专利名称：：引发抗禽分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的组合物的制作方法引发抗禽分枝杆菌副结核亚种的免疫应答的组合物本申请要求2005年2月16日提交的美国临时专利申请系列号60/653,536的优先权，该份申请的内容全文纳入本文作为参考。发明领域本发明总体上涉及对免疫应答的刺激，更具体地说涉及刺激抗禽分枝杆菌副纟吉核亚禾中0^fyco6fl"er/wmav/wwsubspeciespara/w6en:w/c^/力的预防性或禾卩治疗性免疫应答的组合物和方法。发明背景禽分枝杆菌副结核亚种(MPT)是约内病(JD)的致病因子，该病在反刍动物中导致慢性肉芽肿性肠炎。临床上受感染的动物产生慢性腹泻和进行性体重丧失，最终导致死亡，而亚临床受感染的动物主要发生产奶量降低。JD对全世界乳品工业的经济重要性巨大，产量降低和美国约20%受感染乳畜群的动物被早期淘汰造成大量损失，每年乳品工业(在该方面)的花费是两亿两千万美元(Wells等，2000，J.Am.Vet.Med.Assoc.,216:1450-1457)。牛在出生6个月内最易受该微生物感染，但在3-5岁前通常不明显发病。摄入受污染的肥料、受感染母牛的初乳或牛奶导致感染(Sweeney，1996，Vet.Clin.N.Am.FoodAnim.Pract.，12:305-312)。也会发生致命的感染，特别是患重病的怀孕母牛(Sweeney等，1992，Am.J.Vet.Res.53:477-480)。虽然JD是反刍动物的重要感染性疾病，但没有抵御该疾病的有效疫苗。在美国目前唯一可用的疫苗由油佐剂配制的杀灭禽分枝杆菌副结核亚种构成(Kormendy，B.，1992.ActaVet.Hung.40:171-184;Larsen等，1978，Am.J.Vet.Res.39:65-69)。然而，这种疫苗接种程序带来了严重的公共卫生顾虑。例如，动物的疫苗接种期间至少有一位兽医意外接种在手上(Patterson等，(1988)，J.Am.Vet.Med.Assoc.,192:1197-1199)。此外，研究证实用该杀灭的细菌接种后注射部位的反应强烈(Kormendy，B.，1992，ActaVet.Hung.40:171-184;Larsen等，1978,Am.J.Vet.Res.39:65-69)。该疫苗的另一缺陷是接种动物的结核菌素皮肤试验呈阳性(Kormendy，B，1992，ActaVet.Hung，40:171-184;Larsen等，1978，Am.J.Vet.Res.39:65-69)。因此，需要开发更有效的抗JD疫苗，该疫苗可安全使用并是MPT感染的有效预防性和/或治疗性组合物。发明概述本发明提供用于激发动物抗MPT免疫应答的组合物和方法。这些组合物包含免疫原性组分，所述免疫原性组分可以是MPT抗原或编码MPT抗原的多核苷酸或其混合物。在一个实施方式中，这些组合物包含至少5种重组免疫原性组分。MPT抗原的例子包括MPT85A、85B、85C、35kDa、超氧化物岐化酶(SOD)、MptC、MptD和ESAT-6样蛋白。本发明方法包括将激发抗MPT细菌免疫应答有效量的组合物给予动物。该方法对易受MPT感染的任何动物都有益，但特别对反刍动物有益。可用标准药学载体配制含重组MPT抗原、编码MPT抗原的多核苷酸或其混合物的组合物，可经各种常规途径给予所述组合物。可在任何时间将这些组合物给T"易接触MPT感染的动物或已受MPT感染的动物。然而，优选在MPT感染前给予本发明组合物，例如将本发明组合物给予怀孕动物从而能通过初乳将预防性免疫原性组分传递给它们的新生儿，或在出生后l-5周给予本发明组合物。附图简述图1是感染和健康对照母牛的外周血单核细胞的5种MPT重组蛋白体外刺激增殖性反应分析数据图示。结果以刺激指数表示，误差棒表示相对于平均值的标准偏差。未感染母牛的PBMC对任何抗原均没有明显增殖(P〉0.05)。85A和35kDa蛋白质分别在轻度和中度菌痢动物(lowandmediumshedder)中显示最具增殖活性。图2是与MPT菌痢程度(sheddinglevel)相关的各抗原引起的干扰素-y产生的分析数据图示。结果以刺激孔的O.D.值一对照孔的O.D.值(自发产生的IFN-力表示。误差棒表示相对于平均值的标准偏差。85A和85B在两种程度菌痢动物的牛外周血单核细胞中都是最能诱导产生IFN-y的抗原。图3是与MPT散发水平相关的针对各抗原的抗体反应的分析数据图示。柱形表示405nm的平均O.D.值。误差棒表示相对于平均值的标准偏差。按照菌痢程度，所有重组抗原显示提高了抗体反应，对35-kDa蛋白质的抗体反应在未感染的健康母牛和两种程度菌痢动物之间差异显著(P〈0.01)。图4A-4D是用重组抗原刺激后，FACS分析检测的牛外周血淋巴细胞中T细胞亚组分布变化的分析数据图示。图4A，CD4;与轻度菌痢动物相比，Ag85A和Ag85B在中度菌痢动物中诱导较高比例的CD4+T淋巴细胞，而未感染对照牛的CD4+淋巴细胞百分数未改变。图4B，CD8;Ag85A提高了中度菌痢动物中CD8+T淋巴细胞的比例，而在未感染的对照牛中CD8+T淋巴细胞的百分数增加极少。图4C，CD25;Ag85A和Ag85B在两种程度菌痢动物组中提高了CD25+T淋巴细胞的比例，而它们对未感染的牛几乎没作用。相比之下，Ag85G和35-kDa蛋白只在中度菌痢动物中明显提高了CD25+T细胞的比例(p〈0.05)。图4D，y5+T细胞；所有抗原在轻度和中度菌痢动物组对所有细胞亚组都只引起明显较小的增幅，只有SOD在中度菌痢动物中引起明显的Y5+T细胞增加。图5是重组蛋白和两种对照物(ConA和PPD)引起的CD3+T淋巴细胞差异变化的分析数据图示。数据表示为与菌痢程度相关的各重组抗原引起的CD3染色阳性细胞的平均值(相对于平均值的1个标准偏差)。图6是用重组抗原刺激后，FACS分析检测的牛外周血淋巴细胞中增加的CD21+T淋巴细胞亚组的分析数据图示。结果报道为阳性染色细胞增加的平均百分数，误差棒代表相对于平均值的1个标准偏差(SEM)。重组35-kDa蛋白诱导在中度菌痢动物中引起最强的CD21+B淋巴细胞增加。在各种菌痢程度，没有观察到其它抗原明显增加B淋巴细胞比例(PX).05)。图7是用重组抗原刺激24小时后，未感染的牛、轻度和中度菌痢动物的牛PBMC中IL-2情况的分析数据图示。结果表示为与用作校验物的未刺激PBMC相比的IL-2平均增加倍数。Ag85A和Ag85B对中度菌痢动物刺激最强，而35kDa蛋白和SOD的效果较弱(p<0.05)。图8A-8C是用重组抗原刺激24小时后，未感染的牛、轻度和中度菌痢动物的牛PBMC中IFN-y(图8A)、IL-12p40(图8B)和TNF-a(图8C)的细胞因子mRNA情况分析数据图示。结果表示为与用作校验物的未刺激PBMC相比的平均增加倍数。结果相似，其中Ag85A和Ag85B对中度菌痢动物的刺激最强，而35kDa蛋白和SOD的效果较弱。图9是用重组抗原刺激24小时后，未感染的牛、轻度和中度菌痢动物的牛PBMC中IL-4mRNA情况的分析数据图示。结果表示为与用作校验物的未刺激PBMC相比的IL-4平均增加倍数。35-kDa在低和中等散发动物中强烈刺激IL-2mRNA表达。图10是给予指定DNA构建物和对照并随后用MPT攻击后从脾脏和肝脏回收细菌的图示。图11是给予指定DNA构建物和对照及随后用MPT攻击后脾脏和肝脏中肉芽肿平均数目的图示。图12A和12B是显示大量耐酸细菌的Ziehl-Neelsen组织染色的照片(图12A)。相比之下，在用编码所有5种抗原的MPTDNA构建物接种的小鼠中感染程度低得多(图12B)。发明详述本发明提供激发动物抗MPT免疫应答的组合物和方法。这些组合物包含编码MPT抗原的DNA多核苷酸、MPT抗原或它们的混合物。在一个实施方式中，从重组MPT抗原和DNA多核苷酸中至少选择5种免疫原性组分。本发明方法包括将激发抗MPT细菌免疫应答有效量的组合物给予动物。本文所用的"免疫组分"是组合物中能直接或间接激发免疫应答的组分。因此，在引入动物时，含编码MPT抗原的DNA多核苷酸的表达载体进入动物细胞并表达MPT抗原。所表达的MPT抗原进而激发免疫应答。因此，编码MPT抗原的DNA多核苷酸可认为是间接激发免疫应答的免疫原性组分。对于所给予的MPT蛋白质抗原，由于免疫系统直接识别该抗原，可认为该抗原是直接激发免疫应答的免疫原性组分。本发明方法对易受MPT感染的任何动物都有益，在此，感染表示MPT在动物的肠粘膜中聚据。然而，这些组合物与方法特别适合于预防或治疗反刍动物(包括但不限于牛、绵羊、山羊、鹿和麋鹿、羚羊和水牛)的MPT感染。因此，本发明组合物可给予任何感染或尚未感染MPT的动物。据信，按照本发明方法将组合物给予受感染的动物可激发治疗性免疫应答。然而，优选在MPT感染前给予组合物来激发预防性应答。例如，可将本发明组合物给予怀孕动物，从而能经初乳将预防性免疫组分传递给它们未感染的新生儿。或者，可在出生后1-5周给予本发明组合物从而提供防止感染或降低疾病严重性(如果发生感染的话)的预防作用。因此，在一个实施方式中，本发明方法是抗MPT感染的预防方法，而在另一实施方式中，本发明方法是抗MPT感染的治疗方法。本发明方法还可用于预防或治疗约内病(Johne'sdisease)。适用于本发明的MPT抗原包括但不限于MPT蛋白85A、85B、85C、35kDa、SOD、MptC、MptD和ESAT-6样蛋白。可采用本领域技术人员已知的技术，例如常规重组克隆技术获得本发明所用的重组MPT蛋白抗原。已知用于表达和纯化重组蛋白质的合适DNA克隆过程和方法(参见，例如Sambrook等，2001，Molecularcloning:alaboratorymanual(《分子克隆实验室手册》)，第三版，冷泉港实验室出版社，纽约，纽约)。为获得重组MPT蛋白抗原，通常可按照标准方法例如熟知的碱裂解方法从MPT培养液获得MPT基因组DNA。可通过例如聚合酶链式反应从基因组DNA中扩增这些抗原的编码DNA，，可将各克隆扩增产物单独或以各种组合克隆入一个或多个合适的表达载体中。可用表达载体转染合适的宿主细胞，在适合表达这些抗原的条件下培养转染细胞。然后按照标准技术从培养液中提取和纯化抗原。为进行动物给药，可将适当纯化的重组MPT抗原与标准药学载体混合。Remington'sPharmaceuticalSciences(《雷明顿药物科学》)(第18版，A.R.Gennaro等编，MackPublishingCo.，Easton，Pa.，19卯)描述了可用于这些蛋白质的可接受药学载体。此外，可将这些抗原配制成常规脂质体或微粒体制剂用于给药。可通过各种可接受的途径给予包含用于激发免疫应答的含MPT抗原组合物。合适的给药途径包括口服、粘膜和胃肠外途径(例如，血管内、肌肉内和皮下注射)。本领域技术人员可以看出，给予具体动物的抗原量取决于许多因素，例如给药途径和该动物的身形大小、身体条件及MPT状态。可按照已知参数调节制剂中各抗原的相对含量，例如提供一定的摩尔当量或其它比例的各种抗原。此外，本发明组合物可以一次给药，也可通过连续给药来加强抗MPT抗原的免疫应答。通常可给予总量约10-200路的蛋白质。当给予编码MPT抗原的DNA时，通常给予30-500蹄的DNA。在一个实施方式中，本发明方法包括给予含有至少5种重组MPT抗原的组合物。例如，可将MPT抗原85A、85B、85C、35kDa抗原和超氧化物歧化酶(SOD)配在同一制剂中给药。85A、85B和85C是粘连蛋白-结合蛋白；35Kda和SOD蛋白是外表面蛋白。编码MTP85A基因的DNA序列和该85A基因的氨基酸序列见GenBank登录号AF280067(2003年10月10日，登录)。编码MTP85B基因的DNA序列和85B基因的氨基酸序列见GenBank登录号AF21912185B基因(2002年11月21日，登录)。编码MTP85C基因的DNA序列和该85C基因的氨基酸序列见GenBank登录号AF280068(2002年11月21日，登录)。编码MTPSOD基因的DNA序列和该SOD基因的氨基酸序列见GenBank登录号AF180816(2001年11月30日，登录)。在本文编码35kDa蛋白的DNA序列见SEQIDNO:l。在本文该35kDa蛋白的氨基酸序列见SEQIDNO:2。其它MPT包括MptC、MptD和ESAT-6样蛋白。在本文编码MptC蛋白的DNA序列见SEQIDNO:3。在本文该MptC蛋白的氨基酸序列见SEQIDNO:4。在本文编码ESAT-6样蛋白的DNA序列见SEQIDNO:5。在本文该ESAT-6样蛋白的氨基酸序列见SEQIDNO:6。在本文编码MptD序列的DNA序列见SEQIDNO:7。在本文MptD的氨基酸序列见SEQIDNO:8。用于从MPT的基因组DNA中扩增编码本文所用MPT抗原的DNA的引物的DNA序列见表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>SODpVRSODFpVRSODR1516GGATCCTGGGACTATGCAGCAGATCTTCAGCCGAAGATCAGGC5卯AF1808135Kda(MAP2121c)pVR35KDFpVR35KDR1718GGATCCCCACUGGTGATCTAGATCTTCACTTGTACTCATGGAACT910MptC(MAP3734)pVRMPTCFpVRMPTCR1920GGATCCCGCGGTCGGCGTAGATCTTCATGGTCGAGGTGCCT1750MptD(MAP3733)pV腿PTDFpVRMPTDR2122GGATCCCGCCGCATCGACAGATCTTCAAGCTAGGCCGGC600ESAT-6样(MAP0161)pVRESATFpVRESATR2324GGATCCCCGGGCGCGGTGAGATCTTCAGAACAGGCCG270另一实施方式制备的组合物包含编码5种或更多种MPT抗原的DNA多核苷酸。可如下获得MPT抗原编码序列用合适的引物扩增MPT基因组DNA，以制备重组抗原蛋白相同的方式将扩增产物插入表达载体。合适的表达载体含有适当的真核转录和翻译信号，还可含有诸如聚腺苷酸化和/或蛋白质运输信号等其他元件。合适的表达载体的例子是pVR1020(购自Vical，Inc.，圣迭哥，加利福尼亚)，该载体含有立即早期巨细胞病毒启动子，可在真核宿主中启动充分的表达，并具有血纤维蛋白溶酶原激活剂分泌信号，可促进抗原从真核宿主的细胞分泌。本领域技术人员可以看出，本方法将用到一种或多种不同的表达载体，彼此的差异在于各自所编码的MPT抗原和/或各自的调控元件或其它元件(例如多克隆位点)。因此，本发明可用编码至少5种MPT抗原的一种表达载体，或各编码一种不同MPT抗原的至少5种表达载体或各编码至少1种MPT抗原的表达载体的组合来递送编码至少5种MPT抗原的多核苷酸。在一个实施方式中，可将编码MPT抗原85A、85B、85C、SOD、MptC、MptD、35kDa和ESAT6-样蛋白的DNA多核苷酸序列分开在多个表达载体中，可用这些表达载体进行蛋白质表达和纯化，并构成各种组合来给予动物以激发免疫应答。可将编码MPT抗原的表达载体配制成各种药学上有效的制品给予动物。例如，这种制剂可以是盐水溶液，如磷酸盐缓冲液(PBS)。优选能使DNA长期稳定的药学上可接受的制剂。因此，优选除去和/或螯合制剂缓冲液或保存DNA的小瓶和包装材料中的痕量金属离子以在储存期间稳定和保护DNA。此外，可采用掺入非还原性自由基清除剂，例如乙醇或甘油来防止仍可能存在(即使是明显已脱金属化的溶液)的自由基破坏DNA。此外，将DNA配制成常规脂质体或微粒体制剂。递送本发明DNA多核苷酸的途径没有限制，只要递送能在接受动物体内激发抗MPT的免疫应答。因此，可通过本领域已知的任何方式，例如肠道和胃肠外途径将本发明DNA多核苷酸给予动物。这些递送途径包括但不限于肌肉内注射、腹膜内注射、静脉内注射和口服递送。优选肌肉内途径。在另一实施方式中，本发明组合物包含至少5种免疫原性组分，提供的是所述组分以MPT蛋白抗原和编码MPT抗原的DNA多核苷酸的混合物。可将本文所述的虽组MPT抗原和本文所述编码MPT蛋白的多核苷酸混合得到这种组合物。在这点上，所述多核苷酸序列可以存在于一种或多种表达载体中，而提供的所述MPT抗原可以是重组蛋白。可如本文所述和/或按照标准技术将包含重组MPT抗原和编码MPT抗原的多核苷酸的组合物与常规药学载体混合并给药。可以提供重组MPT抗原和编码MPT抗原的多核苷酸的常规脂质体或微粒体制品。此外，本领域技术人员可以看出，无论这些组合物是只包含重组抗原作为免疫原性组分，只包含DNA多核苷酸作为免疫原性组分还是包含重组抗原和编码该重组抗原的DNA多核苷酸的混合物作为免疫原性组分，本发明组合物还可包含合适的佐剂。因此，不想局限于任何特定理论，据信，按照本发明方法给予重组MPT抗原、编码这些重组抗原的多核苷酸和/或它们的混合物可激发预防或治治疗MPT感染的免疫应答。以下实施例描述了本发明的各种实施方式。这些实施例是说明性而不是限制性的。实施例l本实施例比较了各抗原刺激引起的不同的淋巴增生效应。为检测淋巴增生反应，分析了5种MPT重组抗原(85A、85B、85C、35kDa抗原和超氧化物岐化酶(SOD))在母牛PBMC中引发淋巴增生反应的能力，PBMC取自MPT菌痢程度不同的母牛。为了进行本实施例和本文所述的其它实施例，将总共38头2-3岁的Holstein母牛分成3组。通过粪便培养阴性和IS9MPCR检验阴性确定健康对照(r^l8)呈MPT感染阴性。健康对照来自过去10年的粪便培养和IS900PCR均呈阴性的农场。根据每克粪便的菌落形成单位(CFU)，将阳性动物再分成轻度菌痢动物(11=16)和中度菌痢动物(11=4)。轻度菌痢动物即每克粪便的CFU为1-30的动物。中度菌痢动物即每克粪便的CFU在31-300之间的动物。没有严重菌痢动物(每克粪便的CFU>300)，因为一旦被确认它们便被立即从农场中清除。如现有技术所述(Shin等，(2004)J.Vet.Diagn.Invest.16:116-120)进行粪便培养和IS900PCR检验来测定MPT感染状态。为用于淋巴增生试验，采用标准技术并如现有技术所述(Dheenadhayalan等，(2002)DNASeq.13:287-294;Shin等，(2004)J.Vet.Sci.5:111-117)来克隆和表达重组抗原85A、85B、85C、35kDa抗原和SOD，并如现有技术所述(Skeiky等，(1998)J.Immunol.161:6171-6179)纯化。实施例所用的抗原，据鲎变形虫状细胞试验(Limulusamebocyteassay)，内毒素可忽略不计(IOpg/ml)。关于分离和培养牛外周血单核细胞，用肝素化真空管(heparinizedvacuumtube)从尾静脉收集所有母牛的外周血(20ml)。用Histopaque1.077(Sigma)进行差速离心分离肝素化血液的淋巴细胞。在50-ml无菌聚丙烯试管(Falcon)中将20ml肝素化的全血铺15mlHist叩叫ue上，然后室温下以lOOOXg离心30分钟。弃去血浆层，小心收集单核细胞层，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)洗涤三次。室温下加入0.87y。铵KCl缓冲液，翻转混合2分钟以裂解残留红细胞，然后立即加入30mlPBS。用PBS悬浮洗涤后的细胞沉淀物，用血球计和台盼蓝，由此测定活细胞百分数。不同的细胞计数方法一致显示细胞混悬液中淋巴细胞大于96%、单核细胞为1%，粒细胞小于3%。将淋巴细胞以2X106/ml重悬在含10%无内毒素的FCS(CellectGold;ICNBiomedicals,Inc.,CostaMesa，加利福尼亚)、2mML-谷氨酰胺、10mMHEPES、100IU/ml青霉素、100|ig/mL链霉素和50fig/mL庆大霉素(Sigma)的RPMI1640中，根据实验的目的，取250pl加入96-孔圆底平板或平底平板中。为研究各抗原引起的淋巴细胞增殖，进行淋巴细胞原始化(blastogenesis)试验。简言之，首先在37'C，含5%<:02的加湿气氛中将PBMC在96-孔平底微量滴定板中培育3天。然后将用ConA(10pg/mL)、纯化的蛋白质衍生物(PPD)(各阳性对照)(10iug/mL)或各纯化重组蛋白(10pg/mL)对培养物进行激发，并向各孔加入含40pl(1.0|iCi)甲基-3H-胸苷(PerkinElmerLifeScienceInc，MA，美国)的培养基。细胞在相同条件下在培育18小时，然后用半自动细胞收集器(SkatronasLiter，挪威)收集细胞。用液相闪烁计数法记录每分钟放射活性(cpm)，以此表示原始化活性。结果表示为按下式计算的刺激指数(SI):SI(刺激指数)K抗原刺激阳性培养物的CPM)—(背景的CPM)]/[(对照或阴性培养物的CPM)—(背景的CPM)]本实施例和本文所述的其它实施例中，用Excel和GraPadPrism软件包(2.0版)对数据进行统计学分析。用斯氏Z检验(Student'sMest)分析各组之间、抗原之间和细胞因子基因表达的差异。如果获得P〈0.05的概率值，认为差异是显著的。如图1所示，中度菌痢母牛的牛PBMC应所有重组蛋白和两种阳性对照激发的增殖活性高于其它组(P〈0.05)，虽然各母牛之间有差异。接受85A、85B和35-kDa蛋白抗原处理的中度菌痢母牛的PBMC显示的刺激指数(SI)明显高于(PO.005)接受其它重组抗原处理的PBMC。此外，轻度菌痢母牛应35kDa蛋白激发的增殖反应甚至高于中度菌痢母牛应85C和SOD激发的增殖反应(图1)。因此，本实施例表明85A、85B和35-kDa蛋白抗原可能对于影响曾接触过MPT的动物的淋巴细胞增殖至关重要。实施例2本实施例显示了重组抗原对IFN-Y产生的影响。为分析IFN-Y产生，用市售牛IFN-Y专用试剂盒(BiosourceInt.，Camarillo，加利福尼亚)按照生产商的使用说明书检测培养上清液中的IFN-y水平。使用630nm-750nm波长滤波器(Referencefilter),用Bio-Tek312EELISA读数计(BioTEKInstruments,Inc，Winooski，VT05404-0998)在450nm进行培养板读数。根据阴性和阳性对照的光密度(O.D.)比较计算结果。按照生产商的使用说明书，与区分值相比，将结果判定为阴性(<阳性对照的OD)或阳性(〉阳性对照的OD)。检测感染和未感染对照母牛的PBMC中五种重组抗原或两种阳性对照刺激后的IFN-y产量。结果见图2，为校验后的OD值(抗原刺激的OD减去对照的OD)，图中显示，各种抗原增强了IFN-y产生。从图2可看出，与未受感染对照相比，在受感染牛的牛PBMC培养液中，所有被测重组抗原均明显诱导IFN-y释放(P<0.05)，中度菌痢动物IFN-g水平一致高于轻度菌痢动物(P〈0.05)。与两种阳性对照和其它被剌重组抗原相比，重组抗原85A和85B在轻度菌痢动物中诱导的IFN-y水平明显较高(P<0.05)。因此，本实施例表明，重组抗原85A和85B对刺激细胞介导的抗MPT反应可能至关重要。实施例3本实施例比较了从未感染和感染母牛分离的血清中能识别本发明重组抗原的抗体。按照下述步骤进行酶联免疫吸附测定(ELISA)来评估重组抗原的血清反应性(seroreactivity)(Shin等，(2004)J.Vet.Sci.5:111-117)。简言之，用棋盘板滴定法(checkerboardtitration),用2.5、5或10^g/ml的各种抗原和1:100稀释的血清进行间接ELISA优化。用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(14.2mMNa2C03，34.9mMNaHC03，3.1mMNaN3，pH9.5)配制的100(iL各抗原涂布接种平底96-孔板(Maxisorp，Nunc,丹麦)，于4'C过夜，然后用微孔板洗涤器Bio-TekELx405(BioTEKInstruments,Lie,Winooski，VT)以含0.05%吐温20的PBS(PBST，洗涤缓冲液)洗涤三次。37。C用PBST配制的5%脱脂奶封闭孔中未涂布的位置1小时。用PBST洗漆孔板两次，向所有孔中加入100nl最佳稀释(l:25,000)的偶联抗-牛IgG-FIRP(Sigma)，37°。培育1小时。用PBST洗板三次，向各孔中加入200pl2-2'-连氮基-二-噻唑啉-6-磺酸(Sigma)。37'C避光培育各板。培育30分钟后，加入终止溶液(1MHC1)，用Bio-Tek312ELISA读数计(BioTEKInstruments,Inc，Winooski，VT05404-0998)以2分钟间隔在405nm对孔板读数三次。每块板上都有阳性和阴性血清和抗原及抗体对照。图3描述了菌痢组和健康对照组的血清中抗重组抗原IgG抗体水平的检测结果。虽然各母牛的血清抗体含量个体差异很大，但在轻度和中度菌痢动物组中，所有重组抗原的平均IgG抗体反应都显著升高。轻度菌痢物组对任一被测抗原的平均抗体水平未显示明显差异(图3)。令人吃惊的是，中度菌痢动物组对35-kDa蛋白的抗体反应显著高于对其它抗原的抗体反应(P<0.05)，这可能至关重要，因为35-kDa蛋白还能有效激发淋巴细胞增殖，因此它可能同时激发细胞介导免疫应答和体液免疫应答。实施例4本实施例显示了未感染、轻度菌痢母牛和中度菌痢母牛的PBMC应重组抗原激发的淋巴细胞亚组分布改变。为进行此项分析，用抗牛淋巴细胞标记(表2)的单克隆抗体进行单色流式细胞分析。简言之，用FACS缓冲液洗涤细胞三次，4。C用第一抗体(表1)培育30分钟，洗涤三次，然后在4'C用异硫氰酸荧光素标记的马抗-小鼠免疫球蛋白抗体(Vector)培育30分钟，洗涤三次，用200FACS定影剂缓冲液(fixerbuffer)收集，然后分析。用流式细胞测定器(FACSCalibur;BectonDickson)进行分析。用前向散射-侧向散射-现控栅极(forward-scatter-side-scatterlivegate)检测每份样品的5,000-10,000个淋巴细胞。根据淋巴细胞的荧光数据，以阳性染色细胞与用无关同种型对照抗体染色样品的百分数作为结果。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>CACTI16AIgGlCD25(IL-2Ra)(Naessens等，1992，Immunology76:305-309.)CACT63AIgGy3T细胞(Davis等，1996，Vet.Immunol.Immunopathol.52:301-311)如图4A-4D所示，用各重组抗原刺激后，在菌痢动物组和健康对照的PBMC培养液中，通过单色流式细胞计量术检测受抗原刺激T细胞和/或B细胞亚组，即检测CD4+、CD8+、CD3+(CD3+描述于图5)、CD21+和CD25+淋巴细胞亚组百分数的差异以及^+T细胞(图4和5)。该项研究检测的所有淋巴细胞亚组均增加，但根据菌痢水平，未感染的牛和轻度菌痢牛之间对不同重组抗原略有差异(p〈0.05)。CD3是CD4+和CD8+细胞以及^+T细胞表达的泛T-细胞标记。培养液中CD25+T细胞的比例增加，无论使用哪一重组抗原(P<0.05)(图4C)。这些结果提示，该项研究所用的所有抗原能刺激产生致敏T细胞。虽然与未感染对照相比，测试的所有重组抗原均提高了受感染牛的牛PBMC培养液中CD4+细胞的比例(P<0.05)，但与85C、35-kDa蛋白和SOD相比，85A和85B能将CD4+T细胞比例增加至显著更高的水平(P<0.05)(图4A)。而且，用85A和85B处理的中度菌痢PBMC培养液中的CD4+T细胞比例高于轻度菌痢(P<0.05)(图4A)。此外，85A和85B在未受感染牛中不提高CD4+T细胞。虽然不想局限于任何特定理论，但这些结果可能表明85A和85B抗原能诱导MTP特异性致敏的CD4+T细胞，并通过在早期感染阶段(即，首次出现MPT寄居粘膜时)维持循环CD4+T细胞群来提供抵御MTP感染的保护免疫力。与所有抗原均相对于未感染对照诱导CD4+细胞增加不同的是，只在用85A、85B和85C处理的培养液中观察到CD8+T细胞的比例明显增加，并且用85A和85B处理的中度菌痢牛PBMC培养液中的CD8+细胞比例高与轻度菌痢牛(P<0.05)(图4B)。因此，这些抗原可能偏向于刺激细胞介导的反应。只有SOD能在中度菌痢动物的培养液中明显增加Y5+T细胞的比例(P<0.05)(图4D)。然而，除y5+T淋巴细胞外，SOD对淋巴细胞的刺激程度低于所测试的其它抗原，因为在未受感染的牛以及两种菌痢组中，用SOD处理的PBMC培养液中YS+T细胞数量明显较高(图4D)。因此，与其它抗原相比，SOD可偏向于刺激y3+T淋巴细胞。此外，由于yS+T细胞在作为分枝杆菌病原菌进入位点的粘膜组织中为数众多，SOD抗原可能通过其优先刺激y5+T淋巴细胞而在感染的较早阶段起重要作用。与未感染对照相比，所有被测重组抗原均在轻度和中度菌痢动物的牛PBMC培养液中显著提高CD21+B细胞的比例(P<0.05)(P<0.05)(图6)。令人感兴趣的是，在中度菌痢动物的牛PBMC培养液中，CD21+B细胞的比例明显高于其它被测重组抗原的(P〈0.05)。实施例5本实施例比较了用重组抗原剌激后，牛PBMC对细胞因子mRNA产量的受激情况。为制备RNA和用DNA酶I处理细胞，制备PBMC细胞沉淀，用50mL磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，沉淀，按照生产商的建议(Rneasy迷你试剂盒，Qiagen，加利福尼亚)，用350裂解缓冲液裂解5X1()S个细胞，并在RNA提取和互补DNA(cDNA)合成之前于-8(TC保存。利用Rneasy迷你试剂盒(Qiagen)从裂解的细胞或PBMC中提取总RNA(tRNA)。用10U/pl不含RNA酶的DNA酶I处理提取的tRNA(37"，IO分钟)，然后在95'C加热5分钟灭活，再冰上冷却。关于cDNA合成，进行终体积20pL的逆转录(RT)，其中含1.6总RNA、200USuperscriptIIRT(GibcoBRL)、50mMTris-HCl(pH8.3)、75mMKC1、3mMMgCl2、0.01MDTT禾n0.5mMdNTP。反应混合物42。C反应50分钟，70°C灭活15分钟。立即分析cDNA或保存于-2(TC待用。为进行实时定量(RT-PCR)，用Superscript逆转录酶、RandomHexamers(随机六聚物)和逆转录酶试剂(GibcoBRL)取各处理组的约1-5叫总RNA进行逆转录。用获自Genbank的牛GAPDH、细胞因子和生长因子的序列，用PrimerExpressSoftware(引物表达软件)(AppliedBiosystems)设计实时引物和探针。内部探针的5'端用荧光报道染料5-羧基荧光素(FAM)标记，3'端用猝灭剂染料N',N',N',N'，N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)标记。PCR混合物由400nM引物、80nMT叫man探针和市售PCRMastermix(TaqManUniveralPCRMastermix，AppliedBiosytems)构成，所述PCRMastermix含有10mMTris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、5mMMgCl2、2.5mM脱氧核苷酸三磷酸、每次反应0.625UAmpliTaqGoldDNA聚合酶、每次反应0.25UAmpEraswUNG禾口10|il稀释的cDNA样品，终体积为25pl。将样品加入96-孔板中，在自动荧光计(ABIPrism7700序列检测系统，AppliedBiosystems)中扩增。扩增条件是5(TC，2分钟；95°C，IO分钟；然后是95'C，15秒和6(TC，1分钟，40轮。采用比较性循环阈值(CT)法进行最终定量，结果为相对于校验cDNA的相对转录或n倍差异。如图7所示，所有重组抗原在中度菌痢动物PBMC中激发高水平IL-2mRNA，其中，抗原85复合物的作用强于35-kDa蛋白或SOD(P〈0.05)(图7)。85A还在中度菌痢动物中诱导高水平IFN-Y、IL-12p40和TNF-amRNA(分别见图8A、B和C)(P〈0.05)。令人吃惊的是，用35-kDa蛋白抗原刺激的轻度和中度菌痢动物的PBMC高表达IL-4mRNA(P<0.05)(图9)。35-kDa蛋白的这种IL-4mRNA诱导作用随菌痢水平明显增强(P〈0.001)。相比之下，未观察到其它抗原之间有明显差异(PX).05)。这些研究与实施例3的结果一致，表明35-kDa蛋白引起的免疫应答可能在疾病的晚期更重要，因为流式细胞计量术分析显示35-kDa蛋白强烈诱导B淋巴细胞增殖，特别是在中度菌痢动物中(图3)。因此，本实施例证明所有被测重组抗原都能激发细胞介导的免疫应答。实施例6本实施例证明了用编码MPT抗原的DNA多核苷酸接种小鼠，然后用MPT攻击的效果。为证明DNA构建物的作用，从HarlanSpragueDawleyInc(Indianapolis,IN)购得无特定病原体的雌性C57/BL6小鼠。接种时小鼠约8周龄。该项实验期间共有5组小鼠，每个疫苗组包括25只小鼠。这些小鼠喂食市售鼠粮，并可随意饮水，词养于12/12-小时的白天/黑夜周期。DNA疫苗使用市售真核表达质粒pVR1020(Vical，Inc.，圣迭戈，加利福尼亚)。该质粒含有立即早期巨细胞病毒启动子，可确保在真核宿主中充分表达，并具有人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(hTPA)分泌信号，可促进耙抗原从真核细胞分泌(Brandt等，2000，Infect.Immun.68:791-795)。利用表l所列的基因特异性引物通过聚合酶链式反应从MPT基因组DNA扩增编码MPT85A、85B、85C、SOD、35kDa、35kDa(li)、MptC、MptD和ESAT匿6样基因的DNA。简言之，用于扩增MPT85A、85B和85C编码序列的引物各自含有BamHI位点。扩增SOD、MptC、MptD、35kDa和ESAT6-样编码序列的引物之一含有BamHI位点，而另一引物含有BglII位点。用所述的限制性内切酶消化扩增产物，采用标准技术克隆入市售pCR2.1TOPO克隆载体(Invitrogen，加利福尼亚)中。然后采用标准技术并基本上如现有技术所述(Dheenadhayalan等，(2002)，DNASeq.，13:287-294;Shin等，(2004)，J.Vet.Sci.，5:111-117)(Skeiky等，(1998)，J.Immunol.，161:6171-6179)将MPT基因亚克隆在pVR1020质粒(Vical,Inc.,圣迭戈，加利福尼亚)中人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(hTPA)分泌信号的下游。利用lipofectaminTM2000转染试剂(Invitrogen，加利福尼亚)将这些重组构建物转染入HEK-293(人胚胎肾)细胞中，采用RT-PCR在转录水平证明抗原基因的表达。为进行免疫和MPT攻击，将小鼠分成5组(表3)。通过肌肉内注射给予小鼠每剂50(ilPBS配制的50叫各种DNA。小鼠以3周为间隔免疫三次。如表3所示额外注射IL-12基因。第二次加强免疫后3周，腹膜内注射109CFU单位的MPT攻击小鼠。攻击后第4、8、12和16周处死每组的6只小鼠，用如现有技术所述(Kamath等，Infect.Immun.，67:1702-1707)在补加了分枝杆菌生长素J和抗生素的Hemld蛋黄(HEK)斜面琼脂培养基上培养并计数从器官(肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结、肺)收集的细菌。攻击后，每周还从小鼠笼收集粪便，用以上所述琼脂培养基培养。将包括肝脏、脾脏、肺、小肠和肠系膜淋巴结的组织浸在10%缓冲的福尔马林中进行固定，采用标准组织工艺学技术加工以进行组织病理学检验。通过Ziehl-Neelsen染色评估各小鼠的肝脏和脾脏中MPT(耐酸细菌)存在情况。图10显示，与对照相比，攻击后4、8和12周时，疫苗接种小鼠的肝脏和脾脏中的分枝杆菌含量降低，还证明，与未免疫对照相比，接种MPTDNA疫苗混合物的小鼠脾脏和肝脏中细菌含量降低约90%(1loglO)。攻击后4、8和12周的肝脏和脾脏组织病理学比较数据与细菌培养结果一致。可看到，质粒混合物免疫小鼠肝脏和脾脏中的情况与未免疫的小鼠相比有实质性差异(图11)。MPT感染的未接种对照有大量随机散布的肉芽肿，其中小淋巴细胞环绕着中央的上皮巨噬细胞。Ziehl-Neelsen显示有许多耐酸细菌(图12A和插页)。相比之下，接种MPTDNA疫苗混合物的小鼠中感染程度轻得多(图12B)。因此，本实施例证明给予编码至少5种MPT抗原的DNA表达载体能提供明显的抗MPT感染保护作用。权利要求1.一种激发动物免疫应答的方法，包括给予有效量的含至少5种免疫原性组分的组合物，其中所述免疫原性组分选自a)分离的编码MPT抗原的DNA序列；b)重组MPT抗原；或c)a)和b)的组合。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MPT抗原选自85A、85B、85C、35kDa、35kDa(Li)、SOD、MptC、MptD和ESAT-6。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于，编码MPT抗原的多核苷酸序列编码选自85A、85B、85C、35kDa、SOD、MptC、MptD和ESAT-6的MPT抗原。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述组合物包含编码MPT抗原85A、85B、85C、MPT35kDa蛋白和超氧化物歧化酶(SOD)的多核苷酸序列。5.如权利要求l所述的方法，其特征在于，将所述组合物给予反刍动物。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反刍动物是牛、绵羊、山卞-、鹿或麋鹿。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反刍动物是牛。8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反刍动物未受MPT感染。9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反刍动物受MPT感染。10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述牛患有约内病。11.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述组合物还包含药学上可接受的载体。12.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述动物是怀孕的。13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。14.一种用于激发动物抗MPT免疫应答的组合物，包含至少5种免疫原性组分，其中所述免疫原性组分选自a)重组MPT抗原；b)分离的编码MPT抗原的DNA序列；或c)a)和b)的组合。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述MPT抗原选自85A、85B、85C、35kDa、SOD、MptC、MptD和ESAT-6。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，编码MPT抗原的多核苷酸序列编码选自85A、85B、85C、35kDa、SOD、MptC、MptD和ESAT-6的MPT抗原。17.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含编码MPT抗原85A、85B、85C、MPT35kDa蛋白和超氧化物歧化酶(SOD)的多核苷酸序列。18.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体。19.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，还包含佐剂。全文摘要本发明提供激发抗禽分枝杆菌副结核亚种(MPT)的免疫应答的组合物和方法。所述组合物包含至少5种重组免疫原性组分。免疫原性组分可以是MPT抗原或编码MPT抗原的DNA多核苷酸或它们的组合。本发明所用的MPT抗原包括MPT85A、85B、85C、35kDa、超氧化物歧化酶(SOD)、MptC、MptD和ESAT-6蛋白。所述方法包括将激发抗MPT菌免疫应答有效量的组合物给予动物。该方法对易受MPT感染的任何动物都有益，但特别对反刍动物有益。文档编号A61K39/02GK101155596SQ200680009054公开日2008年4月2日申请日期2006年2月16日优先权日2005年2月16日发明者张永富申请人:康奈尔研究基金会股份有限公司