治疗癌症的抗体的制作方法

专利名称：治疗癌症的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗-EGFR免疫偶联物和用其治疗癌症的方法。
技术背景表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜蛋白质，其参与细胞增殖 所必需的信号传导途径。该受体的过表达经常伴随恶性胂瘤的发生和生 长。有越来越多的证据表明EGFR的高表达与攻击性肿瘤生长相关，以 及与人常见癌症的较差临床后果相关，所述癌症包括乳癌、宫颈癌、肺 癌和头颈癌(Baselga， J. W fl/.，丄C7/". Owco/" 18:904-914， 2000; Nicholson, R. I. " a/" ￡紅/ C匿w, 37:S9-S15, 2001 )。 EGFR在癌症 中的关键作用已经引发了对EGFR信号传导途径的选择性抑制剂的广 泛研究。开发阻止配体结合EGFR的单克隆抗体是一种有希望的策略， 其首先由J. Mendelsohn在二十世纪八十年代提出(Ciardello， F. W "/.， C7/". Omcwi M.， 7:2958-2970, 2001 )。爱必妥@ ( Erbitux )是市场上第 一个被批准的具有抗癌活性的抗-EGFR单克隆抗体药物。除爱必妥 外， 另外至少三种抗EGFR的阻断性单克隆抗体已被开发出来(Speake, G. et al" CWf. i^flf附紅o/" 5:343-349, 2005 )。癌细胞中EGFR自分泌生长途径的活化可归因于几种机制，即， EGFR过表达，配体浓度增加，磷酸酶活性降低，受体转换率降低和存 在异常受体。只施用阻断性抗-EGFR抗体对不依赖于配体结合的那些 癌症不太有治疗作用。当前应用的抗癌药物不能从正常细胞中识别肿瘤 细胞。达到细胞杀伤临床有效水平所需的抗癌药物量经常引起活跃增殖 的非恶性细胞(比如胃肠道细胞和骨髓细胞)的严重破坏，导致大量的 不期望副作用。这种特性要求治疗方案在杀伤肿瘤细胞和对于患者过度 毒性之间的谨慎平衡，其造成了癌症化疗中的主要障碍。这样的考虑经常造成对施用剂量在功效方面的限制(Aboud-Pirak, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 86:3778-3781, 1989 )。选择性干扰癌细胞的耙向生物学 疗法可以改善治疗功效，而不增加治疗相关的毒性。经由抗-EGFR抗 体-药物偶联物对抗癌剂的EGFR介导的特异性肿瘤递送是一种治疗效 果不依赖配体结合EGFR的替代性策略(Aboud-Pirak, E. W Mamot, C. " a/" C匿w 63:3154-3161, 2003 )。理论上，药物与抗 体的偶联使得药物失活。 一旦处于肺瘤部位时，所述偶联物结合于所述 肿瘤细胞表面并且被进一步内化从而释放所述药物以杀伤肺瘤细胞。这 样的抗体-药物偶联物还,皮当作肿瘤活化的前药(Lambert, J. M.， Curr. Opin. Phamacol.， 5:543-549, 2005 )。因此，基于以上所述，开发具有改 进的肿瘤特异性和有利于抗癌活性的新的化疗剂是非常重要的。发明内容本发明涉及附加的抗-EGFR免疫偶联物以及用其抑制肿瘤细胞生 长和治疗上皮起源癌症的方法。在一个方面中，本发明涉及EGFR结合 分子。每个分子包含抗-EGFR单克隆抗体的抗原结合片段和细胞毒性 剂。在一个实施方案中，本发明的EGFR结合分子是与细胞毒性剂偶联 的单克隆抗体LAI或者LA22。任何类型的细胞毒性剂可以与EGFR结合分子偶联。细胞毒性剂的 非限制性实施例包括细胞毒性抗生素、化疗剂、放射性同位素、细胞毒 素或者抗癌前药活化酶。在一个实施例中，所偶联的细胞毒性剂是丝裂 霉素C或者平阳霉素。本发明还涉及人源化或者工程化的抗体，其包含与丝裂霉素C、平 阳霉素或者其它抗细胞剂偶联的LAI或者LA22的抗原结合片段。此外，本发明涉及与丝裂霉素C或者平阳霉素偶联的其它抗-EGFR 抗体。这些抗体可以是单克隆抗体、人抗体、人源化或者工程化抗体、 合成的抗体或者单链抗体。本发明的EGFR结合分子或者抗体可以用来杀伤或者抑制癌细胞的 生长。这些方法包括将癌细胞与本发明的EGFR结合分子或者抗体接触o此外，本发明的EGFR结合分子或者抗体可以用来治疗癌症。这些方法包括给有此需要的对象施用有效量的本发明的EGFR结合分子或 抗体。可按本发明处理的癌症或者癌细胞包括那些上皮细胞起源的。此外，本发明^涉及药物组合物，其包含本发明的e6fr結合分子 或者抗体。通过下文的详细描述，本发明其它的特征、目标和优点将是显而易 见的。然而，应当理解，对本发明的详细描述以及给出的实施方案仅是 举例说明，并无限制的意思。对于本领域的技术人员而言，通过以下的 详细说明，本发明范围内的各种变化和改进将变得显而易见。


提供附图用于举例说明，并无限制性含义。图1表明与平阳霉素或者丝裂霉素C偶联的抗-EGFR单克隆抗体对 人表皮样癌细胞的细胞毒作用。图2举例说明与平阳霉素或者丝裂霉素C偶联的单克隆抗体LA22 对人表皮样癌细胞的剂量依赖性细胞毒作用。图3A和3B显示LA22-MMC免疫寸禺联物、MMC和棵mAb LA22 对A431和A549细胞的体外细胞毒作用。图4显示与平阳霉素或者丝裂霉素C偶联的单克隆抗体LA1对人 表皮样癌细胞的剂量依赖性细胞毒作用。图5表明与平阳霉素或者丝裂霉素C偶联的单克隆抗体LA1对人 肺细胞的剂量依赖性细胞毒作用。图6举例说明LA22-MMC对雌性Balb/c小鼠的体内肿瘤毒性作用。 图6A显示LA22-MMC免疫偶联物对A431异种移植物的处理方案以及 体内肿瘤生长的抑制作用。图6B总结了每个处理组的肿瘤大小和肿瘤 抑制百分率(对照，MMC以及0.0032 mg/kg和0.08 mg/kg的 LA22-MMC )。图7显示，在经1251-放射性标记和免疫闪烁成像后，LA22-MMC免 疫偶联物在荷瘤小鼠上的生物学分布。图 8比较了 LA22-MMC免疫偶联物与爱必妥 -MMC (Erbitux -MMC )和赫赛汀⑧-MMC ( Herceptin -MMC )对人表皮样 癌细胞的体外细胞毒作用。 ，详细说明本发明涉及与细胞毒性剂或抗细胞剂偶联的抗-EGFR单克隆抗体 LA1或者LA22。LAI和LA22可以从Upstate USA, Inc., Charlottesville, VA购得。单克隆抗体LA22也在美国专利No. 5,459,061中有描述，其 全部内容通过参考并入本文。合适的细胞毒性剂或者抗细胞剂的非限制性实例包括化疗剂、放射 性同位素和细胞毒素。细胞毒性剂或者抗细胞剂的具体实例包括但不限 于细胞毒性抗生素(比如丝裂霉素C或者平阳霉素)、激素(比如类固 醇)、抗代谢物(比如阿糖胞苷、氟脲嘧啶、曱氨蝶呤或者氨基蝶呤)、 蒽环霉素(anthracycline )、长春花属生物碱、秋7JC仙胺、依托泊苷、 光神霉素、烷化剂(比如苯丁酸氮芥或者苯丙氨酸氮芥)、阿霉素、道 诺霉素、曱氨蝶呤、长春花碱、新制癌菌素、大分子霉素、三来胺醌、 a-鹅膏菌素、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A链、柔红霉素、紫杉醇、溴化 乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide )、长春新碱、长春 花械、秋7JC仙素、二氩蒽环二酮(dihydroxy anthracin dione )、放线菌 素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin, PE )A、 PE40、 相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、莫迪素(modecdn) A链、a-帚曲 菌素(a-sarcin )、 白树毒蛋白(gelonin )、 丝林霉素(mitogellin )、 retstrictocin、酚霉素、依诺霉素、a-帚曲菌素、曲霉素、restirictocin、 核糖核酸酶、白喉毒素、假单胞菌外毒素、麻风树毒蛋白(curicin)、 巴豆毒蛋白、加利车霉素(calicheamicin )、 sapaonaria officinalis抑制 剂、美登素类(maytansinoids )、糖皮质激素和放射性同位素。LAI或者LA22单克隆抗体还可以与抗癌前药活化酶偶联，其能够 将前药转换为它的活性形式。参见，例如美国专利No. 4,975,287,其全 部内容通过参考并入本文。可以通过多种机制，例如，共价结合、亲和性结合、嵌插作用、配 位结合和络合作用，实现抗体与一种或多种细胞毒性结构的连接或者偶 联。优选的结合方法涉及共价结合，比如应用化学交联剂、天然肽或者二疏键的。可以通过现有侧链的直接缩合或者外部桥联分子的并入来实现共价 结合。许多二价或者多价试剂可用于将蛋白质分子与其它蛋白质、'肽或者胺功能基(amine functions )相偶联。偶联剂的实例是碳二亚胺、二 异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。此列表并非对所述本领域 已知各种偶联剂的穷举，而只是可以应用的所述更常见偶联剂的举例。在很多实施方案中，抗体首先被衍生化，随后将细胞毒性组分附着 到衍生产物上。如本文所用，术语"衍生化"是指用合适的交联剂对抗 体底物进行化学修饰。以此方式应用的交联剂的实例包括含二硫键的连 接子SPDP (N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡咬二硫基)丙酸酯)和SMPT ( 4-琥 珀酰亚胺-氧羰基-a-甲基-a(2-吡啶基二硫基)甲苯)。在构建临床活性免疫偶联物中，还可以利用可生物学释放的键，以 使得一旦所述偶联物进入靶细胞，细胞毒性结构就能够从抗体上释放。 已经知道许多类型的连接构建体，包括在氨基酸比如半胱氨酸所含的或 者以其它方式引入相应蛋白质构造物的巯基基团之间简单地直接形成 二硫键，以及应用可用的或者设计的连接子结构的二硫键。已知很多类型的含二硫键连接子，可以成功地利用其偶联细胞毒性 结构和抗体。某些连接子是优选的，比如，例如空间位阻二硫键连接子，由于它们较大的体内稳定性，从而防止在与作用位点结合之前释放毒性 结构。尽管也可以应用其它的连接子比如SATA、 SPDP和2-亚氨基巯 醇(2-iminothiolane)，另 一种优选的交联剂是SMPT。一旦发生偶联，可以纯化偶联物以去除污染物，比如未偶联的细胞 毒性剂或者抗体。在许多情形中，去除未偶联的细胞毒性剂是重要的， 因为有毒性增加的可能性。此外，可以去除未偶联的抗体以避免偶联的 和未偶联的抗体之间竟争抗原的可能性。可以应用多种纯化技术提供足 够纯度的偶联物，从而使得它们可用于临床中。本发明还涉及抗-EGFR分子，其包含与细胞毒性剂或者抗细胞剂偶 联的LA22或者LA1单克隆抗体的抗原结合片段。这些抗原结合片段可 以包括LA22或者LA11单克隆抗体的scFv、双功能抗体(diabody )、 minibody、 Fab、 F(ab，)2或者Fv片段或者由它们组成。在一个实施方案中，本发明的抗-EGFR分子是从单克隆抗体LA22 或者LA1制备的人源化或者工程化的单克隆抗体。人源化或者工程化 的抗体对于治疗人类对象是尤为理想的。非人(例如鼠)抗体的人源化 或者工程化形式是嵌合体免疫球蛋白，或者其抗原结合片段(比如scFv、 双功能抗体、minibody、 Fab或F(ab，)2 )，其含有源于非人免疫球蛋白 的最小序列。人源化或者工程化抗体来源于人免疫球蛋白，其中形成互 补决定区(CDR)的残基由来自非人抗体(比如LA22或者LA1)CDR 的残基所取代。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv骨架残基被相应的 非人残基所替代。人源化或者工程化抗体还可以包含一些残基，其既不 属于受体抗体也不属于导入的CDR或者骨架序列。所述人源化或者工 程化抗体可以包含至少一个或两个可变结构域，其中所有或基本所有的 CDR区对应于非人免疫球蛋白以及所有或基本所有的恒定区对应于人 免疫球蛋白共有序列。此外，可以应用称为"定向选择"的技术产生识别所选表位的人源 化或者工程化抗体。在该方法中，所选的非人单克隆抗体(例如鼠抗体) 被用来引导识别相同表位的人源化或者工程化抗体的选择。还可以应用如美国专利No. 6,639,055和6,794,132(它们通过参考并 入本文)所述的方法来制备人源化或者工程化抗体。此外，本发明涉及与丝裂霉素C、平阳霉素或者其它细胞毒性抗生 素偶联的其它抗-EGFR抗体。适于所述目的的抗体包括但不限于多克 隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、 人源化或者工程化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重 组抗体、杂合抗体、突变抗体(mutated )、移植抗体或者体外产生的抗 体。优选地，本发明的抗体结合于EGFR细胞外结构域中的表位并且具 有至少1()5M1、 1()6m1、 1()7m1、 1()8m1、 1()9m1、 10"m"或者 更强的EGFR结合亲和性。这些抗体的scFv、双功能抗体(diabody)、 minibody、 Fab、 F(ab，)2或者Fv片段也可用来偶联丝裂霉素C、平阳 霉素或者其它细胞毒性抗生素。在制备好足够量的纯化EGFR结合分子之后，人们可能期望将其制 成药物组合物。本发明的药物组合物典型地包括本发明的EGFR结合分 子(例如，丝裂霉素C或者平阳霉素偶联的LA22或者LA1)和药物可 接受载体。如本文所用的，"药物可接受载体"包括任何和所有的溶剂、分散介质、包被剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这 些介质和试剂在药物活性物质中的应用在本领域中是众所周知的。除了 在此范围内的一些常规介质或者试剂不与本发明的载体或者细胞相容 外，其在治疗性或者预防性组合物中的应用也在预期范围内。还可以将 补充的活性成分掺入所述组合物中。可以通过任何常规途径施用本发明的药物组合物，只要经由该途径 可达到靶组织即可。这包括口、鼻、口腔(含服)、直肠、阴道或者局部途径。作为替代，可以通过原位(orthotopic )、皮内、皮下、肌内、 腹膜内、肿瘤内、环绕(circumferentially )、导管插入或者静脉内注射 来施用。还可以通过肠胃外或者腹膜内施用药物组合物。可通过在水中与表 面活性剂(比如羟丙基纤维素)适当混合来制备作为游离碱或者药物可 接受盐的活性化合物的溶液。还可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物 中以及在油中制备分散系(dispersion )。在通常的保存和应用条件下， 这些制备物可以包含防腐剂以防止微生物的生长。适于注射应用的药物形式包括无菌水溶液或者分散系(dispersion ) 以及用于即时制备无菌注射溶液或者分散系的无菌粉末。在大多数情况 下，所述形式是达到易于注射程度的无菌和流体形式。还优选其在制造 和保存以及防止微生物(比如细菌和真菌)污染作用的条件下是稳定的。 所述载体可以是溶剂或者分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如， 甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物或者植物油。可以例 如通过应用包衣(比如卵磷脂)、通过保持分散系情形需要的颗粒大小 或者通过应用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂 或者抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫 柳汞(thimerosal)等来防止微生物作用。在许多情况中，将优选包含 等渗剂，例如糖或者氯化钠。可以通过在所述组合物中应用延迟吸收剂， 例如单硬脂酸铝和明胶来实现注射组合物的延长吸收。可以通过在具有以上所列举的各种其它成分的合适溶剂中掺入需要 量的本发明EGFR结合分子来制备无菌注射溶液，如果需要的话，之后 可以过滤除菌。通常，通过向无菌载体中掺入各种灭过菌的活性成分来 制备分散系，其包含基础分散介质和来自以上所列举的所需其它成分。 在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末情形中，优选的制备方法是真空干燥或者冷冻干燥技术，其从之前经无菌过滤的溶液产生活性成分加上任 何其它期望成分的粉末。对于口服施用'，本发明的EGFR结合分子可以掺入赋形剂并且以非 才聂入型漱口剂和洁牙剂的形式应用。可以通过在合适的溶剂(比如硼酸 钠溶液(Dobell溶液))中掺入需要量的活性成分来制备漱口剂。作为 替代，可以将EGFR结合分子掺入抗菌防腐洗液，其包含硼酸钠、甘油 和碳酸氢钾。EGFR结合分子还可以分散在洁牙剂中，其包括凝胶剂、 糊剂(paste )、散剂或者膏剂(slurries),可以将治疗或者预防有效量 的EGFR结合分子加入糊状洁牙剂，其可以包含水、粘合剂、磨擦剂、 芳香剂、起泡剂或者湿润剂。可以将本发明的组合物配制为中性或者盐的形式。药物可接受的盐 包括与蛋白质的游离氨基形成的或者与无机酸或有机酸形成的酸加成 盐，所述无机酸比如例如盐酸或者磷酸，所述有机酸比如醋酸、草酸、 酒石酸、苦杏仁酸等。与游离羧基形成的盐还可以源于无机碱，比如， 例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，以及源于有机碱比如异丙胺、三曱胺、 组胺、普鲁卡因等。根据制剂，将以与剂型相容的方式以及治疗或者预防有效量施用组 合物或者溶液。制剂易于以各种剂型施用，比如注射溶液、药物释放胶 嚢等。对于水溶液的肠胃外施用，例如，如有必要可以适当地緩冲所述 溶液并且用足够的盐或者葡萄糖使得液体稀释剂首先形成等渗条件。这 些特定的水溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而 论，根据本文公开的内容，可应用的无菌水性介质对于本领域的技术人 员是已知的。例如， 一剂量可以溶解于1 ml等渗NaCl溶液中以及或者 添加到1000 ml皮下输液流体或者在建议输注位点注射(见，例如 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (第15版)，第 1035-1038和1570-1580页)。取决于治疗对象的病况，有必要产生剂量 上的一些变化。技术人员依据REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (第15版)，33章，特别是624-652页，其全部内容通过参考并入本文。 取决于治疗对象的病况，有必要产生剂量上的一些变化。负责施用的人 员将确定针对对象个体的合适剂量。可以应用本发明的EGFR结合分子杀伤癌细胞或者抑制癌细胞的生 长。还可以应用本发明的EGFR结合分子治疗患者或者动物的癌症。可 按本发明治疗的癌症的实例包括但不限于上皮起源的癌症，比如胶质母 细胞瘤、肺癌、乳癌、头颈癌和膀胱癌或者其它的表皮样癌。为杀伤细胞或者抑制细胞生长，可以将靶细胞与本发明的EGFR结 合分子接触。将以有效杀伤或者抑制肿瘤细胞增殖的量提供所述EGFR 结合分子。还可以将EGFR结合分子与其它治疗癌症的常规疗法联合。适于联 合疗法应用的试剂或者因素是应用于细胞时引起DNA损伤的任何化合 物或者治疗方法。这样的试剂和因素包括引起DNA损伤的辐射和波， 比如y-辐照、X-射线、UV-辐照、微波、电子发射等。多种化合物，也 被称为化疗剂，具有引起DNA损伤的功能，它们所有都可以用于本文 公开的联合治疗方法。预期可用的化疗剂包括，例如，阿霉素、5-氟脲 嘧啶(5FU)、依托泊苷(VP-16)、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C、 顺铂(CDDP)和在某些情形中的过氧化氢。应当理解，上述的实施方案和以下的实施例是以举例说明的方式给 出，并无限制的意思。对于本领域的技术人员而言，通过本说明书，本 发明范围内的各种改变和变型将变得显而易见。实施例材料和方法将2 x io4细胞密度的LA22杂交瘤(ATCC No. HB10342 )细胞注 射给Balb/c棵鼠。应用蛋白G亲和琼脂糖珠(Upstate, Lake Placid, NY ) 纯化来自腹水的单克隆抗体。简要地说，用PBS (pH7.4)以1:1稀释 腹水液并在14,000 g离心4分钟。小心收集上清液并将其加载于蛋白G 柱(含有2 mL蛋白G琼脂糖)以及随后向柱施加10 mL的PBS以洗 去未结合组分。用洗脱緩冲液(50mM盐酸甘氨酸，pH2.7)洗脱结合 的mAb LA22并通过脱盐柱(Pierce, Rockford, IL )将其转移到PBS( pH 7.4)中。用SDS-PAGE分析等分试样的纯度。确定mAbLA22的浓度 为1 mg/ml的小鼠IgG，其相当于1.40的O.D.(光密度)读值。应用A431人表皮样癌细胞(其表达大量的EGFR)和A549人肺腺癌细胞进行体外细胞毒性测定。用含有10%胎牛血清(FBS ) ( Hyclone, Logan, UT )的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM )在37C单层培 养这些细胞。用来将小分子抗癌药物丝裂霉素(MMC; Kyowa Hakko Kogyo, Tokyo, Japan )或平阳霉素(PYM )偶联到抗-EGFR mAb LA22或LAI 的原理包括用N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)活化 mAb的氨基，接着用亚胺硫醇(iminothiolane)修饰的mAb LA22进 行二硫键交换(图1 )。见Knoll, K. et al" Cancer Res., 60:6089-6094, 2000.为了活化，MMC( 10 mg溶于5 mL PBS )与0.9 mL SPDP( Pierce, Rockford，IL) ji&液(10 mg溶于1 mL DMF )在4匸反应6小时。以小 等分在-80"C保存所得溶液，直至以后使用。在氮气氛下，通过加入46 jiL 2-亚胺石克醇(4.4 mg溶于1 mL DMF ),经过1小时来还原mAb LA22(5.5 mg溶于3 mL PBS)或者mAb LA1。通过应用用PBS预平衡的 脱盐柱(Pierce, Rockford, IL )通过体积排阻色语纯化还原后抗体。活 化的MMC( Mr: 137 )或者活化的PMC与石克醇化(thiolated )mAb LA22(Mr: ~ 150 K)或者硫醇化mAb LAI的偶联分别在氮气氛下以40:1 的摩尔比在室温下实施1小时。应用脱盐柱(Pierce, Rockford, IL )去 除剩余游离的MMC-SPDP或者PMC-SPDP，脱盐柱同样用PBS进行 预平衡。用0.2 nm Supor膜(Pall, Ann Arbor, MI)对LA22-MMC (或 者LA22-PMC )或者LA1-MMC (或者LAI-PMC )产物进4亍过滤灭菌。 根据所添加MMC或者PMC的总量计算LA22-MMC(或者LA22-PMC ) 或者LA1-MMC (或者LAI-PMC )偶联物用于细胞毒性和/或体内试验 的剂量。最终免疫偶联产物的等分试样在4X:保存，留待以后使用。实施例1A431细胞(人表皮样癌细胞系(ATCC No. CRL-1551))以2000细 胞/孔的量接种于含DMEM-10"/。 FBS的96孔板中。4小时后，将对照 培养基、mAb LA22( 40 nM )、 LA22-PYM免疫偶联物(LA22-P, 40 nM )、 LA22-MMC免疫偶联物(LA22画M, 40 nM )、 mAb LAI (40 nM )、 LAl-PYM免疫偶联物(LA1-P, 40 nM )、LA1-MMC免疫偶联物(LA1-M 40 nM)、 PYM-SPDP (P-连接子，40 nM)、或者MMC-SPDP (M-连 接子，40nM)添加到细胞培养中。4天后，通过MTT测定(Mosmann, J. Immunol. Methods, 65:55-63(1983))来确定每孔中的细胞数。该数以细胞死亡百分率来表示(图1 )。如图1所示，在单独应用40 nM抗-EGFR mAb LA22的情况下，没 有观察到胡显的细胞死亡，而LA22-PYM和LA22'-MMC分别导致42% 和84%的细胞死亡。在相同剂量(40 nM )下，单独的抗-EGFR mAb LA1 引起35。/。的细胞死亡。对于LA1-PYM和LA1-MMC免疫偶联物观察 到细胞杀伤活性增加。实施例2为评价LA22抗生素免疫偶联物的上述体外细胞毒性的浓度依赖 性，在将所述细胞以2000细胞/孔的量接种于DMEM-10% FBS的96 孔板中之后4小时，将不同量的LA22、 LA22-PYM和LA22-MMC添 加到A431细胞培养物中。4天后，通过MTT测定来确定每孔的细胞数。 该数以细胞死亡百分率来表示(图2 )。图2说明抗-EGFR mAb LA22-PYM或者LA22-MMC以剂量依赖方式引起A431人癌细胞死亡。与另外的对照一起实施另一 LA22-MMC细胞毒性测定。将A431 细胞以及人肺腺癌A549细胞(ATCC No. CCL-185 )接种(2xl(^个 细胞/孔，100 nL/孑L )于96孔细胞培养板(Corning, Corning, NY )，其 中存在DMEM培养基和10% FBS，在37*€和5% C02条件下培养4 小时。将在无血清DMEM培养基(100 nL )中的MMC、棵mAb LA22 或LA22-MMC免疫偶联物添加到各个孔中，并在37"C和5% C02条件 下孵育4天。首先弃掉上清液。对于死亡细胞对照，将100 nL的冷95% 乙醇加入孔中，保持l分钟，随后弃掉。添加(100 [iL/孔)MTT溶液(USB， Cleveland, OH; 10%在DMEM培养基中)并在37C孵育4小 时。弃掉上清液并添加DMSO (100 pL/孔)以溶解沉淀物。用酶标仪(Bio-Rad， Hercules, CA )在570 nm处读取光密度。对A431/A549体外细胞生长的上述抑制作用被用作体外药物活性的 度量，并且通过将培养细胞(2 x 103个细胞/孔)与MMC、 LA22-MMC 或者LA22在37"C下接触4天来确定。所检验的MMC浓度为0.03 ng/mL 至30 fig/mL。根据添加到化学偶联反应中的MMC总量瓜计算 LA22-MMC偶联物有关细胞毒性的剂量。因为化学偶联反应的效率不 是100%，所以在理论上与LA22连接的实际MMC浓度低于所指示的 浓度。LA22的剂量与LA22-MMC相同。这些结果表明MMC偶联LA22比单独的游离MMC的效力要低，但是比棵mAb LA22的效力要强(见 图3A和3B )。用MMC标记非特异性小鼠IgG (作为阴性对照)并将 其加到A431细胞中以评估其对体外细胞生长的细胞毒性。结果显示非 特异性小鼠IgG-MMC免疫偶联物没有以LA22-MMC —样有效地杀伤 培养细胞，这证明LA22-MMC的细胞毒性可通过LA22-EGFR结合来 介导(数据未显示)。实施例3同样地，以相似方式评估应用LA1抗生素免疫偶联物的体外细胞毒 性测定。将A431细胞以2000个细胞/孔的量接种于DMEM-10% FBS 的96孔板中。4小时后，将不同量的LA1、 LA1-PYM或者LA1-MMC 添加到所述细胞培养中。4天后，通过MTT测定来确定每孔的细胞数。 该数以细胞死亡百分率来表示(图4)。如图3所表明的，mAb LA1和 它的免疫偶联物以剂量依赖的方式诱导A431人癌细胞死亡。与平阳霉 素或者丝裂霉素C的偶联明显增加了 mAb LA1的细胞杀伤效力。实施例4应用人肺癌A549细胞系(ATCC No. CCL-185 )进一步实施关于 LA1免疫偶联物的另一体外细胞毒性测定。将A549细胞以2000个细 胞/孔的量接种于DMEM-10% FBS的96孔板中。4小时后，将不同量 的LA1、 LA1-MMC或者MMC-SPDP添加到所述细胞培养中。4天后， 通过MTT测定来确定每孔的细胞数。该数以细胞死亡百分率来表示(图 5)。 LA1-MMC以剂量依赖的方式诱导A549人肺癌细胞死亡。单独应 用mAb LA1没有观察到明显的细胞死亡。与丝裂霉素C的偶联明显地 增加了 LA1的细胞杀伤效力。实施例5为检验LA22-MMC对体内胂瘤毒性的作用，应用体重约20 g的5 周龄雌性BALB/c小鼠。通过在第0天将2乂106个胂瘤细胞(重悬于 0.2 mL PBS中)皮下注射入小鼠右前腿产生A431细胞系的异种移植物。 将小鼠分组(每组5只小鼠)并在第1天、第5天和第9天以指定浓度 腹膜内施用PBS、 MMC、棵抗体或者免疫偶联物。每周三次测量肿瘤 大小，根据以下等式计算肿瘤体积肺瘤大小=宽度2><长度/2。在试验结束时(第21天)，处死小鼠，取出肿瘤并称重。如图6A所示，当与对照未处理小鼠比较时，用LA22-MMC ( 0.08 mg/kg )处理的小鼠抑制了体内肺瘤生长。尽管注射MMC ( 0.08 mg/kg ) 强烈抑制肿瘤生长，但是其效率大大低于LA22-MMC (0.08mg/kg), 这表明LA22介导的特异性肿瘤靶向的极大优势。低剂量(0.0032 mg/kg ) 施用LA22-MMC不具有高剂量(0.08 mg/kg )施用LA22-MMC同样的 效力，这表明了 LA22-MMC免疫偶联物的剂量依赖性作用。考虑到由 测量肿瘤所引起的巨大误差，处死小鼠并称重肺瘤(图6B)。在注射了 LA22-MMC( 0.08 mg/kg )的2只小鼠内没有可检测的肿瘤。LA22-MMC (0.08 mg/kg)处理组的平均胂瘤大小远低于其它组。与对照组(注射 PBS)相比，肿瘤缩小到15%，而在注射三次MMC (0.08mg/kg)后， 肿瘤只缩小到60%。这些结果显示LA22-MMC在体内强烈抑制肺瘤生 长。实施例6为显示LA22-MMC免疫偶联物的生物分布，保持在无特定抗原条 件下的5周龄雌性BALB/c棵鼠，在它们的右上肋腹处皮下植入A431 细胞(5xl06)或者A549细胞(5xl06)。当肿瘤的平均直径达到~ 1.0 cm时，对荷瘤小鼠实施免疫闪烁成〗象处理。向用40 ng Iodogen(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO )包的小瓶加入100 ng的 LA曙22-MMC抗体(0.76 mg/mL， 132 )和0.2 M、 pH7.4磷酸緩冲 液中的100 MBq Na1251 ( Beijing Atom High Tech.， Beijing, China )。在 室温下孵育10分钟后，通过PD-10柱(Amersham， Piscataway， NJ) 纯化反应混合物。通过ITLC (85。/。甲醇作为流动相)在放射-薄层扫描 仪(Bioscan AR2000, Washington, DC )上测量标记产率和放射化学纯 度，它们分别大于85%和97%。向荷载A431/A549异种移植物的棵鼠 静脉内注射17.6 MBq ( ~ 20 ng， 0.3 mL )的125I-LA22-MMC,并将其 俯卧置于双头y照相"(E.CAM， Siemens, Munich, Germany ),该照相 机配备有平行孔(parallel-hole )、低能、高分辨率准直仪(collimator )。 在注射后的不同时间点获取后部图像，用于视觉观察LA22-MMC的体 内分布，并将其以128 x 128矩阵进行数字化保存。采集计数限制(Acquisition count limits )设置为1000 K。在图7中显示在4小时至7天中的成像结果。125I标记的LA22-MMC首先分布于循环系统和富含血液的组织比如肝或心中(4小时成4象)；逐 渐地，标记的免疫偶联物富集在肿瘤部位(第l天至第4天)。4天后， LA22-MMC主要富集在肿瘤部位上。实施例7爱必妥@和赫赛汀@是两种用于癌症治疗的商品单抗药物，它们分别 靼向EGFR和HER2。 EGFR和HER2都属于ErbB受体家族 (Mendelsohn, J. et al" Oncogene, 19:6550-7565, 2000 )。为比较 LA22-MMC与爱必妥@以及赫赛汀@，实施应用MTT方法的体外细胞毒 性测定。根据以上所述，实施MMC与爱必妥⑧(ImClone, New York, NY ) 或者赫赛汀⑧(Genentech， San Francisco, CA )或者小鼠IgG的偶联。用MMC标记爱必妥@和赫赛汀@并评价它们的细胞毒性。将A431 (图8A)或者A549 (图8B)细胞接种在96孔细胞培养板中。孑L中加 入棵抗体或者免疫偶联物并在37t:和5% C02条件下孵育4天。应用 MTT测定法测量活细胞。使用相似的抗体浓度，LA22-MMC前药比爱 必妥@-1^1\1€或者赫赛汀⑧-MMC更有效地杀伤A431和A549细胞(见 图8A和8B )。本发明前面的描述提供了例证和说明，但并没有穷举的意思或者将本 发明限制于某一具体^Hf的内容。改进和变化可能与上述教导相一致或者 可以从本发明的实践中获得。因此，应注意本发明的范围是由权利要求和 它们的等同物来限定。
权利要求
1.EGFR结合分子，其包含抗-EGFR单克隆抗体的抗原结合片段和细胞毒性剂，其中所述抗-EGFR单克隆抗体选自LA1和LA22。
2. 根据权利要求1的EGFR结合分子，其包含与所述细胞毒性剂 偶联的所述单克隆抗体。
3. 根据权利要求1或2任一项的EGFR结合分子，其中所述细胞 毒性剂是细胞毒性抗生素。
4. 根据权利要求3的EGFR结合分子，其中所述细胞毒性抗生素 选自丝裂霉素C和平阳霉素。
5. 根据权利要求4的EGFR结合分子，其中所述EGFR结合分子 是工程化抗体，其包含LA1或LA22的抗原结合片段。
6. 根据权利要求1或2任一项的EGFR结合分子，其中所述细胞 毒性剂选自化疗剂、放射性同位素、细胞毒素和抗癌前药活化酶。
7. —种杀伤或者抑制癌细胞生长的方法，其包括将所述细胞与根 据权利要求1-6中任一项的EGFR结合分子接触。
8. 根据权利要求7的方法，其中所述癌细胞是表皮样癌细胞。
9. 根据权利要求7的方法，其中所述癌细胞是肺癌细胞。
10. —种治疗目标对象中癌症的方法，其包括给所述目标对象施用 有效量的根据权利要求1-6中任一项的EGFR结合分子。
11. 药物组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项的EGFR结合 分子。
12. 与丝裂霉素C或者平阳霉素偶联的抗-EGFR抗体。
13. 根据权利要求12的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
14. 根据权利要求12或13中任一项的抗体，其中所述抗体是工程 化抗体或者抗体片段。
15. 杀伤或者抑制癌细胞生长的方法，其包括将所述细胞与根据权 利要求12-14中任一项的抗体接触。
16. 治疗目标患者中癌症的方法，其包括向所述目标患者施角有效 量的根据权利要求12-14中任一项的抗体。
17. 药物组合物，其包含根据权利要求12-14中任一项的EGFR结 合分子。
全文摘要
本发明涉及与丝裂霉素C、平阳霉素或者其它抗细胞剂偶联的单克隆抗体LA1或LA22。本发明还涉及与丝裂霉素C或者平阳霉素偶联的其它抗EGFR抗体。本发明的抗体可用来治疗癌症，其包括但不限于上皮起源的那些癌症，比如胶质母细胞瘤或者肺癌、乳癌、头颈癌和膀胱癌。
文档编号A61K39/00GK101277716SQ200680018655
公开日2008年10月1日 申请日期2006年4月20日 优先权日2005年4月27日
发明者乐 孙 申请人:回而生医药科技有限公司