专利名称：：药物载体、其合成及其使用方法
技术领域：
：本发明涉及药物载体及其使用方法。更具体地，本发明涉及靶向硬组织的环糊精和多功能聚(乙二醇)(PEG)。
背景技术：
：为了阐述本发明所属领域的状态，在整个说明书中引用了若干出版物和专利文献。这些引用中的每一篇都好象其全部^U是出一样在此引作参考。骨是结締组织的高度特化形式，其在所有脊推动物中提供内部支撑系统。为了维持其正常功能，在整个骨骼中骨不断地再吸收和重建。在健康个体中，骨的再吸收和形成得到很好的平衡，骨量维持在稳态水平。这种平衡的打破是包括骨质疏松症、帕哲氏病、骨硬化症、骨癌等等在内的很多骨病的特点(Odgren等(2000)Science289:1508-1514)。当前有4千4百万美国人或55%的50岁和以上人口有患骨质疏松症的危险；1千万人可能已经患有该病(Burckhardt等(1991)Am.J.Med.，90:107-110;America'sBoneHealth:TheStateofOsteoporosisandLowBoneMassinOurNation(美国的骨#:康我们国家骨质疏爭〉症和4氐骨量的状态)；NationalOsteoporosisFoundation:Washington,DC，2002;第1-16页)。同样地，总是伴随骨骼并发症的关节炎(例如类风湿性关节炎和骨关节炎)也影响了数千万美国人的生活(O，Dell,J.R.(2004)N.Engl.J.Med"350:2591-2602;Firestein,G.S.EtiologyandPathogenesisofRheumatoidArthritis(类风湿性关节炎的病因学和发病机理)，在Kelley的风湿病学教科书第7版中；Harris,E.D.等编辑；ElsevierSaunders:Philadelphia,2005;第996页；Wieland等(2005)Nat.Rev.DrugDiscovery4:331-344)。类风湿性关节炎(RA)是一种慢性系统性炎症性疾病，其包括关节毁坏。尽管不知道该病的准确病因，但通常认为其为自身免疫病。该病的主要靶是滑液组织。发炎的滑膜组织(包括滑膜成纤维细胞和破骨细胞)侵入和伤害关节骨和软骨，导致明显疼痛和行动不便。当前，RA影响全世界大约0.8%的成年人，女人比男人发作更早并更普遍，经常在分娩年龄开始。当对该病不加抑制时，通常导致实质性残疾和早期死亡(O'Dell,J.R.(2004)N.Engl.J.Med.,350:2591-2602;Firestein,G.S.(2005)EtiologyandPathogenesisofRheumatoidArthritis(类风湿性关节炎的病因学和发病机理)，在Kelley的风湿病学教科书第7版中。ElsevierSaunders,Philadelphia,9%;McDuffie,F.C.(1985)Am.J.Med"78:1-5)。发明简述本发明提供靶向生物矿物质例如骨和牙的化合物。在特別的实施方案中，所述化合物为通式T-X-CD化合物，其中X为接头域，T为耙向骨的部分，CD为环糊精。在特别的实施方案中，靶向骨的部分为阿伦膦酸盐(alendronate)。本发明另一方面提供组合物，该组合物包含本发明靶向骨的环糊精化合物和至少一种药学可接受载体。该组合物可进一步包含可任选地包含在环糊精孔腔中的至少一种治疗药物。在特别的实施方案中，该治疗药物为骨相关治疗药物。本发明另一方面提供预防或治疗有需要的受试者的骨病和骨病相关病症或并发症的方法。所述方法包括给予患者本发明药物组合物。该组合物可系统或局部给予。本发明另一实施方案提供多功能PEG。该多功能PEG可包含通过"点击(click)"聚合反应连接的PEG嵌段共聚物。在特别的实施方案中，该药物载体为式I。本发明另一方面提供包含多功能PEG和至少一种药学可接受载体的组合物。所述组合物可进一步包含至少一种治疗药物。附图简述图1提供示例T-X-CD,其中环糊精经由接头部分连接阿伦膦酸盐(靶向骨的部分)。图2提供阿伦膦酸盐与环糊精结合的示意性图示。图3A-3E分别提供浸润大小(mm2)、淋巴细胞百分比(侧面)、新骨面积(mm2±SEM)、新骨宽度(mm±SEM)和造骨细胞百分比(侧面)的图表，其从用不同制剂治疗的大鼠下颌骨脱钙切片的苏木精和曙红染色成像分析获得。1为前列腺素E！(PGEO/阿伦膦酸盐(ALN)-环糊精(CD)，2为PGE,/羟丙基(HP)-卩-CD，3为PGE丄/ALN-CD加BioOss,4为PGE/HP-卩-CD加BioOss,5为ALN-CD，6为HP-卩画CD。**p<0.01，***p<0.001。图4A-4G提供用PGE"ALN-CD(图4A)、PGEi/HP-卩-CD(图4B)、PGE一ALN陽CD力口BioOss(图4C)、PGE"HP画卩-CD力。BioOss(图4D)、ALN-CD(图4E)和HP-P-CD(图4F)治疗的大鼠下颌骨的脱钙切片的苏木精和曙红染色成像。图4G为图4A的200x放大。白色箭头指向下颌骨，灰色箭头指向新骨，黑色箭头指向BioOss⑧微粒。图5为经由Cu(I)-催化的Huisgen1,3-偶极环加成反应合成线性多功能PEG的图示。图6提供乙炔基封端的PEG2000(图6A)和经由"点击"反应获得的线性多功能PEG(图6B)的^NMR光谱(D20)图。图7为"点击"聚合产物的分子排阻色谱法(SEC)分析图谱。用Superose6柱(HR10/30)以PBS(pH-7.3)作为洗脱液。用聚环氧乙烷(PEO)校准样品(MW-66kDa)作为参照品。箭头代表少量未反应的乙炔基封端的PEG2000。发明详述I.耙向骨的药物载体在一个实施方案中，本发明涉及靶向硬组织(例如骨和牙)的化合物及其使用方法。优选地该靶向化合物具下式T-X-CD，其中X为接头域，T为耙向骨的一或多个部分，CD为环糊精。尽管下文中以羟丙基(HP)-(3-CD来举例说明，但在本发明化合物中可使用其它环糊精，这些包括但不限于a-CD、卩-CD、，CD、^CD和其衍生物，例如二甲基-(3-CD、羧甲基-乙基-P-CD、磺丁基-乙基-P-CD和阐述于美国专利第4,727,064号和第5，376，645号中的那些。本发明化合物包括至少一种类型的环糊精。在优选实施方案中，每一环糊精连接至少一种靶向骨的部分。环糊精的疏水孔腔可未占用或可利用(即环糊精孔腔未装有治疗化合物或药物)，或可装入或与治疗化合物或药物复合。本发明化合物的环糊精还可为环糊精聚合物(即通过共价4定连接的环糊精)。环糊精聚合物可为线性、分支或树枝状聚合物。环糊精聚合物可包含约2-约200个环糊精单元。接头域X为包含让靶向骨的部分与环糊精共价连接的共价键或原子的链的化学部分。在特别的实施方案中，接头可含有0(即一个键)到约500个原子、约1-约100个原子或约1-约50个原子。接头可连接环糊精的任何可行地合成的位置。在优选实施方案中，接头连接在避免阻止药物与环糊精孔腔结合的位置(例如环糊精环的外面)。例示性接头可包含至少一种任选取代的；饱和或不饱的；线性、分支或环状的烷基、烯基或芳基。接头还可为多肽(例如约l-约20个氨基酸)。接头在生理环境或条件下可生物降解。接头还可以是非生物可降解的，并可能为在生理环境或条件下不能裂解的共价键或任何其它化学结构。官或组织中积聚的化合物。本发明把向骨的部分包括但不限于双膦酸盐(例如阿伦膦酸盐)、四环素(tetracycline)、唾液酸、丙二酸、N，N-二羧甲胺、4-氨基水杨酸、4-氨基水杨酸、靶向骨的抗体或其片段和肽(例如包含约2-约100个D-谷氨酸残基、L-谷氨酸残基、D-天冬氨酸残基和/或L-天冬氨酸残基的肽)。在优选实施方案中，靶向骨的部分为阿伦膦酸盐，藉此得到式ALN-X-CD化合物，其中X为接头域。本发明还涵盖包含靶向骨的环糊精的组合物。所述组合物包含至少一种药学可接受载体。所述组合物还可进一步包含至少一种抗生素、抗炎药物、麻醉剂和/或"骨相关治疗药物"。"骨相关治疗药物"指诱导例如(但不限于)以下所期需的生物学或药理学作用的适于给予患者的药物l)增加骨生长，2)预防不想要的生物学作用例如感染，3)减轻由骨相关疾病引起的病症(例如疼痛或炎症)，和/或4)减轻、降低或消除骨病。优选地，骨相关治疗药物具有骨合成代谢的作用和/或骨稳定作用。骨相关治疗药物包括但不限于组织蛋白酶K抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、前列腺素E受体激动剂、前列腺素El或E2和其类似物、曱状旁腺激素和其片段、糖皮质激素(例如地塞米松)和其衍生物和他汀类(例如辛伐他汀)。骨相关治疗药物可共价连接(任选地经由接头域)到本发明靶向骨的环糊精(T-X-CD),尤其是环糊精分子。在优选实施方案中，骨相关治疗药物通过其它物理相互作用与靶向骨的环糊精结合，例如经由例如范德华力与环糊精的疏水孔结合。可通过任何合适途径给予本发明药物组合物，例如通过注射、口月良、肺部或其它给药方式。可局部或系统给予本发明组合物(例如用于治疗骨质疏松症)。在优选实施方案中，可将组合物直接注射到所期需位点。本发明药物组合物可在控释系统中递送，例如经由可植入渗透泵或其它给药方式。在另一实施方案中，可采用聚合材料以控制释放(参见MedicalApplicationsofControlledRelease(控释药学应用)，Langer和Wise(编辑)，CRCPress:Bocaraton,Florida(1974);ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance(控释药物生物利用度、药物产品设计和性能)，Smolen和Ball(编辑)，Wiley:NewYork(1984);Ranger禾口Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.(1983)23:61;还参见Levy等，Science(l985)228:190;During等，Ann,N画l.(1989)25:351;Howard等，J.Neurosurg.(l989)71:105)。控释系统可置于受试者靶区的近端。其它潜在的控释系统在Langer的综述(Science(1990)249:15271533)中讨论。本发明组合物还可作为医疗器材的一部分给予。本文所用术语"医疗器材"包括永久植入和临时或暂时存在于患者中的装置和材料。本发明组合物可从医疗器材上释放或包被在医疗器材上。医疗器材包括但不限于支架、板、骨折固定植入体(fractureimplant)、凝胶体、聚合物(例如緩释聚合物或凝胶)和释放装置。本发明组合物还可包被在移植体和植入体上面，或与其一起给予，这些移植体和植入体例如但不限于硬脑膜移植体、软骨移植体、软骨植入体、骨移植体、骨植入体和骨髓移植体。本发明还涉及预防或治疗有需要的受试者的骨病和骨病相关病症或并发症的方法，该方法包括给予受试者本发明组合物。骨病可与骨丟失相关联，包括但不限于骨质疏松症、骨质减少症、骨折、骨裂、帕哲氏病(畸形性骨炎)、骨退化、骨弱化、骨骼变形、低骨矿物质密度、脊柱侧凸、骨质软化症、骨髓炎、成骨不全、骨硬化症、内生软骨瘤、骨软骨瘤病、软骨发育不全、牙槽骨缺损、脊推骨压迫(spinevertebracompression)、脊髓损伤后骨丢失、缺血坏死、纤维发育不良、牙周病、甲状旁腺功能亢进症(嚢性纤维性骨炎)、磷酸酶过少症、进行性骨化性纤维发育不良和骨疼和骨炎。骨相关治疗药物可在本发明靶向骨的环糊精化合物的同一组合物中给予，或可以分开的组合物同时或在不同时间给予。II.多功能PEG本发明另一方面提供新型多功能聚(乙二醇)(PEG)共聚物和其合成方法。PEG为水溶性的高度生物相容的人工合成的聚合物，一直广泛用于药物递送和生物缀合中。已知其无免疫原性，并具有卓越的生物相容性(Chapman等(2002)Adv.DrugDdiv.Rev"54:531—545;Greenwald等(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.,55:217—250)。FDA已批准几种PEG缀合的(PEG化的)的治疗药物用于临床使用(Duncan,R.(2003)NatRev.DrugDiscov.，2,347-360;Veronese等(2005)DrugDiscov.Today,10,1451-8;Shen等(2006)Curr.Opin.Mol.Ther"8,240-248)。然而，迄今为止一直使用仅在链末端功能化的PEG,因为与合成线性多功能PEG有关的困难很多。改进其受限的功能(两个链末端)将显著扩展其当前的应用。本发明提供极为简单的合成多功能PEG的方法。本发明PEG缀合物的合成和功能调整可易于完成，这使得个性化的大分子疗法成为可能。另外，可将生物降解结构(例如酯键)引入聚合物主链中，藉此使得高分子量PEG能为生物所分解。然后可从系统中除去降解的PEG，藉此大大提高PEG的生物相容性。多功能PEG还具有明确限定的结构，如此每一官能团可被短但明确限定的PEG链分隔。下文提供简单然而高效的用"点击"化学合成线性多功能PEG的策略。在室温于水中用Cu(I)催化的Huisgen1,3-偶极环加成反应通过2，2-双(叠氮曱基)丙烷-1,3-二醇连接短的乙炔基封端的PEG。获得具有侧羟基的高分子量PEG，并通过111NMR和分子排阻色谱法(SEC)来鉴定。这种简单的"点击"聚合方法提供用于开发用于生物医学应用的新型聚合物和功能聚合缀合物的有力工具。点击化学指一组在两个官能团之间形成共价键并具高产率的反应，它们可在极为温和的条件下进行(Kolb等(2001)Angew.Chem.Int.Ed"40:2004-2021;Lewis等(2002)Angew.Chem.Int.Ed.,41:1053-1057)。点击反应通常为碳原子与杂原子之间的反应，其不可逆，高度能量有利的，反应进行基本完全，除非是在彼此之间否则通常不起化学反应的两个基团之间发生。点击化学技术阐述于例如以下参考文献中美国专利第7,208,243号；美国专利申请公开案2006/0154129、2006/0269942、2005/0222427和2006/0263293;Kolb等(2001)Angew.Chem.Intl.Ed.，40:2004-2021;Kolb等(2003)DrugDisc.Tod"8:1128-1137;Rostovtsev等(2002)Angew.Chem.Intl.Ed"41:2596-2599;Tomoe等(2002)J.Org.Chem.,67:3057-3064;Wang等(2003)J.Amer.Chem,Soc.，125:3192-3193;Lee等(2003)J.Amer.Chem.Soc.,125:9588-9589;Lewis等(2002)Angew.Chem.Int.Ed.,41:1053-1057;Manetsch等(2004)J.Amer.Chem.Soc.,126:12809-12818;和Mocharla等(2005)Angew.Chem.Int.Ed"44:116-120。在本发明中可利用任何点击化学官能团。在特别的实施方案中，使用环加成反应，例如在Cu(I)盐存在下叠氮化物和炔类的Huisgen1,3-偶极环加成反应，藉此形成1，4-二取代1,2，3-三唑(参见例如Padwa,A"ed.，Huisgen1,3-DipolarCycloadditionChemistry(Huisgen1,3"禺才及5不力口成反应4匕学)(第1册)，Wiley，第1-176页；Jorgensen(2000)Angew.Chem.Int.Ed.Engl"39:3558-3588;Tietze等(1997)Top.Curr.Chem.，189:1-120)。或者，在Ru(II)盐存在下，末端炔类或炔基和叠氮化物经历1，3-偶极环加成反应形成1，5-二取代的1,2，3-三唑(Fokin等(2005)Organ.Lett.,127:15998-15999;Krasinski等(2004)Organ.Lett.，1237-1240)。Cu(I)-催化的叠氮化物和炔类的Huisgen1，3-偶极环加成反应以形成1,2，3-三唑的变体作为报告最多的"点击"反应出现。其特征为高反应产率、温和的反应条件、耐受氧和水、后处理简单、良好的官能团相容性和强可靠性(Rostovtsev等(2002)Angew.Chem.Int.Ed"41:2596-2599;Bock等(2006)Eur.J.Org.Chem"51-68)。当将2，2-双(叠氮曱基)丙烷-l，3-二醇用作二功能叠氮化物反应物时，潜在地由于自我催化机理观察到极高的反应速率(Rodionov等(2005)Angew.Chem.Int.Ed.,44:2210-2215)。实际上，很容易将叠氮化物和乙炔引入有机化合物中，这些结构在其它反应条件下稳定。这些独特的特点使得Cu(I)-催化的Huisgen1,3-偶极环加成反应在以下几种情况中成为有力的连接反应药物发现(Kolb等(2003)DrugDiscov.Today.,8:1128-1137;Manetsch等(2004)J.Am.Chem.Soc.,126:12809-12818;Mocharla等(2005)Angew.Chem.，Int.Ed.,44:116-120)、聚合物合成(Parrish等(2005)J.Am,Chem.Soc.,127:7404-7410;Malkoch等(2005)J,Am.Chem.Soc.，127:14942-14949;Ladmiral等(2006)J.Am.Chem.Soc.,128:4823-4830;Wu等(2004)Angew.Chem.Int.Ed.，43:3928-3932)、纳米粒(Joralemon等(2005)J.Am.Chem.Soc.,127:16892-16899)和生物大分子功能化(Wang等(2003)J.Am.Chem.Soc.,125:3192-3193;Beatty等(2005)J，Am.Chem.Soc.，127:14150-14151)。由通过点击化学例如通过2,2-双(叠氮甲基)-丙烷-1，3-二醇连接的经修饰的PEG嵌段物组成的本发明PEG多功能共聚物，提供水溶性的聚合物药物递送系统。多功能PEG为可用作大分子疗法的药物载体的常规药物递送平台。可通过在经修饰PEG和化合物之间实施点击反应来产生多功能PEG，并任选有至少一种其它官能团(即易于与另一分子反应以形成键的基团)，所述经修饰PEG在其末端包含第一点击反应官能团(例如炔)，所述化合物包含至少一个(优选地至少两个)第二点击反应官能团(例如叠氮化物)，所述其它官能团不巻入点击反应，但其使得其它化合物例如治疗药物加到得到的多功能PEG上。或者，该化合物可能在点击反应之前已经缀合到其它化合物或治疗药物上。例如，2，2-双(叠氮曱基)-丙烷-1,3-二醇和其类似物可连接任何感兴趣的化合物。因此，治疗药物、医学造影剂、生化标记、靶向部分、荧光标记和其它化合物可与2,2-双(叠氮曱基)-丙烷1-1,3-二醇连接，并以所期需比率引入到高分子量PEG上。本发明多功能PEG通式为(式I):WN3其中m为2-4000或2-1000，n为2-1000。临床上，多功能PEG可作为药物递送系统用于治疗任何疾病或病症。在特别的实施方案中，多功能PEG可用于实体肿瘤、类风湿性关节炎和其它血管渗漏的病理病症的改进治疗。同样地，当将造影剂或焚光标记引入多功能PEG时，其可用作_珍断工具或研究工具，例如大分子血池造影剂。另外，因为其极高的分子量和粘性，可将本发明多功能PEG任选地与至少一种治疗化合物药物联用直接施用于创面敷料、粘合剂绷带、缝合线、伤口处、烧伤处、磨损处和切口处。多功能PEG还可用于选择性递送抗炎化合物和免疫抑制剂(例如糖皮质激素)到患炎症性关节炎患者的发炎的关节位点。多功能共聚物还可用于连接抗类风湿性关节炎药物，例如经由乙缩酪形成连接地塞米松。乙缩醛是负责pH敏感的地塞米松释放的结构。目前还不能治愈类风湿性关节炎。用于临床治疗和处理该疾病的最常用药物包括非类固醇抗炎药物(NSAID)、糖皮质激素(GC)和病症緩解性抗风湿性药物(DMARD)。认为与其它药物联合的DMARD在控制疾病进展中相当有效(O'Dell，J.R.(2004)N.Engl.J.Med"350:2591-2602;Smolen等(2003)Nat.Rev.DrugDiscov.,2:473-488)。尽管已经能理解疾病进展的分子机理，并能确定类风湿性关节炎的新的治疗靶，但大部分抗风湿药物缺乏亲关节性仍是挑战。本发明多功能PEG共聚物提供用于选择性将抗风湿药物或候选药物递送到关节炎关节的手段。如上所述，本文提供基于多功能PEG的药物载体系统，其中例如通过2,2-双(叠氮曱基)-丙烷-l，3-二醇连接乙炔修饰的PEG嵌段物。可通过用乙炔封端之前用例如低聚肽修饰PEG,使得该共聚物可生物降解。来自接头的二醇为用于与含有羰基的药物缀合的天然结构，形成的乙缩醛连键为一直广泛用于前药设计的pH敏感的接头。本发明设计还具有反应条件简单和显著的大规模生产潜力的优点。药物与本聚合物载体的结合比与其它的共聚物例如HPMA的结合容易一些(Anderson等(2004)The26thAnn.MeetingAmer.Soc.BoneMiner.Res.Seattle,WA,October,2004,posterpresentation)。另夕卜，还可通过2，2-双-(叠氮曱基)-丙烷-l,3-二醇的修饰容易地导入耙向部分。本发明还涵盖包含多功能PEG的组合物。所述组合物包含至少一种药学可接受载体。所述组合物还可进一步包含任选地连接多功能PEG的至少一种治疗化合物。可通过任何合适途径给予包含多功能PEG的组合物，例如通过注射、口服、肺部或其它给药方式。可局部或系统给予本发明组合物(例如用于治疗骨质疏松症)。该组合物还可在控释系统中递送，例如在可植入渗透泵、医疗器材、聚合物材料或其它给药方式中。该组合物还可包被在移植体上或与其一起给予。III.定义术语"基本上纯"指制品包含至少50-60%重量的给定物质(例如核酸、寡核苷酸、蛋白质等等)。更优选地，该制品包含至少75%重量并最优选90-95%重量的给定化合物。通过适于给定化合物的方法(例如色语方法、琼脂糖电泳或聚丙烯凝胶电泳、HPLC分析等等)来测量纯度。术语"分离"指将化合物与其生产期间存在的其它的组分分开。"分离"并不意味着排除与其它的化合物或材料的人造的或人工合成的混合物，或排除基本上不干扰基本活性，以及可例如由于不完全纯化或加入稳定剂而存在的杂质的存在。"接头"、"接头域"和"连键"指包含共价键或共价连接的原子链的化学部分，例如指环糊精靶向骨的部分。在各种实施方案中，接头指定为X。接头可连接环糊精的任何人工合成的可行位置，但优选以避免阻碍药物结合环糊精孔腔的方式(即在环糊精环的外面)。接头通常已为本领域所知。例示性接头可包含至少一种任选地取代的；饱和或不饱和的；线性、分支或环状的烷基或任选地取代的芳基。接头还可为多肽(例如约1-约20个氨基酸)。在生理环境或条件下接头可生物降解。接头还可为非生物可降解的，可为在生理环境或条件下不能裂解的共价键或任何其它的化学结构。本文所用术语"靶向骨"指在体内给予后优先在硬组织而不是任何其它器官或组织中积聚的能力。本文所用术语"可生物降解"或"生物降解"定义为在生理学条件下通过溶解水解作用，或通过由生物学作用形成的可能是酶或是其它生物体产物的实体，将物质转化为较不复杂的中间体或终产物。术语"非生物可降解"指在生理学条件下即使用任何外部干涉仍不能裂解的化学结构。术语"可降解"指经由物理(例如超声)、化学(例如低于4或高于9的pH)或生物学(酶的)手段裂解化学结构的能力。化合物或药物组合物的"治疗有效量"指有效预防、抑制或治疗特定病症或疾病症状的量。例如，"治疗有效量，，可指足以调节动物尤其是人的骨丢失或骨质疏松症的量，包括但不限于降低或预防骨丢失或增加骨量。"药学可接受"指被联邦或州政府管理机构批准，或在美国药典或其它的通常公认用于动物和更具体地人的药典中列举。"载体"指与本发明活性物质一起给予的例如稀释剂、辅药、防腐剂(例如Thimersol、苯曱醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸纳)、稳定剂(例如Tween80、聚山梨醇酯80)、乳化剂、緩沖剂(例如TrisHC1、乙酸盐、磷酸盐)、膨胀物质(例如乳糖、甘露醇)、赋形剂、助剂或溶媒。药学可接受载体可为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物油、才直物油或人工合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。优选釆用水或盐水溶液和葡萄糖水溶液和丙三醇溶液作为载体，特别是用于注射液。组合物可掺入到聚合化合物例如聚乳酸、聚乙醇酸等的微粒制剂中或掺入脂质体或胶嚢中。这样的组合物可影响本发明药物组合物组分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。本发明药物組合物可制备为例如液态形式，或可呈干粉形式(例如冻干)。合适的药用载体阐述于以下文献中"Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)"byE.W.Martin(MackPublishingCo.,Easton,PA);Gennaro，A.R.，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(药物科学与实践)，第20版,(Lippincott,Williams和Wilkins),2000;Liberman等编辑PharmaceuticalDosageForms(药物剂量形式)，MarcelDecker,NewYork,N.Y.,1980;和Kibbe等编辑HandbookofPharmaceuticalExcipients药物赋形剂手册)(3.sup.rdEd.),AmericanPharmaceuticalAssociation,Washington,1999。本文所用术语"烷基"包括在正常链中含约1-20个碳、优选约5-15个碳的直链和支链烃。烷基烃链可插入氧、氮或硫原子。合适的烷基实例包括曱基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、异己基、庚基、4，4二甲基戊基、辛基、2,2,4三曱基戊基、壬基、癸基、其各种支链异构体等等。每一烷基可任选地被包括例如卤素、-OH和烷基的l-4个取代基取代。本文所用术语"环状烷基"或"环烷基"包括含l-3个稠合或不稠合的环的环状烃基。环烷基可含有总共3-20个形成环的碳，优选6-10个形成环的碳。任选地，所述环之一可为下述用于芳基的芳香环。环烷基可含有一个或多个双—建。环烷基还可任选地含有包括至少一个、优选l-约4个硫、氧或氮杂原子环成员的取代的环。每一环烷基可任选地被1-约4个取代基取代，取代基例如烷基(任选取代的直链、支链或环状烃基，任选饱和，具约1-10个碳，特别是约1-4个碳)、卤素(例如F、Cl、Br、1)、卣代烷基(例如CCl3或CF3)、烷氧基、烷硫基、羟基、曱氧基、羧基、氧代、环氧基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、氨基、氨基甲酰基(例如NH2C(-0)-或NHRC(O)-,其中R为烷基)、脲(-NHCONH2)、烷基脲、芳基、醚、酯、硫酯、腈、硝基、酰胺、羰基、羧酸盐和好u醇。"烯基"指包含一个或多个碳碳双键(即烯基为不饱和的)和含有约2-约20个碳原子或约5-约15个碳原子的不被取代的或被取代的烃部分，其可为直链、支链或环状烃基。当被取代时，烯基可在任何可用的连接点被取代。例示性取代基可包括但不限于烷基、卣素、卣代烷基、烷氧基、烷硫基、羟基、曱氧基、羧基、氧代、环氧基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、氨基、氨基曱酰基、脲、烷基脲和硫醇。优选地，烯基包括交替的双键和单键，以使这些键共轭。本文所用术语"芳基"指在环部分含6-10个碳的单环和双环芳香基团。芳基实例包括但不限于苯基、萘基(例如1-萘基和2-萘基)、p引。呆基和吡啶基(例如3-吡啶基和4-吡咬基)。芳基可任选地通过可利用的碳原子被l-约4个基团取代。例示性取代基可包括但不限于烷基、卣素、囟代烷基、烷氧基、烷硫基、羟基、曱氧基、羧基、羧酸盐、氧代、醚、酯、环氧基、烷氧基羰基、烷基羰氧基、氨基、氨基甲酰基、脲、烷基脲、硫酯、酰胺、硝基、羰基和硫醇。芳香基团可为杂芳基。"杂芳基"指包括至少一个、优选l-约4个硫、氧或氮杂原子环成员的任选被:又代的芳香环系统。本文所用"聚乙二醇"、"PEG"和"聚(乙二醇)"指结构"-(OCH2CH2)n-"的化合物，其中(n)介于2-约4000之间。本发明PEG可具有各种末端或"封端"基团。PEG可为"分支"或"分叉"，但优选"线性"。提供以下实施例为了阐明本发明的各种实施方案。它们并非意欲以任何方式限制本发明。实施例l:阿伦膦酸盐环糊精的合成和鉴定图1为本发明阿伦膦酸环糊精的示意图。图2提供合成阿伦膦酸环糊精的图示。该合成方法连同得到的阿伦膦酸环糊精的鉴定研究在下文中阐述。地塞米松(Dex)、前列腺素El和(3-环糊精购自TCIAmerica(Portland,OR)。对甲苯磺酰氯、4-戊炔酸、l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、叠氮钠、CuS04.5H20、抗坏血酸钠、二甲基曱酰胺和二氯曱烷购自Acros(Pittsburgh,PA)。阿4仑膦酸盐购自UltratechIndiaLtd.(Vashi,NewMumbai，India)。内才示氟米龙(fluorometholone)来自Sigma(St.Louis，MO)。乙醇和乙腈来自Fisher(Pittsburgh,PA)。「考f^:4應4)^豕y努潜^合^将卩-环糊精(120.0g，105.8mmol)悬浮于800ml水中。逐滴加入含NaOH(13.14g,328mmol)的40ml水溶液。在加完之前让混悬液均匀。逐滴加入含对甲苯磺酰氯(20.16g,105.8mmol)的60ml乙腈。在室温反应4小时后，通过过滤除去沉淀物，将8mmol稀HCl加入到滤液中。然后让滤液在4。C冷冻过夜。通过过滤收集得到的白色沉淀物，干燥，得到粗产物。通过在热水中重结晶得到纯产物。产率10%。NMR(500Hz,DMSO-d6)S7.75(d，J=8.3Hz,2H),7.43(d,J=8.3Hz,2H)，5.83-5.63(m,14H)，4.85隱4.77(m,7H);4.52-4,17(m,6H),3,70-3.42(m,28H)，3.39-3.20(m，overlapsw他HOD),2.43(s,3H)ppm。冬6-n4j-"-膽/辆-a)」w合乂在80。C让TsO-CD(6.44g,5mmol)悬浮于水(50ml),加入叠氮钠(3.25g，50mmol)。在80。C让反应搅拌进行6小时。冷却到室温后，将该溶液倒入丙酮(300ml)中。真空下干燥得到的沉淀物，以得到白色粉末状叠氮化物产物。通过透析(MWC0500透析管)纯化该产物。产率80%。'HNMR(500Hz,DMSO-d6)S5.78-5.62(m,14H)，4.88陽4.82(m，7H),4.53-4.46(m,6H)，3.76画3.55(m,28H),3.41-3.26(m，与HOD重叠)ppm。;gV4游(0^'炎^2，5-二秉/七-必咨處-/-差游」W合A将2.0g(20mmol)的4-戊炔酸溶于80mlCH2C12。加入2.54g(22mmol)的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)。然后加入l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(4.22g，22mmol)。于室温过夜搅拌该反应物。浓缩反应混合物，通过硅胶柱(己烷:乙酸乙酯=2:1)分离纯产物。产率85%。JHNMR(500Hz,CDC13)S2.88-2.83(m，6H)，2.60(td,J！=2,44Hz,J2=7.81Hz，2H),2.04(t,J=2.44Hz,1H)ppm。/T洽摩^^;^^/t'炎凝P-身《一-4W-炎疯^差7~處-/,/-二差二#凝>潜合參^合成'将阿伦膦酸盐(3.15g，10mmol)溶于60ml水(pH7.0或PBS)，然后将乙腈中的1.976g(5mmol)戊炔酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯逐滴加入到该溶液中。于室温将反应物搅拌4小时，然后再将乙腈中的1.976g(5mmol)戊炔酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯逐滴加入该溶液中。室温搅拌4小时后，将乙腈中的0.8g(2mmol)戊炔酸2，5-二氧代-吡咯烷-l-基酯逐滴加入该溶液中。使继续反应4小时。浓缩该反应液，在乙醇中沉淀3次，得到最终纯产物。产率90%。^NMR(500Hz,D20)S3.20(t，J=6.84Hz,2H),2.44(m，4H)，2.37(t,J=2.44Hz,lH)，L90(m,2H),1.80(m,2H)ppm。^i^i#^ZJV-CD」凝合辆合成将磁力搅拌棒、l-羟基-4-戊-4-炔酰氨基丁烷-l,l-二基二膦酸水溶液(1.38g，3.5mmol)、CuS04.5H20(125mg,0.5mmol)和新鲜制备的抗坏血酸钠水溶液(0.99g,5mmol)装入100ml烧瓶中。使混合物在室温搅拌30分钟。然后向该混合物中逐滴加入含单-6-(叠氮)-(3-环糊精(N3-CD)(4.64g,4mmol)的H20溶液。使反应混合物在室温搅拌3天。让反应液以4000rpm离心0.5小时，将上清液沉淀在DMF中。过滤后，浓缩上清液，在乙醇中沉淀3次。产率82.5%。'HNMR(500Hz,D20)57.80(s，1H),5.15-4.93(m，7H)，4.00隱3.75(m,28H)，3.69-3.51(m,14H),3.16(t,J=6.79Hz,2H)，2.99(t,J=7.32Hz,2H),2.60(t,J=7.32Hz,2H),U9(m,2H)，1.77(m，2H)ppm。/1LA^-CZ)^股丄辦合渗力让20mg罗丹明B标记的ALN-CD或CD和1mg罗丹明B分开溶于0.5ml水，加入100mg羟磷灰石(HA)。然后使混合物在室温轻轻搅拌10分钟。通过离心(10,000rpm，2分钟)收获HA，然后用H20洗涤5-10次，以除去未结合的化合物。使HA于室温中在真空下干燥。将10mg罗丹明B修饰的ALN-CD溶于25ml水，在UV-可见分光光度计上记录光谱。将20mgHA加入到1ml该溶液中，振荡0.5、1和2分钟。然后让该溶液离心30秒，用UV分析上清液。在v4丄7V-CZ)存^7"的她J^t^4'^"/y應,五/(KW〃的相溶解度按照Higuchi和Connors才艮道的方法(Adv.Anal.Chem.Instrum,(1965)4:117-212)进行溶解度研究。将过量地塞米松(3.92mg)或PGEl(2mg)加入到含各种浓度的ALN-CD(0-10mM)水溶液(l.Oml)中。做三个平行实验。密封含有溶液的管，在25。C振荡3天。然后用注射器通过0.22jim滤器过滤该混悬液。通过配有UV检测仪的HPLC测定滤液中地塞米松或PGE1的浓度。对于地塞米松，用10jig/ml氟米龙作为内才示。用以下方程计算稳定常数K:斜率/截距x(l-斜率)，其中斜率为相溶解度图的斜率，截距为在ALN-CD不存在下地塞米松在水中的溶解度。用于检测地塞米松的条件如下色谱柱AgilentC18反相(4.6x250mm,5,;SantaClara,CA);流动相乙腈-水(40:60,V/V)，流速为1ml/分钟；在240nm处UV检测。用于检测PGEl的条件如下色谱柱AgilentQg反相(4.6x250mm，5—;流动相乙腈-0.01MKH2P04(42:58,v/v),流速为lml/分钟；在205nm处UV检测。^合复合辆齡通过让地塞米+>或PGEl的丙酮或曱醇溶液与不同浓度的ALN-CD水溶液混合，制备不同摩尔比的地塞米松或PGEl与ALN-CD的包合复合物。让得到的溶液在环境温度下搅拌直到溶剂完全蒸发。然后用注射器通过0.22|am滤器过滤混悬液，冻干滤出液。參理;遂合參时##以和得到的复合物同样的化学计量比制备物理混合物。在研钵中混合地塞米+》和ALN-CD，直到得到均匀混合物。尸(7￡7一^LAA—O)!合參^^^々澥J^趟(X^q)在30。C-180。C温度范围内用ShimadzuDSC-50热分析仪进行PGE1、ALN-CD和其复合物的DSC。用覆盖超过进行研究的温度范围的各种标准品校准量热仪。将样品密封在铝盘中用于分析，空盘用作对照参考。在氮气流下以5。C/分钟的扫描速度记录热分析图。遽迎A^O蒌定^l^在、禪凌勿fnS"与^W-CD^逸合《合參用Bruker分光光度计(Billerica,MA)进行NMR测量。为了证明地塞米+>包含在ALN-CD孔腔中，将DSP(15.5mM)和ALN-CD(7.7mM-46mM)溶于重水由于少量DHO和H20，内参考为峰。在4mlH20溶液中研究地塞米松(15mg)或PGE1(7.5mg)和ALN-CD(100mg)或CD(73mg)复合物。用0.22pm注射器滤器过滤混悬液，然后将500mgHA加到滤液中。将混合物漩涡振荡至少10分钟，然后过滤并干燥，得到装载Dex或PGEl的HA。用1mlPBS(pH7.4,10mM)萃取100mg装载Dex或PGE1的HA样品10分钟，通过HPLC分析。将另外1mlPBS加入到装载Dex或PGE1的HA中并萃取IO分钟用于分析。检测地塞米松的条件如下色谱柱AgilentQs反相(4.6x250mm，5,);流动相乙腈-水(40:60，V/V)，流速为1ml/分钟;在240nm处UV4企测。检测PGE1的条件如下色i普柱Agilent(318反相(46x250mm,5fim);流动相乙腈陽O.OIMKH2P04(42:58,v/v)，流速为1ml/分钟；在205nm处UV^r测。潜^在HA结合研究中，含罗丹明B和罗丹明B修饰的CD的HA颜色在10次研究后消失。然而，含罗丹明B修饰的ALN-CD的颜色洗-CD成功地结合到HA表面。另外，与HA温育后的上清液中罗丹明B标记的ALN-CD的UV-可见光谱测定表明，在1分钟内几乎完全饱和，证明ALN-CD极快地与HA表面结合。地塞米松或PGE1的水溶液溶解度作为ALN-CD浓度的函数增加。；容解度图可依照Higuchi和Connors(Adv.Anal.Chem.Instrum.(1965)4:117-212)分类为A^型。两个图都是斜率小于1的直线，这可归因于在溶液中以1:1的化学计量形成复合物。用上述方程计算的表观1:1稳定常数Ke提供的地塞米松和PGEl与ALN-CD的值分别为2.57x103M"和4.78x103M"。ALN-CD与地塞米+>和PGEl的两种复合物的确定的1:1化学计量与先前报道的(3-CD与地塞米松的复合物(Shinoda等(1999)DrugDev.Ind.Pharm.,25:1185-1192)和HP-卩-CD与PGEl的复合物(Gu等(2005)Int.J.Pharm.,290:101-108)相似。关于DSC热分析图，PGEl在大约116。C显示特征吸热融合峰。ALN-CD热分析图在约80。C表现脱水过程。物理混合物ALN-CD和PGEl的DSC热分析图显示对应于纯ALN-CD和PGEl的峰，藉此说明缺乏化合物间的相互作用。在通过冻干获得复合物的情况下，116°C左右的吸热峰消失了，说明PGEl包含在ALN-CD孔腔中。NMR业已显示提供关于在溶液和固态中宾-主相互作用(化学计量、结合常数、复合过程能量和复合物结构)的几乎全部信息的能力(Chankvetadze等(1999)Ligand-cyclodextrincomplexes(酉己体-J不才胡4青纟晨合物).载于NMRSpectroscopyinDrugDevelopmentandAnalysis.Weinheim,Germany:Wiley國VCHVerlagGmbH，第155-174页)。该信息可主要用基于显示发生包合时的药物和CD质子的化学位移的]HNMR实验获得。此处^NMR用于鉴定DSP与ALN-CD在水中的相互作用。分析了随ALN-CD浓度(l:0-1:3mol/molDSP-ALN-CD)增加时DSP质子的化学位移变化。测定了诱导的DSP氢原子的化学位移变化，其信号作为ALN-CD浓度的函数未被ALN-CD信号所遮盖。负A(ppm;即在有和没有ALN-CD时DSP化学位移的差另'j)表明高磁场位移，正号表明低磁场位移。由包合到ALN-CD孔腔中产生的局部极性变化引起DSP质子的低磁场位移(Echezarreta-Lopez等(2002)J.Pharm.Sci.，91:1536-47)。CVH和d-H表现出高磁场位移，CrH质子表现出几乎没有化学位移变化，藉此表明这些质子接近环糊精环的边缘。与此相反，来自碳C20-CH3、Qs-CH3和C19-CH3WCu-H、C21-H、C7-H、C14-H、C15-H和曱基质子移向低磁场，表明它们的位置在环糊精孔腔里面。这些结果表示在复合物中质子方位如下B、C、D环质子位于ALN-CD孔腔里面。A环质子可与ALN-CD边缘互相作用，导致高磁场位移，但A环质子不位于ALN-CD孔腔里面，因为C4-H质子没有化学位移变化。ALN-CD/PGE1和ALN-CD/Dex复合物可通过双膦酸基团与HA强力结合。然而，预期对照CD/PGE1和CD/Dex复合物与HA只有非特异性结合。确实，体外释放研究证明，萃取时结合HA的ALN-CD/PGE1和ALN-CD/Dex复合物以比CD/PGE1和CD/Dex复合物慢许多的速率释放药物。因此，可例如通过力。入阿伦膦酸盐对CD进行化学修饰，而不会负面影响疏水孔腔和其与其它化合物复合的能力。实施例2:用阿伦膦酸环糊精进行体内研究为了测定递药系统的安全性，进行了毒性研究。将(3-环糊精(380mg/kg)、阿伦膦酸盐(IOOmg/kg,LD50剂量)和ALN-CD(500mg/kg)(摩尔比l:l:l)都静脉注射到BALB/c小鼠(每组3只，20g/小鼠)。除了ALN-CD组存活到麻醉处死时还没有任何明显副作用外，所有动物都在^^药后7天内死亡。评估在环糊精复合物中含(PGE,/ALN-CD)或不含(PGE"羟丙基(HP)-P-CD)靶向骨部分(阿伦膦酸盐(ALN))的骨合成代谢药前列腺素Ej(PGEO对下颌骨生长发育和炎症的影响。特别使用双侧大鼠下颌骨模型进行试验，对照样品在对侧进行。测试组包括l)一次注射PGE"ALN-CD(含0.75mgPGEJ,相比于2)PGE!/HP-(3-CD(含0.63mgPGE!)(n:6);3)移植包被PGE"ALN-CD(含有138.11figPGEQ的微粒羟磷灰石(BioOss,20mg),相比于4)包被PGE"HP-卩-CD(含有25.62昭PGE0的BioOss(20mg)(n=6);5)—次注射ALN-CD，相比于6)HP-(3-CD(n=4);7)—次注射PGE"ALN-CD(ALN-CD=20mg;含0.75mgPGE,),相比于8)ALN画CD(ALN-CD=20mg)(n=6);9)PGE!(0.75mgPGE,)/EtOH，相比于10)EtOH;ll)盐水，相比于12)未处理组；和13)阿伦膦酸盐(ALN，4.05mg),相比于14)盐水。在24天时麻醉处死大鼠，并在24天时进行组织形态测定评估。在这些研究中使用雌性SpragueDawley退役种鼠，因为其几乎不表现骨生长。注射PGEj/ALN-CD的位点与注射PGE"HP-P-CD的位点比较，新骨宽度增加值为0,53±0.08mm与0.14±0.08mm(p=0.0021),侧骨膜表面上造骨细胞百分比增加值为8.9%与0,4%(p=0.048)(表1和图3)。出乎意料之外的是，ALN-CD和HP-(3-CD位点比较也显示新骨宽度增加值为0.41±0.10mm与0.07±0.10mm(p=0.024)，造骨细胞百分比增加值为18.1%与7.3%(p=0.040)。注射PGE!/ALN-CD比PGE"HP-卩-CD具有更大的炎症浸润面积(4.13±0.58mm2与1.60±0.58mm2,p=0.003)，炎症浸润包含嗜中性粒细胞(达至8.1%,p=0.04)和淋巴细胞(达至2.2%,p=0.0006)的显著增加。其中PGE"ALN-CD和PGE"HP-P-CD吸附于羟磷灰石移植体(BioOss⑧)的组显示很少的骨生长，在试验侧和对照侧完全没有差别，这主要是由于微粒没有固定在下颌骨周围这一事实。无论如何，当移植体固定在下颌骨周围时，观察到有力的新骨生长(图4C和4D)。为了阐明在5)与6)对比中发现的ALN-CD的合成代谢作用，进行如下对比试验组7)对8);9)对10);ll)对12);和13)对14)。如表1中所示，很显然ALN-CD本身可引起蓬勃的新骨生长，甚至比其与PGEt的分子复合物更强。可忽略由直接PGEi注射引起的新骨生长。注射盐水或EtOH不能引起任何骨响应，这排除了在其它动物模型中引起骨生长的机械刺激(针与骨表面接触)的潜在影响。令人感兴趣的是，在大鼠下颌骨模型中注射阿伦膦酸盐引起适度的骨合成代谢作用。阿伦膦酸环糊精缀合物(ALN-CD)和仅含阿伦膦酸盐的盐水(ALN)之间的比较提示(表1),用等量ALN制剂，ALN-CD产生的新骨面积(l.l1+0.25mm2)比ALN(0.61+0.12mm^的更大。另夕卜，在ALN-CD动物中邻近注射制剂位置的新骨宽度(0.47+0.14mm)比ALN(0.14+0.05mm)中邻近注射制剂位置的新骨宽度大(表1)。用50pi的400mg/mLALN-CD溶液或50pl的81mg/mlALN溶液注射大鼠。在6个例子中就有6个ALN-CD导致的新骨明显地沉积在作为注射位点的下颌骨的侧表面。与此形成对照，在8个例子中仅有5个^J合予ALN在该区域显示新骨。在8个例子中有8个ALN还在下颌骨的其它远端区域(例如中间表面)产生新骨。明显地ALN-CD不在该区域引起骨形成。这些资料共同指出，阿伦膦酸盐-环糊精缀合物(ALN-CD)显示极强的局部化骨合成代谢作用，且机理不依赖阿伦膦酸盐和PGE!的生物学作用。这一特点使得可以用注射ALN-CD来修复单独的骨缺损，例如牙周病和普通骨折中发现的骨缺损。同样有望治疗系统性骨缺损例如骨质疏松症。其在给药中的组织特异性将降低所需药物剂量和潜在的有害的副作用。以下以表格形式提供在大鼠下颌骨中骨形成的概要。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>ALN-CD0.78±0.100.36±0.070.18±0.03CD0.25±0.080.05±0.020.19±0.11P0.0030扁2NSALN-CD/PGEi0.66±0.150.23±0.050.26±0.13ALN-CD1.11±0.250.47±0.140.37±0.14P0.020.008NSALN0.61±0.120.14±0.050.24±0.11盐水0.008±0.00800.02±0.02P0.00040.060.005实施例3:多功能PEG与其它的水溶性生物相容性聚合物例如N-(2-羟丙基)曱基丙烯酰胺(HPMA)共聚物(Kopecek等(2000)Eur.J.Pharm.Biopharm.，50:61-81)和聚谷氨酸(PGA;Li,C.(2002)Adv.DrugDeliv.Rev.,54:695-713)比较，PEG的功能性限于其两个链末端，而不管其分子量大小。为了克服这一限制，采用几种方法以合成线性多功能PEG(Nathan等(1994)Bioact.Compat.Polym.，9:239-251;Pechar等(2000)BioconjugateChem"11:131-139;Cheng等(2003)BioconjugateChem.,14:1007-1017;Kumar等(2004)J.Am.Chem.Soc.,126:10640-10644)。迄今业已开发出来的方法，全部涉及多个反应步骤。得到的产物的产率和分子量相对低。本文所述是用铜(I)-催化的Huisgen1，3-偶极环加成反应("点击"反应)合成线性多功能PEG的新颖而又简单的方法。为了达到简单而又高效合成线性多功能PEG,合成策略的设计如图5所示。用炔丙胺l务饰PEG(MW=2000)二醇。然后通过2,2-双(叠氮甲基)丙烷-l,3-二醇连接乙炔基封端的PEG,Cu(I)作为催化剂。由于在用2,2-双(叠氮曱基)丙烷-1,3-二醇的"点击"反应中已经观察到自我催化反应(Rodionov等(2005)Angew.Chem.Int.Ed"44:2210-2215)，这种"点击"聚合非常有效。2,2-双(叠氮曱基)-丙烷-l，3-二醇的两个羟基会将侧链官能团引入到得到的线性PEG。更详细的化学合成在实施例4中提供。制备线性多功能PEG的一个关键步骤是将两个羟基末端100%转化为乙炔(图5)。具单-乙炔官能团的PEG不可避免地担当聚合物链终结者，导致低分子量产物。为了激活PEG二醇2000中的羟基，首先用光气(20y。曱苯溶液)处理干PEG。在除去过量光气后，引入炔丙胺。然后在除去炔丙胺盐酸盐后经由沉淀获得乙炔基封端的PEG2000。为了完全除去残留炔丙胺，用LH-20柱进一步纯化PEG产物。如图6A中所示通过^NMR分析确证经修饰的PEG的结构。市购2,2-双-(溴曱基)丙烷-1,3-二醇可含有三溴化物和四溴化物。因此，在2,2-双(叠氮曱基)丙烷-1，3-二醇合成中可产生三叠氮化物和四叠氮化物。在"点击"聚合中，这样的三-和四-功能接头将导致形成交联聚合物网络而不是线性聚合物。为了避免这一点，通过在曱苯和水中重复重结晶纯化2,2-双-(溴曱基)丙烷-1,3-二醇。其纯度通过GC-MS确证。然后在DMF中用叠氮钠实施2,2-双-(溴曱基)-丙烷-1,3-二醇的叠氮化(图5)。于室温在H20中进行乙炔基封端的PEG2000(10mM)与2,2-双(叠氮甲基)丙烷-l,3-二醇(10mM)的"点击"聚合，因为该反应在水中特别有效(Rostovtsev等(2002)Angew,Chem.Int.Ed.，41:2596-2599;Bock等(2006)Eur.J.Org.Chem.，51-68)。用CuS04'5H20和抗坏血酸钠(各1.25mM)原位产生作为催化剂的活性Cu(I)(Rodionov等(2005)Angew.Chem.Int.Ed.，44:2210-2215)。在10分钟内聚合作用以凝胶化作用结束。当催化剂浓度进一步降到0.1mM时，过夜发生凝胶化。不受理论的束缚，对"点击"聚合中观察到的凝胶化的两个可能的解释如下。首先，因为"点击"反应涉及具有自我催化作用的2,2-双(叠氮曱基)丙烷-l,3-二醇(Rodionov等(2005)Angew.Chem.Int.Ed"44:2210-2215),在形成高分子量PEG时聚合作用可能很高效，藉此导致凝胶化。其次，既然三唑是良好的电子供体，新形成的三唑对就可能与Cu(I)相互作用，在聚合过程中形成物理交联。为了探索第二种可能性的潜力，用EDTA溶液(IOOmM)充分洗涤该凝胶体，且经24小时未观察到凝胶溶解。这排除了Cu(I)交联聚合物网络的可能性。因此，可通过高效率的反应和形成极高分子量PEG来解释在"点击"聚合中观察到的快速凝胶化。为了控制分子量和避免凝胶化，将炔丙胺(乙炔基封端的PEG:炔丙胺=9.5:l)加入到反应物中作为链终结者(Odian,G.(2004)PrinciplesofPolymerization(聚合作用原理)，第4版，Wiley-Interscience，NewJersey,第74-80页)。在这些条件下获得聚合物溶液。聚合物(透析后)的^NMR分析显示三唑质子为7.97ppm(峰f)，来自侧链二醇结构的亚曱基质子为3.34ppm(峰d)和4.39ppm(峰e)。另夕卜，"点击，，聚合后邻近氨基曱酸盐结构的-CH2-从3,89ppm[峰b(A)]位移到4.48ppm[峰b(B)](图6)。这些清楚地确证在每一PEG2000片段之间形成连键。产物的分子排阻色谱法(SEC)分析(图7)表明得到的聚合物(点击PEG)具高分子量和高多分散性。少量未反应的乙炔基封端的PEG^00在SEC图中也很明显(图7，箭头)。总之，在极为温和的条件下，于水中通过Huisgen1，3-偶极环加成反应从简单的结构单元业已合成线性多功能的高分子量PEG。该反应简单高效。可控制聚合物的分子量和多分散性。成功地将侧链二醇基引入到线性PEG，其可用于直接将含酮(或醛)的药物经由pH-敏感的乙缩醛结构缀合到聚合物。因为"点击"反应不干扰其它的官能团，所以还可引入另外的侧链结构，例如-COOH和-NH2。功能聚合物(例如聚-N-异丙基丙烯酰胺、聚赖氨酸或聚丙烯酸)短片段也可与PEG共聚合，产生具独特生物学和物理化学特性的共聚物。本发明"点击"聚合提供了独特的机会以开发新型聚合物和功能聚合缀合物用于多种生物医学应用。实施例4:多功能PEG的化学合成以下为本发明合成多功能PEG的例示性方案。/辦聚乙二醇(MW=2000)购自Sigma(St.Louis,MO)。2，2-双-(溴曱基)丙烷-1，3-二醇和光气曱苯溶液(20%)购自Aldrich(Milwaukee,WI)。LH-20树脂和PD-10柱来自GEHealthCare(Piscataway,NJ)。炔丙胺、叠氮钠、抗坏血酸钠和硫S臾铜购自Acros(MomsPlains,NJ)。所有溶剂都购自FisherScientific(Pittsburgh,PA)或ACROS。在500MHzNMR分光光度计(Varian,PaloAlto,CA)上记录^NMR光谱。通过分子排阻色谱法(SEC)用配有UV和RI(Knauer;Berlin,Germany)检测器的AKTAFPLC系统(GEHealthCare)测定共聚物的重均分子量(MW)和数均分子量(Mn)。在Superose6柱(HR10130)上用PBS(pH=7.3)作为洗脱液实施SEC测量。气(roc/》炎话,乙二寧(P五q;让3g干燥的聚乙二醇溶于圆底烧瓶中的10ml曱苯(l.5mmol)中。搅拌下向烧瓶中加入过量光气(12-15ml光气溶液(20%曱苯溶液)；5mmo1)。在密闭的通风橱中使反应过夜进行。在旋转蒸发仪上除去过量光气。乙#差封端的#乙二寧w合4在除去过量光气后向上述实验反应产物中加入炔丙胺(6mmol,0.33g,384.0piL)。使反应继续进行7-8小时。将产物沉淀于二乙基醚。沉淀后通过离心从有机层分离。粗产物产率为95%。通过透析(MWCO2k)进一步纯化产物，并通过NMR和MALDI-TOF确证产物结构。或者，将PEG二醇2000(10g，[-OH]=10mmol)溶于无水曱苯中，回流，真空下干燥以除去水。然后将光气溶液(15ml，20。/。的曱苯溶液)搅拌下加入到干燥的PEG中。使反应在通风橱中过夜进行。真空中除去过量光气。用DCM(20ml)溶解粘性残留物。然后将炔丙胺(1.65g,30mmol)加入到该溶液中。使反应在室温进行7-8小时。将产物沉淀到二乙基醚中3次，通过LH-20柱纯化。产率83.3%。'HNMR(D20,500MHz):S(ppm)=4.23(t,PEG,-CH2-)，3.89(4炔丙基酰胺，-CH2-)，3.68(m,PEG,-CH2-)。为了确认PEG二醇100%衍生为乙炔基封端的PEG,还通过^NMR(CDC13,500MHz)分析产物。未检测到-OH信号(5=2.63ppm)。么2-欢-d扇f4)-丙處-人3-二寧W合成向50ml圓底烧瓶中加入5g2，2-双-(溴曱基)-丙烷-l,3-二醇。将3g叠氮钠加入含作为反应溶剂的10mlDMSO的烧瓶中。在IO(TC将反应物加热36小时。然后冷却反应物，加入水和盐水。用乙酸乙酯萃取该混合物5次，用盐水洗涤合并的有机相，经无水硫酸镁干燥。过滤并浓缩终产物。得到的产物为黄色油状液体，产率为90%。用NMR确证其结构。或者，将2,2-双-(溴曱基)丙烷-l,3-二醇(4g，15mmo1，从曱苯和水重结晶)溶于DMF(30ml)。然后将NaN"4g，62mmol)悬浮于该溶液中。在120。C将该混合物搅拌过夜，过滤以除去NaN3和NaBr。除去DMF后，将二氯曱烷(DCM,20ml)加入到残留物中。过滤掉得到的沉淀物，将滤液蒸发至干。让残留物经受标准的二乙基醚/水性NaCl萃取。用Na2S04干燥有机相，并蒸发至干。然后通过硅胶柱(氯仿/曱醇=20/1)进一步纯化该粗产物。产率75.2%。'HNMR(CDCl3,500MHz):3(ppm)=3.61(s，4H)，3.41(s,4H)，2.75(br,2H)。么2-双-(^f成f差」-丙處-^U-二寧和乙炎《封^W尸五G之河W^去^将200mgPEG乙炔(0.092mmol)在安瓿中溶于最小量的水(1.8ml)中。将20.0mg(0.1mmol)2，2-双-(叠氮甲基)-丙烷-l,3-二醇加入上述溶液中。随后将8mg(0.06mmol)硫酸铜加入到该溶液中。将20mg(0.10mmol)抗坏血酸钠加入到最少量的水中，然后将该溶液逐滴加入到安瓿中的溶液中。在约6分钟内，聚合溶液变得极为粘稠，说明形成了高分子量聚合物。为了完成该反应，将氮通入反应容器几分钟，然后密封。使反应在80-90。C进行24小时。进行FPLC以检测高分子量多功能PEG，与初始PEG(2k)比较。或者，将乙炔基封端的PEG2000(205.2mg，95)imol)、2,2-双(叠氮曱基)丙烷-1,3-二醇(18,6mg，100,ol)、炔丙胺(0.55mg，10,ol)和CuS04.5H20(3.13mg,12.5pmol)搅拌下溶于H20(8ml)中。然后将含抗坏血酸钠(25mg，125iimol)的H20(2ml)逐滴加入到该溶液中。于室温将反应溶液搅拌4小时。在SEC分析前，通过PD-10柱从得到的聚合物样品中除去未反应的低分子量试剂。为了大规模纯化和除去未反应的PEG2000，将EDTA加入到聚合物溶液中，并对H20透析2天。透析管的分子量截值为12kDa球蛋白。透析后，将纯化的聚合物产物冻干，并通过^NMR分析。产率66.9%。NMR(D20,500MHz):5(ppm)=7.97[s,三唑，-CH]，4,48[s,三唑-012-酰胺，-CH2-]，4.39[s,2,2-双(三唑曱基)丙烷-1,3-二醇，-CH2-]，4.21[t,PEG，-CHr],3.68[m,PEG，-CH2-]，3.34[s,2,2-双(三唑曱基)丙烷-1，3-二醇，-CH2-]。在又一备选方案中，没有链终结者炔丙胺可产生经修饰的PEG。将乙炔基封端的PEG2000(21.6mg，10|imol)、2,2-双(叠氮曱基)丙烷-1,3-二醇(1.9mg，10pmol)和CuS04.5H20(0.31mg，1.25iamol)搅拌下溶于H20(0.8ml)中。然后将抗坏血酸钠(2.5mg,12.5(xmol)的H20(0.2ml)逐滴加入该溶液中。1小时内发生凝胶化。/秀參绥合參W合成可于室温在对曱苯磺酸或三曱基氯硅烷的曱醇溶液存在下让地塞米松与多功能共聚物反应(Chan等(1983)Synthesis3:203-205)。这将导致在19位形成乙缩醛^:。作为第二种方法，可让dex首先与2，2-双-(叠氮曱基)-丙烷-1,3-二醇缀合。然后可让得到的二叠氮化物与乙炔修饰的PEG反应形成共聚物-DEX缀合物。可通过分子排阻色谱(SEC)用配有UV和RI(Knauer)才企测器的AKTAFPLC系统(GEHealthcare)测定聚合缀合物的平均分子量。可在Superdex75或Superose6柱(HR10/30)上用PBS(pH=7.3)作为洗脱液进行SEC测量。可用PEG均聚物标准校准计算缀合物的平均分子量。在用LH-20柱分馏(x2)纯化缀合物以从缀合物中除去任何游离的Dex后，可让其在pH5.0、6.0和7.4的等渗緩沖系统中于4、25和37°C孵育2周时间。可用AgilentHPLC系统(二极管阵列UV/可见检测器，240nm;AgilentC18柱，4.6x150mm，5pm;流动相乙腈/水=50%/50%;流速0.5ml/分钟；进样量10pl)用验证过的方案监测游离Dex的释放。可用大鼠模型比较Dex缀合物与游离Dex的功效(Wang等(2004)Pharm.Res.,21:1741-1749)。可用不同PEG-Dex缀合物测试最佳治疗条件。在治疗研究中，可测量关节炎关节的体积和炎症指数。还可实施骨矿物质密度终点、骨侵蚀表面和组织病理学分析。为了证明递药系统的全部治疗潜力，可将这些结果与用游离Dex和溶纟!某治疗的对照比较。可以不同剂量方案将游离Dex和Dex-PEG共聚缀合物给予健康雄性Lewis大鼠。在实验结束时，可分析体重、大小、骨形成速率、矿物质密度和其它的骨组织形态学参数，以查看副作用。可分离、称重其它的软组织(肾上腺、脾脏、胸腺、肝)，并进行组织学分析。为了证明新型递药系统的优越的安全性，可将这些结果与用溶i某治疗的对照组结果进行比较。尽管上面已经阐述并明确例示本发明某些优选实施方案，但并非意欲将本发明限于这样的实施方案中。如以下权利要求所提出，可进行不偏离本发明的范围和精神的各种修改。权利要求1.式T-X-CD化合物，其中X为接头域，T为靶向骨的部分，CD为环糊精。2.权利要求l的化合物，其中所述靶向骨的部分选自双膦酸盐、阿伦膦酸盐、四环素、唾液酸、丙二酸、N，N-二羧甲胺、4-氨基水杨酸、4-氨基水杨酸、抗体、抗体片段和包含选自D-谷氨酸、L-谷氨酸、D-天冬氨酸和L-天冬氨酸的约2-约100个残基的肽。3.权利要求2的化合物，其中所述靶向骨的部分为阿伦膦酸盐。4.权利要求l的化合物，其中所述环糊精选自a-CD、(3-CD、Y-CD、p-CD、二曱基-(3-CD、羧甲基-乙基-P-CD、磺丁基-乙基-(3-CD和羟丙基-P-环糊精。5.权利要求4的化合物，其中所述环糊精为羟丙基-P-环糊精。6.权利要求1的化合物，其中每一个环糊精连接不止一个靶向骨的部分。7.权利要求l的化合物，其中所述接头域选自键、烷基、烯基、芳基和多肽。8.包含权利要求1的化合物和至少一种药学可接受载体的组合物。9.权利要求8的组合物，其进一步包含至少一种骨相关治疗药物。10.权利要求9的组合物，其中所述至少一种骨相关治疗药物复合于所述化合物的环糊精疏水孔腔中。11.预防或治疗有需要的受试者的骨病和骨病相关病症或并发症的方法，该方法包括给予所述患者权利要求8的组合物。12.权利要求ll的方法，其中所述骨病症选自骨质疏松症、骨质减少症、骨折、骨裂、帕哲氏病(畸形性骨炎)、骨退化、骨弱化、骨骼变形、低骨矿物质密度、脊柱侧凸、骨质软化症、骨髓炎、成骨不全、骨硬化症、内生软骨瘤、骨软骨瘤病、软骨发育不全、牙槽骨缺损、脊推骨压迫、脊髓损伤后骨丢失、缺血坏死、纤维发育不良、牙周病、曱状旁腺功能亢进症(嚢性纤维性骨炎)、磷酸酶过少症、进行性骨化性纤维发育不良和骨疼和骨炎。13.权利要求ll的方法，其中所述组合物系统给予。14.权利要求11的方法，其中所述组合物局部给予。15.权利要求11的方法，其中所述组合物通过注射给予。16.用于合成多功能聚(乙二醇)(PEG)的方法，该方法包括a)提供PEG,其中所述PEG末端包含能够参与点击化学反应的第一官能团；b)在允许点击化学反应进行的条件下，让步骤a)的所述PEG与包含能够与所述第一官能团一起参与点击化学反应的互补第二官能团的化合物接触；和c)分离得到的多功能PEG。17.权利要求16的方法，其中所述点击化学反应为环加成反应。18.权利要求17的方法，其中所述环加成反应为1,3-偶极环加成反应。19.权利要求16的方法，其中所述第一官能团为叠氮化物，所述第二官能团为炔，或其中所述第一官能团为炔，所述第二官能团为叠氮化物。20.权利要求16的方法，其中步骤b)所述化合物为2,2-双-(叠氮曱基)-丙烷-l，3-二醇，所述第一官能团为乙炔。21.通过权利要求16的方法产生的多功能PEG。22.式(I)的权利要求21的多功能PEG。23.与至少一种治疗化合物缀合的权利要求21的多功能PEG。24.包含权利要求21的多功能PEG和至少一种药物载体的组合物。25.权利要求24的组合物，进一步包含至少一种治疗药物。26.治疗关节炎的方法，该方法包括给予权利要求24的组合物。全文摘要本发明提供药物载体、其合成方法及其使用方法。文档编号A61K47/40GK101541347SQ200780036529公开日2009年9月23日申请日期2007年8月2日优先权日2006年8月2日发明者D·王,R·A·赖因哈德特,X·-M·刘申请人:内布拉斯加大学评议会