用于制备人造组织的聚合物骨架的制作方法

专利名称：用于制备人造组织的聚合物骨架的制作方法
用于制备人造组织的聚合物骨架
本发明涉及适于制备人造组织的聚合物骨架，尤其是多糖骨架，制备 它们的方法，它们在制备人造组织中的用途，以及基于所述聚合物骨架制 备的人造组织。
尽管某些低级脊推动物(如蝾螈)能够修复广泛的身体和器官损伤，但 是在大多数哺乳动物包括人类在内，再生能力较低。在人类以及其它哺乳 动物的大多数组织和器官中以各种方式(如由伤害、病原体或自身免疫反应) 引起的损害不能在消除伤害因素后通过形成新的功能组织而被修复，而仅 仅是通过填充特定的结締组织而修补(形成伤疤)，由此可能影响特定器官 的其它功能。甚至在那些显示出较好再生能力的组织(尤其是皮肤、结締组 织和它们的衍生物，如骨骼)中，原有功能的恢复对患者而言既耗时又不舒 服，尤其是在广泛损害情形下(如大面积烧伤)。治疗因此集中于维持或最 小损伤的治疗模式，关于此应当提及的是最小化的侵入式外科法(腹腔镜检 查)。然而，甚至用最优化的医学和外科治疗方法，也不可能完全排除因医 生的治疗或者因上述因素引起的大规模的组织损害。因此，需要寻找恢复 损伤的或经摘除的器官的功能的可能方式。
对此的传统方式是移植和机械弥补术，后者现在限于对基本上生化惰 性和和电生理学惰性的身体部分(如关节、眼睛的晶状体、心瓣膜)。对于 具有生化活性的组织和器官(如心脏、肺、肝脏、肾脏)仅有的可能恢复性 治疗目前而言是移植。尽管在许多情形下它导致完全的功能替代，但是已
知的不足是严重的；关于此应当提到的主要是捐献器官的短缺，需要终生 免疫抑制以避免排斥反应和病原体(尤其是病毒)传播的风险。因此，能够 恢复功能组织，可能恢复甚至整个器官的想法具有极大的治疗兴趣。
目前受到大量关注的方法是采用多能性的干细胞，为了再生目的，这 些干细胞能够分化以产生各种组织。起初的假定是干细胞自身插入到损 害处(如梗塞的心肌组织)，它们自行构造或再生功能组织，如它们在天然个体发生过程中所做的那样。然而已经清楚的是，它不如假定的有价值， 且大面积损害不能直接以此方式处理。尤其是，具有复杂结构(更不用说整 个器官)的组织的恢复明显不可能以此方式进行。
正如目前已知的那样，组织信号的存在对于组织或器官的生长是基本 要素。在天然个体发生过程中，这些信号通过复杂且仅部分了解的可传播
因子的网络和细胞-细胞相互作用(已知为Spemann，s诱发物)介导。关于此， 在完整(complete)生物体中通过细胞在预成型结构体中的排列(尤其是排列 到"细胞外基质"的基本框架中)在再生方法中起着基本作用。"细胞外基质，， 是指与细胞分开的但仍经常与之接触的所有结构体的总和。作为组织细胞 的附着点且由于其自身的固有性质(例如渗透性和机械稳定性)，细胞外基 质对于许多组织的稳定性和功能性而言是重要的，而且由于它对于特定细 胞类型的特异性，它对于保持组织的器官化(形态发生(Morphostase))和动 态平衡也是重要的。组织的器官化关于此是指细胞的正确空间排列，以及 动态平衡是指它们随时间(甚至在变化的应力的情形下)的保持性能。
从活的有机体(包括患者)中切除、扩张和刺激各种组织类型的活细胞 通常是本领域技术人员熟悉的。然而，
提供这样的合成的预成型结构体(基质)仍然涉及一个实质问题对于 该预成型结构体，细胞可自身插入到该结构体内和细胞可自身附着于该结 构体上，由此使得可形成能够行使机能且适于再植入的组织(理想的是整个 器官)。
通过活细胞克隆预成型的合成结构体原则上可在活体内发生，但后移 植方法也是可能的，如人造骨组织用天然骨熔接。
作为医学/药学研究(特别是在药物寻靶领域)的模型，人造组织或器官 的应用除了在可再生治疗中的用途以外还是对目前经常使用的动物器官的 有吸引力的替代，因为它不仅可直接与人类组织一起工作，而且具有更好 的标准化和再现性的可能性。
在活体内制备组织和器官经常是指组织工程(例如参见P. L. Pabst， "Tissue engineering: a historical review as seen through the US Patent Office", Expert Opin. Ther. Patents 13 (2003): 347-352; L. G. Griffith和G.Vaughton， "Tissue Engineering — Current Challenges and Expanding Opportunities", Science 295 (2002): 1009-1012; E. Pennisi， "Tending Tender Tendons", Science 295 (2002): 1011)。
制备人造组织的最初尝试采用软骨，后者是富含在细胞外基质中的几 乎没有代谢和生化活性并因此难以再生的组织。US 5,041,138和 US 5,736,372描述了人造组织片甚至在合成的预成型结构体降解之后的空 间形状的保持力，以及所述人造组织片甚至能够以正确程度生长的可能性， 这例如在儿科应用中是重要的。因此，在该情形下可以谈及完全恢复而不 仅仅是弥补。然而US 5,041,138和US 5，736，372仅仅涉及制备这样的软骨 结构体(如耳朵、鼻子、食道)，该软骨结构体尽管在宏观上具有复杂的形 状，但仅显示出轻微不同的微细结构和低代谢活性。
此，基本方面是该物质必须不能诱发任何炎症或排斥反应，这样就排除了 开篇所述的许多通用的蛋白样材料。此外，所述物质应当是可生物降解的， 理想的是，其生物降解速率对应于在特定器官中由源于生物的结构体代替 之后的速率。这应当使得合成基质可以被天然组织/结构体察觉不到地替 代，而保持没有机械稳定性降低的临界相时的形状。所述降解的进行优选 应当没有溶胀/分裂，而是通过腐蚀进行，以使得人造结构体的机械稳定性 保持得尽可能长。此外，在该降解中应当形成无毒性的单体或低聚物。
这对于预成型合成基质的三维结构以及构成它的材料提出了某些要求。
聚合物生物材料的综述由例如L.G. Griffith, "Polymeric Biomaterials"， Acta Mater. 48 (2000)，第263-277页给出。既可提到天然材 料，如胶原质和纤维蛋白，又可提到合成聚合物，如聚乙醇酸交酯和聚交 酯。对于成型，例如将聚乙醇酸交酯浸入聚交酯的CHCl3溶液中，并将经 润湿的材料在才莫具中成型。然而，这种制备三维骨架的方式既不是非常精 确的，也不能应用于制备如希望一般小或具有复杂形状的骨架。此外，该 方法局限于具有较低软化点或熔点的材料。
US 5,328,603描述一种制备在亚毫米范围内的纤维素珠粒的方法，其意图应用在色傳方法中。在该情形下，首先将纤维素通过离液序列高的盐 增溶，然后将该原子化的液体放置于不溶解纤维素的介质中。
WO 03/029329描述了通过在离子液体中增溶纤维素并随后将该溶液 挤出含水介质中而制备纤维素挤出物。它没有描述制备二维或三维纤维素 结构体。
最初应用于生物高分子的三维成型且全部基本上通过使该聚合物发泡 而起作用的随机方法导致不足的结果，这是因为出于物理原因，获得具 有被聚合材料彼此分开的许多不连续空腔的小泡结构，而不是获得希望的 基本上连续的、优选支化的通道结构。与此对比，基于铸模的方法出于实 际原因得到专门的通道结构，该结构仅以有限的程度为细胞提供附着和积 聚的可能性。此外，施用不熔融的材料(像大多数多糖)的施用是困难的。 天然的源于生物的聚合物的使用可导致形成海绵样结构，该结构中存在通 道和空腔形状但是该结构大多数具有有限的机械稳定性。在提到的三种情 形中的任一种中，不可能分化结构性构造或掺杂生长因子或信号因子。这 对于尤其细菌纤维素也适用(A. Svensson等人，Biomaterials 26 (2005)， 419-431),该纤维素尽管其它方面的性质令人满意，但其仅适于空间简单 且基本结构也简单的组织片，如人造关节软骨。
在精密工程领域，对成型方法的合适程度的控制允许CAD/CAM(计算 机辅助设计/计算机辅助制造)领域的工艺小型化，现在经常指桌面制造或 快速定型(prototyping)。 在这些工艺中，在计算机中制造待制造目标的三 维模型，然后通过计算机控制的自动化工具无需进一步的中间阶段进行制 造。在这些情形中，计算机通常执行将三维模型自动分解成大量适于执行 的有限元素的运算法则并然后成功地将它们完成。
构造方法就此而论是指那些方法，在该方法中，没有由初始粘着的材
料块中切开(cut out)空隙，而是所述材料在成型工艺过程中逐步地加载。
在该情形下，意图的空腔也可以仍旧是空的，即填充工作介质(空气或所述 材料不溶于其中的液体介质)，或该空腔填充有可在成型工艺完成后例如通
过溶剂或加热除去的占据空间的物质。对于构造方法，存在各种可能的变 形，包括化学和/或光化学反应。构造方法的实施原则上可分为印刷(不连续)和标绘(plotting)(连续)这 两类。在印刷中，将所述材料以网屏或光栅方式加载在上面，优选从喷嘴 阵列加载，而在标绘中将基本未间断的材料线挤出。标绘需要更大的工时 消耗，但加载技术和控制运算法则产生更加均匀和可预测的结果。标绘和 印刷以及它们在组织工程领域中的用途描述在现有技术中(如V. L.Tsang 和S. N. Bhatia，"三维组织制造"，Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004): 1635-1647; A. Pfister等人，"用于组织工程应用的生物学功能快速 定型；3D生物标绘对3D印刷"，Journal of Polymer Science [A部分聚合 物化学j，第42巻(2004)，第624-638页)；E. Sachlos和J. T. Czernuszka，" 组织工程骨架制造工作"，Europ. Cells and Materials 5 (2003): 29-40; D. W. Hutmacher，"用于工程组织的骨架设计与制造技术"，J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 12 (2001): 107-124)。然而，，所述文献中应用的聚合物仅仅是 具有较低的软化点或熔点并因而实际上可挤出的那些。
本发明的目的是提供一种方法，该方法使得可以精确地制造可以在形 成可再植入的或适于作为研究模型(例如作为组织工程领域中的骨架)的组 织中用作骨架的二维和/或尤其三维结构体。该方法尤其意图还允许使用这 样的骨架材料该骨架材料尽管从生物学/医学观点看是有利的，但由于它 们的物理化学性质如熔点、模塑性或溶解性，利用形成骨架的常规方法不 能容易地加工。
上述目的通过一种制备可生物降解且生物相容的聚合物的二维或三维 骨架的方法得以实现，该方法包括下述步骤
(i) 在离液序列高的液体中增溶可生物降解且生物相容的聚合物；和 (ii-a)将在第 一步中获得的溶液借助于针基本上连续地挤出到与所述离液 序列高的液体混溶但是所述聚合物基本上不溶于其中的液体介质 中，其中所述针和所得的骨架在挤出步骤过程中在二维或优选三维 上相对于彼此移动；或者 (ii-b)将在第 一 步中获得的溶液借助于针挤出到与所述离液序列高的液体 混溶但是所述聚合物基本上不溶于其中的液体介质中，以形成各个 直的、巻曲的或弯曲的聚合物线，其中所述针和所得的聚合物线在挤出步骤过程中相对于彼此移动，如果合适的话，从液体介质中分 离聚合物线并将该聚合物线连接以形成二维或三维骨架。 任意的可生物降解且生物相容的聚合物原则上都适于用作所述材料。
聚合物在本发明上下文中描述为"可生物降解的"，这是指它在有机 体内的主流条件下，在合适的时间内，如1年内，优选在几周或几个月的 过程中，可被化学或酶催降解成可溶解在体液中的单体或低聚物。
聚合物在本发明上下文中描述为"生物相容的"，这是指该聚合物或 其单体或低聚降解产物对有机体均不显示出有害作用，如有毒和/或促炎作 用，尤其是指所述降解产物可以以原样或者在有机体中经常规转变后被 排泄(裂解、偶合等)和/或在代谢中被利用，而不会发生毒性的、免疫的(如 促炎)、诱变、致癌、辅助致癌或形态发生(如产生畸形)的作用。
合适的聚合物的综述例如由Toshio Hayashi在"生物医学应用的可生 物降解聚合物"，Prog. Polym. Sci.，第19巻，第663-702页，(1994)中给出。
术语"骨架"在本发明上下文中是指包括至少两个直的、巻曲的和/或 弯曲的棒或线并且其中至少一根线或棒经常重叠或接触的空间结构体。"重 叠"关于此是指各线之间的角度不等于0，而接触还包括0角度(例如当 各线彼此平行时)。在骨架内还可以包括非棒状元件，如平的、螺旋形的或 圆形元件。
"棒"或"线"是指这样的结构体，该结构体在延展状态时("直的棒/线") 基本上是线性的，即，沿一维延展的空间。"线"是可通过挤出获得的棒。 弯曲或巻曲的棒/线作为整个结构考虑具有二维的范围。
在本发明上下文中，如果结构体在特定维数上的范围大于1、优选大 于2个线或棒直径，则该结构体要填补该特定维数。因而，根据US 5,328,603 的"珠粒"是零维，而延伸的单线是一维的。"三维骨架"是具有三个维数的 骨架。"二维骨架"具有两个维数的范围。尽管各个巻曲线或弯曲线根据上 述定义也是二维的，但是在本发明上下文中，二维骨架意图指包括至少两 个在至少一个点上重叠或接触的棒/线且它们的接合程度仅限于二维的那 些。除了本发明的骨架以外，多维骨架还包括没有线重叠的形状，例如线 圏或巻材。尽管这些与本发明上下文中使用的术语"骨架"不相对应，但它们可构成本发明骨架的一部分。
术语"增溶，，在本发明上下文中是指在无实质加热的情况下可将骨架材 料(聚合物)转化成可流动态、可倾倒态或可挤出态的转化。这能够使聚合 物转化成溶剂化状态，然而在其中各个聚合物分子不需要通过溶剂化护套 完全包封。有必要通过增溶将聚合物转化成液态或转化成至少软化态。术
语"无实质加热"是指对于增溶采用的温度不超过200°C,优选不超过 150°C,特别优选不超过120。C，尤其不超过100。C。
如果物质能够通过扰乱或影响分子间相互作用而同时又不影响分子内 的共价键而破坏大分子的超分子締合，则该物质指的是"离液序列高的"。
术语"挤出，，在本发明上下文中不限于特定的制造技术，而非常一般 性地是指使可流动材料基本上连续地强制通过较窄的孔(即，最广义的概念 为喷嘴)如通过针。"基本上连续地"关于此是指，挤出操作也可以反复地中 断，例如以为了制备各个聚合物线(例如如步骤(ii-b)),或在步骤(ii-a)中变 换不同的空间平面。然而，它不发生周期性的中断以使得仅制得零维结构 体，例如珠粒。
"基本上连续的"聚合物棒是在延伸状态时是一维的聚合物结构体，即， 不是通过将零维结构体连接在一起和/或以特定排列熔合零维结构体而制 备的结构体。关于此优选的是，所述棒具有基本上均匀的厚度，尤其是它 没有显示出更厚和更薄片段的有节奏的交替，以及分子结构在维度方向上 基本上是均匀的，尤其是分子结构在维度方向上没有显示出有节奏的交替。 进一步优选的是，棒中的聚合物链基本上彼此平行排列并且在棒的纵向上 平行排列，尤其是聚合物链在纵向维度上平行重叠以致于产生分子间的接 触面积。关于此特别优选的是，所述重叠的程度在棒的整个长度上是基本 上均匀的。在该方法的优选实施方案中，聚合物链的重叠导致形成部分结 晶的区域。在另一个实施方案中，通过共价交联在重叠区域可以进行随后 的稳定化。表述"基本上"是指例如通过挤出步骤引起的常见偏差是可容忍 的。
术语"针"是指在第一步中制备的溶液可连续强制通过的任意类型的喷嘴。"针和骨架或针和聚合物线相对于彼此移动"是指在挤出步骤(ii)期 间，针与骨架或与聚合物线或与包含聚合物挤出到其中的液体介质的容器 移动的每一对中，针可以单独移动或者每对中的两者均可移动。从步骤(ii-a) 的整体考虑，该移动在两个空间方向上发生(二维移动)或优选在所有的三 个空间方向上发生(三维移动)，或从步骤(ii-b)的整体考虑，该移动在一个 或两个空间方向上进行。在一个空间方向上的移动产生直的聚合物线，而 二维相对移动产生巻曲或弯曲的线。在步骤(ii-b)中还可以存在针和聚合物 线的三维相对移动，以例如形成螺旋或圆形元素，这些元素也可以是骨架 的 一部分但优选以较d 、程度掺入。
"三维移动"或"在三个空间方向上移动，，是指针孔的位置在所有三个 空间维度上相对于已经形成的骨架被改变。在步骤(ii-a)的特别实施方案中， 挤出机构可在所有三个空间维度上位移。在步骤(ii-a)的可供选择的实施方 案中，挤出机构可在至少两个空间维度上位移，而已经形成的骨架可在至 少一个空间维度上移动，以使得挤出机构中缺少的空间维数(自由度)可通 过位移已经形成的骨架来弥补。在步骤(ii-a)的进一步可供选择的实施方案 中，挤出机构可在至少一个维度上位移，而已经形成的骨架在至少二个维 度上位移，以使得挤出机构中缺少的自由度可通过已经形成的骨架的移动 性来弥补。在步骤(ii-a)的进一步可供选择的实施方案中，挤出机构基本上 不动，而已形成的骨架可在所有三个空间维度上位移。
类似的说明对于步骤(ii-a)或(ii-b)中的"一维或二维移动"是适用的，即 挤出机构或所得的聚合物线(或更准确地是后者挤出到其中的容器)是可移 动的。在二维相对移动的情形下，还可能的是挤出机构在一个空间维度 上移动，而聚合物线在不同于它的空间方向上移动。
"基本上不溶"是指聚合物在液体介质中的溶解度小于5g/L，优选小 于0.5g/L，特别优选小于0.05g/L。
"液体介质"是指其物理化学性质主要由液体溶剂的物理化学性质决定 的介质。作为在可溶性或可溶胀的大分子存在下的结果，液体介质也可以 具有凝胶样稠度。
"烷基"代表直链或支链的烷基。烷基优选d-C6烷基。d-C6烷基代表直链或支链的具有1 6个碳原子的烷基。其实例是甲基、乙基、丙基、异 丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基及这些的构造 异构体。d-C4烷基代表直链或支链的具有1~4个碳原子的烷基。其实例 是甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基。
d-C6烷氧基代表经由氧原子连接的d-C6烷基。其实例是曱氧基、乙
氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、
戊氧基、己氧基及这些的构造异构体。d-C4烷氧基代表经由氧原子连接 的d-C4烷基。其实例是曱氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、
仲丁氧基、异丁氧基和叔丁氧基。
d-C6烷氧基-C,-C6烷基代表其中的 一个或多个氢原子被crc6烷氧基
替代的d-C6烷基。其实例是甲氧基曱基、乙氧基曱基、丙氧基曱基、1-和2-甲氧基乙基、l-和2-乙氧基乙基、l-和2-丙氧基乙基等。d-C4烷氧基
-C广C4烷基代表其中的一个或多个氢原子被C广C4烷氧基替代的C广C4烷
基。其实例是上述基团。
芳基代表优选具有6~14个碳原子的碳芳基。其实例是任选取代的苯 基、任选取代的萘基、任选取代的蒽基和任选取代的菲基。合适的取代基 实例是卤素、CVC6烷基、N02、 OH和CN。芳基优选苯基或取代的苯基， 如曱苯基、二甲苯基、硝基苯基或氯苯基。
芳基-CrC6烷基代表经由CrC6烷基、优选d-C2烷基连接的芳基， 如千基或2-苯基乙基。
芳氧基代表经由氧连接的芳基，如苯氧基。
芳基-d-C6烷氧基代表其中的一个氢原子被芳基替代的d-C6烷氧基、
优选d-C2烷氧基，如节氧基。
芳氧基-CVC6烷基代表其中的一个氢原子被芳氧基替代的d-C6烷基、
优选d-C2烷基。
闺素代表氟、氯、溴或不典，尤其是氟或氯。
CVC6单羧酸的酸阴离子是脂肪族d-C6单羧酸的酸阴离子。其实例是 乙酸根、丙酸根、丁酸根、异丁酸根、戊酸根、己酸根等。
C2-C6 二羧酸的一价阴离子和二价阴离子是脂肪族C2-C6 二羧酸的单价阴离子或二价阴离子，如如下酸的一价阴离子或二价阴离子草酸、丙 二酸、琥珀酸、己二酸等。
下文关于本发明主题的优选实施方案所作的说明适用于它们自身以及 相互的组合。
在本发明方法的优选实施方案中，聚合物骨架材料是有机聚合物。有 机聚合物关于此是指其单体基本上是有机分子的聚合物，所述有机分子例 如是醇类，尤其是二醇和多元醇；羧酸，尤其是羟基二羧酸和氨基酸；胺，
尤其是二胺和多胺；氨基酸；糖类，尤其是葡萄糖和果糖单元。"基本上是
有机分子"是指这些分子还可包含无机组分，如金属阳离子或卣素离子，但 分子的整个性质是有机的。
在特别优选的实施方案中，聚合物是生物大分子。生物大分子关于此 是指其单体是天然存在的(如糖类和氨基酸)的聚合物，尤其是其整个结构
都天然存在的聚合物。生物大分子的实例是蛋白，如丝蛋白；以及多糖， 如纤维素、纤维素衍生物、甲壳质、壳聚糖、葡聚糖、透明质酸、硫酸软 骨素、木聚糖和淀粉。
聚合物更优选选自多糖和改性多糖，尤其是选自多糖。这些不仅满足 在组织工程领域中对于合适材料的化学和机械的要求；与许多蛋白相比， 它们额外地是免疫学上可接受的。合适多糖的实例是纤维素、纤维素衍生 物、甲壳质、壳聚糖、葡聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、木聚糖和淀粉。
在甚至更优选的实施方案中，将纤维素或纤维素衍生物应用于本发明 方法中。合适的纤维素衍生物的实例是甲基纤维素、乙基纤维素、丙基纤 维素、羟乙基纤维素和羟丙基纤维素。尤其使用纤维素。任何已知形式的 纤维素可用作纤维素，如纸浆、棉花、由纸张获得的纤维素或细菌纤维素。
聚合物可在增溶前如通过研磨和/或切碎适当地进行机械尺寸降低。
聚合物可以单独或与其它组分一起用于步骤(i)中。优选的其它组分是 有利地影响骨架构造和/或影响骨架的随后使用的那些。合适组分的实例是 无机颗粒，如羟基磷灰石颗粒和非骨架性的生物大分子，即不同于骨架聚 合物的生物大分子，如蛋白、蛋白片段、肽或某些碳水化合物。在优选的 实施方案中，非骨架性的生物大分子用作有利于细胞的粘附和/或有利于器官化的超细胞结构的形成的额外组分。合适的非骨架性的生物大分子的实 例是基质蛋白，如纤连蛋白、玻连蛋白、胶原质、层粘连蛋白、外源凝聚
素、组织提取物、生长因子，如VEGF或融合蛋白，或所述蛋白的其它衍 生物。其它合适的生物大分子是包含氨基酸图形R-G-D的蛋白或肽，还 有利于粘附的碳水化合物，如sialyl-LewisX或其片段，或以其它方式具有 生物活性的碳水化合物，如肝磷脂或其片段。相应的分子在每种情形下可 与聚合物分子共价或非共价连接。
当应用于步骤(i)的聚合物包含一种或多种所述生物大分子时，后者的 存在量基于骨架聚合物的总重量优选为0.1 5%重量，尤其是1~2%重量。
当骨架聚合物包含无机颗粒如羟基磷灰石时，这些无机颗粒的存在量 基于骨架聚合物的总重量优选为1 20%重量，尤其为5 10%重量。
在本发明的优选实施方案中，离液序列高的液体基本上是无水的。"基 本上无水"是指离液序列高的液体基于该离液序列高的液体的总重量，包含 小于5%重量的水，优选小于2%重量的水，特别优选小于1%重量的水。
在本发明的优选实施方案中，离液序列高的液体基本上不含含氮碱。 "基本上不含含氮碱"是指，离液序列高的液体基于该离液序列高的液体的 总重量，包含小于5%重量、优选小于2%重量、特别优选小于1%重量的 含氮碱。含氮碱例如是氨、胺以及具有至少一个碱性氮原子作为环成员的 芳族或非芳族杂环。
离液序列高的液体优选是在不超过150°C，如在-100。C +150。C或在 0 +150。C或50~+150。C的温度范围，特别优选不超过120。C ， 如-50。O+120。C或0~+120°C或50~+120。C的温度范围，尤其不超过 100。C，如-10。O+100。C或0~+100。C或50~+100°C的温度范围的温度下 是液体。这是指，该离液序列高的液体的熔点优选不超过150°C，特别优 选不超过120。C,尤其不超过100。C。
增溶步骤也可借助于超声进行。
在本发明的特别实施方案中，加热通过微波辐照进行。 增溶优选在不超过200°C，如0 200°C或优选20。~200°C或特别优选 50 200。C或尤其100 200。C，特别优选不超过150°C，如0°O+150°C或优选20~150°C或特别优选50~150°C或尤其100~150°C，更优选不超过 120。C，如0。C 120。C或优选20 120°C或特别优选50~120°C或更优选 80 120。C或尤其100 120。C,以及尤其不超过100。C,如0。C~+100。C或 优选20 100°C或特别优选50~100°C或尤其80~100°C的温度下进行。
在本发明的优选实施方案中，离液序列高的液体选自液体盐。液体盐 也称作离子液体。离子液体通常是指在其中离子仅微弱配位以使得这些盐 在较低温度下(如低于150。C或低于100。C或甚至在室温)是液体的盐。在 该情形下，至少一种离子的电荷是离域的，且至少一种离子的性质是有机 的，由此防止了稳定晶格的形成。
液体盐优选具有式Het+Ax-1/X。
关于此，Het+是带正电荷的N-烷基化、N-芳基化、N-芳基烷基化、N-烷氧基化、N-芳氧基化、N-芳基烷氧基化、N-烷氧基烷基化和/或N-芳氧 基烷基化的含氮杂环。换言之，Het+是这样的带正电荷的含氮杂环，其中 通常环氮原子经由其游离电子对带有键合的烷基、芳基、芳基烷基、烷氧 基、芳氧基、芳基烷氧基、烷氧基烷基和/或芳氧基烷基，以使得在杂环上 产生正电荷，即，杂环的正电荷归功于环氮原子的游离电子对上的取代。
在所述基团中的烷基优选为d-C6烷基。所述基团中的烷氧基优选为 d-C6烷氧基。所述基团中的芳基优选为苯基。所述基团中的芳基烷基优 选为芳基-CVC6烷基，如节基或苯乙基。所述基团中的芳氧基优选为经由 氧连接的苯基，如苯氧基。所述基团中的芳基烷氧基优选为芳基-d-C6烷 氧基，如苄氧基。所述基团中的烷氧基烷基优选为CrC6烷氧基-d-C6烷 基。所述基团中的芳氧基烷基优选为芳氧基-d-C6烷基，尤其是苯氧基
-C广C6坑基》
取决于Het+是否是其中环氮原子不是双键的一部分的芳族杂环或脂环 族杂环，形式上产生正电荷的氮原子被上述基团取代一次或两次。 A、,x是阴离子，其中x为l、 2或3。 Het+优选选自
-带正电荷的5-或6-元芳族杂环，其包含作为环成员的基团NRa并任选包 含一个或两个选自N、 O、 S、 NRb、 SO和S02的杂原子或含杂原子基团，
-带正电荷的5-或6-元芳族杂环，其包含作为环成员的基团NRa并任选包
含一个或两个选自N、 O、 S、 NRb、 SO和S02的杂原子或含杂原子基
团，并且该芳族杂环与苯环稠合，和 -带正电荷的5-或6-元饱和脂环族杂环，其包含作为环成员的基团NRaRa'
并且任选包含一个或两个选自O、 S、 NRb、 SO和S02的杂原子或含杂
原子基团， 其中
Ra和Ra'各自独立地为CrC6烷基、芳基、d-C6烷氧基、芳氧基、CrC6 烷氧基-CVC6烷基或芳氧基-d-C6烷基，优选d-C6烷基或d-C6烷 氧基-d-C6烷基；和 -
Rb为氢、d-C6烷基、芳基、d-C6烷氧基、芳氧基、C广C6烷氧基-C广C6 烷基或芳氧基-CrC6烷基,优选d-C6烷基或d-C6烷氧基-d-C6烷基;
其中所述的脂环族或芳族杂环或者后者可与之稠合的苯环可具有1 5个 选自CrC6烷基、CrC6烷氧基和CrC6烷氧基-d-C6烷基的取代基。 Het+特别优选选自式Hetl HeU5的化合物
<formula>formula see original document page 18</formula><formula>formula see original document page 19</formula>
其中
R1和R2各自独立地为d-C6烷基或CrC6烷氧基-C，-C6烷基；和
R3 R9各自独立地为氢、C广C6烷基、C广C6烷氧基-C广C6烷基或d-C6
烷氧基，特别优选氢。
优选W和W均为d-C4烷基或d-C4烷氧基-d-C4烷基，其中这些
基团之一特别优选是甲基。特别优选W和I^均为d-C4烷基。尤其RJ或 W之一为曱基，而另一个为C广Q烷基，如乙基。 R3 R9优选为H。
Het+优选为单环。因此，Het+优选选自式Het.l HeU3的化合物。Het+ 特别优选5-元单环。因此，Het+特别优选选自式Het.5 HeUl和Hetl3的
化合物。
Het+更优选为式Het.5的咪唑铕离子、式Het6的吡唑错离子、式Het.7的噁唑镥离子、式Het.8或Het.9的1，2，3-三唑镥离子、式Het.10的1，2，4-三唑错离子或式Het.ll的噻唑错离子，其中R匕RS如上定义。此处也相应 地适用上文关于优选的基团R^RS的说明，即，W和I^优选均为Q-C4 烷基或d-C4烷氧基-d-C4烷基，特别优选d-C4烷基，其中特别优选这
些基团之一为曱基。尤其是，基团W或ie之一为甲基，而另一个为CrC4
烷基，如乙基。F^ R5优选为H。
Het+更优选为式Het.5的咪唑錄离子，其中1^ R5如上定义。此处也 相应地适用上文关于优选的基团R1 115的说明，即，R1和W优选均为Q-C4 烷基或d-C4烷氧基-d-C4烷基，特别优选d-C4烷基，其中特别优选这 些基团之一为曱基。RS RS优选为H。因此，Het+尤其是式Het5的咪唑镛 离子，其在一个环氮原子上带有曱基，而在另一个环氮原子上带有CrC4 烷基或d-C4烷氧基-d-C4烷基。在该情形下，R3、 R"和RS特别是H。尤 其是，基团R'或R"之一为甲基，而另一个为C广C4烷基，如乙基。
AX-仏优选选自配位阴离子，即原则上能够配位的那些，例如与金属中 心配位的那些。
AX-仏优选选自卤离子、拟卤离子、高氯酸根、d-C6单羧酸的酸阴离 子以及C2-C6二羧酸的一价阴离子和二价阴离子，其中单羧酸和二羧酸可
以被卣素和/或鞋基取代一次、两次或三次。优选的酸阴离子是乙酸根。
AX-仏特别优选选自卤离子、拟卤离子和乙酸根。
拟卤离子的实例是氰离子(CN-)、氰酸根离子(OCN—)、异氰酸根离子 (CNCT)、硫代氰酸根离子(SCN-)、硫代异氰酸根离子(NCS-)和叠氮离子 (N3_)。
A x尤其是氯离子、溴离子、氰酸根离子、硫代氰酸根离子或乙酸根。 Ax—1/X特别为氯离子或乙酸#>。
特别是，Het+Ax-1/X是氯化咪唑错盐Het.5-Cr或乙酸咪唑鏘盐 Het.5-(CH3COO-)，其中咪唑錄离子优选如上被取代。
在可供选择的优选实施方案中，离液序列高的液体选自离液序列高的 盐在极性非质子溶剂中的溶液。
无机盐优选选自碱金属面化物、碱土金属卣化物、卣化铵、碱金属拟卣化物、碱土金属拟氯化物、拟卣化铵、碱金属高氯酸盐、碱土金属高氯 酸盐、高氯酸铵以及前述盐的混合物。
无机盐特别优选选自氯化锂、硫代氰酸钓、多典化钠、高氯酸钠以及前 述盐的混合物。
优选的极性非质子溶剂是二曱基曱酰胺、二曱基乙酰胺、二曱亚砜和 二乙胺以及前述化合物的混合物。
离液序列高的液体特别优选选自如上所述的离子液体。关于此参考上 文关于离子液体的优选实施方案所作的说明。
本发明方法的步骤(i)进行的方式通常应使得将如果合适的话，先前 进行过碾磨的聚合物，与离液序列高的液体机械混合并搅拌直至完全溶解。 在本发明的特别实施方案中，在所述混合的过程中或之后加热混合物，以 加快溶解和均化步骤，例如如通过微波辐照加热，但优选加热到温度不超 过150。C，更优选不超过120。C，尤其不超过100。C。
在优选实施方案中。增溶的聚合物在离液序列高的液体中的浓度为 5~35%重量，优选5 25%重量，尤其是10~25%重量。
当将增溶的聚合物《I入到液体介质中时(步骤(ii))，它在非常短的时间 内如小于l秒内沉淀。该引入通过挤出进行，即，将增溶物挤出通过针。 在将离液序列高的溶液引入到离液序列高的组分可溶于其中但是聚合物材 料基本上不溶于其中的液体介质中时，聚合物沉淀。
将聚合物桥出到液体介质中通过可移动的针来进行，所述针优选是自 动化装置的组件。使针或使液体介质存在于其中的容器或者使这两者在此 期间移动，其移动方式应使得在变型(ii-a)中的挤出物呈现三维骨架、网 络或网格的形状，而在变型(ii-b)中的挤出物呈现直的、巻曲的或弯曲的聚 合物线的形状。
应用于步骤(ii)的液体介质一方面与步骤(i)的离液序列高的液体混溶， 而另一方面，所用的聚合物基本上不溶于其中。优选的液体介质是质子溶 剂，如水和链烷醇；环醚，如四氬呋喃和二^恶烷；酮，如丙酮和甲乙酮； 腈类，如乙腈；以及前述溶剂的混合物。优选的液体介质是质子溶剂，如 水和链烷醇，及它们的混合物。合适的链烷醇是d-C4链烷醇，例如曱醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和+又丁醇。液体介质优选含水，即
它包含至少10%重量的水。液体介质特别优选包含至少50%重量的水，尤 其是至少80%重量的水。含水介质的其它组分优选选自Q-C3链烷醇，如 曱醇、乙醇、正丙醇和异丙醇。尤其是使用水。
在本发明的优选实施方案中，在骨架、网格或网络的各元素之间的接 触点或重叠点通过聚电解质来稳定。
称作"聚电解质"的聚合物是其重复单元具有能够接收或释放质子的基 团，因而能够在质子介质、尤其是含水介质中接收电荷并再将它们释放的 那些，它们在分子内可以带正电荷和/或带负电荷。在含水介质中带负电荷 的基团的实例是羧基，在含水介质中带正电荷的基团的实例是氨基。原则 上所有常用的聚电解质均是合适的。合适的聚电解质的实例是用作添加剂 以增加在造纸中纸张的湿强度的化合物，如聚羧酸，如聚丙烯酸；聚胺， 如聚乙烯胺；聚亚胺，在酰胺结构部分中不饱和的羧酰胺与不饱和羧酸的 共聚物，如N-乙烯基甲酰胺/丙烯酸共聚物；可聚合的碱性杂环，如N-乙 烯基吡咯烷酮；聚胺与表氯醇的反应产物；环氧化聚酰胺，脲树脂、蜜胺 树脂、聚氨酯等。所述的湿强度剂例如描述在EP 01 118 439中，该文献引 入本文作为参考。
然而，优选的聚电解质是聚羧酸，例如聚丙烯酸，单一的脂族聚胺， 例如聚乙烯胺，和可聚合的碱性杂环，即具有环外烯属双键的杂环，例如 聚乙烯吡咯烷酮。
在本发明的优选实施方案中，聚电解质是增溶的聚合物挤出到其中的 液体介质的组分。关于此优选的是，液体介质包含基于该液体介质的总重 量，至多20%重量的聚电解质，尤其是5~10%重量的聚电解质。
然而，在骨架、网格或网络的不同元素之间的接触点或重叠点也可以 按照下文关于工艺变型(ii-b)所述进行稳定。
在本发明的优选实施方案中，骨架的各个部分或者所有部分提供有作 用于活细胞的信号因子或生长因子。相应的因子(如VEGF或NGF)是本领 域技术人员熟悉的。取决于它们的各物理或化学性质，这些因子优选加入 到如上所迷的步骤(i)中的待挤出材料中("掺杂")，或者在步骤(ii)的挤出工艺过程中涂覆到所得线的表面上或然后使用合适的针涂覆到所得线的表面 上。
所得的聚合物骨架关于所述因子的分布可以是均匀的，但优选导致形 成信号因子梯度并因而给出形成新组织(如血管和神经纤维的向内生长)方 向的非均匀分布。特别优选的是，信号因子的不均匀性与骨架、网格或网 络的结构不均匀性以合适的方式通过让大的高度掺杂的凹穴自由(如对于 血管或神经)或者产生用于形成更复杂器官结构的先决条件进行组合。
在步骤(ii-a)的优选实施方案中，挤出的进行方式应使得骨架基本上 以分层方式构造使得形成具有层结构的骨架，即，大多数的棒或线位于彼 此平行的平面中，其中各相邻层之间的稳定化接触主要通过线的重叠产生， 而不位于平面中的棒或线的贡献对于层间的相互作用是不重要的，并因此 对于骨架的三维稳定性也是不重要的。"基本上以分层方式构造"是指，骨 架也可包含不属于这些层的线排列，但所述骨架主要(例如，基于全部构造 成骨架的聚合物线的长度，有至少60%、优选至少80%、尤其至少90%) 由聚合物线以分层方式排列。
每一层优选主要由彼此平行走向的挤出物线、尤其是往复 (bustrophedon)线(即，挤出物线在一个方向上和其相反方向上从相邻线到 相邻线交替地走向)组成。不平行走向的元素的比例在该情形下不重要。如 果要将网格状的可透过结构体提供在平面的相关区域中，则每一层的线的 稳定化主要通过与相邻层或相邻各层的线的接触来实现。然而，平面或部 分平面也可以通过在相关区域中彼此放置得如此近以致于接触的平行走向 的线而具有不可渗透的构造。
关于此，对于骨架的机械稳定，优选的是，相邻平面的线彼此既不平 行也不反平行。特别优选的是，相邻层之间的线的角度为90°、 60。或45°。
在步骤(ii-a)的另一个优选实施方案中，挤出的进行方式应使得各层 基本上由呈二维空间填充曲线的形式(FASS曲线；FASS-空间填充，自避 免，简单和自相似)的挤出物线构造。"基本上"是指，基于构造成各层的聚 合物线的总长度，至少60%、优选至少80%、尤其至少卯％的层由呈二 维空间填充的曲线形式的聚合物线构成。FASS曲线是这样的路线，该路线在由许多均匀区块组成的区域上引出，或者该路线穿过由许多"室"组成 的三维或多维空间，以至于每个区块或每个室接触，而该路线自身不交叉。 这导致形成的结构体相比于当平面由平行线构成时在平面的两个维度上更
均匀。优选的特定类型的FASS曲线是Peano曲线、Hilbert曲线和 Sierpi6ski曲线。
在该实施方案中，对于制备，优选将每个平面划分成许多区域，每个 区域基本上独立于同一平面的其它区域填满。关于此优选的是，将相邻平 面划分到不同的区域组中。每个平面特别优选划分产生最大比例的四方区 域，这些四方区域在每种情形下由FASS曲线填满。关于此特别优选的是， 待划分的各区域能够使挤出尽可能地连续。
关于此同样特别优选的是，平面的划分方式应使得它基本上(例如至 少50%、优选至少75%、尤其至少90%)由FASS曲线组成。
FASS曲线可通过对给定区块的回归算法产生。相应的方法是本领域 技术人员熟悉的且例如描述于下列文献中V. Batagelj: Z^g( to尸MWc77;pr. 为Eurologo'97准备的文章，Ljublj ana 1997; A.J. Cole: j w她s/ ace cwrves. Software - Practice and Experience, 13(1983)， 1181-1189; A.J. Cole: J wote 户eafi0 i^(^ms aw</ Ofly CWes. International Journal of Computer Mathematics, 18(1985)， 3-13; C. Davis, D. E. Knuth: 7Vw附^
/ e/7fesew似,/o附 awf/ Z)mg0/1 Cw/W51， Journal of Recreational
Mathematics, 3(1970)， 66-81; 3(1970)， 133-149; F.M. Dekking， M. Mendes
France, A. van der Poorten: Fo/fife !. The Mathematical Intelligencer, 4(1982)， 130-138; 4(1982)， 173-181; 4(1982)， 190-195; F.M. Dekking: / ec鮮e"f 5Ws. Advances in Mathematics, 44(1982)， 78-104; A.J. Fisher:」 ew fl/goW幼附Z/i76eW c""ves. Software - Practice and Experience, 16(1986)， 5曙12; W.J. Gilbert: Fni""/ Geo附"/j Z)enVed /h 附 CV 附/7fex: 5"亂The Mathematical Intelligencer, 4(1982)， 78-86; J. Giles, Jr.: Cbws,尸w"/ow /^//ctfriwg 5"M/ e/^Mres1. Journal of Combinatorial Theory, Series A， 26(1979)， 328-334; L.M. Goldschlager: fl/gw幼附s 5/7flce-/Z〃/"g c"fves. Software - Practice and Experience, 11(1981)， 99;A. Null: iS/mce-/ //— cwves， o/* /row to謹他,/歸w/幼a / /o股r. Software -Practice and Experience, 1(1971)， 403-410 ; P. Prusinkiewicz， A. Lindenmayer: 77re a/gw'狄附/c 6ea鄉Springer, New York, 1990; N. Wirth.. J/goW幼附s + Z) f" 5^"wms =Prentice國Hall， 1976; I.H. Witten und B. Wyvill: 幼e gewemftV /1 awd附e o/5/7""-/ //,>1《c"rves. Software - Practice and Experience, 13(1983), 519-525，这些文献引入本文 作为参考。
在另一个优选的实施方案中，聚合物骨架包含螺旋形的、螺旋的或圆 形的元素，这些元素可以为圆的或有角的、连续的或分步的单螺旋或多螺 旋。在优选的实施方案中，就线厚度和/或来自呈网格形式的元素的掺杂而 言，螺旋形的、螺旋的或圆形的元素线可不同。
在另一个优选的实施方案中，聚合物骨架的结构基本上是三维均匀的， 即，线或棒在所有空间维度上作出数量上和质量上相当的贡献。
在步骤(ii-a)的特别优选的实施方案中，聚合物骨架基本上由呈三维 FASS曲线、尤其是呈三维Peano曲线形式的挤出物线组成。"基本上" 是指，基于全部构造成骨架的聚合物线的总长度，至少60%、优选至少 80%、尤其至少卯％的骨架由呈三维FASS曲线形式的聚合物线构造。
在另一个优选的实施方案中，聚合物骨架的总体积的至少25%被连续 通道占据。"连续通道"是其长度至少是整个聚合物骨架的与之平行的那一 维的长度的一半且与骨架外表面相通的空穴。
聚合物骨架通过将其从用于步骤(ii)的容器中取出而分离，或者首先通 过移除挤出已经进行到其中的液体介质进行分离。尤其当使用水或含水混 合物作为步骤(ii)的液体介质时，适合的可供选择的分离方法是冷冻所述 介质，并由冷冻的介质中通过合适的方法(即，通过机械移除冷冻的介质或 通过升华移除冷冻的介质)分离骨架。然后，可对所述骨架除去液体介质的 残余物，例如通过在空气中、烘箱中或真空干燥箱中干燥，或者通过冻干。
在变型(ii-b)中，挤出步骤(i)中获得的增溶物的方式应使得产生各个 直的、巻曲的或弯曲的聚合物线。希望的形状通过针与容器的相对移动和/ 或通过在挤出后将线成型(如通过拉伸、巻曲和/或弯曲)来产生。为此目的可以使用所有常用的机械辅助手段，如夹子、镊子、棒等，或者要不然是 具有希望形状并浸在液体介质中且随后再取出的模具。
在加工形成所述骨架之前，将聚合物线优选从液体介质中分离出来， 如果合适的话，(后)成型和/或干燥。分离和干燥可如前所述进行。所述(后) 成形可在干燥之后，优选干燥之前进行。(后)成形可包括例如将聚合物线 拉伸、巻曲和/或弯曲，如借助于前述辅助手段。
然后，可将聚合物线(纤维)连接，得到希望的骨架结构体。关于此， 可以将仅仅相同类型的聚合物纤维连接在一起，也可以将不同的聚合物纤 维连接在一起。当使用不同的聚合物纤维时，它们的不同之处可在于它们 的直径、它们的性质和/或它们的制备方法。因而，可以使用不同的聚合物
制备，和/或在于它们由不同的可生物降解且生物相容的聚合物开始制备， 和/或在于它们通过不同的方法制备，但是其中至少一种类型的聚合物线必 须是通过本发明方法制备的。不同于本发明方法的且可采用的方法是本领 域技术人员熟悉的且适于用于制备聚合物纤维的特定类型聚合物的所有方 法，如纺纱方法、电纺纱方法等。
连接可借助于将这些类型的聚合物接合/键合的已知技术，如借助于可 生物降解且生物相容的常用于此目的的粘合剂进行。然而，该连接优选通 过施用步骤(i)获得的少量增溶物进行，或者将少量的由在离液序列高的液 体中的生物相容且可生物降解的聚合物组成的另一种增溶物施用到希望的 连接点，随后加入聚合物不溶于其中的液体介质。当所述聚合物沉淀时， 它同时将各聚合物线接合在一起。
原则上，也可以在液体介质中将聚合物线连接在一起，例如通过将少
量步骤(i)中获得的增溶物施用到希望的连接点。然后，可将在液体介质中 制备的骨架如上所述进行分离且如果希望的话，进行干燥。然而优选第一 种工序，即，首先分离出聚合物线，并且仅随后进行连接得到骨架，因为 它更容易进行。
尤其是当使用仅仅少量的液体介质时，经常在步骤(ii)中形成可以较容 易分离的凝胶状产物。转化成固态通过干燥来进行。也可能有利的是，为
26了增加它们的储存性，让骨架在它们被应用前以凝胶状形式形成，且在紧 临使用前将它们干燥。
如果所述骨架还没有(完全)干燥，则如果希望的话，它们可以(后)成型， 这可以如前所述进行。
变型(ii-a)对于步骤(ii)是优选的，尤其是对于制备具有复杂形状的骨架 而言是优选的。该变型尤其允许可简单且可再现地获得三维骨架，而后者 的制备在其它方面将不会是瑣碎的。然而，根据变型(ii-b)的工序也适于制 备简单的、尤其是二维的骨架，例如足以构造例如平面组织(如皮肤)的网。
然后，可将所得骨架按照上文和下文所述进行处理，例如通过使用作 用于活细胞的信号和/或生长因子进行涂覆或掺杂，或通过用活细胞进行克 隆。
通过本发明方法，可以容易地由通常难以加工的可生物降解的且生物 相容的聚合物(如纤维素或纤维素衍生物)制备二维和三维骨架。这些骨 架——它们也可以呈现非常复杂的形状——可在构造人造组织中用作成型 结构体。
本发明还涉及可通过本发明方法获得的聚合物骨架。关于聚合物骨架 的优选实施方案，也可以参考上述说明。
在优选的实施方案中，在已完成的主要骨架的空隙处，通过浇注可熔 融或胶凝且其在体内的降解性不同于第一聚合物的另 一种聚合物并然后降 解第一聚合物而形成"阴骨架"。
在本发明聚合物骨架的优选实施方案中，将活细胞限制于其中。这些 优选是真核细胞，尤其是哺乳动物细胞，如人细胞。作为选择，活细胞优 选是原核细胞，尤其是以社会方式组织的细菌(socially organized bacteria) 的细胞，如形成生物膜或在菌丝体中生长的细菌。
在聚合物骨架通过活细胞克隆之前，它可以合适的方法进行制备。因 而，用于通过活细胞克隆的已完成的聚合物骨架的制备可例如通过用含水 介质如水，生理盐水("林格溶液")或磷酸盐緩沖的生理盐水(PBS)洗涤一次 或多次来进行。尤其当使用的聚合物和/或使用的聚电解质包含大比例的低 分子量物质时，多次洗涤是合适的。而且，所述聚合物骨架可在通过活细胞克隆之前干燥，例如通过快速 冷冻并然后冷冻干燥。关于此优选的是，干燥参数的选择应使得经干燥的
聚合物骨架是可储存的。关于此，储存性是指在优选至少一周内，特别 优选至少一个月内，聚合物骨架在光或电子显4敫镜下不显示出明显的结构 损害。
经干燥的骨架在通过活细胞克隆之前优选用含水介质进行平衡，该平 衡步骤它可以设计成洗涤步骤，或其后跟随一个或多个洗涤步骤。此外， 该平衡也可包括最初用与聚合物线的表面特定或非特定结合的物质浸渍聚 合物骨架。所述浸渍也可以在没有先前的干燥步骤下进行。优选的用于浸 渍的分子是调节或影响活细胞的克隆和/或功能但与本发明的挤出方法不 相容(例如由于关于所用的离液序列高的物质缺乏稳定性)的那些。关于此 优选的是，将吸收在聚合物线上的物质的希望的分布基本上是均匀的，或
致于产生待吸收物质的不同分布。
尤其当要将与聚合物线的表面结合的分子活化时，适于进行上述平衡/
浸渍，所述活化如通过消除保护基、活化酶原的蛋白水解裂解和/或复活因 用离液序列高的物质处理而已经变性的多肽链来进行，例如通过用在弱还 原条件下具有陪伴活性的蛋白或蛋白混合物处理骨架，例如通过用包含 10%重量的血清白蛋白和lmM的P-巯基乙醇的生理盐水緩沖液在+37。C 下孵育。
此外，聚合物骨架可在该聚合物骨架通过活细胞克隆之前进行机械预 处理，如通过拉伸或预拉伸进行处理。所述工艺是聚合物技术所熟悉的； 不束縛于理论，可以假定将小机械力施加到聚合物线上导致超分子排列的 改善，并因而分子间的相互作用增强和线的机械稳定性增加。
如果希望的话，在通过活细胞克隆之前，可以将聚合物骨架进行其它 的机械、化学、热和辐射处理。
制备的聚合物骨架通过活细胞的克隆原则上在体内进行，而聚合物骨 架的降解、细胞外基质等的形成，如果合适的化，可在植入后继续。主要 用于克隆的细胞是粘连的或能够粘连的，并且先前已经从它们的天然聚集体中脱离，如通过用蛋白酶、优选胰岛素和/或螯合剂，例如乙二胺四乙酸
(EDTA)处理。从它们的聚集体中提取细胞的相应方法是本领域技术人员熟 悉的。
克隆有利地通过在通常可允许的条件下用在生长介质中的细胞孵育所 制备的聚合物骨架而进行，该聚合物骨架如果合适的话，已经用细胞生长 介质平衡过。通过人细胞克隆的典型条件是例如用10%胎牛血清和合适 的抗生素增补的DMEM (Eagle介质的Dulbecco修饰)，在+37。C在大气压 下，5%C02。所述介质和条件是本领域技术人员熟悉的。组织的克隆和构 造可以各种方式进行监测，如就地通过光显微镜方法监测。使用前可以进 一步洗涤和将介质调节至更像人体那样的条件。
适于生化/生理学活化组织的预成型结构体必须具有这样的三维精细 结构，该结构使得在体内通过细胞来克隆成为可能，允许对这些细胞充足 地供应氧气和营养成分，并后来允许来自有机体的血管(血管化)和如果合 适的话，神经的向内生长。为此目的以及为了构造具有复杂结构的器官或 器官部分(如肾单位)，还希望能够用合适的生长因子和信号因子"掺杂"预 成型合成结构体的各个部分，以为了以此方式使细胞自组织成功能聚集体。 刺激例如血管或神经向内生长进入到组织区域中的生长因子以及对于建立 并保持有机体中的结构的信号物质，原则上它们至少对本领域技术人员是 熟悉的。例如 Bukovsky， "Cell-mediated and neural control of morphostasis"， Med. Hypotheses 36 (1991)， 261-268给出了综述。
本发明进一步涉及活细胞按如上所述与之结合的聚合物骨架在制备用 于在待处理有机体中恢复、测量或修饰生物学功能的植入物中的用途。在 优选的实施方案中，所述植入物选自人造骨組织、人造皮肤、人造血管和 中空器官。在作为选择的优选实施方案中，所述植入物用作药物释放体系 或可植入的緩释制剂的载体。
本发明进一步涉及由本发明聚合物骨架构成的人造组织。在该情形下， 该聚合物骨架可在植入或其它应用的时候仍然基本上完全保留、部分降解 和/或部分被细胞外基质替代，或基本上完全降解和/或基本上完全被细胞外 基质替代。在优选实施方案中，植入物用作恢复坏掉的神经纤维的神经引导物。 关于此优选的是，聚合物骨架在植入的时候还没有完全降解。
在可供选择的优选实施方案中，所述组织选自人造骨组织、人造皮肤、 人造血管和中空器官。如果组织是人造血管或中空器官，则它优选包括螺 旋形元素，因为这些元素具有适于制备内表面和外表面的几何条件。
本发明进一 步涉及基于本发明聚合物骨架的人造组织在体内和体外诊 断中的用途。
本发明进一步涉及本发明聚合物骨架在生物反应器中的用途，其中活 细胞已经与所述骨架结合。在特别的实施方案中，细胞在该情形下保持在 稳态条件下，如通过使用逆流交换来保持。关于此优选的是，细胞分泌可 溶性产物，特别优选形成可溶性蛋白的杂交瘤或稳定的转染子。在该实施 方案中，三维聚合物骨架对于现有技术中已知的中空纤维系统构成更耐用
的选择(例如参见T. L. Evans和R. A. Miller, "Large-scale prouction of
murine monoclonal antibodies using hollow fiber bioreactors"， Biotechniques 1988， Sep. 6 (8): 762-767)。
如果根据本发明在生物反应器中使用真核细胞，则优选杂交瘤和其它 产生抗体的细胞，如双杂交瘤(Quadrome)。同样优选稳定的转染细胞，如 CHO或NIH3T3细胞，它们例如具有整合到基因组的转基因，其中特别优 选的细胞是分泌可溶性蛋白的细胞。
如果根据本发明在生物反应器中使用原核细胞，则优选低分子量代谢 物的以社会方式组织的生产者，尤其是抗生素的生产者，如链霉菌，如链 霉菌(iSVr印to考ce51 c"e/Zco/o/*)。
本发明进一步涉及一种进行本发明方法的装置，尤其是用于通过挤出 制备聚合物骨架的装置。在优选的实施方案中，该装置包括在相对于所 得网格的三维方向上可移动的挤出针，机械定位器和适于控制定位器的计 算机单元。对于该计算机单元特别优选包括自动产生结构体的程序。
在特别的实施方案中，挤出机构和/或当前形成的骨架可围绕固定轴或 可变轴旋转。
用于针的相对三维定位的相应机械装置正如聚合物的挤出原理那样，是本领域技术人员熟悉的(例如参见T.H.Ang等人"Fabrication of 3D chitosan-hydroxyapatite scaffolds using a robotic dispensing system", Materials Science and Engineering C 20 (2000): 35-42)。
在特别的实施方案中，三维移动主要平行于所得骨架的三个轴分步发 生。关于此优选的是，将针保持为不与所述三个轴的任一个平行，尤其是 使针与所有三个轴形成最大角度(arc tan々2 - 55°;相当于笛卡尔坐标体系 中的1 1 1点)。
在进一步优选的实施方案中，针与骨架的轴之一平行。关于此优选的 是，骨架在一维方向上可移动且而挤出机构在两个其它方向上移动，而针 保持与骨架的移动方向("Z轴")平行。
在特别的实施方案中，针的横截面是圆的。在另一个特别的实施方案 中，针具有椭圆形、多边形、锯齿状的或不规则形状的横截面。关于此， 在本发明中为了同时或顺序地制备骨架，可使用多个具有相同或不同直径 和具有相同或不同橫截面几何形状的针。
本发明的装置原则上包括三类组件
1、 离液序列高的溶液用的储存容器、管线系统和针，
2、 针的定位系统；
3、 液体介质用的容器。
所述第 一组件包括直接与聚合物在离液序列高的溶剂中的溶液接触的 那些部件。因此，相应部件有利地由能耐受所用离液序列高的试剂的材料 制成，所述离液序列高的试剂尤其具有腐蚀效果。考虑到已完成骨架的随 使用，优选对于该骨架可以无菌操作第一组件的各部件，如通过超热汽流 对它们进行消毒("能经受住压热器作用的，，)。
储存容器优选由硅酸盐材料或耐腐蚀金属(如玻璃、陶瓷或不锈钢)构 成。所述针优选由耐腐蚀金属如不锈钢构成。由储存容器引出到可移动针 的管线通常包括柔韧性部件，在特别的实施方案中也可以是刚性部件。所 述管线的柔韧性部件适于由耐腐蚀聚合物材料如聚硅氧烷制成。如果刚性 部件用作管线的元素，则这些原则上可由与储存容器同样的材料制成或者 与柔韧性部件同样的材料制成。储存容器用于接收溶解在本发明的离液序列高的试剂中的聚合物。在 特别的本发明实施方案中，储存容器装有搅拌器，以确保聚合物溶液的均 匀性。在进一步特别的实施方案中，储存容器是温控的，优选它可以将储 存容器的内容物保持在聚合物的离液序列高的溶液是液体的温度。搅拌器 和温控单元都可各自独立地连接到第二组件的控制系统中，或者独立于该 系统。
储存容器原则上可具有任何合适的形状。
溶解的聚合物通过与储存容器连接的管线从储存容器中取出，或者依 靠重力，如用阀门控制，或者优选通过受控泵取出。在该情形下，优选的 泵机构要求可移动构成部分与待泵送溶液不直接接触，如蠕动管式泵。关 于此优选的是，用于控制流速的部件(阀门和/或泵)与第二组件的控制系统 连接。
第二组件包括机械组件，并优选包括用以控制针和挤出物之间的相对 移动的软件。机械组件关于此原则上是已知的。在优选的实施方案中，第 二组件组包括许多驱动彼此垂直设置且用于移动针的精细驱动器的步进式 发动机。关于此，当所述针具有侧向移动的自由度时，所述第二组件优选 包括与针一样多的步进式发动机/精细驱动器。
在本发明特别的实施方案中，所述第二组件组额外地包括改变针角度 的装置。在进一步特别的实施方案中，所述第二组件组包括用于旋转针的 装置。在进一步特别的实施方案中，所述第二组件组包括用以在不同直径 和/或不同几何形状的不同针之间的自动改变的装置，如基于旋转装置原 理。
在本发明的优选实施方案中，第二组组件的步进式发动机和任选组件
通过计算机经由D/A转换器进行控制。特别优选的是，第一组的阀门和泵 以及尤其还有第一组的搅拌器和温控单元也因此是受控的。
在优选的实施方案中，计算机使用适于三维控制针的市购硬件和软件。 关于此特别优选的是，软件能够将预定的空间形状自动地转化成根据本发 明的挤出物线的排列，尤其是挤出物线的包含FASS曲线、特别是Peano 曲线的排列，并相应地引导所述针。在本发明特别的实施方案中，控制性计算机还控制属于第 一组件组并控制溶解的聚合物对针的供应的泵，适合 控制针的移动。
相应的步进式发动机、精细驱动器系统、D/A转换器和合适的计算机 硬件组件原则上是本领域技术人员所熟悉的。
第三组件组包括用于液体介质的容器，在该容器中，溶解的聚合物材 料发生桥出。任何类型的容器原则上都适于该目的。在本发明特别的实施 方案中，水箱由玻璃或陶瓷构成。在本发明的优选实施方案中，水箱同样 支撑于由能够增添针在侧向位移和/或旋转中的缺失自由度的步进式发动 机和精细驱动器系统上。有利的是，第三组件组的步进式发动机和精细驱 动器通过与第二组相同的硬件和软件进行控制，以使得可以均匀控制系统 中的所有移动，以为了精确成型。
考虑到已完成骨架的随后使用，优选的是，也可以无菌操作第三组件 的各部件，如通过超热汽流对它们进行消毒("能经受住压热器作用的")。
本发明通过下述非限制性实施例和附图
进行说明。
所述附图表明，如实施例制备的两个方向上的纤维素网络。所述的1 分硬币表示网的尺寸。
实施例
将纤维素引入到l-乙基-3-曱基咪唑鏘乙酸盐中，并在卯。C下通过搅 拌2小时使其溶解在其中。溶液中的纤维素含量基于该溶液的总重量为1% 重量的纤维素。
将该溶液通过外科针以70 mL/h的速率注入到水浴中，并拉伸所得的 聚合物纤维。结果得到凝胶，该凝胶在干燥时收缩且形成游离纤维(free fiber)。这些干纤维的平均直径为70pm。将这些凝胶一个铺在另一之上， 并通过施加一滴上面制备的纤维素溶液以及然后施加一滴水将纤维之间的 连接点连接，这样得到网状结构体(参见附图)。
权利要求
1、一种制备可生物降解且生物相容的聚合物的二维或三维骨架的方法，其包括下述步骤(i)在离液序列高的液体中增溶可生物降解且生物相容的聚合物；和(ii-a)将在步骤(i)中获得的溶液借助于针基本上连续地挤出到与所述离液序列高的液体混溶但是所述聚合物基本上不溶于其中的液体介质中，其中所述针和所得的骨架在挤出步骤过程中相对于彼此移动；或者(ii-b)将在第一步中获得的溶液借助于针挤出到与所述离液序列高的液体混溶但是所述聚合物基本上不溶于其中的液体介质中，以形成各个直的、卷曲的或弯曲的聚合物线，其中所述针和所得的聚合物线在挤出步骤过程中相对于彼此移动，如果合适的话，从液体介质中分离聚合物线并将该聚合物线连接以形成二维或三维骨架。
2、 根据权利要求l的方法，其中所述聚合物是多糖或改性多糖。
3、 根据权利要求2的方法，其中所述多糖是纤维素或纤维素衍生物。
4、 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述离液序列高的液体的熔 点小于或等于150。C。
5、 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述离液序列高的液体选自 式Het+A x的盐，其中Het+是带正电荷的N-烷基化、N-芳基化、N-芳基烷基化、N-烷氧基化、 N-芳氧基化、N-芳基烷氧基化、N-烷氧基烷基化和/或N-芳氧基烷基化的含 氮杂环；A、/x是阴离子；以及x为1、 2或3。
6、根据权利要求5的方法，其中Het+选自 -带正电荷的5-或6-元芳族杂环，其包含作为环成员的基团NRa并任选包含1 3个选自N、 O、 S、 NRb、 S0和S02的杂原子或含杂原子基团， -带正电荷的5-或6-元芳族杂环，其包含作为环成员的基团NRa并任选包含一个或两个选自N、 O、 S、 NRb、 SO和S02的杂原子或含杂原子基团，并且该芳族杂环与苯环稠合，和 -带正电荷的5-或6-元饱和脂环族杂环，其包含作为环成员的基团NRaRa'并且任选包含一个或两个选自O、 S、 NRb、 SO和S02的杂原子或含杂原子基团， 其中Ra和Ra'各自独立地为d-C6烷基、芳基、d-C6烷氧基、芳氧基、d-Q烷氧基-CrC6烷基或芳氧基-d-C6烷基；和 Rb为氢、d-C6烷基、芳基、d-C6烷氧基、芳氧基、C广C6烷氧基-C广C6烷基或芳氧基-d-C6烷基； 其中所述的脂环族或芳族杂环或者后者可与之稠合的苯环可具有1~5个选自d-Cfi烷基、d-C6烷氧基和d-Q烷氧基-d-C6烷基的取代基。
7、根据权利要求6的方法，其中Het+选自式HeU HeU5的化合物<formula>formula see original document page 3</formula><formula>formula see original document page 4</formula>Het.14 Het.15其中W和R2各自独立地为Q-C6烷基或d-C6烷氧基-d-C6烷基；和RS I^各自独立地为氢、CVC6烷基、d-C6烷氧基或CrC6烷氧基-C广C6烷基。
8、 根据权利要求7的方法，其中Het+选自式Het5的咪唑错离子、式 Het6的吡唑错离子、式Het7的喁唑错离子、式Het.8或Het.9的l，2，3-三唑 错离子、式HeU0的l，2,4-三唑错离子或式Het.ll的噻唑镛离子。
9、 根据权利要求5 8任一项的方法，其中A、/x选自卣离子、拟卣离子、高氯酸根、C广C6单羧酸的酸阴离子以及C2-C6二羧酸的一价阴离子或二价阴离子，其中单羧酸和二羧酸可以被g素和/或羟基取代一次、两次或 三次。
10、 根据权利要求9的方法，其中A^,x选自闺离子和拟囟离子。
11、 根据权利要求1 4任一项的方法，其中所述离液序列高的液体选自 无机盐在极性非质子溶剂中的溶液。
12、 根据权利要求ll的方法，其中所述无机盐选自碱金属g化物、碱 土金属卣化物、卣化铵、碱金属拟卣化物、碱土金属拟氯化物、拟鹵化铵、 碱金属高氯酸盐、碱土金属高氯酸盐、高氯酸铵以及前述盐的混合物。
13、 根据权利要求11或12的方法，其中所述极性非质子溶剂选自二曱基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲亚砜、二乙胺及前述化合物的混合物。
14、 根据前述权利要求任一项的方法，其中应用于步骤(ii-a)或(ii-b)中 的液体介质是含水的。
15、 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述针是自动化装置的组件。
16、 根据前述权利要求任一项的方法，其中将所述骨架的各个部分或 所有部分使用作用于活细胞的信号因子或生长因子涂覆或掺杂。
17、 根据前迷权利要求任一项的方法，其中骨架在步骤(ii-a)中具有基 本上分层的骨架。
18、 根据权利要求17的方法，其中所述骨架的各层基本上由平行走向 的挤出物线构成。
19、 根据权利要求17的方法，其中所述骨架的各层基本上由呈FASS 曲线形式的挤出物线构成。
20、 方法根据权利要求1 16任一项的方法，其中所述骨架在步骤(ii-a) 中基本上由呈三维FASS曲线形式的挤出物线构成。
21、 一种可通过前述权利要求任一项的方法获得的聚合物骨架。
22、 根据权利要求21的聚合物骨架，包含与聚合物骨架结合的活细胞。
23、 根据权利要求21或22的聚合物骨架在制备用于恢复、修饰或测量 生物学功能的植入物中的用途。
24、 根据权利要求21或22的聚合物骨架在生物反应器中的用途。
25、 一种包含根据权利要求21或22的聚合物骨架的人造組织。
26、 根据权利要求25的人造組织在体内和体外诊断中的用途。
全文摘要
本发明涉及适于制备人造组织的聚合物骨架，尤其是多糖骨架。本发明还涉及它们在制备人造组织中的用途，以及由所述聚合物骨架制备的人造组织。
文档编号A61L27/20GK101410559SQ200780010569
公开日2009年4月15日 申请日期2007年1月24日 优先权日2006年1月24日
发明者M·马斯, S·德克, S·钱普 申请人:巴斯夫欧洲公司