专利名称：可注射原位交联水凝胶及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水凝胶，尤其涉及一种可注射原位双硫键交联水凝胶，此外本发明还涉及该可注射原位交联水凝胶的制备方法及其在医药或外科手术中的用途。
背景技术：
水凝胶是最常见也是最为重要的一种含有大量水但不溶于水的物质，它在水中可以吸收超出自重达几百倍的水仍能保持其形状。绝大多数的生物、植物内存在的天然凝胶以及许多化学合成的凝胶均属于水凝胶。高分子凝胶是一类常见的水凝胶，其结构是高分子之间组成的三维交联网络，其网络由高分子主链及侧链上有亲水(极性)基团和疏水性基团，或(和)有解离基团组成，溶剂被固定在分子网络中。高分子凝胶的交联网络点，可以是由共价键组成化学交联，也可以是物理交联，如静电作用、氢键作用、疏水作用等等。
水凝胶，尤其是以细胞间质基质材料制备的高分子水凝胶，在生物医药领域具有非常广泛的应用。与合成材料制备的水凝胶相比，以细胞间质基质制备的水凝胶具有很多优点如可以模拟生物体内的天然环境、很高的含水量、良好的通透性、更好的生物相容性、以及可调节的酶降解性能等等(Silva等，Curr Top Dev Biol，64，181，2004；Drury等，Biomaterials，24，4337，2003)。更重要的是，细胞间质基质可具有生物诱导作用，可以定向和诱导组织的特异性修复。例如透明质酸钠是一种天然细胞间质基质高分子，具有管理细胞粘附和迁移、调节细胞分裂和分化等生物学功能。高分子量的透明质酸钠可以诱导鸡胚胎肢干骨髓干细胞分化为软骨细胞(Kujawa等，Develop Biol，114，519，1986)。因此以细胞间质基质制备的水凝胶在生物医药(尤其是组织工程)领域得到了越来越多的重视。
虽然水凝胶具有很多优点，然而使用方式却在相当程度上限制了水凝胶在生物医药领域的广泛应用。目前很多水凝胶医药产品都被制备成薄膜、多孔海绵等形式，如明胶海绵、胶原海绵等等。通常这些产品只能外用或结合开放式手术使用。然而随着医学技术的发展，越来越多的医生和病人倾向于微创手术，希望医药产品也可以通过内窥镜方式的使用，这对生物医药产品的开发提出了新的挑战。
可注射的水凝胶医药产品可以通过内窥镜的方式使用，也可以结合微创手术使用，同时适合于任何复杂形状的三维伤口，可以很好地粘附于创面，在生物医药领域具有广泛的应用前景。例如多种以透明质酸钠为原料制备的可注射交联水凝胶，目前作为新一代的除皱填料，克服了胶原类除皱填料的免疫原性风险，在美容方面得到了广泛的应用。Restylane(Q-Med，瑞典)，Hylaform(Inamed Corporation，美国)，Juvederm(Leaderm，法国)，Belotero(Anteis，瑞士)，Puragen(Mentor Corporation，美国)均已在欧洲上市(其中Restylane和Hylaform还通过了美国FDA的审批)，是这一类新一代除皱填料的代表性产品。
目前大多数水凝胶类生物医药产品的制备方法都采用先进行化学交联、然后纯化除去残余交联剂和副产物的工艺。然而化学交联剂通常有较大的毒副作用，即使是复杂的工艺也难以保证彻底除去残余交联剂。更为严重的是，对于部分官能团发生交联反应的残余交联剂，已经通过共价键固定在水凝胶中，无法除去。这些残余的交联剂可能在在临床使用上引起发炎等毒副症状。例如，明胶海绵中微量的残余交联剂引起了生物体较为严重的炎症反应。前述的多种以透明质酸钠为原料制备的可注射交联水凝胶也均采用先交联后纯化的制备工艺。例如，Restylane和Hylaform分别通过1、4-丁二醇二环氧丙醚和二乙烯基亚砜与透明质酸钠羟基之间的化学反应制备(Malson等，EP0185070，1985；Balazs等，US 4582865，1986；Balazs等，US 4713448，1987)；然而残余的1、4-丁二醇二环氧丙醚和二乙烯基亚砜很难从水凝胶中彻底除去，同时单端反应的1、4-丁二醇二环氧丙醚或二乙烯基亚砜已经通过共价键固定在水凝胶中，无法除去。上述的局限性不仅需要复杂的纯化工艺，同时还导致了临床使用的风险。
双硫键交联水凝胶近年来得到了一定的研究。双硫键是一种可逆的化学键，自由巯基可以氧化成双硫键，双硫键可以还原为自由巯基。例如双硫键交联的水凝胶目前已被用作细胞培养基质，加入细胞相容的双硫键还原剂即可非常方便地收集细胞。
氧化剂(如过氧化氢、碘、烷基过氧化物，过氧酸，二甲基亚砜，Fe3+，Co3+，Ce4+等)可以把巯基氧化成双硫键(Capozzi G.；Modena G.，In The Chemistry of the ThiolGroup Part II；Patai S.Ed.；WileyNewYork，1974；pp785-839)。然而这些氧化剂通常有一定的毒副作用，如果残留在医药产品中会有较大的风险；同时这些氧化剂的氧化能力很强，反应过于激烈，会把双硫键进一步氧化为磺酸根等副产物(Shu等，Biomacromolecules，3，1304，2002；Capozzi等，The Chemistry ofthe Thiol Group PartII，785，1974)。
氧气也可以把自由巯基氧化成双硫键。一分子氧气可以把四个巯基氧化成两个双硫键，同时产生两分子水，没有其它副产物。采用氧气作为氧化剂制备双硫键交联水凝胶，具有反应条件简单温和、不需要交联剂等许多优点。采用氧气作为交联剂制备双硫键交联水凝胶有望解决前述水凝胶制备工艺中交联剂残余的局限性。
双硫键交联水凝胶在生物医药领域具有很多潜在的应用前景，近年来受到了很多的关注。但到目前为止，尚未见临床实用报道，原因主要有两个方面。第一个原因是当前双硫键交联水凝胶的制备工艺不利于工业化生产。在生理条件下氧气把巯基氧化形成双硫键交联水凝胶是一个缓慢的过程，需要不断地消耗大量的氧气，研究人员普遍认为溶液敞口接触空气是形成双硫键交联凝胶的前提条件。在目前已公开的报道中，含有巯基的生物相容高分子溶液都需要敞口放置接触空气才能形成双硫键交联凝胶。例如透明质酸钠巯基化衍生物溶液可以在与空气敞口接触的条件下形成双硫键交联凝胶，干燥后可得到双硫键交联的薄膜(Shu等，Biomacromolecules，3，1304，2002)；透明质酸钠巯基化衍生物和胶原蛋白巯基化衍生物的混合溶液可以在与空气敞口接触的条件下形成双硫键交联凝胶，常温干燥或冷冻干燥后即可得到双硫键交联的薄膜或多孔海绵(Shu等，Biomaterials，24，3825，2003；Liu等，Journal of BiomedicalMaterials Research，68，142，2004；)。第二个限制双硫键交联水凝胶进入临床实用的原因是产品的形式。目前所报道的双硫键交联凝胶大都以薄膜或海绵的形式出现，只能外用或结合开放式手术适用，不能满足很多临床治疗(尤其是微创手术)的需求。
到目前为止，研究人员普遍具有一种技术偏见含有巯基的生物相容高分子溶液需要敞口接触空气才能形成双硫键交联水凝胶(Shu等，Biomaterials，24，3825，2003；Liu等，Journal of Biomedical Materials Research，68，142，2004；George等，PCT Int.Appl.WO 2008/098019；Wallace等，US6624245)，这在很大程度上限制了双硫键交联水凝胶的工业化大规模生产工艺。到目前为止还没有在密封的可注射容器内形成双硫键交联水凝胶的报道，而这种可注射的双硫键交联水凝胶在生物医药领域具有非常广泛的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种可注射原位双硫键交联水凝胶，其凝胶化过程在注射器内完成，具有可注射的性能，使用方便、不含杂质、生物相容性好、无毒副作用，在生物医药领域具有非常广泛的应用前景。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种可注射原位双硫键交联水凝胶的制备方法，该方法克服了双硫键交联水凝胶的制备需要与空气敞口接触的技术偏见，解决了大规模工业化生产的技术难题，制备工艺简单。
本发明要解决的技术问题之三是提供一种可注射原位双硫键交联水凝胶在医药或外科手术中的用途。
在本发明的一方面，提供了一种可注射原位双硫键交联水凝胶的制备方法，包括以下步骤 (1)交联活性溶液灌入可注射容器，其中交联活性溶液中至少含有一种侧链带有两个以上巯基的生物相容高分子； (2)密封含有交联活性溶液的可注射容器； (3)在密封的可注射容器内交联活性溶液中的溶解氧把巯基氧化成双硫键形成交联水凝胶。
该方法特征是采用交联活性溶液中的溶解氧在密封的可注射容器内把巯基氧化形成原位双硫键交联水凝胶。同时可以方便地通过控制温度、氧气分压或接触时间等参数灵活调节交联活性溶液中的溶解氧浓度，从而调节双硫键交联过程和双硫键交联水凝胶的性能。
在本发明中所使用的部分术语定义如下所述。
水凝胶是指含有大量水的具有三维交联网络结构的物质，介于液态和固态之间，没有流动性；凝胶化是指从具有流动性的液态到失去流动性的凝胶态的过程，凝胶化时间是指从具有流动性的液态到失去流动性的凝胶态的时间。
在本发明中，交联活性溶液是指含有至少一种侧链带有两个以上巯基的生物相容高分子的溶液。交联活性溶液以水为主要溶剂，也可含有一些盐成份(如氯化钠、pH缓冲盐成份等)，起调节溶液渗透压和稳定溶液pH值等功能；也可能含有其它一些极性、水溶性成份，如乙醇等等。
在本发明中，侧链带有两个以上巯基的生物相容高分子主要是指多糖、蛋白或合成高分子通过一种或一种以上化学改性得到的衍生物，其中至少一种化学改性是巯基化改性。
多糖包括硫酸软骨素、肝素、类肝素、海藻酸、透明质酸、皮肤素、硫酸皮肤素、果胶、羧甲基纤维素、壳聚糖等以及它们的盐形式(如钠盐，钾盐等)；蛋白包括胶原、碱性明胶蛋白、酸性明胶蛋白、碱性基因重组明胶蛋白、酸性基因重组明胶蛋白等；合成高分子包括聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚酒石酸、聚谷氨酸、聚富马酸等以及它们的盐形式(如钠盐，钾盐等)。上述硫酸软骨素包括A型、B型、C型等各种形式。所述的多糖、蛋白和合成高分子的分子量通常在1,000～10,000,000之间。上述的合成高分子不包括的聚乙二醇。
化学改性方式包括疏水化改性(如烷基化改性等)、羧基化改性(如羧甲基化改性等)、巯基化改性等。
巯基化改性是指引入自由巯基的化学改性过程，通常多糖、蛋白和合成高分子的侧链基团(羧基、氨基、羟基等)可以通过适当的化学反应引入自由巯基。一种常见的巯基化改性主要包括下述化学反应过程多糖、蛋白和合成高分子的侧链羧基在碳化二亚胺的活化下，和含有双硫键的二氨或二酰肼反应生成中间产物，然后把双硫键还原为自由巯基(Shu等，Biomacromolecules，3，1304，2002；Aeschlimann等，US 7196180；Prestwich等，PCT Int.Appl.WO 2004/037164)。也可用巯基保护的伯氨代替含有双硫键的二氨或二酰肼，所得到的中间产物脱除巯基保护基团即可得到生物相容高分子巯基化衍生物(Gianolio等，Bioconjugate Chemistry，16，1512，2005)。很多侧链含有羧基的多糖、蛋白和合成高分子都可以通过这种方法得到侧链带有两个以上巯基的衍生物，如透明质酸钠巯基化衍生物、硫酸软骨素巯基化衍生物、明胶巯基化衍生物等等(Shu等，Biomacromolecules，3，1304，2002；Aeschlimann等，US 7196180)。羧基直接与含有双硫键的碳化二亚胺(如2，2’-二硫代双(N-乙基(N’-乙基碳二亚胺))等)反应、双硫键还原后也可以得到侧链带有两个以上巯基的衍生物(Bulpitt等，US 6884788)。
另一种常见的巯基化改性是多糖、蛋白和合成高分子的侧链氨基的直接或间接化学改性。例如，胶原等蛋白的侧链氨基可以与含有双硫键的活化物(如双丁二酸双酰胱胺双羰二咪唑活化酯等)反应，还原双硫键为自由巯基，即可实现巯基化改性(Benesch等，Proc Natl Acad Sci USA，44，848，1958；Yamauchi等，Biomaterials，22，855，2001；Nicolas等，Biomaterials，8，807，1997；Kafedjiiski等，Biomaterials，26，819，2005)。多糖、蛋白和合成高分子侧链氨基的巯基化也可以通过间接方式实现，例如氨基首先羧基化，然后通过羧基的改性实现巯基化(宋等，CN101200504)。
多糖、蛋白和合成高分子的侧链羟基的巯基化改性也是一种常见的方式。例如纤维素、透明质酸、甲壳素和壳聚糖等多糖的侧链羟基在强碱条件下都可以进行羧基化，然后通过前述方法实现羧基的巯基化改性。Carbylan-S既是通过这种方式制备的透明质酸钠的巯基化衍生物(Prestwich等，PCT Int.Appl.WO 2005/056608)。侧链羟基也可以通过直接的化学反应实现巯基化，如聚乙烯醇的巯基化改性衍生物等(Ossipov等，Maxromolecules，41，3971，2008)。
在本发明中，侧链含有两个以上巯基的生物相容高分子也可以通过基因工程发酵等方式制备。在基因工程中，可以按照理论设定的分子结构，通过控制基因的表达片断，采用发酵工程生产侧链含有两个以上巯基的生物相容高分子(Lutolf等，NatureBiotechnology，23，47，2005)。
在本发明中，侧链含有两个以上巯基的透明质酸钠巯基化衍生物、硫酸软骨素巯基化衍生物、肝素巯基化衍生物、壳聚糖巯基化衍生物、明胶巯基化衍生物、胶原巯基化衍生物等均可方便地通过本发明方法制备出可注射凝胶。
在本发明中，交联活性溶液中可以含有一种侧链带有两个以上巯基的生物相容高分子，也可以含有两种或两种以上侧链含有两个以上巯基的生物相容高分子。例如按照不同的应用要求，交联活性溶液中可以任意含有透明质酸钠巯基化衍生物、硫酸软骨素巯基化衍生物、肝素巯基化衍生物、明胶巯基化衍生物、胶原巯基化衍生物、壳聚糖巯基化衍生物中的一种或多种。
在本发明中，交联活性溶液中除了至少含有一种侧链带有两个以上巯基的生物相容高分子外，还可以含有一种或多种其它物质。这些物质可以是多糖、蛋白或高分子化合物，如透明质酸钠、硫酸软骨素、肝素钠、酸性明胶蛋白、碱性明胶蛋白、基因重组明胶蛋白、聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚酒石酸、聚谷氨酸、聚富马酸等等；也可以是活性药物组份，包括类固醇、抗生物以及治疗肿瘤的药物，例如各种蛋白质药物，如各种生长因子(碱性生长因子、酸性生长因子、血管生长因子、成骨生长因子等)、核酸(如RNA等)等；又如各种小分子药物(抗生素、皮质激素等)等等。该活性药物组份可以固体颗粒形式分散在交联活性溶液中，也可以溶解在交联活性溶液中。
巯基是在生物体内天然存在的具有良好生物相容性的官能团，它具有很好的反应活性；双硫键是一种可逆的化学键。自由巯基可以氧化成双硫键，双硫键可以还原为自由巯基，这在生物学上具有重要的功能。双硫键交联的水凝胶在生物医药领域具有重要的应用前景，如可以用于促进创伤愈合、细胞培养载体、组织的修复再生等等。
氧气是一种温和的天然生物相容氧化剂，广泛存在人体的各个生理过程中。氧气也可以把自由巯基氧化成双硫键。一分子氧气可以把四个巯基氧化成两个双硫键，同时产生两分子水，没有其它副产物。本发明中采用氧气作为氧化剂，具有反应条件简单温和、不需要交联剂等许多优点。
对于以氧气作为氧化剂的双硫键交联水凝胶，研究人员普遍具有一种技术偏见含有巯基的生物相容高分子溶液需要敞口接触空气才能形成双硫键交联水凝胶(Shu等，Biomaterials，24，3825，2003；Liu等，Journal of Biomedical Materials Research，68，142，2004；George等，PCT Int.Appl.WO 2008/098019；Wallace等，US6,624,245)。我们对双硫键交联的凝胶化过程进行了深入研究，结果表明主要是溶液中的溶解氧而不是空气中的氧气把巯基氧化为双硫键交联。这个发现给双硫键交联水凝胶的制备方法提供了新的思路，为大规模工业化生产工艺的研制提供了可能。
到目前为止还没有在密闭的条件下利用溶液中溶解氧形成双硫键交联水凝胶的研究报道。上述研究结果给我们指出了一个新的方向交联活性溶液也有可能在与空气隔绝的状态下形成双硫键交联水凝胶，关键在于交联活性溶液中的溶解氧含量。例如，我们的研究结果表明，1.0％(w/v)透明质酸钠巯基化衍生物的中性溶液(45％的羧基改性为巯基)(Shu等，Biomacromolecules，3，1304，2002)装入注射器后隔绝空气密封，通常溶液在2～7天内逐渐失去流动性，形成双硫键交联水凝胶。
进一步的分析表明，上述例子中1.0％(w/v)透明质酸钠巯基化衍生物的中性溶液中巯基含量约为10mmol/L(即330mg/L)，相应地需要2.5mmol/L(即80mg/L)的溶解氧气才能把全部巯基氧化为双硫键。在常温25℃时，氧气在水中的饱和溶解度只有8.4mg/L(25℃)，理论上只能把上述透明质酸钠巯基化衍生物溶液中的10％自由巯基氧化为双硫键。虽然在实际过程中溶解氧浓度通常比饱和溶解度低，但也足以在密封的条件下形成双硫键交联水凝胶，只是水凝胶的强度较低，凝胶化时间较长。
为了进一步调节凝胶化过程和凝胶的性能(如强度等)，调节交联活性溶液中的溶解氧浓度是本发明的一个重要手段。一般说来，氧气在水中的饱和溶解度可以按照亨利定律计算(CO2＝KO2PO2)，其中CO2是氧气在水中的饱和溶解度，KO2是亨利常数，PO2是氧气的分压。
例如，在1个大气压下，根据亨利定律可计算出氧在空气饱和的水中的溶解度。水蒸气在25℃时的分压为0.0313大气压，干燥空气中含20.95％的氧气，则根据道尔顿分压定律，氧的分压为PO2＝(1.0000大气压-0.0313大气压)×0.2095＝0.2029大气压；氧气在25℃水中的亨利常数KO2＝1.28×10-8mol/(L·Pa)。因此根据亨利定律，氧气在水中的溶解度为CO2＝KO2·PO2＝1.28×10-8×0.2029×1.013×105＝2.63×10-4mol/L；由于氧的分子量为32，所以其饱和溶解度为8.4mg/L。
温度是影响氧气在水中溶解度的一个重要因素，这个效应可由克劳修斯-克拉佩隆(Clausius-Clapeyron)方程显示
式中C1和C2分别为绝对温度T1和T2下气体在水中的饱和溶解度(mg/L)；ΔH是溶解热(J/moL)；R是气体常数(8.314J/K.moL)。从上述公式可以看出，随着温度的升高，氧气在水中饱和溶解度逐渐降低。例如，当温度从4℃升高到25℃时，纯水中饱和溶解氧的浓度从13.1mg/L降低到8.4mg/L。
压力是影响氧气在水中溶解度的关键因素。根据亨利定律CO2＝KO2·PO2，在特定温度下，氧气在水中的饱和溶解度与氧气分压成正比。例如25℃，氧气在空气(1个大气压)饱和的水中的溶解度为8.4mg/L，而在氧气(1个大气压)饱和的水中的溶解度提高了约5倍(约40mg/L)。
水中的含盐量也会影响氧气在水中的饱和溶解度，但影响不显著。随着含盐量增加，氧在水中的溶解度降低。例如，海水中饱和溶解氧一般为淡水中的80％左右。
在本发明中，通常通过控制氧气的分压和温度来调节交联活性溶液中溶解氧浓度。温度的降低可以增加溶解氧的饱和浓度，常用的温度范围是0～50℃，最常用的温度为4～40℃。氧气的分压是调节交联活性溶液中溶解氧浓度的最重要因素。根据亨利定律，在相同条件下氧气在水中的饱和溶解度与氧气分压成正比，通过调节氧气的分压，即可方便地调节交联活性溶液中溶解氧的浓度，从而调节自由巯基氧化为双硫键的凝胶化过程。例如25℃时，在1个大气压空气的条件下水中的溶解氧饱和浓度为8.4mg/L，而在1个大气压氧气的条件下水中溶解氧饱和浓度提高了约5倍(40mg/L)，相当于5个大气压空气作用下的饱和溶解氧的浓度；而抽真空15分钟则可几乎全部除去水中的溶解氧。在本发明中，当交联活性溶液中的溶解氧浓度增加，可以显著地加快凝胶化过程和提高凝胶的强度，反之则延缓了凝胶化过程和降低了凝胶的强度。
本发明的制备方法的实现途径通常包括以下步骤 (1)交联活性溶液灌入可注射容器； (2)密封含有交联活性溶液的可注射容器； (3)交联活性溶液中的溶解氧把巯基氧化成双硫键形成交联水凝胶； 本发明的实现途径可采用无菌工艺或终端灭菌的方式生产，以满足不同临床医学要求。通常交联活性溶液可采用手工方式或医药工业罐装设备灌入可注射容器，然后在注射器内原位双硫键交联形成凝胶。
本发明克服了双硫键交联水凝胶的制备需要与空气敞口接触的技术偏见，为可注射双硫键交联凝胶的大规模工业化生产解决了技术障碍。通过本发明的制备方法，采用医药工业常用的罐封生产线即可实现大规模工业化生产，每小时产量可方便地达3000支以上。罐封生产线可选用高宁格公司的直线式全自动注射器预灌封生产线或蜂巢式注射器全自动预罐装和加塞设备、以及德国博世公司的预消毒灭菌注射器液体灌封机等等。可注射容器可以是玻璃材质，也可以是塑料材质，如BD公司的Hypac SCF类预消毒灭菌注射器。也可以用软胶袋等可挤出容器代替注射器。
上述步骤(1)和(2)可以非常方便地在医药工业罐封设备上实现。在交联活性溶液灌入可注射容器密封的过程中，注射器的连接针头端通常是密封的，交联活性溶液从敞口端(注射器推杆端)灌入，然后用胶塞密封敞口端，最后装入推杆。上述步骤(3)是灌入注射器的交联活性溶液形成双硫键交联水凝胶。交联活性溶液在可注射容器内逐渐形成双硫键交联水凝胶的时间一般大于30分钟。升高温度可以促进凝胶化，凝胶化时间通常是几个小时到几天。采用光照或电子束辐照也会加快凝胶化过程。交联活性溶液的pH值、生物相容高分子的巯基含量等因素也对凝胶化过程有显著的影响。交联活性溶液的pH值越高，凝胶化过程越快，在本发明中通常采用微酸性、中性或微碱性的pH。生物相容高分子的巯基含量的增加也会显著促进凝胶化过程。
在本发明中，还可以根据实际需要在步骤(1)前后调节交联活性溶液中的溶解氧浓度以调节凝胶化过程和凝胶的性能。通过控制氧气的分压、温度、时间等参数，即可增加或减少交联活性溶液中溶解氧浓度。交联活性溶液与氧气分压小于常压空气中氧气分压的气体相互作用或抽真空可以减少交联活性溶液中溶解氧浓度。抽真空是最常见的一种减少溶解氧的方法。交联活性溶液在真空状态下保持一定时间即可除去大部分溶解氧，然后在惰性气体的保护下实现灌入可注射容器并密封。此时所制备的双硫键交联水凝胶凝胶化时间较长，强度较低。交联活性溶液与氧气分压大于常压空气中氧气分压的气体相互作用可以增加交联活性溶液中溶解氧浓度。与含有氧气气体相接触是增加交联活性溶液中溶解氧浓度的常用方法。含有氧气的气体可以是加压空气、纯氧气或其它含有氧气的气体，其中氧气分压大于常压空气中氧气的分压，加大氧气的分压即可显著地提高交联活性溶液中的溶解氧浓度。其操作过程可以是把含有氧气的气体通入交联活性溶液中或液面上方，搅拌可以加快氧气的溶解速度。在与含有氧气的气体相互接触的同时，交联活性溶液可以方便地灌入注射器，并快速地加胶塞密封，防止由于气压的变化导致溶解氧的逸出。
交联活性溶液灌入注射器后，罐装设备加塞时通常胶塞直达液面，加塞后的密闭注射器内不留有空隙。但也可根据实际需要灵活调整胶塞在注射器中的深度，留有特定体积的空隙。例如在10ml的注射器中灌入5ml交联活性溶液，根据需要胶塞可以在6ml或其它刻度处密封。采用现有的注射器预灌封生产设备，可以方便地在注射器的空隙中充入气体(如空气、纯氧气等等)，进一步调节交联活性溶液中的溶解氧。另外，交联活性溶液在加胶塞密封前，也可以与含有氧气的气体接触，进一步调节交联活性溶液中的溶解氧浓度。例如，在加胶塞的密闭容器中通入一定氧气分压的气体，一定时间后再加胶塞密封等。但上述操作导致了工艺的复杂性，一般不采用。
在本发明的另一方面，提供了采用上述方法制备的可注射原位交联水凝胶。
在本发明中，交联活性溶液中的侧链带有两个以上巯基的生物相容高分子可在溶液的状态下纯化，现有的纯化工艺(如超滤等)可以彻底保证杂质的去除；同时，凝胶化过程不需要加入交联剂，溶液中的溶解氧即可把巯基氧化为双硫键交联，产物为水。因此与其它可注射交联凝胶相比，本发明所制备的可注射原位交联凝胶具有显著的优势。
本发明的有益效果是利用交联活性溶液中的溶解氧来实现巯基氧化为双硫键的凝胶化过程，这不仅克服了双硫键交联凝胶的制备需要与空气敞口接触的技术偏见；解决了大规模工业化生产的技术难题；同时可以方便地通过控制温度、氧气分压等参数灵活调节交联活性溶液中的溶解氧浓度，从而调节双硫键交联过程和双硫键交联水凝胶的性能；同时凝胶化过程在注射器内完成，具有可注射的性能。本发明的方法具有不需要交联剂、制备工艺简单、使用方便、不含杂质、生物相容性好、无毒副作用、在医学中具有广泛用途等许多优点。
本发明的有益效果还包括凝胶化过程是在注射容器内完成，避免了二次污染，临床使用极为方便，使用时无交叉感染，病房中不洁净的空气接触不到产品，无需抽药，一次性使用等优点。
在本发明的另一方面，还提供了上述可注射原位交联水凝胶在医药和外科手术中的应用。
本发明所制备的原位交联水凝胶在医学中的应用包括可以用于促进伤口愈合，可用于皮肤或其它创伤的伤口敷料；也可用于防止粘连，包括外科手术(例如鼻窦炎手术)之后防止组织或器官之间的纤维性粘连；也可用于组织的再生修复，包括皮肤的再生、软骨的修复等；也可用作关节润滑剂用于治疗关节炎等。
本发明所制备的原位交联水凝胶在药学中的应用包括作为各种活性治疗物质的载体，实现缓慢释放的性能。活性治疗物质可以是化学药物或生物学上的活性因子，包括消炎剂、抗生素、止痛药、麻醉剂、伤口愈合促进剂、细胞生长促进或抑制因子、免疫刺激剂、抗病毒药物等等。
具体实施例方式 下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1巯基化改性透明质酸钠的制备 按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的方法制备。透明质酸20克溶解于2升蒸馏水，加入23.8克二硫代二丙二酰肼，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入19.2克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。加入1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液到pH 7.0终止反应。然后加入100克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。调解溶液的pH值为8.5。室温电磁搅拌反应24小时。此后，在上述溶液中加入1摩尔/升的盐酸直至约pH 3.5。上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用大量0.0003摩尔/升的盐酸和0.1摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用大量的0.0003摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体。
上述白色絮状固体溶解于蒸馏水中得到1.0～2.5％w/v溶液，调节溶液的pH值为4.0～8.0，过滤除菌后，立即使用或冷冻保存待用。或者在上述制备过程中，透析纯化后的溶液再经透析柱脱水浓缩至合适浓度(通常1.0～2.5％w/v)，调节溶液的pH值(通常为4.0～8.5)，过滤除菌后，立即使用或冷冻保存待用。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)巯基化改性透明质酸钠侧链巯基取代度为42/100个重复二糖单元；分子量及其分布(GPC测定)重均分子量13.6万、数均分子量6.1万。
实施例2巯基化改性硫酸软骨素的合成和表征 硫酸软骨素(c型，来自鲨鱼软骨，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中，得到澄清透明溶液。在上述溶液中加入0.704克双琥珀酸双酰胱胺二酰肼(舒等，中国发明专利CN101190891)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.192克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75，室温电磁搅拌反应2小时。然后加入10克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和少量0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。凝胶逐渐溶解，同时不断加入0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液使溶液的pH值保持在8.5。待凝胶全部溶解后，室温电磁搅拌反应24小时。此后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量2000，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后透析管内的溶液冷冻干燥或经透析柱脱水浓缩至一定浓度(3.0～6.0％w/v)，并调节溶液pH值(通产为4.0～8.5)，过滤除菌后，冷冻保存待用。
以硫酸软骨素的乙酰基的特征甲基吸收峰为内标，根据吸收峰的面积计算出巯基化改性硫酸软骨素的侧链取代度为47％。
用GPC测定分子量及其分布测定重均分子量3.8万，数均分子量1.7万，分子量分布2.23。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测巯基化改性硫酸软骨素的活性巯基含量44.2个巯基/100个硫酸软骨素二糖重复单元。
实施例3巯基化改性明胶的制备 明胶(B型，来自猪皮，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中，得到澄清透明溶液。在上述溶液中加入0.75克双琥珀酸双酰胱胺二酰肼(舒等，中国发明专利CN101190891)，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入1克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。溶液黏度不断增加，并在10分钟左右形成凝胶。凝胶形成后，室温静置反应2小时。然后加入10克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和少量0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。凝胶逐渐溶解，同时不断加入0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液使溶液的pH值保持在8.5。待凝胶全部溶解后，室温电磁搅拌反应24小时。此后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量2000，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体约0.6克。
上述白色絮状固体溶解于蒸馏水中得到3.0～6.0％w/v溶液，调节溶液的pH值为4.0～8.0，过滤除菌后，立即使用或冷冻保存待用。
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的巯基化改性明胶巯基化改性明胶为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测巯基化改性明胶的活性巯基含量为0.57毫摩尔/克。
实施例4可注射原位交联水凝胶的制备 透明质酸钠凝胶实施例1所制备的巯基化改性透明质酸钠溶液(pH 7.0，1.0％w/v)在无菌过滤后立即灌入1毫升注射器，密封室温保存。一周后观察，密封注射器内的溶液失去流动性，已经形成凝胶。凝胶不溶于水，但可溶于二硫苏糖醇溶液，证实为双硫键交联。
硫酸软骨素凝胶实施例2所制备的巯基化改性硫酸软骨素溶液(pH 7.0，5.0％w/v)在无菌过滤后立即灌入1毫升注射器，密封室温保存。一周后观察，密封注射器内的溶液失去流动性，已经形成凝胶。凝胶不溶于水，但可溶于二硫苏糖醇溶液，证实为双硫键交联。
明胶凝胶实施例3所制备的巯基化改性明胶溶液(pH 7.0，5.0％w/v)在无菌过滤后立即灌入1毫升注射器，密封室温保存。一周后观察，密封注射器内的溶液失去流动性，已经形成凝胶。凝胶不溶于水，但可溶于二硫苏糖醇溶液，证实为双硫键交联。
实施例5可注射原位交联水凝胶的制备 透明质酸钠/明胶凝胶实施例1所制备的巯基化改性透明质酸钠溶液(pH 7.0，1.0％w/v)和实施例3所制备的巯基化改性明胶溶液(pH 7.0，5.0％w/v)按照适当体积比(如10∶1、1∶1和1∶10等)混合均匀，立即灌入1毫升注射器，密封室温保存。一周后观察，密封注射器内的溶液失去流动性，已经形成凝胶。凝胶不溶于水，但可溶于二硫苏糖醇溶液，证实为双硫键交联。
硫酸软骨素/明胶凝胶实施例2所制备的巯基化改性硫酸软骨素溶液(pH 7.0，5.0％w/v)和实施例3所制备的巯基化改性明胶溶液(pH 7.0，5.0％w/v)按照适当体积比(如10∶1、1∶1和1∶10等)混合均匀，立即灌入1毫升注射器，密封室温保存。一周后观察，密封注射器内的溶液失去流动性，已经形成凝胶。凝胶不溶于水，但可溶于二硫苏糖醇溶液，证实为双硫键交联。
透明质酸钠/硫酸软骨素/明胶凝胶实施例1所制备的巯基化改性透明质酸钠溶液(pH 7.0，1.0％w/v)、实施例2所制备的巯基化改性硫酸软骨素溶液(pH 7.0，5.0％w/v)和实施例3所制备的巯基化改性明胶溶液(pH 7.0，5.0％w/v)按照各种体积比(如1∶1∶1等)混合均匀，立即灌入1毫升注射器，密封室温保存。一周后观察，密封注射器内的溶液失去流动性，已经形成凝胶。凝胶不溶于水，但可溶于二硫苏糖醇溶液，证实为双硫键交联。
实施例6可注射原位交联水凝胶的制备 含有硫酸软骨素的透明质酸钠凝胶硫酸软骨素(c型，来自鲨鱼软骨，Sigma，美国)溶解于水中得到1.0％w/v溶液，然后与实施例1所制备的巯基化改性透明质酸钠溶液(pH 7.0，1.5％w/v)按体积比2∶1混合后立即灌入1毫升注射器，密封室温保存。一周后观察，密封注射器内的溶液失去流动性，已经形成凝胶。凝胶不溶于水，但可溶于二硫苏糖醇溶液，证实为双硫键交联。
含有透明质酸钠的硫酸软骨素凝胶透明质酸钠(分子量约100万，山东福瑞达生物化工有限公司)溶解于水中得到1.0％w/v溶液，然后与实施例2所制备的巯基化改性硫酸软骨素溶液(pH 7.0，6.0％w/v)在混合均匀后立即灌入1毫升注射器，密封室温保存。一周后观察，密封注射器内的溶液失去流动性，已经形成凝胶。凝胶不溶于水，但可溶于二硫苏糖醇溶液，证实为双硫键交联。
含有透明质酸钠的明胶凝胶透明质酸钠(分子量约100万，山东福瑞达生物化工有限公司)溶解于0.9％的生理盐水中得到1.0％w/v溶液，然后与实施例3所制备的巯基化改性明胶溶液(pH 7.0，8.0％w/v)在混合均匀后立即灌入1毫升注射器，密封室温保存。一周后观察，密封注射器内的溶液失去流动性，已经形成凝胶。凝胶不溶于水，但可溶于含有氯化钠的二硫苏糖醇溶液，证实为双硫键交联。
实施例7交联活性溶液中溶解氧浓度的调节 实施例1所制备的巯基化改性透明质酸钠溶液(pH 8.0，1.0％w/v)抽真空10分钟，然后室温敞口接触空气，电磁搅拌，间隔一定的时间采用溶解氧测定仪(HI 9143，HANNA公司)测定溶液中溶解氧的浓度。结果如下
实施例8可注射原位交联水凝胶的制备和表征 在实施例6中，室温搅拌5分钟的溶液(溶液A)和室温搅拌20分钟的溶液(溶液B)分别灌入1毫升注射器，密封室温保存。48小时后观察，溶液A变得很粘稠，但还具有一定的流动性；而溶液B则完全失去流动性，形成了凝胶。按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中所报道的方法测定溶液A和B中的双硫键的含量，结果表明溶液B中的双硫键含量比溶液A高15％以上。
实施例9交联活性溶液中溶解氧浓度的调节 实施例1所制备的巯基化改性透明质酸钠溶液(pH 8.0，1.0％w/v)在密闭容器中敞口接触一个大气压氧气，电磁搅拌，间隔一定的时间采用溶解氧测定仪(HI 9143，HANNA公司)测定溶液中溶解氧的浓度。结果如下
实施例10可注射原位交联水凝胶的制备和表征 在实施例8中，与一个大气压氧气接触搅拌0分钟的溶液(溶液A)和搅拌10分钟的溶液(溶液B)分别灌入1毫升注射器，密封室温保存。溶液B在24小时内形成了凝胶，而溶液A的凝胶化需要约48小时。在48小时后，按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中所报道的方法测定溶液A和B中的双硫键的含量，结果表明溶液B中的双硫键含量比溶液A高30％以上。
实施例11含有药物的可注射原位交联水凝胶的制备 在10毫升实施例1所制备的巯基化改性透明质酸钠溶液中(pH 7.0，1.0％w/v)中，分别加入50毫克抗生素(庆大霉素)、100毫克抗肿瘤药物(紫杉醇)或50微克碱性生长因子，混合均匀后立即灌入1毫升注射器，密封室温保存。一周后观察，密封注射器内的溶液失去流动性，已经形成凝胶。
实施例12含有皮质激素的可注射原位交联水凝胶的制备和表征 在10毫升实施例1所制备的巯基化改性透明质酸钠溶液中(pH 7.0，1.0％w/v)中，分别加入0.1～10毫克皮质激素(如倍氯米松Beclomethasone、倍氯美松双丙酸酯Beclomethasone dipropionate；布地奈德Budesonide；地塞米松Dexamethasone；泼尼松龙Prednisolone、Prednisone泼尼松等)，立即灌入1毫升注射器，密封室温保存。一周后观察，密封注射器内的溶液失去流动性，已经形成凝胶。
上述含药物凝胶0.2毫升放入15毫升塑料离心管，加入10毫升磷酸盐缓冲溶液，放入摇床(37℃，100转/分钟)，间隔一定的时间测定上清液中药物的紫外吸收。测定波长如下倍氯米松Beclomethasone 246nm、倍氯美松双丙酸酯Beclomethasonedipropionate 240nm；布地奈德Budesonide 248nm；地塞米松Dexamethasone 242nm；泼尼松龙Prednisolone 248nm、Prednisone泼尼松244nm。
药物在不同时间点的累积释放百分比如下
从上述结果可以看出，可注射原位交联水凝胶是一种很多的药物缓释载体，对6种皮质激素均具有较好的缓释效果。根据药物疏水性的差异，药物从凝胶中释放的行为有很大的不同。药物疏水性越强，释放越为缓慢。例如对于相对较为亲水的泼尼松龙Prednisolone，7天内已基本释放完毕；而对于疏水性很强的倍氯美松双丙酸酯Beclomethasone dipropionate，几乎检测不到释放。
实施例13可注射原位交联水凝胶防止鼻窦炎术后鼻窦口的再狭窄化 8只雄性巴斯德灭菌的新西兰白兔，体重3.5-4.0公斤，肌肉注射氯胺酮(35毫克/公斤)及甲苯唑嗪(5毫克/公斤)麻醉，剥离鼻外背面，碘酒消毒，然后以3毫升1％利多卡因与1∶100000肾上腺素混合液麻醉。无菌条件下，沿中线做2.5毫米垂直切口，将覆盖于上颌窦的软组织及骨膜提起分离。用外科电钻打开上颌窦前壁，以4毫米球面切割钻将上颌窦中壁与鼻腔打通，从而形成一个直径4毫米边缘无黏膜的圆周形孔道。在4只兔子的孔道两侧中均填入实施例4所制备的透明质酸钠凝胶(治疗组)，在4只兔子的孔道两侧中均不作填充(对照组)。然后将骨膜以可吸收缝线间断缝合，然后将皮肤以可吸收缝线缝合封闭上颌窦。不做其他包扎。术后给予动物正常饮食饮水。
术后两周，处死兔子。处死后将愈合的伤口切开，暴露窦腔。窦腔内的残留物用吸引器一边冲水一边轻轻吸出，用30度鼻内窥镜检查鼻窦内侧壁并进行摄像。每个孔径均用毫米刻度的尺子进行测量。双盲法完成对孔径的观察及测量。治疗组和对照组的孔径测量结果如下
鼻窦口的再狭窄化是鼻窦炎临床手术的一个重要难题，会影响手术疗效，甚至导致鼻窦炎复发。上述结果表明可注射原位交联水凝胶可以非常显著地防止鼻窦口的狭窄化，有望在临床上得到广泛的应用。
实施例14可注射原位交联水凝胶促进创伤愈合 采用Kirker等人在Biomaterials，23，3661，2002所报道的动物模型。简述如下10只重约25克的小鼠麻醉后，用手术刀切除小鼠背部表皮和真皮，得到直径为1厘米的创面。治疗组的创面填入0.3毫升实施例4所制备的透明质酸钠凝胶，然后用TegadermTM辅料和纱布包扎；空白对照组的创面直接用TegadermTM辅料和纱布包扎。术后5天和10天，处死小鼠，以表皮再生率(新生表皮与原始创面的百分比)表征创伤愈合状况。表皮再生率(％)结果如下
可注射原位交联水凝胶显著促进了创伤的表皮再生，可以在临床上作为创伤辅料使用。
权利要求
1.一种可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤
(1)交联活性溶液灌入可注射容器，其中交联活性溶液中至少含有一种侧链带有两个以上巯基的生物相容高分子；
(2)密封含有交联活性溶液的可注射容器；
(3)在密封的可注射容器内交联活性溶液中的溶解氧把巯基氧化成双硫键形成交联水凝胶。
2.按照权利要求1所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤(1)前后调节交联活性溶液中的溶解氧浓度。
3.按照权利要求2所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的调节交联活性溶液中溶解氧浓度包括增加或减少溶解氧浓度。
4.按照权利要求2或3所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联活性溶液中的溶解氧浓度可通过调节温度、与交联活性溶液相接触的气体的氧气分压或接触时间来控制。
5.按照权利要求3所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的增加溶解氧浓度的方法包括交联活性溶液与氧气分压大于常压空气中氧气分压的气体相互作用。
6.按照权利要求3所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的减少溶解氧浓度的方法包括交联活性溶液与氧气分压小于常压空气中氧气分压的气体相互作用和抽真空。
7.按照权利要求1所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的可注射容器是指注射器、或可挤出的容器。
8.按照权利要求1所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的侧链带有两个以上巯基的生物相容高分子是指多糖、蛋白或合成高分子通过一种或一种以上化学改性得到的衍生物，其中至少一种化学改性是巯基化改性。
9.按照权利要求8所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的多糖包括硫酸软骨素、肝素、类肝素、海藻酸、透明质酸、皮肤素、硫酸皮肤素、果胶、羧甲基纤维素、壳聚糖；所述的蛋白包括酸性明胶蛋白、碱性明胶蛋白、基因重组明胶蛋白；所述的合成高分子包括聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚酒石酸、聚谷氨酸、聚富马酸。
10.按照权利要求8所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的巯基化改性包括下述化学反应过程制备羧基在碳化二亚胺的活化下，和含有双硫键的二氨或二酰肼反应生成中间产物，然后双硫键还原为巯基，纯化后得到巯基化改性衍生物。
11.按照权利要求8所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的侧链带有两个以上巯基的生物相容高分子包括侧链带有两个以上巯基的透明质酸钠巯基化改性衍生物、侧链带有两个以上巯基的硫酸软骨素巯基化改性衍生物、侧链带有两个以上巯基的明胶巯基化改性衍生物、侧链带有两个以上巯基的胶原巯基化改性衍生物、侧链带有两个以上巯基的壳聚糖巯基化改性衍生物、侧链含有两个以上巯基的肝素巯基化改性衍生物。
12.按照权利要求1所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的交联活性溶液含有两种或两种以上侧链带有两个以上巯基的生物相容高分子。
13.按照权利要求12所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的交联活性溶液含有透明质酸钠巯基化衍生物、硫酸软骨素巯基化衍生物、肝素巯基化衍生物、明胶巯基化衍生物、胶原巯基化衍生物、壳聚糖巯基化衍生物中的任意两种或两种以上。
14.按照权利要求1或12或13所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的交联活性溶液还含有一种或一种以上多糖、蛋白和合成高分子。
15.按照权利要求14所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的多糖包括硫酸软骨素、肝素、类肝素、海藻酸、透明质酸、皮肤素、硫酸皮肤素、果胶、羧甲基纤维素、壳聚糖；所述的蛋白包括酸性明胶蛋白、碱性明胶蛋白、基因重组明胶蛋白；所述的合成高分子包括聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚酒石酸、聚谷氨酸、聚富马酸。
16.按照权利要求1所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的交联活性溶液在可注射容器内逐渐形成双硫键交联水凝胶的时间大于30分钟。
17.按照权利要求1或12或13所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的交联活性溶液含有活性药物组份。
18.按照权利要求14所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的交联活性溶液含有活性药物组份。
19.按照权利要求17所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的活性药物组份以固体颗粒形式分散在交联活性溶液中，或者溶解在交联活性溶液中。
20.按照权利要求18所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的活性药物组份以固体颗粒形式分散在交联活性溶液中，或者溶解在交联活性溶液中。
21.按照权利要求18-20任一项所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的活性药物组份包括类固醇、抗生物以及治疗肿瘤的药物。
22.按照权利要求17所述的可注射原位交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的活性药物组份包括类固醇、抗生物以及治疗肿瘤的药物。
23.一种采用如权利要求1-22任一项所述的方法制备的可注射原位交联水凝胶。
24.一种如权利要求23所述的可注射原位交联水凝胶在医药或外科手术中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种可注射原位交联水凝胶及其制备方法，至少含有一种侧链带有两个以上巯基生物相容高分子的交联活性溶液灌入可注射容器并密封，在溶解氧的作用下形成原位双硫键交联水凝胶；可通过控制氧气的分压、温度、时间等参数，调节交联活性溶液中溶解氧浓度，优化凝胶化过程和凝胶性能。本发明还涉及该可注射原位交联水凝胶在医药或外科手术中的用途。本发明具有不需要交联剂、制备工艺简单、使用方便、不含杂质、生物相容性好、无毒副作用、在医学中具有广泛用途等许多优点。
文档编号A61K38/02GK101721349SQ20081004384
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月16日 优先权日2008年10月16日
发明者舒晓正 申请人:常州百瑞吉生物医药有限公司