含穿心莲内酯衍生物的药物组合物及其制备方法与用途的制作方法

专利名称：：含穿心莲内酯衍生物的药物组合物及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及以下述通式化合物为活性成分的药物组合物及其制备方法，具体为乳剂及其制备，及此药用组合物在制药中的用途。1896年Boorsma从穿心莲中首次分离出一种无色结晶物，1911年经Gorter结构鉴定为二萜内酯类化合物，被命名为androgrAPholide，中文名称穿心莲内酯，又称穿心莲乙素，是穿心莲的主要化学成分之一。穿心莲内酯具有抗炎、解热、抗病毒、抗菌、免疫调节、抑制NF-icB、抗肿瘤等药理活性。但穿心莲内酯的结构决定穿心莲内酯化学性质较不稳定和相对活泼的特点韩光.穿心莲的超分子提取和穿心莲内酯衍生物的合成及活性研究.辽宁中医学院博士学位论文.2005(6)。如穿心莲内酯在碱性条件下不稳定，且随着碱性的增加其不稳定性增强；其最稳定的pH值为35，但在该酸性条件下溶解性较差。该特点使得将穿心莲内酯直接开发为新药具有一定的缺陷性。故近年来许学学者皆致力于穿心莲内酯的结构改造，以期改善该化合物自身的缺陷。如我国药物化学工作者对穿心莲内酯进行结构改造，而成功开发的穿心莲内酯衍生物穿琥宁注射液(脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐灭菌水溶液)、炎琥宁注射液(脱水穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯单钾钠盐水物)、莲必治注射液(穿心莲内酯与亚硫酸氢钠作用而制得的单体化合物灭菌水溶液)、喜炎平注射液(穿心莲总内酯磺酸盐)治疗上呼吸道感染、肺炎等皆取得显著的临床疗效。但上述几个衍生物却存在着稳定性差、质量难控、不良反应发生率高、配伍禁忌多等问题。其中尤以过敏性不良反应发生率较高的问题较为严重张立华.穿琥宁的不良反应分析及措施.中国新医药.2004(3):67—69;李杰，陈敏.炎琥宁致急性呼吸窘迫症1例.江苏药学与临床研究.2004(增刊)朱磊.喜炎平注射液和青霉素、头孢拉定在两种输液
背景技术：
：中配伍前后微粒的变化.辽宁药物与临床.2002(4):199—200。究其原因我们认为上述穿心莲内酯衍生物在形成衍生物的过程'中产生许多中间体，使其衍生物的成份复杂多变，从而其制成注射剂后稳定性差，有效成份的含量测定困难，质量难控。且由于衍生物及其中间体复杂多变而导致过敏性不良反应发生率高，并使其在与抗生素配伍过程中出现沉淀等。国内上市的穿心莲内酯衍生物的上述问题严重妨碍该类药物的临床应用。而国外的许多学者亦以穿心莲内酯为原料衍生出大量的化合物，其中以印度科学家NanduriS为代表。该课题组近年来合成了上百种穿心莲内酯衍生物，并对其进行抗肿瘤、调节代谢、调节免疫等活性筛选PCT公开号WO01S5710，获得许多有价值的化合物，但却未发现对该类化合物进行深入的药剂学研究报告。一氧化氮参与机体许多生理和病理过程，参与巨噬细胞的细胞毒和免疫调节、松驰血管平滑肌、抑制血小板聚集和传递神经信息等。一氧化氮生成过量或不足在许多疾病的发生中皆起着重要作用。其中一氧化氮生成过量可见于骨性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、全身炎性反应综合征、脓毒血症、感染性休克、脑梗塞、高血压、心肌梗塞、充血性心力衰竭、肾小球肾炎、肝硬化、炎症性肠病、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、血管性头痛、哮喘、肿瘤余跃.一氧化氮与疾病.北京；科学出版社。故开发可以抑制一氧化氮生成过量的新药具有重要的临床意义。国内外的学者们虽然获得大量穿心莲内酯衍生物，但却未发现对该类化合物进行深入的药剂学研究报告。由于下述通式化合物(I)的水溶性极差，为了解决其注射给药问题，我们发明以通式化合物(I)为活性成份的乳剂组合物。其中Ri、R2选自乙酰基、羟基、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、链烷酰基、链烯酰基、芳酰基，杂芳酰基或Ri和R2被异亚丙基取代，Rs选自氢或卤素。通式化合物(I)在大豆油等长链油中溶解度很小，不能达到临床应用要求；通式化合物(I)在中链油中有较好的溶解度，但由于中链油(MCT)不含人体必需的a-亚麻酸和亚油
发明内容酸，而必须有长链油(LCT)来补充，这就使中链油(MCT)单独使用不好唐云.脂肪乳剂与多不饱和脂肪酸的代谢.国外医学外科学分册，i994(6):322-324，因此本发明采用中链油和长链油的混合油作为油相载体；本发明对长链油和中链油的比例进行了筛选，确定了长链油和中链油的最佳比例，既能使通式化合物(I)溶解度达到临床治疗有效量，又能制成质量稳定并符合临床用药安全的乳剂。通过对上述通式化合物(I)为活性成份的乳剂组合物的药理活性研究发现，该乳剂组合物不但解决注射给药问题，还取得以下意想不到的效果上述通式化合物(I)的体内药理活性与剂型关系密切，即简单地将该通式化合物(I)混悬后口服，动物体内抗炎活性较差甚至无活性，而将其制成乳剂后，不但解决注射给药问题，而且无论口服给药还是注射给药，其动物体内抗炎活性皆得到显著性提高。具体技术方案如下-一种通式化合物(I)的药物组合物，含治疗有效量的通式化合物(I)及药学上所说口服或静脉给药乳剂制剂的辅料。较优选的药物组合物，所述为口服乳或静脉乳剂，其组成为治疗有效量的通式化合物(I)、药学上可作为载体的油、乳化剂和水；其配比为每lOOtnl乳剂含通式化合物(I)0.013.0g、油520g、乳化剂0.55g，油酸0.02-0.2g,等渗调节剂2.03.Og，余量为水。上面所述的药物组合物，其特征在于，所述油为药学上作为载体的油，由中链油与长链油以中链油比长链油重量比为h0.25的比例组成。更优选的乳剂组合物配比是每100ml乳剂组合物含通式化合物(I)0.1lg、中链油215g、长链油310g、乳化剂0.83.0g，油酸0.02-0.2g，等渗调节剂2.03.Og，余量为水。再优选的乳剂组合物配比是每100ml乳剂组合物含通式化合物(I)0.1lg、中链油28g、长链油38g、乳化剂1.22.4g，油酸0.02-0.lg，等渗调节剂2.03.Og，余量为水。本发明所述通式化合物(I)具体亦可如下列通式(II):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中X选自氢或卤素。其中特别有用的化合物包括3，19一异亚丙基一14一乙酰穿心莲内酯、7—氯一3，19—异亚丙基一14一乙酰穿心莲内酯。本发明所述通式化合物(I)具体亦可如下列通式(m):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中Ri、R2选自乙酰基、羟基、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、链烷酰基、链烯酰基、芳酰基，杂芳酰基，R3选自氢或卤素。其中特别有用的化合物包括3，14，19一三乙酰穿心莲内酯、14，19一二乙酰穿心莲内酯、14—乙酰穿心莲内酯、7—氯一3，14，19—三乙酰穿心莲内酯。本发明所述的通式化合物(I)中的具体代表性化合物是由穿心莲内酯经化学合成获得，并经过纯化获得，含量不低于95%。所述的油是指生物可接受的物质，一般指植物油、动物油、合成油或其混合物。长链油为植物油或动物油或两者混合物，所述植物油为大豆油、玉米油、花生油、橄榄油、蓖麻油、棕榈油、椰子油、菜籽油、芝麻油、棉子油中的一种或它们的混合物，所述动物油为鱼油、鯨蜡油或它们的混合物。中链油即辛癸酸甘油酯，是半合成的天然功能性油脂，碳链长度(VC1C。本发明所述的乳化剂可以是磷脂类或泊洛沙姆类(如poloxamer188)中的一种或几种。本发明所述的乳化剂优选大豆磷脂、蛋黄磷脂、氢化磷脂等中的一种或几中。本发明所述通式化合物(I)乳剂组合物的等渗调节剂为甘油等常规辅料。前述各项药物组合物的制备方法为将通式化合物(I)与油混合，加热至6080'C，搅拌，使溶解为澄明溶液，加入油酸和乳化剂，搅拌，使溶解为澄明溶液，得油相；将等渗剂溶于水中形成水相，加热至60-8(TC;在高速搅拌下将油相加到水相中形成初乳，所得初乳加水定容后，经高压均质机乳化，即得。优化的制备方法为将含有治疗有效量通式化合物(1)、大豆磷脂和/或蛋黄磷脂、中链油与长链油混合，加热至708(TC，加入油酸，使溶解为澄明溶液，得油相将甘油溶于水中形成水相，加热至70-80°C;把含有通式化合物(I)的油相加到水相中用高速搅拌形成初乳，所得初乳加水定容后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后灭菌。含有所述通式化合物(I)的乳剂组合物体外可显著抑制一氧化氮生成；并且对多种肿瘤细胞皆具有细胞毒活性。本发明提供了上述通式化合物(I)乳剂组合物在制备治疗一氧化氮生成过量疾病药物中的应用。其中所述一氧化氮生成过量疾病包括骨性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、全身炎性反应综合征、脓毒血症、感染性休克、脑梗塞、高血压、心肌梗塞、充血性心力衰竭、肾小球肾炎、肝硬化、炎症性肠病、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、血管性头痛、哮喘、肿瘤。本发明提供的通式化合物(I)乳剂组合物用作治疗一氧化氮生成过量疾病的用法用量每人每日0.003-6mg/kg，口服或静脉注射。下述具体实施方式目的在于进一步解释说明本发明，并不局限于此。具体实施例方式穿心莲内酯(纯度大于98%):购自四川广汉本草植化有限公司；其余化学试剂均为市售品(分析纯)精制大豆卵磷脂(供注射用)购自上海太伟药业有限公司；鱼油、精制蛋黄卵磷脂(供注射用)购自上海东尚实业有限公司；大豆油茶油、玉米油(供注射用)购自铁岭北亚药用油有限公司。制备例l3,19-异亚丙基-14-乙酰穿心莲内酯(简称AP5)的制备将5g穿心莲内酯(简称AP)、20mL2，2-二甲氧基丙烷及催化量的对甲苯磺酸溶于100mL丙酮中，加热回流过夜，反应混合物用乙酸乙酯萃取，有机层依次用饱和NaHC03和饱和食盐水洗，无水Na2S04干燥，浓縮，经硅胶柱层析得3,19-异亚丙基穿心莲内酯(简称AP2)，为白色固体。lgAP2溶于10mLAcA加热回流2小时，反应混合物用乙酸乙酯萃取，有机层依次用水、饱和NaHC03和饱和食盐水洗，无水Na2SC^干燥。经硅胶柱层析得AP5白色固体。分子式为C25H3606。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>化合物确认数据如下IRvSCcm—1):3435,2932,1740,1642,1383,1227,1096,1024,897,603,466.&(400MHz,CDCI3):S7.03(td,J=6.91,1.49Hz,1H,H-12),5.93(d,J=6.00Hz,1H,H-14),4.90(bs,1H，H-17a),4.56(dd，J=11.68,4.26Hz,1H,H-15a),4.54(bs,1H,H-17b)，4.25(dd,11.26,1.86Hz,1H，H-15b)，3.96(4/=11.60Hz,1H,H-19a)，3.50(dd,/=8.50,3.90Hz,1H,H-3),3.18(d,/=11.56Hz,1H,H-19b),2.51~2.39(m,3H),2.13(s,3H),2.05~1.97(m,2H)，1.871.68(m,4H),1.41(s,3H),1.36(s,3H)，1.33~1.22(m,3H),1.20(s,3H,CH3-8),0.94(s,3H,CH3-20),13C-NMR(100MHz,CDC13):5107.5，169.0,150.7,147.1,123.8,108.8,99.2,76.1,71.6,67.8,63.9,55.9,52.2,38.4,37.9,37.6,34.5,27.0,26.1,25.4,25.3,24.9,23.1,20.7,16丄MS(ESI)(%):433([M+H]+，100%)制备例23,14,19-三乙酰穿心莲内酯(简称APIO)的制备lg穿心莲内酯溶于lOmLAc20，加热回流2小时，反应混合物用乙酸乙酯萃取，有机层依次用水、饱和NaHC03和饱和食盐水洗，无水MgS04干燥。经硅胶柱层析得APIO白色固体。分子式为C26H3608。化合物确认数据如下:IRv給"cm"):3454,3080,2954,1731,1683,1375,1250,1191,1075,1026,895,606.^(400函z,CDC13):S7.00(td,J=6.84,1.48Hz,1&H-12),5.92(d,/=5.96Hz,IH,H-14),4.90(bs,IH,H-17a),4.60(dd，J=11.68，4.26Hz,IH,H-15a),4.55(dd,J=11.24，6.08Hz，IH,H-15b),4.53(bs,IH,H-17b)，4.36(d，J=11.80Hz,IH,H-19a),4.25(dd,J=11.24，1.80Hz,IH,H-3),4.12(d,■/=11.80Hz,IH,H-19b),2.522.37(m,3H),2.12(s,3H),2.05(s,6H),2.0CM.96(m,IH),1.90-1.86(m，2H),1.801.77(m，2H),1.731.66(m,IH),1.571.47(m，1H),1.371.31(m,2H),1.03(s,3H:CH3-8)，0.76(s,3H,CH3-20)13C-NMR(100MHz,CDC13):S170.8，170.4,170.3,168.9，150.0，146.5,124.0,108.8,79.6,71.5,67.7,64.6,55.8,55.2,41.2,38.9,37.8,37.0,25.1,24.6,24.2,22.6,21.1,21.0,20.6,14.4MS(ESI)j/z(°/。)499([M+Na]+,100%),477([M+H]+，13%)制备例314,19-二乙酰穿心莲内酯(简称AP12)和14-乙酰穿心莲内酯(简称AP13)的制备5g穿心莲内酯加入30mL乙酸搅拌加热至8(TC，反应过夜。反应混合物用乙酸乙酯萃取，有机层依次用水和饱和食盐水洗，无水MgS04干燥。经硅胶柱层析得AP12和AP13。AP13为白色固体。分子式为C22H32Q6。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>化合物确认数据如下-IRvl穀(cm"):3436,2927,1738,1641,1384,1233,1077,1024,723,621&(400MHz,Acetone):S6.88(td,J=6.92,1.68Hz,1H,H-12),6.03(d,J=6.04Hz,1H,H-14),4.87((!，■/=1.20Hz,1H,H-17a),4.59(d,J=1.08Hz,1H,H-17b)，4.59~4.57(m,1H,OH-19),4.58(dd,J=10.94,5.94Hz,1H,H-15a)，4.26(dd,J=11.00,1.76Hz，1H,H-15b),4.11(d,</=10.88Hz,1H,H-19a),3.70(d，■/=6.88Hz,1H,OH-3),3.44~3.40(m，1H,H-3),3.303.25(m,1H,H-19b),2.62~2.38(m,3H),2.08(s,3H，Ac-14),2.06~1.96(m,2H),1.86-4.74(m,4H)，1.40~1.25(m，3H)，1.20(s,3H，CH3-8):0.70(s,3H,CH3-20)MS(ESI)m/z(%):415([M+Na]+,100%)，393([M+H]+，56%)制备例47-氯-3,19-异亚丙基-14-乙酰穿心莲内酯(简称AP20)的制备取AP5510mg，溶于20raL1:1二氯甲烷与水的混合溶液中，加入CeC].7H201.32g，缓慢滴加12%NaOCl2.2mL，室温反应1小时后加入5mL10%邮03搅拌30min停止反应，反应混合物用二氯甲烷萃取，有机层依次用水、饱和NaHC03和饱和食盐水洗，无水MgS04干燥。经硅胶柱层析得AP20。AP20为白色固体。分子式为C25H3505C1。IRvgg(cm—、3438,2924,2854,1738,1638,1461,1383,1228,1098,1020,832,676&(400MHz,CDC13):S7.18(td,</=6.38,1.16Hz,1H,H-12),5.98~5.97(m,1H,H-17a),5.93((!，/=6.04Hz,1H,H-14),4.58(dd,J=11.28,6.08Hz，1H,H-15a),4.26(dd,J=11.28,1.68Hz,1H,H-15b),4.15-4.04(m,2H，H-17b,H-7)，3.98((!,</=11.44Hz,1H,H-19a),3.52~3.49(m,1H,H-3),3.24(d,J=11.48Hz,1H,H-19b),2.59~2.56(m,2H),2.44(bs,1H),2.17~2.11(m，1H),2.13(s，3H,Ac-14):2.0CM.71(m，4H),1.46~1.38(m，1H),1.42(s,3H),1.38(s,3H),1.28~1.22(m,1H),1.22(s,3H,CH3-8),0.95(s,3H,CH3-20)MS(ESI)//z(%):469([M+H]+,33%),467([M+H]+,100%)制备例57-氯-3,14,19-三乙酰穿心莲内酯(AP23)的制备取APIO600mg，溶于30mL1:1二氯甲烷与水的混合溶液中，加入CeCl7H201.41g，缓慢滴加12%NaOCl2.4mL，室温反应1小时后加入8mL10%^^03搅拌30min停止反应，用二氯甲烷萃取，有机层依次用水、饱和NaHC03和饱和食盐水洗，无水MgS04干燥。柱层析得AP23。AP23为白色固体。分子式为C26H3508C1。化合物确认数据如下IRv^Ccm-1):3445,2926,2855,1736,1640,1460,1382,1237,1039,854,677,442^(400MHz,CDC13):S7.13(td,J=6.92,1.40Hz,1H,H-12),6.00-599(m,1H,H-17a),5.92(d,/=5.92Hz,1H,H-14),4.62-4.56(m,2H),4.41(d,/=11.88Hz,1H),4.2611.32,1.88Hz,1H),4.22(d,J=11.92Hz,1H),4.08(d,./=11.36Hz,1H),4.00(d,./=11.48Hz,1H),2.61~2.58(m,2H),2.46(bs,1H),2.12(s,3H),2.07(s,3H),2.05(s,3H),1.901.85(m,1H),1.78~1.69(m,2H),1.54~U9(m,3H),1.06(d,J=11.16Hz,1H),1.03(s,3H,CH3-8),0.85(s,3H,CH3-20)MS(ESI)ot/z(%):513([M+H〗+,33%),511([M+H]+,100%)制备例6空白乳的制备将蛋黄卵磷脂1.2g、加入到中链油6g和大豆油4g的混合油中，加入油酸0.04g，加热至6080°C，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.25g溶于80ml水中形成水相，加热至60-80°C;把油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后,分装后12rC灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径176nm。实施例1:AP5乳剂的制备将AP50.05g、大豆卵磷脂0.5g、加入到茶油3g和中链油2g的混合油中，加入油酸O.02g，加热至608(TC，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.0g溶于60ml水中形成水相，加热至60-8(TC;把含有AP5的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后,分装后121'C灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径416nm。实施例2:AP10乳剂的制备将AP103.0g、蛋黄卵磷脂5.0g、加入到精制芝麻油5g和中链油20g的混合油中，加入油酸0.2g,加热至6080°C，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油3.0g溶于60ml水中形成水相，加热至60-8(TC;把含有AP10的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100inl后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后12:TC灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的O色乳液，平均粒径758咖。实施例3:AP12乳剂的制备将AP121.0g、蛋黄卵磷脂3.0g、在氮气保护条件下加入到鱼油10g和中链油15g的混合油中，加入油酸0.2g，加热至6080。C,搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油3.0g溶于70ml水中形成水相，加热至60-80°C;把含有AP12的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后12rC灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径371nm。实施例4:AP13乳剂的制备将AP130.lg、蛋黄卵磷脂0.8g、在氮气保护条件下加入到中链油2g和玉米油3g的混合油中，加入油酸0.02g，加热至6080。C，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.0g溶于80ml水中形成水相，加热至60-8(TC;把含有AP13的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后,分装后121'C灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径274mn。实施例5:AP20乳剂的制备将AP201.0g、蛋黄卵磷脂2.4g、加入到中链油8g和玉米油8g的混合油中，加入油酸0.lg，加热至608(TC，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油3.0g溶于80ml水中形成水相，加热至60-80'C;把含有AP20的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后12rC灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径258nm。实施例6:AP23乳剂的制备将AP230.lg、大豆卵磷脂1.2g、加入到中链油2g和大豆油3g的混合油中，加入油酸0.02g,加热至608(TC，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.Og溶于80ml水中形成水相，加热至fi0-8(TC;把含有AP23的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121。C灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径197mn。实施例7:AP5乳剂的制备将AP50.5g、蛋黄卵磷脂2.4g、加入到中链油15g和大豆油3g的混合油中，加入油酸0.06g，加热至6080'C，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于80ml水中形成水相，加热至60-8(TC;把含有AP5的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121'C灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径384nra。实施例8:AP5乳剂的制备将AP50.lg、蛋黄卵磷脂1.2g、加入到中链油2g和大豆油10g的混合油中，加入油酸0.04g，加热至608(TC，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于80ml水中形成水相，加热至60-8(TC;把含有AP5的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ral后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121匸灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径316nra。实施例9:AP5乳剂的制备将AP50.3g、蛋黄卵磷脂1.4g、加入到中链油3g和大豆油8g的混合油中，加入油酸0.04g，加热至6080'C，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.25g溶于80ml水中形成水相，加热至60-80°C;把含有AP5的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后,分装后121°0灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径216nin。实施例10:AP5乳剂的制备将AP50.5g、蛋黄卵磷脂1.6g、加入到中链油6g和大豆油4g的混合油中，加入油酸0.04g,加热至6080°C，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于80ml水中形成水相，加热至60-80°C;把含有AP5的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121'C灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径316nm。实施例11:AP10乳剂的制备将AP100.2g、蛋黄卵磷脂1.6g、加入到中链油2g和大豆油8g的混合油中，加入油酸0.04g，加热至608(TC，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.25g溶于80ml水中形成水相，加热至60-8(TC;把含有AP5的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后,分装后12rC灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径164nm。实施例12:AP10乳剂的制备将APIO0.3g、蛋黄卵磷脂1.6g、加入到中链油3g和大豆油9g的混合油中，加入油酸0.05g，加热至6080'C，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.5g溶于80ml水中形成水相，加热至60-80'C;把含有AP10的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121'C灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径176nm。实施例13:AP5乳剂的制备将AP53.Og、蛋黄卵磷脂2.4g、加入到精制芝麻油5g和中链油15g的混合油中，加入油酸0.2g，加热至6080'C，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油3.Og溶于60ml水中形成水相，加热至60-8(TC;把含有AP5的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后12rC灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径468mn。实施例14:AP12乳剂的制备将AP123.Og、大豆磷脂2.Og、加入到精制大豆油5g和中链油15g的混合油中，加入油酸0.2g，加热至608(TC，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油3.Og溶于60ml水中形成水相，加热至60-8(TC;把含有AP12的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121。C灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径438nm。实施例15:AP13乳剂的制备将AP133.Og、蛋黄卵磷脂2.6g、加入到精制芝麻油5g和中链油15g的混合油中，加入油酸0.2g,加热至608(TC，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油3.Og溶于60ml水中形成水相，加热至60-8(TC;把含有AP13的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力lOOMpa的条件下乳化后,分装后121'C灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径458nm。实施例16:AP20乳剂的制备将AP203.Og、蛋黄卵磷脂2.2g、加入到精制芝麻油5g和中链油15g的混合油中，加入油酸0.2g，加热至608(TC，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油3.Og溶于60ml水中形成水相，加热至60-8(TC;把含有AP20的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后,分装后121'C灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径418nm。实施例17:AP10乳剂的制备将AP100.Olg、大豆卵磷脂0.5g、加入到茶油3g和中链油2g的混合油中，加入油酸0.02、，加热至608(TC，搅拌使溶解为澄明溶液，得油相；将甘油2.Og溶于60ml水中形成水相，加热至60-8(TC;把含有AP10的油相加到水相中用高速搅拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，经高压均质机在压力100Mpa的条件下乳化后，分装后121'C灭菌15分钟，即得。所得乳剂为均匀的白色乳液，平均粒径420nm。对比例1:AP5在大豆油中的溶解度将AP50.02g加入到5g玉米油中，加热至608(TC，搅拌3小时，AP5不能完全溶于玉米油，无法制得油相。对比例2:AP10在大豆油中的溶解度将AP100.05g加入到20g大豆油中，加热至608(TC，搅拌搅拌3小时，AP10不能完全溶于玉米油，无法制得油相。试验例1:药物对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞释放一氧化氮(NO)的抑制活性实验1、药品及仪器脂多糖(lip叩o]ysaccharide，1PS)、MTT购自Sigma公司;小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中科院细胞库(ATCC);RPMI1640培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清购自Gibco公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯；全自动酶标仪(美国，Biotek集团生产)；恒温C02培养箱(美国，Thermo公司生产)。AP5、APIO、AP12、AP13、AP20样品:按制备例1、2、3、4制备，并以DMSO溶解用于体外细胞实验。2、小鼠巨噬细胞RAW264.7培养:小鼠巨噬细胞RAW264.7培养于含10%热灭活(56°C，30min)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素钠、100吗/mL链霉素的RPMI1640培养基中，37°C、4>(C02)=5%的恒温培养箱中孵育生长。3、NO释放量的测定由于NO极不稳定，在细胞培养上清液内很快代谢成亚硝酸基(NCf)，故采用Griess法测定样品中N02的浓度作为衡量NO水平的指标。Griess试剂A:w(N-萘乙二胺盐酸盐)=0.1%溶于水中；Griess试剂B:w(对氨基苯磺酰胺)=1%溶于4>(H3P04)=5%中，使用前等体积混合试剂A和B。用RPMI1640培养基将小鼠巨噬细胞RAW264.7稀释至5X105cells/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200nL细胞悬浮液。C02培养箱中培养lh后，每孔加入LPS(1ng/mL)和不同浓度(0.l-200pmol/L)的测试样品0.4&，同时设LPS组(不加入被测试样品)和空白对照组(DMSO)，每个样品4个重复。在37'C、CCV恒温培养箱中培养24h后吸取培养液上清100HL至酶标板中，加入等体积的Griess试剂，室温反应10min后测定540nm处的吸光值。用浓度分别为1、5、10、50Wnol/L的Na冊2绘制标准曲线，根据NaN02标准曲线计算细胞培养上清液中N02—的浓度以及对NO释放的抑制率，抑制率计算公式为LPS-[NO2—]LPS+样品NO释放抑制率<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>[NO2—]LPS-[NO2—]空白4、结果测得抑制率后，计算各样品的IC，详见表l。表1各乳剂对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞释放一氧化氮(NO)的抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>一氧化氮生成过量可导致多种疾病的发生，下面以炎症性疾病的经典模型抗炎与肿瘤的经典模型体外细胞毒活性为例说明。试验例2:AP5与APIO对巴豆油致小鼠耳肿胀的抑制作用研究1、试药AP5、AP10:按制备例l、2制备。AP5乳剂、AP10乳剂按实施例9、12制备。空白乳剂按制备例6制备。注射用炎琥宁批号20050406，吉林马应龙制药有限公司生产。地塞米松批号0601146，郑州羚锐制药有限公司生产。羧甲基纤维素钠(简称CMC):批号F20041221，国药集团化学试剂有限公司生产。2%巴豆油杭州中山化学有限公司生产。2、实验动物昆明种小鼠，昆明医学院实验动物中心提供。3、实验方法190只小鼠(19-22g)，雄性，随机分为19组，分组情况详见下表。AP5、AP10CMC混悬灌胃组皆先用1%羧甲基纤维素钠溶液混悬后给小鼠连续灌胃三天，空白CMC组灌胃同等剂量的1%羧甲基纤维素钠溶液、空白乳剂灌胃组灌胃同等剂量空白乳剂三天。AP5、AP10乳剂组、炎琥宁组、地塞米松组、空白乳剂静注组均尾静脉给药1次。给药结束后30min，每只小鼠左耳均匀涂抹巴豆油20微升，右耳不涂作为对照。4h后，脱臼处死小鼠，剪下双耳，用8mm打孔器冲下耳片，称重，计算求得平均耳片重，计算抑制率。肿胀度(mg)-左耳耳片重(mg)—右耳耳片重(mg)模型组平均耳片重一给药组平均耳片重抑制率(％)=-X100%模型组平均耳片重4、实验结果研究结果AP5与AP10混悬后灌胃无明显改善巴豆油致小鼠耳肿胀作用，炎琥宁60mg/kg亦未显示出明显的抗炎作用，而各乳剂组无论口服还是注射皆表现出显著的抑制作用，其作用强度与地塞米松相当，高剂量组甚至优+地塞米松。详见表2。试验例3:MTT法测定各乳剂体外抗肿癟活性丄、药品及仪器-MTT购自Sigma公司；各种肿瘤细胞株均购自中科院细胞库(ATCC);RPMI1640及DMEM培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清购自Gibco公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯；全自动酶标仪(美国，Biotek);恒温C02培养箱(美国，Thermo)。AP5、APIO、AP12、AP13、AP20样品按制备例l、2、3、4制备，并以DMSO溶解用于体外细胞实验。2、肿瘤细胞株的培养人肺癌细胞株A549、人胃癌细胞株SGC7901、人肝癌细胞株S腿C-7721、用含10%热灭活(56°C，30min)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素钠、100pg/mL链霉素的RPMI1640培养基，人乳腺癌细胞株MDA-MB-435s、人前列腺癌细胞株PC3用含10%热灭活胎牛血清、丄OOU/mL青霉素钠、100吗/mL链霉素的DMEM培养基在37°C、0(C02)=5%的恒温培养箱中孵育生长。3、试验方法各肿瘤细胞株按照1X105cells/mL的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200pL细胞悬浮液。C02培养箱中培养24h后，每孔加入不同浓度(0.1-200jimol/L)的测试样品0.4pL，并以0.4nL的DMSO作为空白对照组，每个组3个重复孔。加入药物处理48h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液8pL，置于0)2培养箱中继续培养4h后，弃去上清，吸干残留液体，加入DMSO150pL，在摇床上振摇IOmin使生成的甲瓒结晶充分溶解后，设定630nm为参比波长，在570nm下测定吸光值。按照以下公式计算细胞增殖抑制率。样品抑制率(％)=100X(1--)5白4、结果测得抑制率后，计算各样品的ICs。。详见表3。表2对巴豆油致小鼠耳肿胀的抑制作用实验分组给药剂量(mg/kg)给药途径动物数(只)耳肿胀度(呢)抑制率(%)空白CMC组—灌胃1020.7±4.1—空白乳剂灌胃组—灌胃1022.7±3.5—空白乳剂静注组—静注1021.6±3.2——地塞米松0.5静注1010.5±4.9A51.3炎琥宁60静注1017.5±6.019.0AP5CMC混悬剂(高)100灌胃1017.1±2.217.4AP5CMC混悬剂(低)50灌胃1020.0±3.63.4AP10CMC混悬剂(高)100灌胃1016.9±3.918.4AP10CMC混悬剂(低)50灌胃1018.5±3.510.6AP5乳剂(高)100灌胃105.5±3.8##75.8AP5乳剂(低)50灌胃1011.2±2.5#50.7AP10乳剂(高)100灌胃105.6±3.6##75.3AP10乳剂(低)50灌胃109.9±1.3#56.4AP5乳剂(高)60静注105.9±2.5AA72.7AP5乳剂(中)30静注106.7土1.4AA69.0AP5乳剂(低)15静注1011.1±2.5A48.6AP10乳剂(高)60静注103.8±2.9厶A82.4AP丄0乳剂(中)30静注102.7±1.3AA87.5AP10乳剂(低)15静注109.6±2.8A55.6与空自CMC组比较*p<0.05，林p〈0.01;与空白乳剂灌胃组比较flp〈0.05，弁p〈0.01;与空白乳剂静注组比较Ap〈0.05，AAp<0.01。表3各样品体外抗肿瘤活性(lCs。pmoi/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>权利要求1、一种以下述通式化合物(I)为活性成份的药物组合物，其组成为每100ml组合物中含有通式化合物(I)0.01～3g、油5～25g、乳化剂0.5～5.0g、油酸0.02-0.2g，等渗调节剂2.0-3.0g，余量的水；其中R1、R2选自乙酰基、羟基、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、链烷酰基、链烯酰基、芳酰基，杂芳酰基或R1和R2被异亚丙基取代，R3选自氢或卤素。2、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述通式化合物(I)为下列通式(II):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中X选自氢或卤素。3、如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述通式化合物(II)选自3，19一异亚丙基一14一乙酰穿心莲内酯、7—氯一3，19一异亚丙基一14一乙酰穿心莲内酯。4、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述通式化合物(I)为下列通式(III):CH3COO其中R,、R2选自乙酰基、羟基、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、链烷酰基、链烯酰基、芳酰基，杂芳酰基，R3选自氢或卤素。5、如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述通式化合物(m)选自3，14，19一三乙酰穿心莲内酯、14，19一二乙酰穿心莲内酯、14一乙酰穿心莲内酯、7—氯一3，14，19一三乙酰穿心莲内酯。6、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述油为药学上作为载体的油，由中链油与长链油以中链油比长链油重量比为1比0.25的比例组成。7、如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述长链油为大豆油、玉米油、花生油、橄榄油、蓖麻油、棕榈油、椰子油、菜籽油、芝麻油、棉子油、鱼油、鯨蜡油或它们的混合物；所述中链油即辛癸酸甘油酯，是半合成的天然功能性油脂，碳链长度CVd。。8、如权利要求1所述的药物组合物，所述乳化剂为大豆磷脂、蛋黄磷脂、氢化磷脂屮的一种或者它们的混合物。9、如权利要求l所述的药物组合物，其特征在于，每100ml组合物中含有通式化合物(I)0.llg、中链油215g、长链油310g、乳化剂0.83.0g，油酸0.02-0.2g，等渗调节剂2.03.0g，余量为水。10、如权利要求1所述药物组合物，其特征在于，所述组合物是口服乳剂或静脉乳剂。11、如权利要求1一10所述任一组合物的制备方法，其特征在于，将通式化合物(I)和乳化剂与油混合，加热，搅拌，使溶解为澄明溶液，得油相；将等渗剂溶于水中形成水相；在高速搅拌下将油相加到水相中形成初乳，所得初乳加水定容后，经髙压均质机乳化，得到乳剂。12、如权利要求l一ll所述任一组合物在制备治疗一氧化氮生成过量疾病药物中的应用，其中所述一氧化氮生成过量疾病包括骨性关节炎、类风湿性关节炎、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、全身炎性反应综合征、脓毒血症、感染性休克、脑梗塞、高血压、心肌梗塞、充血性心力衰竭、肾小球肾炎、肝硬化、炎症性肠病、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、血管性头痛、哮喘、肿瘤。全文摘要本发明涉及以下述通式化合物为活性成分的药物组合物及其制备方法，具体为1、该通式化合物为穿心莲内酯衍生物；2、将该通式化合物与油、乳化剂等制成乳剂；3、该乳剂药用组合物在制备一氧化氮生成过量疾病药物中的用途。其中R₁、R₂选自乙酰基、羟基、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、链烷酰基、链烯酰基、芳酰基，杂芳酰基或R₁和R₂被异亚丙基取代，R₃选自氢或卤素。文档编号A61K47/24GK101284003SQ20071001428公开日2008年10月15日申请日期2007年4月13日优先权日2007年4月13日发明者关玉昆,珂刘,滕厚雷,翟大伟,烽赵,萌邵申请人:烟台靶点药物研究有限公司