连接子，以将其连接至所需的DNA序列上。适用于酵母宿主细胞的合适启动子也为本领域所公知。增强子可有利地与酵母启动子一同使用。适用于哺乳动物宿主细胞的启动子是公知的，并包括(但不限于)得自病毒基因组的启动子，所述病毒如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙肝病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)。其他合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动子启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。调控(E10C)hPYY3-36或(DllC)hPYY3.36表达的值得注意的其他启动子包括(但不限于)SVO早期启动子区(BemoistandChambon，A^/we290:304-10,1981)/CMV启动子；包含在Rous肉瘤病毒3'长端重复中的启动子(Yamamoto等，Ce〃22:787-97,1980);疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，尸賜.扁.JcW.t/.".78:1444-45,1981);金属硫蛋白(metal固onine)基因调节序列(Brinster等,胸訓296:39-42,1982);真核表达载体如P-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，尸rac.A/a仏^cadm75:3727-31,1978);或tac启动子(DeBoer等，P賜.編.Jcad.m,80:21-25，1983)。可以向载体中插入增强子序列以促进编码(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36的DNA在高等真核动物中的转录。增强子是DNA的顺式作用元件(通常约10-300bp长度)，其对启动子作用，以促进转录。增强子相对不依赖于方向和位置。其被发现位于转录单元的5'和3'。已知若千可得自哺乳动物基因的增强子序列(例如球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、a-胎儿蛋白和胰岛素)。然而，通常会使用来自病毒的增强子。SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子是用于激活真核启动子的示例性增强元件。虽然可以将增强子剪接入载体中(E10C)hPYY3—36或(DllC)hPYY3-36的编码核酸分子的位置5'或3，，但是其通常位于启动子的5'位点。可从如市售可得的起始载体构建表达载体。这类载体可以包含或不包含所有所需的侧翼序列。当本文所述的一种或多种侧翼序列并非已经存在于载体中时，可以单独获得它们并连接进载体。用于获得各侧翼序列的方法为本领域技术人员公知。优选的载体为可以与细菌、昆虫和哺乳动物宿主细胞相容的载体。这类载体包括pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)、pBSII(Stratagene，LaJolla，CA)、pET15(Novagen,Madison,WI)、pGEX(PharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)、pEGFP-N2(Clontech,PaloAlto,CA)、pETL(BlueBacII,Invitrogen)、pDSR-a(PCTAppl.Publ.No.WO90/14363)禾口pFastBacDual(Gibco-BRL,GrandIsland,NY)等。其他合适的载体包括，但不限于粘粒、质粒或修饰的病毒，但是应当理解载体体系必须与选择的宿主细胞相容。这类载体包括，但不限于质粒如Bluescript⑧质粒衍生物(高拷贝数的基于ColEl的噬菌粒，Stratagene)、设计为用于克隆Taq扩增的PCR产物的PCR克隆质粒(例如TOPO⑧TA克隆⑧试剂盒、PCR2.1⑧质粒衍生物，Invitrogen)和哺乳动物、酵母或病毒载体，如杆状病毒表达体系(pBacPAK质粒衍生物，Clontech)。构建好载体并将编码(E10C)hPYY3.36或(01101^￥￥3.36多肽的核酸分子插入载体的合适位点后，可将完成的载体插入用于扩增和/或多肽表达的合适宿主细胞中。将(E10C)hPYY3.36或(D11C)hPYY3.36多肽的表达载体转化进所选的宿主细胞可通过公知方法完成，包括的方法例如为转染、感染、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖法或其他已知技术。所选择的方法应部分取决于要使用的宿主细胞的类型。这些方法和其他合适的方法为技术人员所公知，并公开于例如Sambrook等(出处同上)。宿主细胞可以是原核宿主细胞(如大肠杆菌)或真核宿主细胞(如酵母、昆虫或脊椎动物细胞)。在合适条件下培养时，宿主细胞合成(E10C)hPYY3.36或(011(:)1^￥￥3.36多肽，其可随后从培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌进培养基中)或直接从产生它的宿主细胞中收集(如果其未被分泌)。合适宿主细胞的选择取决于多种因素，例如所需的表达水平、活性所期望或必需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)和易于折叠为生物活性分子。大量合适的宿主细胞为本领域已知，并可得自美国菌种保藏中心(AmericanTypeCultureCollection(ATCC),Manassas,Va)。实例包括，但不限于哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、CHODHFR(-)细胞(Urlaub等，尸rac.iVaf/.jc^/.>SW.KS乂97:4216-20,1980)、人胚肾细胞(HEK)293或293T细胞或3T3细胞。合适的哺乳动物宿主细胞的选择以及用于转化、培养、扩增、筛选、产物制造和纯化的方法为本领域已知。其他合适的哺乳动物细胞系为猴COS-l和COS-7细胞系和CV-l细胞系。其他示例性的哺乳动物宿主细胞包括灵长类细胞系和啮齿类细胞系，包括转化的细胞系。正常的二倍体细胞、得自原始组织体外培养物的细胞株以及原始外植体也是合适的。候选细胞可以遗传上缺少选择基因，或可含有显性作用的选择基因。其他合适的哺乳动物细胞系包括，但不限于小鼠神经母细胞瘤N2A细胞、HELA、小鼠L-929细胞、得自Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK仓鼠细胞系。这些细胞系各为蛋白质表达领域技术人员已知并可获得。细菌细胞可类似地用作合适的宿主细胞。例如，多种大肠杆菌菌株(例如HB101、DH5a、DH10和MC1061)为生物
技术领域：
公知的宿主细胞。多种枯草杆菌(及^te'fo)、假单胞菌属(尸w^/omoww)、其他杆菌属(Sa"'//ws)和链霉菌属(5V"/tow7ca5)也可用于该方法。许多本领域技术人员已知的酵母细胞菌株也可作为表达(E10C)hPYY3.36和(DllC)hPYY3-36多肽的宿主细胞。优选的酵母细胞包括例如酿酒酵母(xSacc/wrow少ces禾口巴斯德毕赤酵母(尸z'c/n.a/(xsto/ls)。另外，需要时可使用昆虫细胞体系表达(E10C)hPYY3.36和(DllC)hPYY3.36。这类体系描述于例如Kitts等，1993，所0&cAm々1^14:810-17;Lucklow，C鮮.O一.飽ec/mo/.4:564-72,1993;和Lucklow等,/Wra/"67:4566-79，1993。优选的昆虫细胞为Sf-9和Hi5(Invitrogen)。(E10C)hPYY3.3^n(DllC)hPYY3—36多肽生产包含(E10C)hPYY3-36或(DllC)hPYY3-36表达载体的宿主细胞系可使用技术人员公知的标准培养基培养。培养基通常含有细胞生长和存活必需的全部营养物。用于培养大肠杆菌细胞的合适培养基包括例如LuriaBroth(LB)和/或TerrificBroth(TB)。用于培养真核细胞的合适培养基包括RoswellParkMemorialInstitute培养基1640(RPMI1640)、最小必需培养基(MEM)禾口/或Dulbecco's改进的Eagle培养基(DMEM)，其均可根据培养的特定细胞系的需要补充血清和/或生长因子。用于昆虫培养的合适培养基为根据需要补充有酵母自溶液(yeastolate)、乳清蛋白水解产物禾口/或胎牛血清的Grace's培养基。通常以添加物的形式向培养基中添加抗生素或其他用于转染的或转化的细胞选择性生长的化合物。要使用的化合物应由转化宿主细胞的质粒上存在的可选择标记元件指定。例如，当可选择标记元件为卡那霉素抗性时，加入培养基中的化合物应为卡那霉素。用于选择性生长的其他化合物包括氨苄青霉素、四环素和新霉素。宿主细胞产生的(E10C)hPYY3—36或(D11C)hPYY3.36多肽的量可使用本领域已知方法评估。这类方法包括，但不限于Westem印迹分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)分离、免疫沉淀和/或活性测定，例如DNA结合凝胶迁移测定法。如果(El0C)hPYY3.36或(Dl1C)hPYY3.36被设计为从宿主细胞系中分泌，大部分多肽可在细胞培养基中被发现。然而，如果多肽未从宿主细胞中分泌，其将存在于细胞质和/或细胞核(对于真核宿主细胞)或胞质溶胶(对于革兰氏阴性细菌宿主细胞)中。对于位于宿主细胞细胞质和/或细胞核(对于真核宿主细胞)或胞质溶胶(对于细菌宿主细胞)、细胞内物质(包括革兰氏阴性菌的包涵体)中的(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36而言，其可使用技术人员已知的任何标准技术从宿主细胞中提取。例如，可通过French压碎、匀化禾fl/或声裂法裂解宿主细胞使其释放周质和/或细胞质内涵物，然后离心。如果(E10C)hPYY3-36或(DllC)hPYY3-36在胞质凝胶中形成包涵体，所述包涵体常结合在内和/或外细胞膜上，因此离心后其主要可以在沉淀物材料中找到。然后可在极端pH下处理或用离液剂(例如洗涤剂、胍、胍衍生物、尿素或尿素衍生物)在存在还原剂(例如碱性pH时用二硫苏糖醇或酸性pH时用三羧乙基膦)时处理，以释放、解离和溶解包涵体。然后可使用凝胶电泳、免疫沉淀等分析溶解的(E10C)hPYY3—36或(DllC)hPYY3.36。如果需要分离多肽，可使用如本文和Marston等，MeA.￡"z.182:264-75,1990所述的标准技术完成分离。如果表达(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3—36时没有形成显著程度的包涵体，则多肽会主要在离心细胞匀桨后在上清液中发现。可使用如本文所述的方法从上清液中分离多肽。可使用多种技术从溶液中纯化(ElOC)hPYY3.36或(D11C)hPYY3.36。如果多肽合成时其羧基端或氨基端含有标签，例如六组氨酸9或其他小肽如FLAG(EastmanKodakCo.,NewHaven,CT)或myc(Invitrogen)，贝U其可在一步过程中通过将溶液穿过亲和柱进行纯化，所述柱中柱基质对标签具有高亲和力。例如，聚组氨酸以高亲和力和特异性与镍结合。因此，镍亲和柱(例如Qiagen⑧牵臬柱)可用于纯化。参阅例如Q/^reWProtocolMo/ecw/wAo/ogyf10.11.8(Ausubel等编，GreenPublishersInc.禾卩WileyandSons,1993)。另外，(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36多肽可通过能够特异识别并结合^10(:)11￥￥3.36或(011(:)11￥￥3.36多肽的单克隆抗体进行纯化。在优选部分或完全纯化(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36多肽使其部分或基本上不含污染物的情况下，可使用本领域技术人员已知的标准方法。这类方法包括，但不限于通过电泳和随后的电洗脱分离、各种类型的色谱(亲和、免疫亲和、分子筛和离子交换)、HPLC和制备性等电聚焦(Isoprime"仪器/技术，HoeferScientific,SanFrancisco,CA)。在一些情况下，可组合使用两种或更多种纯化技术以达到增加纯度。本领域己知大量用于生产多肽的其他方法，这些方法可用于生产(E10C)hPYY3.36和(DllC)hPYY3.36多肽。参阅例如Roberts等，MzZ/.t/JJ.94:12297-303,1997，其描述了制造mRNA及其编码的肽之间的融合蛋白。还参阅Roberts，C^'".C/em.历o/.3:268-73，1999。用于生产肽或多肽的方法也描述于美国专利号5，763，192、5,814,476、5,723,323和5,817,483。该方法涉及制造推测的基因或其片段，然后将这些基因引入宿主细胞，该宿主细胞产生由推测的基因编码的一种或多种蛋白质。然后筛选宿主细胞，鉴定产生具有目的活性的肽或多肽的克隆。用于重组月太表达的其他方法公开于美国专利号6，103,495、6,210,925、6,627,438和6，737，250。该方法使用大肠杆菌和大肠杆菌一般分泌途径。该肽与信号序列最虫合，从而该肽目标为用于分泌。用于生产肽或多肽的另一方法描述于PCT专利申请公开号WO99/15650。公开的方法(称为用于发现基因的基因表达随机激活)涉及通过原〗立重组方法激活内源基因表达或过基因表达。例如通过将调节序列整合进革巴细胞激活或提高内源基因的表达，所述靶细胞能够通过非同源或非常规重组激活基因表达。先将靶DNA接受辐射，并插入遗传启动子。该启动子最终在基因前部布置一断裂，起始基因的转录。这引起所需肽或多肽的表达。酰胺化通过称为肽酰-甘氨酸-a-酰胺化单加氧酶(PAM)的酶，将合成或重组的肽酰胺化。当使用细菌表达体系重组产生(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36肽时，该肽可以使用重组PAM酶通过体外反应被C端酰胺化。PAM酶来源、其产生和纯化的方法以及可以用于酰胺化(E10C)hPYY3.36或(011(:)11￥￥3.36肽的方法描述于例如美国专利号4,708,934、5,789,234和6,319,685。选择性(E10C)hPYY3.36和(DllC)hPYY3.36抗体特异结合(￡10<:)11￥￥3.36或(011(:)11￥￥3.36多肽(其在半胱氨酸取代位点聚乙二醇化或未聚乙二醇化(如本文所述))，但不选择性结合天然hPYY3.36的抗体和抗体片段，属于本发明范围之内。抗体可以是多克隆的，包括单特异性多克隆的；单克隆的；重组的；嵌合的；人源化的，例如CDR-移植的；人的；单链的和/或双特异性的以及其片段、变体或衍生物。抗体片段包括与(E10C)hPYY3.36和(DllC)hPYY3.36多肽上表位结合的抗体部分。这类片段的实例包括通过酶切全长抗体产生的Fab和F(ab')片段。其他的结合片段包括通过重组DNA技术(例如表达含有编码抗体可变区核酸序列的重组质粒)产生的片段。针对(E10C)hPYY3_36或(D11C)hPYY3.36多肽的多克隆抗体通常通过多次SC或IP注射(E10C)hPYY3—36或(DllC)hPYY3.36多肽和佐剂在动物(例如兔和小鼠)中产生。也可将(E10C)hPYY3-36或(DllC)hPYY3.36多肽与在要免疫的物种中具有致免疫性的载体蛋白质缀合，所述载体蛋白质例如钥孔虫戚血蓝素(keyholelimpethemocyanin)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。也可使用凝集剂如明矾来增强免疫应答。免疫后将动物抽血并检测血清的抗(E10C)hPYY3.36或抗(D11C)hPYY3.36抗体效价。使用通过培养中的连续细胞系制备抗体分子的任何方法来制备针对(E10C)hPYY3_36或(D11C)hPYY3.36多肽的单克隆抗体。用于制备单克隆抗体的合适方法的实例包括Kohler等，A^似re256:495-97,1975的杂交瘤方法，和人B细胞杂交瘤方法(Kozbor,丄/mm"wo/.133:3001，1984;Brodeur等，Mowoc/owfl//VofiM"细7iec/m一as1朋fi^///z'ca"o似，51-63(MarcelDekker,Inc.,1987))。本发明还提供制造与(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36多肽反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。通过竞争性抑制确定单克隆抗体特异性和亲和力的优选的方法可见于HarlowandLane,Jw幼O(iierylLaZ0rato7M朋wa/(ColdSpringHarborLaboratories,1989);Cwrmz/z'w7mmw"o/og>>(Colliganetal"eds"GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience,1993);禾口Muller,Me仇E"zj;mo/.92:589-601,1988。本发明的嵌合抗体可包含单独的H和/或L免疫球蛋白链。优选的嵌合体H链包含从对(E10C)hPYY3-36或(DllC)hPYY3.36多肽特异的非人抗体H链衍生的抗原结合区，其连接在至少部分人H链C区(CH)如C^或CH2上。优选的嵌合体L链包含从对(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3-36多肽特异的非人抗体L链衍生的抗原结合区，其连接在至少部分人L链C区(CL)上。嵌合抗体及其制造方法为本领域已知。参阅Cabilly等，尸rac.A^//.XcaJ.U.S.A.81:3273-77,1984;Momson等,尸rac.淑/.爿cm/.Scz'.U.S.A.81:6851-55,1984;Boulianne等，7V^wre312:643-46，1984;Neuberger等，7Va^re314:268-70,1985;Liu等，尸rac.iVa".^cW.5b'.U.S.A.84:3439-43,1987;和HarlowandLane,同上。也可根据本领域已知的方法，通过个体多肽链的适当结合制备具有拥有相同或不同可变区结合特异性的具有嵌合的H链和L链的选择性结合齐ll。参阅例如Cw;rewf尸ratoco/sMo/ecw/ar5z'o/ogy(Ausubel等编，GreenPublishersInc.andWileyandSons,1994)禾卩HarlowandLane,同上。使用该方法，将表达嵌合的H链(或其衍生物)的宿主细胞与表达嵌合的L链(或其衍生物)的宿主细胞分开培养，并分开回收免疫球蛋白链，然后将其结合。或者，宿主细胞可以共培养，并使得链在培养基中自发结合，然后回收装配好的免疫球蛋白。在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体为"人源化"抗体。用于人源化非人抗体的方法为本领域已知。参阅美国专利号5,585,089和5,693,762。通常，人源化抗体带有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。人源化可例如使用本领域描述的方法(Jones等，1986，7Va/"re321:522-25;Riechmann等，1998,A^wre332:323-27;Verhoeyen等，1988,5We"ce239:1534-36)通过将至少一部分啮齿类互补性决定区(CDR)取代相应的人抗体区来完成。不制造单克隆抗体的用于创建抗体分子抗原结合区(即Fab或可变区片段)的重组DNA版的技术包含在本发明范围内。在该技术中，从被免疫动物的免疫系统细胞内提取抗体特异的信使RNA分子并转录为cDNA。然后将cDNA克隆进细菌表达体系中。适用于实践本发明的这种技术的一个实例使用带有前导序列的噬菌体入载体体系，所述前导序列使表达的Fab蛋白移至周质空间(细菌细胞膜和细胞壁之间)或被分泌。可以快速制造并筛选大量结合抗原的功能性Fab片段。这类(E10C)hPYY3-36-或(DllC)hPYY3—3结合分子(对(E10C)hPYY3.36-或(Dl1C)hPYY3-3多肽具有特异性的Fab片段)特别包含在本文使用的术语"抗体"内。本发明的范围还包括发展用于制造嵌合抗体的技术，其将来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有合适生物活性(例如激活人补体和介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力)的人抗体分子的基因剪接在一起。Morrison等，尸roc.7Va//.JcW.5W.CZ&A81:6851-55，1984;Neuberger等，7Va似w,312:604-08,1984。选择性结合剂，如通过该技术制造的抗体，包括在本发明范围内。应当理解本发明并非仅限于小鼠或大鼠的单克隆抗体；事实上可使用人抗体。这类抗体可通过使用人杂交瘤获得。因此，结合(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36多肽的完全人抗体包含在本发明内。这类抗体通过用(E10C)hPYY3—36或(DllC)hPYY3.36抗原(任选地与载体缀合)免疫能够制造人抗体集合而不制造内源免疫球蛋白的转基因动物(如小鼠)来制造。参阅例如Jakobovits等,尸rac.扁.JcW.Scz'.90:2551-55，1993;Jakobovits等，iVa^^e362:255-58,1993;Bruggemann等,Fearz力/mmw肌7:33-40，1993。本发明还包括结合(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3.36多肽的人抗体。使用能够制造人抗体集合而不制造内源免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)，通过用任选地缀合在载体上的(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3-36多肽抗原(即具有至少6个连续氨基酸)将其免疫制造这类抗体。参阅例如Jakobovits等，1993(出处同上);Jakobovits等,胸厨362:255-58，1993;Bruggermann等，1993(出处同上)。在一种方法中，将编码其中重和轻免疫球蛋白链的内源基因座失能，并将编码人重链和轻链蛋白质的基因座插入其基因组来制造这类转基因动物。然后将部分修饰的动物(即具有少于全部补体修饰的动物)杂交获得具有所有所需免疫系统修饰的动物。当施用免疫原后，这些转基因动物产生具有人(而非例如鼠)氨基酸序列的抗体，其包含对这些抗原免疫特异的可变区。参阅PCT专利申请公开号WO96/33735和WO94/02602。其他的方法描述于美国专利号5,545，807，PCT专利申请公开号WO91/10741和WO90/04036，以及欧洲专利号0546073Bl和PCT专利申请公开号WO92/03918中。还可通过如本文所述在宿主细胞中表达重组DNA或通过在杂交瘤细胞中表达来制造人抗体。在另一实施方案中，还可从噬菌体展示文库中制造人抗体(Hoogenboom等，M/.編.227:381，1991;Marksetal"/M。/.編.222:581,1991)。这些过程模拟免疫选择，通过在丝状噬菌体表面展示抗体谱，随后通过噬菌体与所选抗原的结合选择噬菌体。这样一种技术描述于PCT专利申请公开号WO99/10494中，其描述了使用该方法分离MPL和msk受体的高亲和力和功能性激动抗体。嵌合抗体、CDR移植抗体和人源化抗体通常通过重组方法制造。将编码抗体的核酸引入宿主细胞中，并使用本文所述的和本领域已知的材料和方法表达。在优选的实施方案中，抗体在哺乳动物宿主细胞如CHO细胞中产生。单克隆(如人)抗体可通过如本文所述在宿主细胞中表达重组DNA或通过在杂交瘤细胞中表达来制造。本发明的抗-(E10C)hPYY3.36和抗(D11<:)1^￥￥3.36抗体可用于任何已知的测定方法中，如用于检测和定量(E10C)hPYY3.36和(DllC)hPYY3.36多肽的竞争性结合测定、直接和间接三明治分析法和免疫沉淀测定(Sola,Mwoc/o加/爿Ma肌a/</recAm々wes，147-158(CRCPress,Inc.，1987))，以及多肽纯化。该抗体以适用于所使用测定法的亲和力与(￡10<:)1^￥￥3.36或(011(:)11￥￥3.36多肽结合。本发明的PYY激动剂可以提供为本发明方法使用的药学可接受酸加合盐的形式。本发明化合物的代表性药学可接受酸加合盐包括氢氯化物、氢溴化物、氢碘化物、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟碱酸盐、醋酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、延胡索酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、p-甲苯磺酸盐、巴莫酸盐、棕榈酸盐、丙二酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、硼酸盐、六氟磷酸盐、萘酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐和月桂基磺酸盐等。当变体用作制备PEG-PYY3.36变体缀合物的中间体时，未聚乙二醇化变体的盐不需要是药学可接受的。本发明的PYY激动剂通常以药物组合物的形式施用。药物组合物可以是适用于以下施用方式的形式口服施用(例如锭剂、胶囊、丸剂、粉剂、溶液、悬浮液)、胃肠外注射(例如无菌溶液、悬浮液或乳剂)、鼻内施用(例如气溶胶滴剂)、直肠施用(如栓剂)或经皮肤(如贴片)。药物组合物可以是精确剂量的适合单次施用的单位剂型。该药物组合物将包含常规的药学载体和作为活性成分的本发明PYY激动剂。另外，其可包含其他药剂、佐剂等。制备生物活性肽的多种药物组合物的方法为制药科学领域所公知。例如参阅美国专利申请公开号2005/0009748(用于口服施用)；以及2004/0157777、2005/0002927和2005/0215475(用于穿过粘膜施用，例如鼻内或夹员方但用)。还可参阅ie附z'wgtow:7Tze尸racriceo/P/za/7wac少,LippincottWilliamsandWilkins，Baltimore,MD,20thed.2000。本发明的PYY激动剂可与用于治疗本文所述疾病状态或病症的药剂组合使用。因此本发明还提供包括将本发明化合物与其他药剂组合施用的治疗方法。可与本发明PYY激动剂组合使用的合适的药剂包括其他抗肥胖剂，例如大麻素-1(CB陽1)拮抗剂(如利莫那班(rimonabant))、lip-羟基类固醇脱氢酶-1(1型11(3-HSD)抑制剂、MCR-4激动剂、胆囊收縮素-A(CCK-A)激动剂、单胺再摄取抑制剂(如西布曲明(sibutramine))、拟交感神经剂、p3肾上腺素能受体激动剂、多巴胺受体激动齐U(如溴隐亭(bromocriptine))、黑色素细胞刺激激素受体类似物、5HT2c受体激动剂、黑色素浓縮激素拮抗剂、莱普亭(leptin)、莱普亭类似物、莱普亭受体激动剂、甘丙肽拮抗剂、脂酶抑制剂(如四氢制胰脂菌素(tetrahydrolipstatin，即奥利斯他(orlistat))、厌食剂(如铃蟾肽(bombesin)激动剂)、神经肽-Y受体拮抗剂(例如NPYY5受体拮抗剂)、拟甲状腺素剂、脱氢表雄酮或其类似物、糖皮质激素受体激动剂或拮抗剂、阿立新受体拮抗剂、高血糖素样肽-l受体激动剂、睫状神经营养因子(如可得自RegeneronPharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NYandProcter&GambleCompany,Cincinnati,OH的AxokineTM)、人类野灰蛋白相关蛋白(AGRP)抑制剂、生长素释放肽受体拮抗剂、组胺3受体拮抗剂或逆转激动剂、神经介素U受体激动剂、MTP/ApoB抑制齐lj(例如肠选择性MTP抑制剂，例如dirlotapide)等。可与本发明PYY激动剂组合使用的优选的抗肥胖剂包括CB-1受体拮抗剂、肠-选择性MTP抑制剂、CCKa激动剂、5HT2c受体激动剂、NPYY5受体拮抗剂、奥利斯他和西布曲明。本发明方法所使用的优选的CB-1受体拮抗剂包括利莫那班(SR141716A，也已知其商标名AcompliaTM)，其可从Sanofi-Synthelabo获得或可如美国专利号5,624,941所述制备；iV-(哌啶-l-基)-l-(2,4-二氯苯基)-5-(4-碘代苯基)-4-甲基-lH-吡唑-3-羧酰胺(AM251)，其可得自TocrisTM,Elisville,MO;[5-(4-溴代苯基)-l-(2,4-二氯-苯基)-4-乙基-AKl-哌啶基H界吡唑-3-羧酰胺](SR147778)，其可如美国专利号6,645,985所述制备；7V-(哌啶-l-基)-4,5-二苯基-l-甲基咪唑-2-羧酰胺、7V-(哌啶-l-基)-4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-氯苯基)-l-甲基咪唑-2-羧酰胺、AK哌啶-1-基)_4,5_二_(4-甲苯基)-l-甲基咪唑-2-羧酰胺、7V-环己基-4,5-二-(4-甲苯基)-1-甲基咪唑-2-羧酰胺、iV-(环己基)-4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-氯苯基)-l-甲基咪唑-2-羧酰胺和AK苯基)-4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-氯苯基)-l-甲基咪唑-2-羧酰胺，其可如PCT专利申请公开号WO03/075660中所述制备；l-[9-(4-氯苯基)-8-(2-氯苯基)-9H-嘌呤-6-基]-4-乙氨基-哌啶-4-羧酸酰胺的氢氯化物、甲磺酸盐和苯磺酸盐，其可如美国专利申请公开号2004/0092520所述制备;l-[7-(2-氯苯基)-8-(4-氯苯基)-2-甲基-吡唑并[l,5-a][l,3,5]三嗪-4-基]-3-乙氨基-吖丁啶-3-羧酸酰胺和1-[7-(2-氯苯基)-8-(4-氯苯基)-2-甲基4匕唑并[1,5-a][l，3，5]三嗪-4-基]-3-甲氨基-吖丁啶-3-羧酸酰胺，其可如美国专利申请公开号2004/0157839所述制备；3-(4-氯苯基)-2-(2-氯苯基)-6-(2,2-二氟丙基)-2,4，5,6-四氢-吡唑并[3,4-c]吡啶-7-酮，其可如美国专利申请公开号2004/0214855所述制备；3-(4-氯苯基)-2-(2-氯苯基)-7-(2，2-二氟丙基)-6，7-二氢-2H，5H-4-氧杂-l，2，7-三氮杂-甘菊环-8-酮，其可如美国专利公开号2005/0101592所述制备；2-(2-氯苯基)-6-(2，2,2-三氟-乙基)-3-(4-三氟甲基-苯基)-2，6-二氢-卩比唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，其可如美国专利申请公开号2004/0214838所述制备；(3)-4-氯-1^{[3-(4-氯苯基)-4-苯基-4,5-二氢-妣唑國1-基]-甲氨基-甲叉》-苯磺酰胺(SLV-319)和(S)-N-U3-(4-氯苯基)-4-苯基-4,5-二氢-吡唑-l-基]-甲氨基-甲叉卜4-三氟甲基-苯磺酰胺(SLV-326)，其可如PCT专利申请公开号WO02/076949所述制备；N-哌啶基-5-(4-溴代苯基)-l-(2,4-二氯苯)-4-乙基吡唑-3-羧酰胺，其可如美国专利号6,432,984所述制备；1-[二(4-氯苯基)-甲基]-3-[(3,5-二氟-苯基)-甲磺酰基-甲叉]-吖丁啶，其可如美国专利号6,518,264所述制备；2-(5-(三氟甲基)口比啶-2-基氧基)-N-(4-(4-氯苯基)-3-(3-氰苯基)丁-2-基)-2-甲基丙酰胺，其可如PCT专利申请公开号WO04/048317所述制备；4-{[6-甲氧基-2-(4-甲氧苯基)-1-苯并呋喃-3-基]羰基}苄腈(LY-320135)，其可如美国专利号5,747，524所述制备；l-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(4-氟苯基)-苯并[l，3]二氧杂环戊烯-5-磺酰]-哌啶，其可如WO04/013120所述制备；和[3-氨基-5-(4-氯苯基)-6-(2,4-二氯苯基)-呋喃并[2,3-b]吡啶-2-基]-苯基-甲酮，其可如PCT专利申请公开号WO04/012671所述制备。可用于本发明组合、药物组合物和方法的优选的肠作用MTP抑制剂包括dirlotapide((5>1{2-[苄基(甲基)氨基]-2-氧代-1-苯乙基}-1-甲基-5-[4'-(三氟甲基)[l,l'-联苯基]-2-羧酰胺基]-l界吲哚-2-羧酰胺)和l-甲基-5-[(4'-三氟甲基-联苯基-2-羰基)-氨基]-lH-吲哚-2-羧酸(氨甲酰基-苯基-甲基)-酰胺，其都可使用美国专利号6,720,351中所述的方法制备；(S)-2-[(4'-三氟甲基-联苯基-2-羰基)-氨基]-喹啉-6-羧酸(戊基氨甲酰基-苯基-甲基)-酰胺、(S)-2-[(4'-叔-丁基-联苯基-2-羰萄-氨基]-喹啉-6-羧酸([(4-氟-节基)-甲基-氨甲酰基]-苯基-甲基卜酰胺和(3)-2-[(4'-叔丁基-联苯基-2-羰基)-氨蜀-喹啉-6-羧酸[(4-氟-苄基氨甲酰基)-苯基-甲基]-酰胺，其都可如美国专利申请公开号2005/0234099Al所述制备；(-)-4-[4-[4-[4-[[(2&4R)-2-(4-氯苯基)-2-[[(4隱甲基-4//-1,2，4-三唑-3-基)璜酰]甲基-1,3-二氧杂环戊垸-4-基]甲氧基]苯基]哌嗪-l-基]苯基]-2-(li)-l-甲基丙基]-2,4-二氢-3界l,2，4-三唑-3-酮(也称为Mitratapide或R103757)，其可如美国专利号5,521,186和5,929，075所述制备;和英普他派(implitapide)(BAY13-9952)，其可如美国专利号6,265，431所述制备。最优选的是dirlotapide、mitratapide、(S)-2-[(f-三氟甲基-联苯基-2-羰萄-氨蜀-喹啉-6-羧酸(戊基氨甲酰基-苯基-甲基)-酰胺、(S)l[(叔丁基-联苯基-2-羰基)-氨基]-喹啉-6-羧酸{[(4-氟-节基)-甲基-氨甲酰基]-苯基-甲基}-酰胺或(S)-2-[(4'-叔丁基-联苯基-2-羰基)-氨基]-喹啉-6-羧酸[(4-氟-节基氨甲酰基)-苯基-甲基]-酰胺.优选的NPYY5受体拮抗剂包括2-氧代-N-(5-苯基吡啶)螺环[异苯并呋喃-l(3H),4'-哌啶]-l'-羧酰胺，其可如美国专利申请公开号2002/0151456所述制备;和3-氧代-N-(5-苯基-2-吡嗪基)-螺环[异苯并呋喃-l(3H)，4'-哌啶]-l'-羧酰胺；3-氧代-^(7-三氟甲基吡啶并[3,2七]吡啶-2-基)-螺环-[异苯并呋喃-l(3H),4'-哌啶]-l'-羧酰胺；N-[5-(3-氟苯基)-2-嘧啶細-3-氧代螺环-[异苯并呋喃-l(3H),[4'-哌啶]-l'-羧酰胺；及式-3'-氧代-^(5-苯基-2-嘧啶基)]螺环[环己垸-l，l'(3'H)-异苯并呋喃]-4-羧酰胺；反式-3，-氧代-N-[l-(3-喹啉基)-4-咪唑基]螺环[环己烷-l,l'(3'H)-异苯并呋喃]-4-羧酰胺；反式-3-氧代-^(5-苯基-2-哌嗪基)螺环[4-氮杂异苯并呋喃-1(3印,1'-环己烷]-4'-羧酰胺；及式-^[5-(3-氟苯萄-2-嘧啶基]-3-氧代螺环[5-氮杂异苯并呋喃-1(3H),l'-环己垸]-4'-羧酰胺；^式-N-[5-(2-氟苯基)-2-嘧啶基]-3-氧代螺环[5-氮杂异苯并呋喃-l(3H)，l'-环己烷]-4'-羧酰胺；及式-^[1-(3，5-二氟苯基)-4-咪唑基]-3-氧代螺环[7-氮杂异苯并呋喃-l(3H),l'-环己烷]-4'-羧酰胺；^式-3-氧代^-(1-苯基-4-吡唑基)螺环[4-氮杂异苯并呋喃-1(3印，1'-环己烷]-4'-羧酰胺；^式-N-[H2-氟苯基)-3-吡唑基]-3-氧代螺环[6-氮杂异苯并呋喃-1(3H),l'-环己烷]-4'-羧酰銜^式-3-氧代-N-(l-苯基-3-吡唑萄螺环[6-氮杂异苯并呋喃-l(3H)，l'-环己烷]-4'-羧酰胺和反式-3-氧代-^(2-苯基-1,2,3-三唑-4-基)螺环[6-氮杂异苯并呋喃-l(3H),l'-环己烷]-4'-羧酰胺，其均可如PCT专利申请公开号WO03/082190所述制备;以及它们的药学可接受盐和酯。所有上述美国专利和出版物均通过引用并入本文。在本发明方法中，单独的或与一种或多种其他药剂组合的本发明的PYY激动剂以本领域已知的任何常规外周施用方法单独或一起外周施用给受治者。因此，PYY激动剂或组合可肠胃外(例如静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下)、鼻内、口服、舌下、颊部、通过吸入(例如通过气溶胶)、直肠(例如通过栓剂)或经皮肤施用给受治者。肠胃外施用是优选的施用方法，皮下施用是优选的肠胃外施用方法。适用于胃肠外注射的组合物通常包括药学可接受无菌水或非水溶液、分散液、悬浮液或乳剂，以及用于重建为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水或非水载体或稀释剂(包括溶剂和载体)的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合适等混合物、甘油三酯(包括植物油如橄榄油)和可注射有机酯如油酸乙酯。这些用于肠胃外注射的组合物还可含有赋形剂，如防腐剂、湿润剂、助溶剂、乳化剂和分散剂。可以使用多种抗菌剂和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等达成组合物的微生物污染预防。其还可按需要包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。可通过使用能够延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)达成可注射药物组合物的延缓吸收。施用给受治者的本发明的PYY激动剂的剂量取决于大量因素而变化，包括施用方式、受治者年龄和体重、在治疗的疾病、病症或失调的严重程度和施用的PYY激动剂的药学活性。特定患者剂量范围和最佳剂量的确定为本领域普通技术人员所熟知。就肠胃外施用而言，本发明的PYY激动剂可以以如下剂量水平施用给人类受治者，所述剂量以未聚乙二醇化变体为基础在约0.01/zg/kg到约10mg/kg/剂的范围内。例如对于30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36而言，肠胃外给药水平以^10(:)11￥￥3.36为基础将在约0.01^g/kg到约10mg/kg/剂的范围内，优选在约0.05mg/kg到约1.0mg/kg/剂，或约0.05或0.1mg/kg到约1.0mg/kg/剂，或约0.05或0.1mg/kg到约0.3或0.5mg/kg/剂的范围内。例如，85mg的分子量为约34024Da(30kDaPEG加上未聚乙二醇化的肽的分子量4024)的30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36的剂量等同于以未聚乙二醇化(E10C)hPYY3-36为基础的10mg。给药方案可以是每天一剂或多剂，优选在餐前，或特别的对于30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36或20KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36而言，优选每周2或3次或一周一次或每10-14天一次的给药方案。本发明的实施方案由下列实施例说明。然而应当理解本发明的实施方案并非仅限于这些实施例的特定细节，因为本领域普通技术人员可以由本公开文件和附属的权利要求书启发了解或明白其其他变化。所有本文所列的参考资料通过弓I用并入本文。实施例实施例l线性30K和20KmPEG和20K马来酰亚胺(E10C)hPYY^该实施例提供残基10连接有mPEG(30K或20K)的基本同质的单聚乙二醇化的(E1OC)hPYY3—36的制法。(a)制备(E10C)hPYY^使用自动肽合成仪(433A型；AppliedBiosystems,FosterCity,CA)利用Fmoc策略，用六氟磷酸2-(lH-苯并三唑-l-基)-l,l，3，3-四甲基脲鎗(uronium)(HBTU)活化(Fastmoc，0.15mmoH盾环)通过固相方法合成(E10C)PYY3—36。Asn、Gln、Cys和His使用的侧链保护基团为Trt;Ser、Thr和Tyr使用的侧链保护基团为tBu;Lys使用的侧链保护基团为Boc;Asp和Glu使用的侧链保护基团为OtBu;Arg使用的侧链保护基团为Pbf。用9mL三氟醋酸(TFA)、0.5g苯酚、0.5mLH20、0.5mL硫代茴香醚和0.25mL1,2乙二硫醇的混合物在室温下处理4小时完成肽-树脂的切割。在冰冷的乙醚中沉淀肽并用乙醚洗涤，将其溶于DMSO，并在WatersDeltapakC18，15um,IOOA,50x300mmlD柱(Cat#WAT011801，Waters,Milford,MA)上，使用从100X溶剂A'.0y。溶剂B到70V。溶剂A:30。/。溶剂B的线性梯度在30分钟内以80mL/min的流速，通过反相HPLC纯化。溶齐IJA为0.1。/。TFA(三氟醋酸)水溶液。溶剂B为0.1。/。TFA的乙腈溶液。通过ESI-MS确认纯化的肽的分子量(MAvg-4024)并通过反相HPLC评估纯度(图l)。(V)制备线性30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY^将约30,000MW(SunbrightME画300MA,NOFCorporation,Tokyo，Japan)的线性mPEG马来酰亚胺试剂选择性地偶联至(E10C)hPYY3—36上残基IO的半胱氨酸硫氢基上。通过直接加入肽以产生lmg/mL肽浓度和约l:l的mPEG:(E10C)hPYY3.36相对摩尔比例，使溶解在20mMHEPES(SigmaChemical,St.Louis,MO)pH7.0或者20mM醋酸钠(SigmaChemical,St.Louis,MO)pH4.5中的线性30KmPEG马来酰亚胺立刻与(E10C)hPYY3-36肽反应。反应在避光下于室温进行0.5-24小时。通过将HEPESpH7.0中的反应物在20mM醋酸钠pH4.5中稀释将反应终止，并立即在阳离子交换色谱中纯化。在20mM醋酸钠pH4.5中的反应物直接上样至阳离子交换色谱中。使用SEC-HPLC评估反应产物(图2)。(c)纯化线性30KmPEG马来酰亚胺(E10OhPYY^使用单一离子交换色谱步骤从反应混合物中将聚乙二醇化的(￡10(3)1^￥￥3.36物质纯化至〉95%。从未修饰的(E10C)hPYY3.36和更大分子量物质中使用阳离子交换色谱纯化单聚乙二醇化的(E10C)hPYY3.36。将如上所述的典型的线性301<:111￡0马来酰亚胺(￡10(:)11￥￥3.36反应混合物(10mg蛋白质)在用20mM醋酸钠，pH4.5(缓冲液A)平衡的SP-SepharoseHitrap柱(5mL)(AmershamPharmaciaBiotech,GEHealthcare,Piscataway，NJ)上分级分离。用缓冲液A将反应混合物稀释7倍并以2.5mL/min的流速上样在柱上。用5-10倍柱体积的缓冲液A洗涤柱。随后用20个柱体积的0-100mM线性NaCl梯度将不同的(E10C)hPYY3-36种类从柱上洗脱。通过280nm(A28Q)处的吸光度监测洗脱液，并收集适当大小的级分。根据通过@303{八0￡评估的聚乙二醇化程度合并级分(图3)。然后在Centriprep3浓縮仪(AmiconTechnologyCorporation,Northborough,MA)中或者使用Vivaspin10K浓縮仪(VivascienceSartoriusGroup,Hannover,Germany)将纯化的合并液浓縮至0.5-5mg/mL。通过将RPHPLC峰面积与PYY^标准曲线(未示出)比较确定纯化的合并液的蛋白质浓度，或者，使用实验得到的消光系数通过280nm处的吸光度确定纯化的合并液的浓度。图6示出了使用SEC-HPLC得到的聚乙二醇化的(El0C)hPYY3-36的纯化合并液的分布图谱。(d)制备线性20KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY^将约20，000MW的线性mPEG马来酰亚胺试剂(SunbrightME-200MA，NOFCorporation)选择性地偶联至(E10C)hPYY3.36上残基10的半胱氨酸硫氢基上。通过直接加入肽以产生lmg/mL肽浓度和约1.3:l的mPEG:(E10C)hPYY3.36相对摩尔比例，使溶解在20mM醋酸钠(SigmaChemical,St.Louis,MO)pH4.5中的线性20KmPEG马来酰亚胺立刻与(E10C)hPYY3-36肽反应。反应在避光下于室温进行60分钟后在《C下进行16个小时。在20mM醋酸钠pH4.5中的反应物直接上样至阳离子交换色谱中。使用SEC-HPLC评估反应产物。(e)纯化线性20KmPEG马来酰亚胺(E10OhPYY3^使用单一离子交换色谱步骤从反应混合物中将聚乙二醇化的(E10C)hPYY3-36物质纯化至〉95。/。。从游离的PEG、未修饰的(E10C)hPYY3.36和更大分子量物质中使用阳离子交换色谱分离单聚乙二醇化的(E10C)hPYY3-36。将如上所述的典型的20KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36反应混合物(20mg蛋白质)在用20mM醋酸钠，pH4.5(缓冲液A)平衡的SP-SepharoseHitrap柱(5mL)(AmershamPharmaciaBiotech,GEHealthcare)上分级分离。将反应混合物以l.OmL/min的流速上样在柱上。用4倍柱体积的缓冲液A以2.5mL/min的流速洗涤柱。随后用25个柱体积的0-200mM线性NaCl梯度以2.5mL/min的流速将不同的(E10C)hPYY3—36种类从柱上洗脱。通过280nm(A28Q)处的吸光度监测洗脱液，并收集适当大小的级分。根据通过SEC-HPLC评估的聚乙二醇化程度合并级分。然后使用Vivaspin10K浓縮仪(VivascienceSartoriusGroup)将纯化的合并液浓縮至0.5-5mg/mL。使用实验得到的消光系数通过280nm处的吸光度确定纯化的合并液的蛋白质浓度。纯化的单20KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36的总过程产率为38%。SEC-HPLC确定单20KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36的合并液的纯度为96QX。实施例2线性30KmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYY^该实施例提供残基ll连接有mPEG的基本同质的单聚乙二醇化的(DllC)hPYY3.36的制法。(a)制备(D110hPYY^使用自动肽合成仪(433A型；AppliedBiosystems,FosterCity,CA)利用Fmoc策略，用六氟磷酸2-(lH-苯并三唑-l-基)-l，l，3，3-四甲基脲鐵(HBTU)活化(Fastmoc,0.15mmol循环)通过固相方法合成(DllC)hPYY3-M。Asn、Gln、Cys和His使用的侧链保护基团为Trt;Ser、Thr和Tyr使用的侧链保护基团为tBu;Lys使用的侧链保护基团为Boc;Asp和Glu使用的侧链保护基团为OtBu;Arg使用的侧链保护基团为Pbf。用9mL三氟醋酸(TFA)、0.5g苯酚、0.5mLH20、0.5mL硫代茴香醚和0.25mL1,2-乙二硫醇的混合物在室温下处理4小时完成肽-树脂的切割。在冰冷的乙醚中沉淀肽并用乙醚洗涤，将其溶于DMSO，并在WatersDeltapakC18,15um,IOOA，50x300mmlD柱(Cat#WAT011801,Waters,Milford,MA)上，使用从100X溶剂A:0。/。溶齐IJB到70。/。溶剂A:30。/。溶剂B的线性梯度在30分钟内以80mL/min的流速，通过反相HPLC纯化。溶齐1仏为0.1%TFA(三氟醋酸)水溶液。溶剂B为0.1。/。TFA的乙腈溶液。通过ESI-MS确认纯化的肽的分子量(MAv^4038)并通过反相HPLC评估纯度(图4)。(V)制备线性30KmPEG马来酰亚胺O)llC)hPYY"6将约30，000MW(SunbrightME-300MA,NOFCorporation,Tokyo,Japan)的线性mPEG马来酰亚胺试剂选择性地偶联至(DllC)hPYY3-36上残基ll的半胱氨酸硫氢基上。通过直接加入肽以产生lmg/mL肽浓度和约l:l的mPEG:—(DllC)hPYY3-36相对摩尔比例，使溶解在20mMHEPES(SigmaChemical,StLouis，MO)pH7.0中的线性30KmPEG马来酰亚胺立刻与(DllC)hPYY3.36肽反应。反应在避光下于室温进行0.5-24小时。通过将反应物在20mM醋酸钠pH4.5中稀释将其终止，并立即在阳离子交换色谱中纯化。使用SEC-HPLC评估反应产物(图5)。或者，不是如上所述将线性30KmPEG马来酰亚胺溶解在HEPES中，而是将其溶解在20mM醋酸钠(SigmaChemical,St.Louis,MO),pH4.5中，并通过直接加入肽以产生lmg/mL肽浓度和约l:l的mPEG:(DllC)hPYY3_36相对摩尔比例，使其立刻与(DllC)hPYY3.36肽反应。反应在避光下于室温进行0.5-24小时。反应物直接上样于阳离子交换色谱中。使用SEC-HPLC评估反应产物。〖c)纯化线性30KmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYY^使用单一离子交换色谱步骤从反应混合物中将聚乙二醇化的(Dl1<:)1^￥￥3.36物质纯化至>95%。从未修饰的(D11C)hPYY3.36和更大分子量物质中使用阳离子交换色谱纯化单聚乙二醇化的(DllC)hPYY3.36。将如上所述的典型的30KmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYY3.36反应混合物(10mg蛋白质)在用20mM醋酸钠，pH4.5(缓冲液A)平衡的SP-SepharoseHitrap敏5mL)(AmershamPharmaciaBiotech,GEHealthcare,Piscataway,NJ)上分级分离。用缓冲液A将反应混合物稀释7倍(pH7.0)并以2.5mL/min的流速上样在柱上。用5-10倍柱体积的缓冲液A洗涤柱。随后用20个柱体积的0-100mM线性NaCl梯度将不同的(DllC)hPYY3.36种类从柱上洗脱。通过280nm(A，)处的吸光度监测洗脱液，并收集适当大小的级分。根据通过SECHPLC评估的聚乙二醇化程度合并级分。然后在VivaspinIOK浓縮仪(VivascienceSartoriusGroup,Hannover,Germany)将纯化的合并液浓縮至0.5-5mg/mL。通过将RPHPLC峰面积与PYY3.36标准曲线(未示出)比较确定纯化的合并液的蛋白质浓度。图7示出了使用SEC-HPLC得到的聚乙二醇化的(DllC)hPYY3-36的纯化合并液的分布图谱。或者将来自上述(b)的反应物(pH4.5)以2.5mL/min的流速直接上样在柱上并使用实验得到的消光系数通过280nm处的吸光度确定纯化的合并液的浓度。实施例3支化的43KmPEG马来酰亚胺〖E10C〗hPYY"fi该实施例提供残基10连接有mPEG的基本同质的单聚乙二醇化的(E10C)hPYY3.36的制法。fa)制备支化的43KmPEG马来酰亚胺(E10OhPYY^将约43,000MW(SunbrightME画400MA,NOFCorporation,Tokyo,Japan)的支化mPEG马来酰亚胺试剂选择性地偶联至如实施例l(a)所述制备的OE10C)hPYY3.36上残基10的半胱氨酸硫氢基上。通过直接加入肽以产生lmg/mL肽浓度和约l:l的mPEG:(E10C)hPYY3-36相对摩尔比例，使溶解在20mMHEPES(SigmaChemical，St.Louis,MO)pH7.0中的支化的43KmPEG马来酰亚胺立刻与(E10C)hPYY3.36肽反应。反应在避光下于室温进行0.5-24小时。通过将HEPESpH7.0中的反应物在20mM醋酸钠pH4.5中稀释将反应终止，并立即在阳离子交换色谱中纯化。使用SEC-HPLC评估反应产物(图8)。或者，将支化的43KmPEG马来酰亚胺溶解在20mM醋酸钠(SigmaChemical,St.Louis，MO),pH4.5中，并通过直接加入肽以产生lmg/mL肽浓度和约1:1的mPEG:(E10C)hPYY3.36相对摩尔比例，使其立刻与(E10C)hPYY3—36肽反应。反应物直接上样于阳离子交换色谱中。(b)纯化单聚乙二醇化的支化的43KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY^从未修饰的(￡10(:)11￥￥3.36和更大分子量物质中使用单一阳离子交换色谱步骤分离单聚乙二醇化的支化43KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3—36。将如上所述的典型的支化的43K1^￡0马来酰亚胺(￡10(:)11￥￥3.36反应混合物(10mg蛋白质)在用20mM醋酸钠，pH4.5(缓冲液A)平衡的SP-SepharoseHitrap禾主(5mL)(AmershamPharmaciaBiotech,GEHealthcare)上分级分离。用缓冲液A将pH7.0的反应混合物稀释10倍并以2.5mL/min的流速上样在柱上。用5-10倍柱体积的缓冲液A洗涤柱。随后用20个柱体积的0-100mM线性NaCl梯度将不同的(E10C)hPYY3.36种类从柱上洗脱,通过280nm(A28。)处的吸光度监测洗脱液，并收集适当大小的级分。？根据通过SEC-HPLC评估的聚乙二醇化程度合并级分。然后在Centriprepl3浓縮仪(AmiconTechnologyCorporation)中或者使用Vivaspin10K浓縮仪(VivascienceSartoriusGroup)将纯化的合并液浓縮至0.5-5mg/mL。通过氨基酸分析定量纯化的合并液的蛋白质浓度。图9示出了使用SEC-HPLC得到的单聚乙二醇化的支化的43KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36的纯化合并液的分布图谱。或者，通过将RPHPLC峰面积与PYY3.36标准曲线(未示出)比较，或使用实验得到的消光系数通过280nm处的吸光度确定纯化的合并液的浓度。实施例4该实施例考虑制备残基10连接有线性的12kDmPEG或支化的20kDmPEG的基本同质的单聚乙二醇化的(DllC)hPYY3.36，以及考虑制备残基11连接有线性的20kDmPEG、线性的12kDmPEG或支化的20kDmPEG的基本同质的单聚乙二醇化的(DllC)hPYY^。(a)制备线性12KmPEG马来酰亚胺〖E1OC)hPYY^将约12,000MW(SunbrightME-120MA,NOFCorporation)的线性mPEG马来酰亚胺试剂选择性地偶联至(E10C)hPYY3.36上残基10的半胱氨酸硫氢基上。通过直接加入肽以产生lmg/mL肽浓度和约1:1的mPEG:(E10C)hPYY3-36相对摩尔比例，使溶解在20mM醋酸钠(SigmaChemical)pH4.5中的线性12KmPEG马来酰亚胺立刻与(E10C)hPYY3.36肽反应。反应在避光下于室温进行0.5-24小时。在20mM醋酸钠，pH4.5中的反应物直接上样至阳离子交换色谱中。使用SEC-HPLC或SDS-PAGE评估反应产物。(b)纯化线性12KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYYw6使用单一离子交换色谱步骤从反应混合物中将聚乙二醇化的(E10C)hPYY3.36物质纯化至〉95。/。。从未修饰的(E10C)hPYY3.36和更大分子量物质中使用阳离子交换色谱分离单聚乙二醇化的(E10C)hPYY3.36。将如上所述的典型的线性12KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36反应混合物(10mg蛋白质)在用20mM醋酸钠，pH4.5(缓冲液A)平衡的SP-SepharoseHitrap銜5mL)(AmershamPharmaciaBiotech,GEHealthcare)上分级分离。以l.OmL/min的流速将反应混合物上样在柱上。用4倍柱体积的缓冲液A以2.5mL/min的流速洗涤柱。随后，用25倍柱体积的0-200mM线性NaCl梯度以2.5mL/min的流速将不同的(E10C)hPYY3-36种类从柱上洗脱。通过280nm(A28Q)处的吸光度监测洗脱液，并收集适当大小的级分。根据通过SEC-HPLC评估的聚乙二醇化程度合并级分。然后使用VivaspinIOK浓縮仪(VivascienceSartoriusGroup)将纯化的合并液浓縮至0.5-5mg/mL。使用实验得到的消光系数通过280nm处的吸光度确定纯化的合并液的蛋白质浓度。使用SEC-HPLC或SDS-PAGE得到12KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36的纯化合并液的分布图谱。(c)制备支化的20KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY^^将约20,000MW(SunbrightGL-2-200MA,NOFCorporation)的支化的mPEG马来酰亚胺试剂选择性地偶联至(E10C)hPYY3—36上残基10的半胱氨酸硫氢基上。通过直接加入肽以产生lmg/mL肽浓度和约l:l的mPEG:(E10C)hPYY3.36相对摩尔比例，使溶解在20mM醋酸钠(SigmaChemical,St.Louis,MO)pH4.5中的支化的20KmPEG马来酰亚胺立刻与(E10C)hPYY3.36肽反应。反应在避光下于室温进行0.5到24小时。在20mM醋酸钠，pH4.5中的反应物直接上样至阳离子交换色谱中。使用SEC-HPLC或SDS-PAGE评估反应产物。(d)纯化支化的20KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36使用单一离子交换色谱步骤从反应混合物中将聚乙二醇化的(E10C)hPYY3-36物质纯化至〉95。/。。从游离的PEG、未修饰的(E10C)hPYY3—36和更大分子量物质中使用阳离子交换色谱分离单聚乙二醇化的(E10C)hPYY3-36。将如上所述的典型的支化的20KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3—36反应混合物(10mg蛋白质)在用20mM醋酸钠，pH4.5(缓冲液A)平衡的SP-SepharoseHitrap柱(5mL)(AmershamPharmaciaBiotech,GEHealthcare)上分级分离。以l.OmL/min的流速将反应混合物上样在柱上。用4倍柱体积的缓冲液A以2.5mL/min的流速洗涤柱。随后用25倍柱体积的0-200mM线性NaCl梯度以2.5mL/min的流速将不同的(E10C)hPYY3.36种类从柱上洗脱。通过280nm(A28Q)处的吸光度监测洗脱液，并收集适当大小的级分。根据通过SEC-HPLC评估的聚乙二醇化程度合并级分。然后使用Vivaspin10K浓縮仪(VivascienceSartoriusGroup)将纯化的合并液浓縮至0.5-5mg/mL。使用实验得到的消光系数通过280nm处的吸光度确定纯化的合并液的蛋白质浓度。使用SEC-HPLC或SDS-PAGE得到20KmPEG马来酰亚胺(￡10(:)11￥￥3.36的纯化合并液的分布图谱。(e)制备线性的20KmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYY"6将约20,000MW(SunbrightME-200MA,NOFCorporation)的线性mPEG马来酰亚胺试剂选择性地偶联至(01101^￥￥3.36上残基11的半胱氨酸硫氢基上。通过直接加入肽以产生lmg/mL肽浓度和约1:1的mPEG:(DllC)hPYY3—36相对摩尔比例，使溶解在20mM醋酸钠(SigmaChemical)pH4.5中的线性20KmPEG马来酰亚胺立刻与(DllC)hPYY3.36肽反应。反应在避光下于室温进行0.5到24小时。在20mM醋酸钠，pH4.5中的反应物直接上样至阳离子交换色谱中。使用SEC-HPLC或SDS-PAGE评估反应产物。ffl纯化线性的20KmPEG马来酰亚胺(DllOhPYY,.!使用单一离子交换色谱步骤从反应混合物中将聚乙二醇化的(011(:)11卩￥￥3.36物质纯化至>95%。从游离的PEG、未修饰的(DllC)hPYY3.36和更大分子量物质中使用阳离子交换色谱分离单聚乙二醇化的(DllC)hPYY3.36。将如上所述的典型的线性20KmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYY3-36反应混合物(10mg蛋白质)在用20mM醋酸钠，pH4.5(缓冲液A)平衡的SP-SepharoseHitrap柱(5mL)(AmershamPharmaciaBiotech,GEHealthcare)上分级分离。以l.OmL/min的流速将反应混合物上样在柱上。用4倍柱体积的缓冲液A以2.5mL/min的流速洗涤柱。随后用25倍柱体积的0-200mM线性NaCl梯度以2.5mL/min的流速将不同的(DllC)hPYY3-36种类从柱上洗脱。通过280nm(A28Q)处的吸光度监测洗脱液，并收集适当大小的级分。根据通过SEC-HPLC评估的聚乙二醇化程度合并级分。然后使用Vivaspin10K浓縮仪(VivascienceSartoriusGroup)将纯化的合并液浓縮至0.5-5mg/mL。使用实验得到的消光系数通过280nm处的吸光度确定纯化的合并液的蛋白质浓度。使用SEC-HPLC或SDS-PAGE得到20KmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYY3-36的纯化合并液的分布图谱。W制备线性12KmPEG马来酰亚胺(Dl1C)hPYYw6将约12,000MW(SimbrightME-120MA,NOFCorporation)的线性mPEG马来酰亚胺试剂选择性地偶联至(DllC)hPYY3-36上残基10的半胱氨酸硫氢基上。通过直接加入肽以产生lmg/mL肽浓度和约l:l的mPEG:(DllC)hPYY3-36相对摩尔比例，使溶解在20mM醋酸钠(SigmaChemical,St.Louis,MO)pH4.5中的线性12KmPEG马来酰亚胺立刻与(DllC)hPYY3.36肽反应。反应在避光下于室温进行0.5到24小时。在20mM醋酸钠，pH4.5中的反应物直接上样至阳离子交换色谱中。使用SEC-HPLC或SDS-PAGE评估反应产物。(h)纯化线性12KmPEG马来酰亚胺(Dl10hPYY^使用单一离子交换色谱步骤从反应混合物中将聚乙二醇化的(DllC)hPYY3-36物质纯化至〉95。/。。从游离的PEG、未修饰的(DllC)hPYY3.36和更大分子量物质中使用阳离子交换色谱分离单聚乙二醇化的(DllC)hPYY3.36。将如上所述的典型的线性12KmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYY3-36反应混合物(10mg蛋白质)在用20mM醋酸钠，pH4.5(缓冲液A)平衡的SP-SepharoseHitrap柱(5mL)(AmershamPharmaciaBiotech,GEHealthcare)上分级分离。以l.OmL/min的流速将反应混合物上样在柱上。用4倍柱体积的缓冲液A以2.5mL/min的流速洗涤柱。随后用25倍柱体积的0-200mM线性NaCl梯度以2.5mL/min的流速将不同的(DllC)hPYY3.36种类从柱上洗脱。通过280nm(A28Q)处的吸光度监测洗脱液，并收集适当大小的级分。根据通过SEC-HPLC评估的聚乙二醇化程度合并级分。然后使用Vivaspin10K浓縮仪(VivascienceSartoriusGroup)将纯化的合并液浓縮至0.5-5mg/mL。使用实验得到的消光系数通过280nm处的吸光度确定纯化的合并液的蛋白质浓度。使用SEC-HPLC或SDS-PAGE得到12KmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYY3-36的纯化合并液的分布图谱。。制备支化的20KmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYYw将约20,000MW(SunbrightGL2-200MA,NOFCorporation)的支化的mPEG马来酰亚胺试剂选择性地偶联至(DllC)hPYY3-36上残基10的半胱氨酸硫氢基上。通过直接加入以肽产生lmg/mL肽浓度和约l:l的mPEG:(DllC)hPYY3.36相对摩尔比例，使溶解在20mM醋酸钠(SigmaChemical，St.Louis，MO)pH4.5中的支化20KmPEG马来酰亚胺立刻与(DllC)hPYY3.36肽反应。反应在避光下于室温进行0.5到24小时。在20mM醋酸钠，pH4.5中的反应物直接上样至阳离子交换色谱中。使用SEC-HPLC或SDS-PAGE评估反应产物。ffl纯化支化的20KmPEG马来酰亚胺(Dl1C)hPYY二^使用单一离子交换色谱步骤从反应混合物中将聚乙二醇化的(DllC)hPYY3.36物质纯化至〉95。/。。从游离的PEG、未修饰的(D1lC)hPYY3-36和更大分子量物质中使用阳离子交换色谱分离单聚乙二醇化的(DllC)hPYY3.36。将如上所述的典型的支化20KmPEG马来酰亚胺卩11(:)1^￥￥3.36反应混合物(10mg蛋白质)在用20mM醋酸钠，pH4.5(缓冲液A)平衡的SP-SepharoseHitrap柱(5mL)(AmershamPharmaciaBiotech,GEHealthcare)上分级分离。以l.OmL/min的流速将反应混合物上样在柱上。用4倍柱体积的缓冲液A以2.5mL/min的流速洗涤柱。随后用25倍柱体积的0-200mM线性NaCl梯度以2.5mL/min的流速将不同的(DllC)hPYY3.36种类从柱上洗脱。通过2S0nm(A28。)处的吸光度监测洗脱液，并收集适当大小的级分。根据通过SEC-HPLC评估的聚乙二醇化程度合并级分。然后使用Vivaspin10K浓縮仪(VivascienceSartoriusGroup)将纯化的合并液浓縮至0.5-5mg/mL。使用实验得到的消光系数通过280nm处的吸光度确定纯化的合并液的蛋白质浓度。使用SEC-HPLC或SDS-PAGE得到支化的20KmPEG马来酰亚胺(D11C)hPYY3.36的纯化合并液的分布图谱。实施例5生化特性通过不同的生化方法，包括电喷雾质谱法(ESI-MS)、SDS-PAGE和SECHPLC以及RPHPLC，分别表征(E10C)hPYY3-36、(DllC)hPYY3-36和聚乙二醇化形式的(El0C)hPYY3-36和(D11C)hPYY3.36。(A)电喷雾电离质谱法(ESI-MS)在1100系列LC/MSD电喷雾质谱仪(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)上，在正离子模式下进行的(实施例l(a)、2(a))。(B)在ZORBAXEclipseXDB陽C8，4.6X150mm，5mm柱(Cat#993967-906,AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)上，以1.5ml/分钟的流速，使用3分钟内从100X溶剂A、0X溶剂B到95X溶剂A、5X溶剂B，然后在12分钟内从95X溶剂A、5X溶剂B到50X溶剂A、50X溶剂B的线性梯度，进行反相色谱(实施例l(a))用于分析(E10C)hPYY3.36肽(图1和4)。溶剂A为O.lXTFA溶液。溶剂B为0.1X的TFA乙腈溶液。在VydacC18(2.1x250mm)柱(Cat#218MS552,Vydac,Hesperia,CA)上，以0.2ml/分钟的流速，使用48分钟内从80X溶剂A、20X溶剂B到40X溶剂A、60。X溶剂B的线性梯度，进行反相色谱(实施例1C,2C)用于定量聚乙二醇化的(E10C)hPYY3-36和(DllC)PYY3-36(未示出)。溶剂A为0.1XTFA的水溶液。溶剂B为0.085X的TFA乙腈溶液。(C)尺寸排除高性能液相色谱(SEC-HPLC)使用非变性SEC-HPLC评估线性30K或支化的43KmPEG与(E10C)hPYY3.36或(DlIC)hPYY3-36的反应混合物、它们的阳离子交换纯化合并液和最终纯化的产物(实施例l(b)和(c)，2(b)和(c))。在20mM磷酸盐，pH7.4、150mMNaCl中使用ShodexKW804或TSKG4000PWXL(Tosohaas)，以1.0mL/分钟的流速进行分析性非变性SEC-HPLC(任选地可使用Superdex2007.8mmX30cm,AmershamBioscience,Piscataway，NJ)。聚乙二醇化大幅提高蛋白质的流体动力学体积，引起向更早保留时间的偏移。在30KmPEG马来酰亚胺与(E10C)hPYY3.36的反应混合物中，可观察到对应于残留的未修饰(￡10(3)11￥￥3.36的小峰，和对应于聚乙二醇化肽种类的新峰(图2)。在剩余非常少量未修饰(D11C)hPYY3-36或(E10C)hPYY3.36的情况下，在30KmPEG(DllC)hPYY3—36和支化的43KmPEG(E10C)hPYY3-36反应混合物中观察到新的物质种类(图5和图8)。通过SP-Sepharose色谱将这些聚乙二醇化和未聚乙二醇化的物质分级分离，并且所得的纯化的单mPEG(E10C)hPYY3.36和mPEG(Dl1C)hPYY3.36物质随后在非变性SEC上显示洗脱为>95%纯度的单峰(图6、图7和图9)。SP-Sepharose色谱步骤从单聚乙二醇化的线性30K和支化的43KmPEG(E10C)hPYY3-36或mPEG(DllC)hPYY3_36中有效地去除游离的mPEG、(E10C)hPYY3-36或(Dl1C)hPYY3-36和更大分子量物质。(D)SDSPAGE还使用SDS-PAGE(实施例l(c))评估反应、阳离子交换纯化级分(图3)和最终纯化产物。在lmm厚10-NuPAGE凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)上，在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE，并使用NovexColloidalCoomassie，G-250染色试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色。生物学分析本发明PYY激动剂作为在哺乳动物(特别是人)中减少体重增加和治疗肥胖症的药物活性剂的用途可由常规分析中以及下文描述的体外和体内分析中的激动剂活性证实。这类分析还提供了将本发明PYY激动剂的活性与已知化合物活性比较的方法。食物摄入研究禁食诱导的再进食分析每笼安置2只C57BL/6J雄性小鼠(TheJacksonLaboratory,BarHarbor,ME)。将小鼠养在12:12光:暗循环(上午5:00开灯，下午5:00关灯)中，喂以丸状RMH3000Purina啮齿动物伺料(ResearchDiets,Inc.,NewBrunswick,NJ)并可任意喝水。当小鼠7-8周龄时在研究前使其适应至少10天。研究当天小鼠为9-12周龄。开始研究前一天，将小鼠置于有新床铺、没有食物但是允许随意接近水的笼中。小鼠禁食过夜(20-24小时)。研究当天，对小鼠IP注射(剂量体积=5mL/kg)给予药物，放回笼中并将预先称重的食物立刻放进笼中。使用的给药载体为20mM醋酸钠，pH4.5,50mMNaCl，并针对未聚乙二醇化的活性PYY实体计算剂量。检测三种剂量(O.lmg/kg、0.3mg/kg和1.0mg/kg)的载体对照、天然PYY、30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36和43KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36。在给药后2、4、6和24小时再称重食物。检査床铺上泄漏的食物，将其称重并包含在计算中。从起始食物重量中减去各时间点的食物重量计算累积的食物摄入。通过(FI治疗-FI载体)/FI载^IOO计算抑制百分比<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>图10显示IP注射三种剂量的天然PYY3-36(图10A)和30KmPEG马来酰亚胺(El0C)hPYY3-36(图1OB)后6小时累积的摄入。天然PYY3-36和30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36均显示在6小时过程中，累积食物摄入发生依赖于剂量的减少。43KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36也产生6小时(图11A)和24小时(图11B)累积食物摄入依赖于剂量的减少。然而，6小时和24小时后，43KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36减少累积食物摄入的效应均不如相同剂量(0.1mg/kg)的30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYYw6大。还将注射O.lmg/kg(SC)后30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36对禁食诱导的再进食的效应与30K马来酰亚胺(DllC)hPYY3-36的效应进行比较。尽管如下表所示，30KmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYY3—36肽在24小时的时间过程中引起了累积的食物摄入(FI)减少，但是该效应不如30K马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36所观察到的大。2小时变化4小时变化6小时变化24小治疗EIn时FI载体均值2.030.002.930.00楊0.0010.790.00SEM0.168.060.227.460.4611.300.676.23E10C均值1.89-6.992.16-26.212.45-39.628.04-25.48SEM0.2713.450.279.090.266.330.888.14D11C均值2.145.222.56-12.563.09-24.029.08-15.88SEM0.157.300.237.720.276.680.423.88将线性20KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36的效应与30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36(均为实施例l中的)比较。在对雄性小鼠注射O.lmg/kg(IP)剂量的研究中，结果如下表所示。相对于载体治疗的累积食物摄入变化％<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>类似的，在O.lmg/kg剂量(SC)后比较线性20KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36和30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36的喂食效应的第二种研究中，结果如下表所示。相对于载体治疗的累积食物摄入变化％<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>自发性食物摄取分析将C57BL/6J雄性小鼠(TheJacksonLaboratory)单独安置并在研究前允许其适应2周。小鼠置于12/12光/暗循环中，随意喂以粉末状饲料，并允许任意接近水。在给药前一天将小鼠置于摄食箱中并使其适应一天。第二天，就在关灯前(下午4:00)用IP或皮下(SC)注射给予小鼠药物。在整个时间过程中以10分钟的间隔自动监测食物摄入，并每天测量体重。显示了IP注射的天然PYY3.36和30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3_36(图12)以及SC注射的天然PYY3-36和30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36(图13)的结果。尽管与载体治疗的小鼠相比，天然PYY3.36和30K1^￡0马来酰亚胺(￡10(3)11￥￥3.36均可立即减少累积食物摄入，但是30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36引起的减少食物摄入的效应的持续时间远远长于天然PYY3.36引起的效应的持续时间。在具有更持久的食物摄入效应的同时，30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36还显示在单次注射(0.1mg/kg,IP)后延长的对血浆的影响(图14)。尽管天然PYY3-36具有16ml/min/kg的清除率和38nM的Cmax，但30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36具有0.2ml/min/kg的清除率和267nM的C自。使用hPYY放射性免疫试剂盒(LincoResearch,Inc.,St.Louis,MO)测量小鼠中的血浆PYY值。用ob/ob小鼠进行迷你泵分析将8-9周龄(n=26)的雄性ob/ob小鼠(TheJacksonLaboratory)维持正常饮食并植入14天渗透迷你泵(AlzaCorp.,MountainView,CA)，所述迷你泵施用载体(盐水)、PYY3.36(0.1mg/kg/天)或30KPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36(0.03mg/kg/天)。每天称量食物重量和体重。在第0天和第13天确定体脂构成。研究结束时采血样。这些组中食物摄入、体重或体脂构成没有显著差异。研究结束时通过前述放射性免疫测定法确定血浆PYY。在天然PYY3-36治疗的组中，血浆PYY水平测量为15±2ng/ml;在30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36治疗组中，血浆PYY水平为132±22ng/ml。体外结合研究配体结合的SPA:配体结合的SPA测量来自Y2受体的放射性标记的PYY的竞争性取代，并使用用得自AmershamBiosciences的麦胚凝集素(WGA)涂层(Cat.No.RPNQ0085)的含有闪烁剂(SPA珠)的微球。在其表面表达Y2受体的KAN-TS人神经母细胞瘤(FuWendor傳,尸rac.7Va仏JcW.87:182-186,1990)悬浮液使用细胞收集缓冲液制备，所述细胞收集缓冲液由50mMHepes缓冲液(pH7.4)、145mMNaCl、2.5mMCaCl2、1mMMgCl2、lOmM葡萄糖、0.1%BSA、5%DMSO和Roche蛋白酶抑制剂组成。在96孔板中一式三份使用50,000细胞/孔、125I-PYY(40,000cpm/孑L)和SPA珠(0.5mg/L)在分析缓冲液中进行SPA测定，所述缓冲液由50mMHepes缓冲液(pH7.4)、lmMMgCl2、2.5mMCaCl2、0.1%(w/v)BSA、0.025%(w/v)杆菌肽和0.025。/。叠氮化钠组成。将不同浓度(0.032到500nM)的检测配体加入分析混合物中，然后在室温下摇晃孵育16-24小时。将平板静置l小时然后使用MicroBeta⑧Trilux检测器(PerkinElmer,Boston,MA)计数。hPYY3-36和实施例l的30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36的结果示于图15中。NPYY2受体处的GTP7[35S]结合分析功能性分析为在NENFlashplates(96孔板)中进行的GTP7["S]结合分析。如Bass等，Mo/.50:709-715,1990所述从KAN-TS细胞中制备膜。GTP7[35S]结合分析在96孔板FlashPlate中一式两份使用100pMGTPy["S]和10pg膜每孔在分析缓冲液中进行，所述分析缓冲液由50mMTrisHcl(pH7.4)、3mMMgCl2(pH7.4)、10mMMgCl2、20mMEGTA、100mMNaCl、5GDP、0.1%牛血清蛋白和以下蛋白酶抑制剂100昭/mL杆菌肽、100昭/mL苯甲脒、5昭/mL抑肽酶、5吗/mL亮肽酶素组成。然后在3CTC下将分析混合物与浓度渐增的测试化合物(6点浓度曲线；在10"2M到l(T5M范围内的对数稀释液)孵育60分钟。然后将FlashPlatesTM在2000xg下离心IO分钟。然后使用MicrobetaTM检测器定量GTP7fS]结合的刺激。使用Graphpad的Prism计算ECso和内在活性计算值。hPYY3-36和实施例1的30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36的结果示于图16中。实施例1中30KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3-36和20KmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYY3.36的EC5Q值相当(例如在相同分析中测量的值为4.3nM和4.6nM)。权利要求1.具有氨基酸序列IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQIDNo.3]的多肽(E10C)hPYY3-36或其药学可接受的盐。2.具有氨基酸序列IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2[SEQIDNo.:4]的多肽(DllC)hPYY3.36或其药学可接受的盐。3.包含聚乙二醇(PEG)和多肽(E10C)hPYY3.36或(DllC)hPYY3-36的缀合物。4.如权利要求3所述的具有3式的缀合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中PEG为甲氧基PEG且为线性的或支化的，并具有约1kD到50kD范围内的重均分子量，L为如下式的基团-0(CH2)pNHC(0)(CH2)r-其中p和r分别独立地为从1到6的整数，或L为如下式的基团-NHC(0)(CH2)s-其中s为从l到6的整数，并且-SR为多肽(E10C)hPYY3-36或(DllC)hPYY3-36，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子。5.如权利要求4所述的缀合物，其中所述mPEG为线性的。6.如权利要求5所述的具有4式的缀合物CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2CH2NHC(0)CH2CH2N,其中n为约600到750范围内的整数，且-SR为多肽(E10C)hPYY3—36，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子。7.如权利要求6所述的缀合物，其中(OCH2CH2)n部分具有约30kD的重均分子量。8.如权利要求5所述的具有4式的缀合物其中n为约375到525范围内的整数，且-SR为多肽(E10C)hPYY3.36，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子。9.如权利要求8所述的缀合物，其中(OCH2CH2)n部分具有约20kD的重均分子量。10.如权利要求5所述的具有4式的缀合物CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2CH2NHC(0)CH2CH2NCH3(OCH2CH2)nOCH2CH2CH2NHC(0)CH2CH2N,其中n为约600到750范围内的整数，且-SR为多肽(D1lC)hPYY3_36，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子。11.如权利要求IO所述的缀合物，其中(OCH2CH2)n部分具有约30kD的重均分子量。12.如权利要求4所述的缀合物，其中所述mPEG为支化的。13.如权利要求12所述的缀合物，其中所述mPEG为甘油支化的。14.如权利要求13所述的具有5式的缀合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中每个m大致相同并且是约450到500范围内的整数，且-SR为(E10C)hPYY3.36多肽，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子。15.如权利要求14所述的缀合物，其中各(OCH2CH2V部分具有约20kD到22kD范围内的重均分子量。16.如权利要求13所述的具有5式的缀合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中每个m相等并为约450到500范围内的整数，且-SR为(DllC)hPYY3.36多肽，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子。17.如权利要求16所述的缀合物，其中各(OCH2CH2)m部分具有约20kD到22kD范围内的重均分子量。18.具有5式的甘油支化的43kmPEG马来酰亚胺(E10C)hPYYw6缀合物或其药学可接受的盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中每个m大致相同，且-SR为(E10C)hPYY3-36多肽，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子。19.5式的甘油支化的43kmPEG马来酰亚胺(DllC)hPYY3-36缀合物或其药学可接受的盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中每个m大致相同，且-SR为(DllC)hPYY3-36多肽，其中S为半胱氨酸硫醇基团的硫原子。20.药物组合物，其包含如权利要求1或2所述多肽或权利要求3-19中任一项所述缀合物或其药学可接受的盐和药学可接受的载体。21.如权利要求20所述的药物组合物，还包含第二药剂，所述第二药剂为抗肥胖剂。22.在需要治疗的哺乳动物中治疗肥胖或超重症状的方法，包括对哺乳动物外周施用治疗有效量的如权利要求1或2所述多肽或权利要求3-19中任一项所述缀合物或其药学可接受的盐。23.在哺乳动物中抑制增重、减少食物摄入或减少热量摄入的方法，包括对哺乳动物外周施用治疗有效量的如权利要求1或2所述多肽或权利要求3-19中任一项所述缀合物或其药学可接受的盐。24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述多肽、缀合物或盐与第二药剂组合施用，所述第二药剂为抗肥胖剂。25.如权利要求1或2所述的多肽或如权利要求3-19中任一项所述的缀合物或其药学可接受的盐在制造药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中治疗肥胖或超重症状或用于在哺乳动物中抑制增重、减少食物摄入或减少热量摄入。26.编码如权利要求1或2所述多肽的多核苷酸。27.与包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽特异结合的单克隆抗体。28.如权利要求27所述的单克隆抗体，其中所述多肽在其半胱氨酸残基上被聚乙二醇化。全文摘要本发明提供可用于治疗由NPYY2受体激动剂调节的疾病的PYY_3-36变体及其聚乙二醇化衍生物和组合物以及方法。文档编号A61K47/48GK101115770SQ200680004172公开日2008年1月30日申请日期2006年1月30日优先权日2005年2月4日发明者南希·安·纳尔东尼,奈娜·利尼·萨默斯,奈德·罗杰·斯盖尔,罗里·弗朗西斯·芬尼申请人:辉瑞产品公司