抗肿瘤药物的干细胞递送的制作方法

专利名称：抗肿瘤药物的干细胞递送的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用干细胞进行药物治疗的领域。更特别地，本发明涉
及中枢神经系统(CNS)肿瘤的治疗。

发明内容
在一个方面中，本发明提供修饰的干细胞，其包含干细胞和至少一 种受控释放的运载体，其中所述至少一种受控释放的运载体包含至少一 种抗肿瘤剂和至少一个靶向部分，且其中所述修饰干细胞的特征是能够 靶向一种或多种胶质瘤细胞。在一个实施方案中，所述至少一种受控释 放的运栽体选自纳米颗粒、生物相容性聚合物、聚合物基质、脂质体和 月旨质球(liposphere)。
在一个实施方案中，所述至少一种受控释放的运载体包含至少一 种纳米颗粒。在另 一个实施方案中，所述纳米颗粒具有约10到约600 nm 的直径。在另一个实施方案中，所述纳米颗粒具有约200到约400 nm 的直径。在一个实施方案中，所述纳米颗粒是硅酸盐纳米壳(nanoshell)。 在一个实施方案中，所述硅酸盐纳米壳载有所述至少一种抗肿瘤剂。在 一个实施方案中，所述受控释放的运栽体具有受控的释放速率。在另一 实施方案中，所述受控的释放速率是约5天到约31天。
在一个实施方案中，所述干细胞选自间充质干细胞、神经干细胞和 胚胎千细胞。在一个实施方案中，所述至少一个靶向部分与所述受控释 放运栽体的表面缀合。在一个实施方案中，所述至少一个耙向部分是抗 体或其片段。在另一实施方案中，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体 或其片段.在一个实施方案中，所述至少一个靶向部分与干细胞上的表 面抗原特异性结合。在一个实施方案中，所述表面抗原选自CD105 (SH2)、 CD73(SH3/4)、 CD44、 CD卯(Thy國l)、 CD71、 Stro誦l、 CD106 和CD166。在另一实施方案中，所述i面抗原是CD卯。
在一些实施方案中，所述至少一种抗肿瘤剂选自化学治疗剂、基于
5蛋白质的药物和基于核酸的药物。在一些实施方案中，所述至少一种抗 肿瘤剂选自天冬酰胺酶、阿霉素、生物碱、烷化剂、六曱蜜胺、安吖啶、 抗代谢物化合物、抗肿瘤抗生素、硫唑喋呤、硫酸博来霉素、白消安、 喜树碱、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、
阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、多西紫杉醇、盐酸多柔 比星、表鬼臼霉素、盐酸表柔比星、雌莫司汀磷酸钠、依托泊苷、磷酸 依托泊苷、非那雄胺、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、促性腺素释放激素激 动剂(GnRH)、戈舍瑞林、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊立 替康、洛莫司汀、马立马司他、氮芥、盐酸氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲 氨喋呤钠、丝裂霉素、米托坦、盐酸米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、鬼 臼毒素、卟吩姆钠、盐酸丙卡巴阱、放射性治疗剂、链佐星、苏拉明、 他莫昔芬、紫杉烷、泰素、替尼泊苷萜类、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替 派、TNP470、拓朴异构酶抑制剂、托泊替康、维A酸(全反式视黄酸)、 长春碱、硫酸长春碱、长春花生物碱、长春新碱、硫酸长春新碱、长春 地辛、硫酸长春地辛和酒石酸长春瑞滨。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒还包含标记部分。在一个实施方 案中，所述标记部分是异硫氰酸荧光素(FITC)。
在一个方面中，本发明涉及药物组合物，其包含修饰的干细胞和可 药用载体。
在一个方面中，本发明涉及用于治疗胶质瘤的方法，所述方法包括 对有此需要的受试者施用治疗有效量的修饰干细胞。在一个实施方案 中，所述施用是通过全身性施用实现的。在一个实施方案中，所述施用 是通过局部施用实现的。在一个实施方案中，所述局部施用包括注射进 受试者的颅内。
在一个方面中，本发明涉及延緩胶质瘤生长或降低胶质瘤体积的方 法，所述方法包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的修饰干细胞。
在一个方面中，本发明涉及修饰的干细胞用于制造治疗胶质瘤的药 物的用途。
在一个方面中，本发明涉及用于治疗胶质瘤的药盒，所述药盒包含一种或多种修饰的干细胞和所述一种或多种修饰干细胞的使用说明。
在一个方面中，本发明涉及用于产生修饰的干细胞的方法，所述方法
包括将干细胞与至少一种受控释放的运载体接触，所述受控释放的运载 体具有至少一种抗肺瘤剂和至少一个把向部分。在一个实施方案中，千细 胞优选地定位于受试者的胶质瘤。


图1A、 1B和1C是培养的C6胶质瘤细胞在接触载有阿霉素的结合 抗C90的硅酸盐纳米颗粒之前(图1A)和之后(图1B、 1C)的显微 照片。
图2A到2F是与抗C90、以FITC标记的珪酸盐纳米颗粒接触的间 充质干细胞的显微照片。

发明内容
本发明尤其涉及修饰的干细胞、相关的制备方法以及使用修饰干细 胞的方法。
在本发明中，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、 免疫学和微生物学的许多常规技术。这些技术是公知的，并分别描述于 侈ij如iVotoc0/s /" M( /ec to/* 5/0/05iV，第I-III巻，Ausubd编辑 (1997); Sambrook等,Afo/ecw/w C7wi/wg: j丄fl6or"to/j M<ww i/，第二版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY， 1989); D7V^ C7卵iVig: J iVfl"/c"/ Jp/mMc/i,第I和II巻,Glover编辑(1985); 0//^ wMc/rWiVjfe iS"狄^s/s1, Gait编辑(1984); tV"c/c/c爿"V/母6nV/fe"ftV if， Hames & Higgins编辑(1985); T)wism》ftVwi朋d DwwtoVwi， Hames & Higgins编辑.(1984); Jn/附fl/ CW/ C"/似w, Freshney编辑(1986); /附附o6i7/zeflf C^//s ￡>i^v/ es (IRL Press, 1986); Perbal， J G"twVfe to胁/ecw/"r C7<m//ig; Me仇￡"矽腳/.丛书，(Academic Press, Inc., 1984)、 Gewe Actors /of* M /ii ifl//fl/i Ce/fe， Miller & Calos编辑(Cold
Spring Harbor Laboratory, NY, 1987)以及Me仇五w矽附o/"第154巻和155 i， Wu & Grossman和Wu编辑。在以下的描述中，广泛地使用了大量的术语。本文中提供了解释， 以便于理解技术。参考说明书整体，下文提供的术语得到更为完整的说 明。
除非另有说明，术语"包含"以及"具有"和/或"包括"应当理解 为包括例如所称呼实体中所述的信息，但是不排除未明确提及的信息。
在本文中，当没有数量词修饰或以"一种(个)"表示时，相应的名词 应理解为"一或多种(个)"，除非明确指明或者上下文中确切显示并非如 此。
涉及数值时，除非另有说明，术语"约"表示所列数值加减10%。
本文中，对受试者"施用"药剂或药物包括将化合物引入或递送至 受试者从而发挥其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径 来进行，所述途径包括经口、鼻内、胃肠外(静脉内、肌内、腹膜内或
皮下)、直肠或局部。施用包括自我施用或由他人施用。
本文使用的术语"抗体"表示下述多肽，所述多肽包含来自免疫球 蛋白基因或其片段的构架区，所述构架区特异性结合并识别抗原。术语 "抗体"的使用旨在包括完整的抗体(包括单链完整抗体)和抗体相关 的多肽。术语"抗体"包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们显 示想要的生物活性或功能即可。
本文使用"抗肺瘤剂"是任何抑制、消除、延迟或逆转细胞的肿瘤
表型的化合物、组合物、混合物(admixture)、共混合物(co-mixture)或 掺合物。在一些实施方案中，抗肿瘤剂包括但不限于小分子药物、基于 蛋白质的药物或基于核酸的药物。
本文使用的术语组合物的"有效量，，或"药物有效量"或"治疗有 效量"是足以实现想要的治疗和/或预防效果的量，例如足以预防或减 少受治疗疾病或医学状况(medical condition)(例如与乾多肽相关的疾病 或医学状况)的相关症状的量。对受试者施用的组合物的量将取决于疾 病的类型和严重程度，并取决于个体特征，如一般健康、年龄、性别、 体重和对药物的耐受。还会取决于疾病的程度、严重程度和类型。技术 人员将能够根据这些因素和其它因素确定合适的剂量。组合物也可以与
8一种或多种其它的治疗化合物组合施用。
本文使用的术语"表位"表示抗原上与抗体结合的任何抗原决定簇。 表位决定簇通常由化学活性表面分子(如氨基酸或糖侧链)簇组成，并 通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。在一些实施方案 中，表位位于千细胞的表面抗原上，并被干细胞特异性抗体识别。
本文使用的术语"免疫应答"是指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬 细胞、粒细胞和/或上述细胞或肝生产的可溶性大分子(包括抗体、细 胞因子和补体)的协调作用，它导致损伤、破坏和从人体中消除有害细 胞，如癌细胞和转移性肿瘤细胞。
本文使用术语"医学状况"包括但不限于表现为需要治疗和/或预防 的一个或多个生理和/或心理症状的任何状况或疾病，并包括从前和最 近鉴定的疾病和其它病症。医学状况可包括但不限于中枢神经系统的癌 症，例如胶质瘤。
本文使用的术语"单克隆抗体"是指得自基本均一的抗体群的抗体， 即除了可能少量存在的天然发生的突变以外，构成该群的个体抗体是相 同的。例如，单克隆抗体可以是来自单个克隆(包括任何真核、原核或 噬菌体克隆)的抗体，并且不受限于其生产方法。单克隆抗体组合物对 特定表位显示单一的结合特异性和亲和力。单克隆抗体是高度特异性 的，针对单个抗原性位点。另外，与可包含针对不同决定簇(表位)的 不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上 的单个决定簇。修饰语"单克隆"表示抗体得自基本均一的抗体群这一 特征，并且不应理解为需要通过任何特定方法生产该抗体。单克隆抗体 可以使用本领域已知的多种技术制备，包括但不限于杂交瘤技术、重组
技术和噬菌体展示技术。例如，单克隆抗体可通过由Kohler等，1975. 256:495首先描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法 (参阅如美国专利No. 4,816,567)制备。"单克隆抗体"也可以使用 Clackson等，1991. iVa似/^ 352:624-628和Marks等，1991. / A/o/.说V /. 222:581-597中所述技术从噬菌体抗体文库中分离。
本文使用的术语"纳米颗粒"是指具有纳米级别尺寸的颗粒，即直 径为约1到约1000纳米，并可具有任何尺寸、形状或形态。本文使用的术语"纳米颗粒"可包括球形纳米颗粒以及非球形纳米颗粒。例如， 在纳米线、纳米管和相似结构的情况下，颗粒可以是伸长的。"纳米壳" 是纳米颗粒的亚类，其特征是分离的核心/壳结构，其中壳包围至少一 部分核心。纳米壳的核心可以是空心的(即空的或充有气体的)，或者 可充有与壳不同的固体或液体(水性液体、油等)。
本文使用的术语"肽"、"多肽"和"蛋白质"可互换使用，并应理
解为表示包含两个或更多氨基酸的分子，其中一个氨基酸的a羧基与另 一个氨基酸的a氨基结合。肽可具有C端和N端，这是指肽链一端氨 基酸的羧基部分和肽链另 一端氨基酸的氨基部分。
本文使用的术语"多克隆抗体"是指免疫后针对抗原产生的抗血清 中的多种免疫球蛋白，其可识别并结合所述抗原的一个或多个表位。
本文使用的术语"小分子"表示分子量低于约5kDa的组合物。小 分子可以是例如核酸、肽、多肽、糖肽、拟肽(peptidomimetic)、碳水 化合物、脂质、脂多糖、它们的组合或者其它有机或无机分子。
本文使用术语"干细胞" 一般指能够无限期分化并产生特化细胞的 任何细胞。术语"干细胞"包括但不限于a)全能细胞，如胚胎干细 胞、胚外干细胞、克隆的干细胞、孤雌生殖产生的细胞、被再编程而具 有全能特性的细胞或原始生殖细胞；b)多能细胞，如造血干细胞、来 自脂肪的干细胞、间充质干细胞、胯带血干细胞、来自胎盘的干细胞、 来自脱落的牙齿的干细胞、毛嚢干细胞或神经干细胞；以及c)组织特 异性祖细胞，如神经元的、肝的、肾原性的、脂肪形成的、成骨细胞的、 破坏骨的、肺泡的、心的、肠的或内皮镨系的前体细胞。细胞可来自诸 如以下的组织胰腺组织、肝组织、平滑肌组织、横紋肌组织、心肌组 织、骨组织、骨髄组织、骨海绵组织、软骨组织、肝组织、胰腺组织、 胰管组织、脾组织、胸腺组织、派尔斑组织、淋巴结组织、曱状腺组织、 表皮组织、真皮组织、皮下组织、心组织、肺组织、维管组织、内皮组 织、血细胞、膀胱组织、肾組织、消化道组织、食管组织、胃组织、小 肠组织、大肠组织、脂肪组织、子宫组织、眼组织、肺组织、睾丸组织、 卵巢组织、前列腺组织、结締组织、内分泌组织和肠系膜组织。
术语"特异性结合"是指在诸如酶/底物、受体/激动剂、抗体/抗原、凝集素/碳水化合物、适配体/配体和互补核酸的配对种类之间发生的结 合，所述结合可以由共价或非共价相互作用或共价和非共价相互作用的 结合来介导。当两个种类的相互作用产生非共价结合的复合体时，发生 的结合一般是静电、氢键或是亲脂相互作用的结果。因此，"特异性结 合"发生在配对的种类之间，其中两者之间的相互作用产生具有抗体/ 抗原或酶/底物相互作用特征的结合复合体。特别地，特异性结合的特 征是配对的一个成员与特定的种类结合，而不与该结合成员的相应成员 所属化合物家族中的其他种类结合。因此，例如，抗体一般与蛋白质家 族中的单个表位结合，而不与其它表位结合。
本文使用的术语"受试者"表示受试者是哺乳动物如人，但是也可 以是诸如家畜(例如犬、猫等等)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、马 等等)和实验动物(例如猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等等)的动物。
本文使用的术语"靶向部分"是能够与靶标特异结合的分子。在一 些实施方案中，靶向部分是特异性结合对的成员，例如抗原、配体、受
体、聚酰胺、肽、碳水化合物、寡糖、多糖、低密度脂蛋白(LDL)或LDL 的脱辅基蛋白质、类固醇、类固醇衍生物、激素、拟激素 (hormone-mimic)、凝集素、药物、抗生素、适配体、DNA、 RNA、月旨 质或者抗体或抗体相关多肽。
本文使用"治疗效果"表示治疗受试者所获得的效果，其改变、促 进或改善疾病或状况的症状或者治愈疾病或状况。
本文使用的术语"治疗"或"改善"是指治疗性处理和预防性措施， 其目的是预防或延緩(减轻)所靶向病理学状况或病症。在接受治疗量 的修饰干细胞后，如果受试者显示特定疾病或医学状况的一个或多个体 征和症状有可观察和/或可测量的减少或消失，则受试者针对该病症得 到成功"治疗"。例如，就癌症而言，癌细胞数量的减少或癌细胞的消 失、肿瘤尺寸的减小、肿瘤转移的抑制(即在一定程度的减緩或停止)、 在一定程度上抑制肿瘤生长、提高减轻的时长和/或在一定程度上緩解 与癌症相关的一种或多种症状、降低发病率和死亡率以及改善生活质 量。还应理解，所述对医学状况的多种治疗或预防模式旨在表示"基本 上"，这包括完全治疗或预防，但也包括得到了一些生物学或医学相关 结果的非完全治疗或预防。
iiI、组合物
在一个方面中，本发明提供了能够靶向胶质瘤细胞的修饰干细胞。 在一些实施方案中，所述修饰干细胞包含至少一种受控释放的运载体， 所述运栽体用于向胶质瘤细胞递送至少 一种抗肿瘤剂。所述修饰干细胞 显示对胶质瘤细胞的趋向性。这样可释放该至少一种抗肿瘤剂的局部浓 缩剂量，这可以例如杀伤或损伤乾细胞或组织，导致肿瘤的破坏或肺瘤 尺寸或体积的减小和/或与赘生物相关的一个或多个症状的改善。在该 部分中，描述了修饰干细胞的组分。
A、干细胞
干细胞是将抗肿瘤药物递送至胶质瘤的有效递送运载体。不希望受 理论限制地，干细胞的定向迁移能力提供了使用干细胞递送抗肺瘤药物 的重要组分。许多干细胞类型显示朝向胶质瘤的强趋向性，包括但不限 于例如神经干细胞、骨髓间充质干细胞和未分化的胚胎干细胞。参阅如 Li等，2007， 7Ve"rw^/wW 18(17): 1821-1825; Aboody等，2000，7VW爿ow/ S" f/5^. 97(23): 12846-12851'
在一些实施方案中，干细胞得自来源组织。因此，无论干细胞群是 否来自成体或胚胎来源，干细胞均可在培养基中培养以增加异质细胞混 合物的群体或纯化的细胞群。已经开发了在体外培养干细胞的若干种方
法，并且是本领域已知的。
待扩增的干细胞可以通过本领域技术人员已知的任何手段从任何 哺乳动物生物体的任何器官中分离。干细胞可来自胚胎或成体组织。本 领域技术人员可以确定如何使用本领域已知的方法从具体的目的器官 或组织中分离干细胞。在一个实施方案中，干细胞分离自脐带血。在一 个实施方案中，干细胞分离自骨髄。
本领域技术人员将能够确定用于干细胞初始制备物的合适培养基。 用于干细胞的常用培养基包括但不限于例如Iscove改良的Dulbecco培 养基(IMDM)培养基、DMEM、 KO誦DMEM、 DMEM/F12、 RPMI1640 培养基、McCoy's 5A培养基、基本必需培养基a培养基(a-MEM)、F-12K 养分混合物培养基(Kaighn改良的，F-12K)、 X-vivo 20、 Stemline、CCIOO、 H2000、 Stemspan、 MCDB 131培养基、Eagle基本培养基 (BME)、 Glasgow基本必需培养基、改良的Eagle培养基(MEM)、 Opti-MEM I低血清培养基、Waymouth's MB 752/1培养基、Williams 培养基E、NCTC-109培养基、神经胞质培养基、BGJb培养基、Brinster，s BMOC-3培养基、CMRL培养基、<:02非依赖性培养基、Leibovitz's L-15 培养基等等。
如果需要的话，可以添加其它组分如生长因子。可以添加的示例性 生长因子和其它组分包括但不限于血小板生成素(TPO)、干细胞因子 (SCF)、 IL-1、 IL-3、 IL-7、 flt-3配体(flt國3L)、 G画CSF、 GM-CSF、 Epo、 FGF-1、 FGF-2、 FGF國4、 FGF-20、 IGF、 EGF、 NGF、 LIF、 PDGF、 骨形态发生蛋白(BMP)、激活蛋白-A、 VEGF、毛喉素、糖皮质激素等 等。另外，培养基可含有血清(如胎牛血清、马血清或人血清)或血清 替代组分。已经向培养基中引入大量试剂以减轻对血清的需要。例如， 血清替代物包括牛血清白蛋白(BSA)、胰岛素、2-巯基乙醇和运铁蛋白 (TF)。
然后，如果需要的话，可以将干细胞保存所需时间。干细胞的保存 方法是本领域技术人员已知的。可以用冷冻防护过程处理干细胞，然后 冷冻保存备用。冷冻保护剂是本领域技术人员公知的，并可包括但不限 于美国专利No. 6,461,645 (通过参考整体并入本文)中所述的二甲基亚 砜(DMSO)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、蔗 糖、乙二醇、i-赤藓糖醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨糖醇、i-肌醇、 D-乳糖或氯化胆碱。
在与受控释放的运载体接触之前，可以通过本领域已知的方法(例
如使用抗体技术如细胞淘选，使用荧光激活细胞分选(FACS)法或磁体激 活细胞分选法如MACS设备)纯化干细胞，以在与受控释放的运载体 接触之前分离具有想要的干细胞标志物的细胞，或去除具有不理想的细 胞标志物的不想要的污染细胞类型。其他的干细胞纯化或浓缩方法可包 括使用诸如对流离心洗脱法、平衡密度离心、单位重力下的速率沉淀、 免疫玫瑰花结技术(immune rosetting)和免疫粘附、T '淋巴细胞损耗 的技术。可用于纯化的干细胞标志物的实例包括但不限于FLK-1、 AC133、 CD34、 c-kit、 CXCR画4、 Oct-4、 Rex國l、 CD9、 CD13、 CD29、CD44、 CD166、 CD90、 CD105、 SH-3、 SH曙4、 TRA國1國60、 TRA國1誦81、 SSEA-4、 Sox-2等等。可被用作不期望的污染细胞类型标志物的细胞表 面标志物实例取决于所寻求的干细胞表型。例如，如果想收集多能造血 细胞，则污染细胞应具有与分化的造血细胞相关的标志物，如CD38或 CD33。如果想选择基质间充质细胞(stromal mesenchymal cell)，则可通 过造血标志物如CD45的表达来检测污染细胞。另夕卜，可以基于如尺寸、 密度、与某些物质粘附方面的特性或者流出某些染料(如Hoechst33342 或Rhodamine 123 )的能力来纯化干细胞。
在一些实施方案中，所述干细胞是人间充质干细胞(MSC)。间充质 干细胞是存在于骨髄和外周血中的形成性多能母细胞。间充质千细胞也 常被称为"骨髄基质细胞"或仅称为"基质细胞"。MSC可由于对胶质 瘤细胞的固有特异性亲和力而向胶质瘤细胞迁移(见Yuan等，2006. Cancer Res 66:2630-2638以及Nakamizo等，2005. Cancer Res 65:3307-3318 )。
尽管MSC是很稀少的(占骨髓中总有核细胞的约0.01-0.0001%)， 但是该细胞仍可从骨髓中分离、从其它骨髓细胞中纯化并在培养物中扩 增，而不丧失其干细胞潜力(Haynesworth SE等1992. 5卵e 13， 81-88)。 在一些实施方案中，用于本文所述组合物和方法中的MSC可以从外周 血或骨髄中分离。用于制备MSC的方法描述于美国专利No. 5，486，359。 另外，间充质干细胞也可以从脐带血中分离，如Erices等2000. 5r. / /^e附flto/ 109(l):235-42所述。在一些实施方案中，MSC从将接受治疗 的胶质瘤患者的骨髄或外周血中分离，即MSC可用于自体移植。
有多种已知技术可用于快速分离间充质干细胞，包括但不限于白细 胞清除术、密度梯度分离、免疫选择、差异性舉附分离等等。例如，免 疫选择可包括使用单克隆抗体分离MSC群，所述单克隆抗体是针对由 骨髄衍生的MSC所表达的表面抗原而产生的(即SH2、 SH3或SH4 )， 如在美国专利No. 6,387,367中所述。SH2抗体结合内皮糖蛋白(CD105)， 而SH3和SH4结合CD73。另外，这些单克隆抗体提供有效的探针， 所述探针可用于鉴定、定量和纯化MSC，而与其在体内的来源无关。 在一个实施方案中，通过培养来扩增MSC，以富集表达CD45、 CD73、 CD105、 stro-l或其组合的细胞。在另一实施方案中，在向受试者施用
14人MSC之前，通过培养来扩增MSC，以富集含有被单克隆抗体SH2、 SH3或SH4识别的表面抗原的细胞。stro-l抗体描述于Gronthos等，1996, /. /^附^^化5: 15-23。可用于富集人MSC的其它细胞表面标志物如 Fibbe等，2003. 7V.i:996: 235-244的第237页表I中所示。
用于本文所述组合物和方法中的MSC可以在培养基中维持，所述 培养基可以是化学成分确定的无血清培养基或可以是"完全培养基"， 如补充有10%血清的Dulbecco改良的Eagles培养基(DMEM)。化学成 分确定的无血清培养基的实例描述于美国专利No. 5，卯8，782和 W096/39487,完全培养基描述于美国专利No. 5,486,359。化学成分确 定的培养基包括补充有人血清白蛋白、人ExCyte脂蛋白、运铁蛋白、 胰乌素、维生素、必需和非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺和促分裂 原的基本培养基，如Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)。这些培养 基刺激MSC生长而不发生分化。约2周的培养将使贴壁细胞群倍增10 到14次。将细胞涂板后，通过每3到4天更换一次培养基来去除未贴 壁细胞，得到高度纯化的贴壁细胞培养物，所述培养物保持其干细胞特 征，并可以通过单克隆抗体SH2、 SH3和/或SH4所识别的细胞表面抗 原的表达来鉴定和定量。
在一些实施方案中，所述干细胞是神经干细胞(NSC)。 NSC可以从 出生后及成体组织中分离。来自出生后和成体组织的NSC在其分化为 神经元和神经胶质的能力以及生长和分化特征方面是量上相当的。然 而，从多种出生后和成人CNS中体外分离NSC的效率可能远低于从胎 儿组织中分离NSC的效率，其中胎儿组织中含有更大量的NSC群。
NSC可来自一个部位并作为自体移植物移植到同一受试者中的另 一部位。另外，NSC可来自在遗传上相同的供体，并作为同系移植物进 行移植。再者，NSC可来自于相同物种在遗传上不同的成员，并作为同 种异体移植物进行移植。或者，NSC可来自非人来源，并作为异种移植 物进行移植。通过使用免疫抑制剂，可以将非人神经前体(如猪来源的 神经前体)的同种异体移植物和异种移植物移植进人受试者中。
可以通过任何标准方法解离样品组织。在一个实施方案中，通过使 用移液器和不含二价阳离子的緩冲液柔和地机械研磨来解离组织，形成 解离细胞的悬液。充分解离以获得大量的单细胞是理想的，以避免局部细胞密度过高。
在一个实施方案中，可诱导神经干细胞系，以进一步富集特定亚型 的神经元。已经筛选了大量的生长因子、化学品和天然物质来鉴定特定
神经元的有效诱导剂，所述神经元为例如来自中脑或脊髄NSC的产生 乙酰胆碱的胆碱能神经元和表达酪氨酸羟化酶的多巴胺能神经元。所述 因子或化学品或其组合可以在NSC的有丝分裂期和/或分化期引入。
B、受控释放运载体
在一些实施方案中，所述修饰的干细胞中包含至少一种受控释放的 运栽体，所述运载体包含至少一种抗肿瘤剂和至少一个靶向部分。在一 个实施方案中，受控释放运栽体被干细胞运送至胶质瘤，在此抗肿瘤剂 以足够破坏肿瘤或减小肺瘤尺寸或体积和/或改善赘生物的一个或多个 症状/作用的量进行释放。在一个实施方案中，在干细胞迁移至胶质瘤 后，抗肿瘤剂以更大的量或以更快的速率从受控释放的运栽体中释放。
本技术中适用的受控释放运栽体包括但不限于例如纳米颗粒、生物 相容性聚合物、聚合物基质、脂质体和脂质球。受控释放的运栽体提供 了用于靶向性和/或受控释放的药物递送应用的系统。更特别地，抗肺 瘤剂可以封装在受控释放的运载体中，这提供了所封装抗肿瘤剂的受控 释放。受控释放的运栽体可以整合显示在其外表面上的靶向部分，以使 受控释放的运栽体有效靶向到干细胞，从而辅助制备修饰的干细胞组合 物。
在一些实施方案中，所述至少一种受控释放的运栽体是纳米颗粒。 纳米颗粒可以是如颗粒、纳米壳、纳米核或纳米球的物理结构。纳米球
是具有实心球结构类型的颗粒，尺寸小于约i，ooo纳米。纳米核是指具
有实心核的颗粒，所述实心核的尺寸小于约1,000纳米。纳米壳是指具 有被壳包围的中空核的颗粒，使得颗粒的尺寸小于约1,000纳米。当纳
米壳中含有抗肿瘤剂时，抗肿瘤剂位于被纳米壳的壳包围的核中。纳米 颗粒可以具有任何尺寸、形状或形态，例如其可包括球形纳米颗粒以及
非球形纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约lnm到约1000 nm、或约1 nm多』约500 nm、约1 nin至l]约300 nm、约10 nm至l]约300 nm、约100到约300nm、或约150 nm到约250 nm的尺寸(球形纳米颗粒的直径或者非球形纳米颗粒的长度/宽度)。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒是硅酸盐纳米颗粒。硅酸盐纳米
基团，以帮助颗粒在合适的条件下自组装成正常的胶束(micelle)和反胶 束(reverse micelle)。得到的胶束(和反胶束)核心可用于驻留生物分子 如小分子药物、蛋白质等。该系统可以装栽亲水及疏水化合物，并且可 以在水包油微乳剂中沉淀，从而可以避免使用腐蚀性溶剂(如环己烷) 和复杂的纯化步骤(如溶剂蒸发、超速离心等)。可以进一步修饰纳米 颗粒的有机基团，以附着靶向部分，且它们可以通过Si-C键的生物化 学分解而被生物降解。有机基团的存在也降低了颗粒的总体刚性和密 度。
可以通过四烷基硅烷的水解来制备胶体二氧化硅的纳米颗粒。这种 方法通常称为"溶胶-凝胶(sol-gel)"法，可以进一步扩展合成经有机修 饰的二氧化硅颗粒，其中前体烷氧基硅烷分子也包含一个或两个有机基 团。有机基团的掺入改变了二氧化硅网络的最终结构，例如导致形成介 孔基质(mesoporous matric)，其特征为孔隙率有序且均一的网络结构。 这类多孔基质可装载大量生物活性分子，如荧光染料、蛋白质、抗肿瘤 剂、造影剂等。
在一个实施方案中，可将至少一个靶向部分附着到纳米颗粒的表 面，从而将纳米颗粒靶向干细胞。因此，纳米颗粒的表面可以用不同的 抗体或配体进行功能化，从而将颗粒靶向含有表面抗原或配体特异性受 体的干细胞。
在一个实施方案中，纳米颗粒可以是用于受控释放抗肺瘤剂的分层 的硅酸盐纳米颗粒。分层的硅酸盐纳米颗粒可选自天然或合成的分层硅 酸盐纳米颗粒，并可具有在约1和约1000纳米或从约10到约500 nm 或从约150到350 nm之间的截面长度(例如，球形颗粒的直径或者片 状颗粒的宽度)。硅酸盐纳米颗粒中邻近层之间的间距可以为约5-20埃。
分层的硅酸盐纳米颗粒可选自以下材料的天然及合成形式(a)水 铝英石、(b)鱼眼石、(c)硅锰矿、(d)碳>^^钾石(carletonite )、 (e)水
17硅钒钓石(cavansite)、 (f)珪孔雀石；(g)粘土类成员，包括(i)绿泥石 家族的成员如锌铁绿泥石(baileychlore )、鲕绿泥石(chamosite)、矿物 绿泥石、斜绿泥石(clinochlore )、 锂绿泥石(cookeite)、 镍绿泥石
(nimite )、猛铝绿泥石(pennantite )、 叶绿泥石(penninite )、 铝绿泥 石(sudoite)、 (ii)海绿石(glauconite )、 (iii)伊利石(illite )、 (iv)高冷 石(kaolinite )、 (v)蒙脱石(montmorillonite )(vi)坡缕石(palygorskite )、 (vii)叶蜡石(pyrophyllite )、 (viii)锌蒙脱石(sauconite ) (ix)滑石和(x) 蛭石(vermiculite )、 (h)片珪碱钾石(delhayelite )、 (i)钠锆石(elpidite)、 (j)珪钠钾石(fedorite)、 (k)羟珪锌锰^tS (franklinfurnaceite )、 (l)班珪 猛石 (franklinphilite ) 、 (m)富猛绿泥石 (gonyerite)、 (n)白钾'沐石
(gyrolite)、 (O)淡钡钬石(leucosphenite); (p)云母类成员，包括(i)黑 云母、(ii)锂云母、(iii)白云母、(iv)钠云母、(v)金云母和(vi)铁锂云母； (q)水珪锌钙钾石(minehillite )、 (r)硅钠锶镧石(nordite )、 (s)五角石
(pentagonite )、 (t)透锂长石(petalite )、 (u)葡萄石(prehnite )、 (v)纤 ^^钾石(rhodesite)、 (w)珪钡石(sanbornite )、 (x)蛇紋石类成员，包 括(i)叶蛇紋石(antigorite )、 (ii)斜纤蛇紋石(clinochrysotile )、 (iii)利蛇 玟石(lizardite)、 (iv)正纤蛇紋石(orthochrysotile )和(v)蛇紋石、(y) 铝珪鉛石(wickenburgite)、 (z)叶沸石(zeophyllite)及其混合物。
除上述材料以外，分层硅酸盐材料还可选自以下材料的天然和合成 形式滑间皂石(aliettite)、锂蒙脱石(swinefordite )、 yakhontovite、 铬岭石(volkonskoite )、斯惠石(stevensite )、锂蒙脱石(hectorite)、 麦幾硅钠石(magadiite )、 kenyaite、伊矛J石(ledikite )、锂藻土( laponite )、 急石(saponite)、锌蒙脱石(sauconite )、 蒙脱石(montmorillonite )、 膨润土 (bentonite)、绿脱石(nontronite )、贝得石(beidellite )、锂蒙 脱石(hectorite)、其它蒙皂石(smectite)类粘土及其混合物。
根据抗肺瘤剂的性质和硅酸盐纳米颗粒的性质，治疗剂可以通过大 量机制中的任意种来保持与分层硅酸盐纳米颗粒的结合，包括如氬键键 合、范德华力键合、通过亲水/疏水相互作用鍵合、离子键合等等。通 过将治疗剂与硅酸盐纳米颗粒结合，每个硅酸盐颗粒成为治疗剂的 一个 库。在一个实施方案中，治疗剂与硅酸盐颗粒的结合使其占据硅酸盐颗 粒邻近层之间的空间。
18例如，在一些实施方案中，当治疗剂和硅酸盐纳米颗粒的亲水性相 似(或疏水性相似)时，治疗剂可自发地与硅酸盐纳米颗粒的层结合。 在其它实施方案中，硅酸盐纳米颗粒被表面修饰为带有多种电荷，以结 合某些分子。例如在一些实施方案中，硅酸盐纳米颗粒被修饰为带有阳 离子电荷或阴离子电荷。另外，在一些实施方案中，硅酸盐纳米颗粒被 修饰为带有某些官能团。例如，本领域已知大量移植技术可用于在硅酸 盐纳米颗粒的表面上建立多种官能团，包括疏水官能团和离子官能团。
一旦形成后，则载有抗肿瘤剂的纳米颗粒在以下两方面具有极大的
灵活度(a)可将其掺入的聚合物运载体的范围，和(b)将其配制进聚合 物运载体中的技术。
在一些实施方案中，可将抗肺瘤剂包含在聚合物运载体中，以延长 药剂从纳米颗粒中的释放。例如，在壳装配中使用明胶可以延长药物释 放。在一个实施方案中，纳米壳由多层聚(二甲基二烯丙基氯化铵) (PDDA)和明胶组成。就生物相容性考虑而言，可以用阳离子的多聚L-赖氨酸(PLL)代替PDDA。从明胶和PLL制成的纳米壳既是生物相容性 的又是可生物降解的。因此在一些实施方案中，纳米壳由通过静电层叠 (layer-by-layer, LbL)法装配的生物相容性有机聚合物构成。壳直径可以 在100和1500 nm之间或在100和600 nm之间。壳厚度可以在10和 100nm之间或在10和30nm之间。可以通过改变纳米壳的膜特性(例 如厚度、聚合物种类、聚合物分子量和添加剂)来改变药物释放动力学。
用于聚合物运载体中的聚合物可以是均聚物或共聚物(包括交替共 聚物、随机共聚物和嵌段共聚物)，它们可以是环状的、线性的或分枝 的(例如具有星形、梳形或树形结构的聚合物)，它们可以是天然的或 合成的，它们可以是热塑性或热固性的，并且它们可以是疏水的、亲水 的或两亲的。
用于聚合物运载体的聚合物可以选自例如下述多聚羧酸聚合物和 共聚物，包括聚丙烯酸；缩醛聚合物和共聚物；丙烯酸酯和异丁烯酸酯 聚合物和共聚物(例如甲基丙烯酸正丁酯)；纤维素聚合物和共聚物， 包括醋酸纤维素、硝酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、赛璐玢、 人造丝、三乙酸人造丝，和纤维素醚如羧曱基纤维素和羟基烷基纤维素； 多聚甲搭聚合物和共聚物；聚酰亚胺聚合物和共聚物，如聚醚嵌段二酰亚胺、聚酰胺酰亚胺(polyamideimide)、聚酯酰亚胺(polyesterimide)和 聚醚酰亚胺(polyetherimide);聚砜聚合物和共聚物，包括聚芳基砜和聚 醚砜；聚酰胺聚合物和共聚物，包括尼龙6，6、尼龙12、聚己内酰胺和 聚丙烯酰胺；树脂，包括醇酸树脂、酚醛树脂、尿素树脂、三聚氛胺树 脂、环氧树脂、烯丙基树脂和环氧化物树脂；聚碳酸酯；聚丙烯腈；聚 乙烯吡咯烷酮(交联的或以其它方式)；乙烯基单体的聚合物和共聚物， 包括聚乙烯醇、聚乙烯面化物如聚氯乙烯、乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)、 聚偏二氯乙烯、聚乙烯醚如聚乙烯甲醚、聚苯乙烯、苯乙烯-马来酸酐 共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-乙烯-丁烯共聚物(例如聚苯乙 烯-聚乙烯/丁烯-聚苯乙烯(SEBS)共聚物，可得自Kraton.RTM. G系列 聚合物)、苯乙烯-异戊二烯共聚物(例如聚苯乙烯-聚异戊二烯-聚苯乙 烯)、丙烯腈-苯乙烯共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、苯乙烯-丁 二烯共聚物和苯乙烯-异丁烯共聚物(例如聚异丁烯-聚苯乙烯嵌段共聚 物如SIBS)、聚乙烯酮、聚乙烯啼唑，和聚乙烯酯如聚乙酸乙烯酯、聚 苯并咪唑；聚烷基环氧聚合物和共聚物，包括聚氧化乙烯(PEO);聚酯， 包括聚对苯二酸亚乙酯(polyethylene terephthalate)和脂肪族聚酯，如丙 交酯(其包括乳酸及d-、 l-和内消旋-丙交酯)、s-己内酯、乙交酯(包 括羟乙酸)、羟基丁酸酯、羟基戊酸酯、对-二氧杂环己酮、环丙烷碳酸 酯(及其烷基衍生物)、1，4-二氧杂环庚烷-2-酮(l,4-dioxepan-2-one)、 1，5-二氧杂环庚烷-2-酮和6，6-二曱基-l，4-二氧杂环己烷-2-酮(聚乳酸和聚己 内酯的共聚物是一个具体实例)的聚合物和共聚物；聚醚聚合物和共聚 物，包括聚芳基醚，如聚次苯基醚、聚醚酮、聚醚醚酮；聚苯硫醚；聚 烯烃聚合物和共聚物，包括聚亚烷基如聚丙烯、聚乙烯(低和高密度、 低和高分子量)、聚丁烯(如聚丁-l-烯和聚异丁烯)、EPDM共聚物(例 如santoprene)、乙烯丙烯双烯单体(EPDM)橡胶、聚-4-甲基-戊-l-烯 (poly-4-methyl-pen-l-ene)、乙烯-a-烯烃共聚物、乙烯-异丁烯酸甲酯共 聚物和乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；氟化的聚合物和共聚物，包括聚四氟 乙烯(PTFE)、聚(四氟乙烯-共-六氟丙烯)(FEP)、改性的乙烯-四氟乙 烯共聚物(ETFE)和聚偏乙烯氟化物(PVDF);硅酮聚合物和共聚物；聚 氨基甲酸酯；对苯二曱基聚合物、聚亚胺基碳酸酯(polyiminocarbonate); 共聚(醚-酯)如聚乙烯氧化物-聚乳酸共聚物；聚磷腈(polyphosphazine); 聚亚烷基草酸酯；聚氧杂跣胺和聚氧杂酯(包括含有胺和/或酰氨的那 些)；聚原酸酯；生物聚合物如多肽、蛋白质、多糖和脂肪酸(及其酯)，包括纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原、弹性蛋白、壳聚糖、明胶、淀粉、
一些实施方案中可使用弹性聚合物。弹性聚合物包括(a)聚烯烃聚合 物，例如含丁基的聚合物，如聚异丁烯；(b)聚烯烃共聚物，例如聚烯烃 -聚乙烯芳香族共聚物，如聚异丁烯-聚苯乙烯共聚物、聚(丁二烯/丁烯)-聚苯乙烯共聚物、聚(乙烯/丁烯)-聚苯乙烯共聚物，和聚丁二烯-聚苯乙 烯共聚物；和(c)硅酮聚合物和共聚物；及其掺合物。聚烯烃-聚乙烯芳 香族共聚物的特异实例包括聚烯烃-聚乙烯芳香族二嵌段共聚物，和聚 乙烯芳族-聚丙烯-聚乙烯芳族三嵌段共聚物，例如可作为Kraton⑧获得 的聚苯乙烯-聚(乙烯/丁烯)-聚苯乙烯(SEBS)三嵌段共聚物，和聚苯乙烯-聚异丁烯-聚苯乙烯(SIBS)三嵌段共聚物，其描述于例如美国专利No. 5，741，331、美国专利No. 4，946，899和美国专利No. 6,545,097中，各参 考文献通过参考整体并入本文。其它的聚烯烃-聚乙烯芳香族共聚物在 前一段中公开。
在一些实施方案中，受控释放的运载体是脂质体、脂质球或基于脂 质的纳米颗粒。颗粒会封装一种或多种抗肿瘤剂，如适用于治疗或预防 特征为中枢神经系统恶性肺瘤的医学状况的化学毒素、蛋白质、肽、反 义寡核苷酸和碳水化合物。抗肿瘤剂被封装在颗粒的水性核心中，并被 脂双层或膜包围，所述脂双层或膜可包含一级磷脂(primary phospholipid)和溶血脂质(lysolipid)。 一级磷脂和溶血脂质可具有相 同或不同的酰基链长度。
脂质体是具有水性核心和由脂双层组成的膜的球形运栽体，所述膜 将一种或多种活性剂封装在水性核心中。脂双层是由两个相对层的脂质 分子组成的膜或膜区域。分子以其烃尾部彼此面对的方式排列形成油性 双层。烃尾部也被称作"烃链"或"酰基链"。该分子具有带电的或极 性的头，其面向膜一侧的水性核心。脂双层的分子可包含一级磷脂和溶 血脂质。 一级磷脂可具有与溶血脂质烃链长度不同的烃链长度。 一级磷 脂可具有从约6到20个碳原子范围内的链长度。溶血脂质可具有从约6 到24个碳原子范围内的链长度。在一个实施方案中， 一级磷脂与溶血 磷脂之间的链长度差异为约4个碳原子。
一级磷脂可包括双链磷脂，例如1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)或1，2-二-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。 一级磷脂也可 以包含三链磷脂或任何其它磷脂。
溶血脂质可包括具有单跣基链的分子。该分子可以是由于水解去除 而缺乏其脂肪酸链之一的磷酸衍生物。溶血脂质可包括C6-C20单酰基 溶血脂质和表面活性剂如l-肉豆蔻酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (MMPC)或l-棕榈酰-2-羟基-s/n-甘油-3-磷酸胆碱(MPPC)。溶血脂质的 其它实例包括l-油酰-2-羟基-sn-甘油-3-礴酸胆碱(MOPC)、 1-月桂酰基 國2画羟基國sn-甘油-3-磷酸胆碱(MLPC)、和l画硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷 酸胆碱(MSPC)或任何其它单链溶血脂质。
一级磷脂和溶血脂质组织形成脂双层。 一级磷脂可构成脂双层的约 80%到95%。 一级磷脂与溶血脂质的摩尔比可为约80:20到约95:5。脂 双层也可以含有其它物质如胆固醇、聚乙二醇表面包衣或另一聚合物如
可以通过调节受控释放运载体的厚度、颗粒尺寸、结构、使用的聚 合物类型和聚合物层密度来控制从组合物释放抗肿瘤剂的速率。可以通 过改变包衣中抗肿瘤剂的负荷来调节聚合物包衣的密度。当包衣不含有 抗肿瘤剂时，聚合物包衣的密度最大，通过包衣洗脱抗肿瘤剂最慢。相 反，当抗肿瘤剂栽入包衣中时， 一旦抗肺瘤剂从其外表面开始被洗脱出 来，则包衣成为多孔的，因此颗粒中心的活性剂可以以更高的速率被洗 脱。包衣层中的药物载荷越高，则密度约低且洗脱速率越高。包衣中抗 胂瘤剂的负载可以低于外部包衣下颗粒内部的抗肿瘤剂负荷。也可以通
的释放速率。在一个实施方案中，抗肿瘤剂具有约1到5天、约1到7 天、约1到14天、约1到31天、约5到14天、约5到31天或约5到 60天的释放速率。在一个实施方案中，抗肺瘤剂在干细胞迁移至胶质瘤 位点后开始从受控释放的运栽体中释放。
C、抗肿瘤剂
在一些实施方案中，受控释放的运栽体包含至少一种可用于治疗或 预防与中枢神经系统恶性肿瘤或赘生物相关的医学状况(例如胶质瘤) 的抗肿瘤剂。在一个实施方案中，抗肿瘤剂是小分子药物或其它生物效可以是在生物系统中具有活性的生物效应分子。 生物学效应分子包括但不限于蛋白质、多肽或肽，包括但不限于结构蛋 白、酶、细胞因子(例如干扰素和/或白介素)、多克隆或单克隆抗体或
其有效部分如Fv片段(所述抗体或其部分可以是天然抗体的、合成的 或人源化的)、肽激素、受体，或信号转导分子。术语"免疫球蛋白" 包括完整的免疫球蛋白以及抗体片段，如Fv、单链Fv(scFv)、 Fab或 F(abV
目的抗肺瘤剂包括但不限于药理活性药物、遗传活性分子等。目的 化合物包括化学治疗剂、消炎剂、激素或激素拮抗剂、离子通道改性剂 和神经活性剂。药物试剂的实例包括"The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y" (1996)第9版的以下章节中描述的药剂Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites; Drugs Acting on the Central Nervous System; Autacoids: Drug Therapy of Inflammation; Water, Salts and Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism; Cardiovascular Drugs; Drugs Affecting Gastrointestinal Function; Drugs Affecting Uterine Motility; Chemotherapy of Parasitic Infections; Chemotherapy of Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Used for Immunosuppression; Drugs Acting on Blood画Forming organs; Hormones and Hormone Antagonists; Vitamins, Dermatology和Toxicology,以上均通过参考并入本文。还包括毒素和生 物战剂与化学战剂，参阅如Somani， S. M.编辑，Oie/rn'oi/附w/are jgewte， Academic Press, New York (1992)。
在一些实施方案中，生物学效应分子是能够结合细胞内环境中的抗 原的免疫球蛋白、抗体、Fv片段等。这些类型的分子称为"胞内抗体 (intrabody)"或"细胞内抗体"。"细胞内抗体"或"胞内抗体"是能 够在细胞内环境或在模拟细胞内环境的环境中与其乾标或相关抗原结 合的抗体。用于直接鉴定这类"胞内抗体"的选择方法包括使用体内双 杂交系统，所述系统用于选择能够在哺乳动物细胞内结合抗原的抗体。 这类方法描述于PCT/GB00/00876中，通过参考并入本文。用于生产细 胞内抗体(如抗-p-半乳糖苷酶scFv )的技术还描述于Martineau等，/Mo/ 说V / 280:117-127 (1998)和Visintin等，iV"汰爿c^/. f/5L4
2396:11723-1728 (1999),
在一些实施方案中，生物效应分子选自蛋白质、多肽、肽、核酸、 病毒、病毒样氨基酸、氨基酸类似物、修饰的氨基酸、修饰的氨基酸类 似物、类固醇、蛋白聚糖、脂质和碳水化合物或其组合(例如既包含蛋 白质又包含DNA组分的染色体材料，或者一对或一组效应分子，其中 一个或多个将另一个转化为活性形式，例如通过催化来转化)。
生物效应分子可包括核酸，包括但不限于寡核香酸或修饰的寡核苷 酸、反义寡核苷酸或修饰的反义寡核苷酸、适配体、cDNA、基因组DNA、 人工或天然的染色体(例如酵母人工染色体)或其部分、RNA (包括 siRNA、 shRNA、 mRNA、 tRNA、 rRNA或核酶)或肽核酸(PNA)、病 毒或病毒样颗粒、核苷酸或核糖核苷酸或其合成的类似物，它们可以是 修饰的或未修饰的。生物效应分子也可以是修饰或未修饰的氨基酸或其 类似物、非肽(例如类固醇)激素、蛋白聚糖、脂质或碳水化合物。
也可以使用小分子，包括无机和有机化学品。在一个实施方案中， 小分子是药物活性剂。有用的药物活性剂种类包括但不限于抗生素、消 炎药、血管生成剂或血管活性剂、生长因子和化学治疗剂(例如肿瘤抑 制剂)。
本文使用的术语"前药"是指在体内转化成具有想要的药物活性的 其他物质的任何物质。如果前药以无活性的形式装栽进受控释放的运栽 体中，则还可以装栽另一效应分子。有用的另一效应分子是将无活性前 药转化成活性药物形式的激活多肽。在一个实施方案中，激活多肽包括 但不限于病毒胸苷激酶(由Genbank登录号J02224编码)、羧肽酶A (由Genbank登录号M27717编码)、a-半乳糖苷酶(由Genbank登录 号M13571编码)、p-葡糖醛酸糖普酶(由Genbank登录号M15182编 码)、碱性磷酸酶(由Genbank登录号J03252 J03512编码)或细胞色 素P-450 (由Genbank登录号D00003 N00003编码)、纤溶酶、羧肽酶 G2、胞嘧咬脱氨酶、葡萄糖氧化酶、黄噤呤氧化酶、p-葡萄糖苷酶、偶 氮还原酶、t-谷氨酰基转移酶、p-内酰胺酶或青霉素酰胺酶。
治疗剂也可以是放射性治疗剂，例如适用于中子捕获疗法的硼或钆 化合物或络合物，或固有的放射活性同位素如5SFe或12SI或131I。适用于本发明的组合物和方法中的抗肿瘤剂包括但不限于例如天 冬酰胺酶、阿霉素、生物碱、烷化剂、六曱蜜胺、安吖啶、抗代谢化合 物、抗肿瘤抗生素、硫唑嘌呤、硫酸博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、 卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡
巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、多西紫杉醇、盐酸多柔比星、表鬼臼霉 素、盐酸表柔比星、雌莫司汀磷酸钠、依托泊苷、磷酸依托泊苷、非那 雄胺、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、促性腺素释放激素激动剂(GnRH)、 戈舍瑞林、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、 马立马司他、氮芥、盐酸氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨喋呤钠、丝裂霉 素、米托坦、盐酸米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、鬼臼毒素、卟吩姆钠、 盐酸丙卡巴阱、放射性治疗剂、链佐星、苏拉明、他莫昔芬、紫杉烷、 泰素、替尼泊苷萜类、沙利度胺、硫鸟噤呤、塞替派、TNP 470、拓朴 异构酶抑制剂、托泊替康、维A酸(全反式视黄酸)、长春碱、疏酸长 春碱、长春碱生物碱、长春新碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春 地辛和酒石酸长春瑞滨。
释放区域内的抗肿瘤剂不需要局限在装载有药物纳米颗粒内的位 置。例如，除了存在于装栽有药物的纳米颗粒中以外，抗肺瘤剂也可以 如所期望地溶解或分散在被修饰的干细胞周围的载体中。
D、靶向部分
在一些实施方案中，受控释放运载体包括一个或多个靶向部分，用 于使受控释放运载体选择性结合靶分子。在一个实施方案中，靶向部分 与干细胞的靶分子特异结合。靶向部分的实例包括但不限于例如抗原、 配体、受体、特异性结合对的一个成员、聚酰胺、肽、碳水化合物、寡 糖、多糖、低密度脂蛋白(LDL)或LDL的脱辅基蛋白质、类固醇、类固 醇衍生物、激素、拟激素、凝集素、药物、抗生素、适配体、DNA、 RNA、脂质、抗体和抗体相关多肽。在一些实施方案中，靶向部分是抗 体或抗体相关多肽。例如，适合用作靶向部分的抗体包括一般抗体和单 克隆抗体。靶向部分可包含多肽，所述多肽对多糖靶标例如凝集素(如 种子、豆、根、树皮、藻类、真菌、细菌或无脊推动物凝集素)具有亲 和力。
许多靶向部分和用于靶向化合物的方法是本领域技术人员公知的。把向方法的非限制性实例参阅如美国专利No. 6,316,652、 6,274,552、
6,271,359、 6,253,872、 6,139,865、 6，131，570、 6,120,751、 6，071，495、
6,060,082、 6,048,736、 6,039,975、 6,004,534、 5,985,307、 5，972，366、5，卯0，252、 5,840,674、 5，759，542和5,709,874.
靶向部分可以是能够与靶分子上至少一个表位特异性结合的抗体或抗原结合抗体片段，所述靶分子与干细胞相关联、由干细胞产生或位于干细胞表面上。抗体或抗体片段可以是单特异性或多特异性的。可使用多克隆抗体和单克隆抗体以及某些重组抗体，如嵌合抗体以及人源化抗体和融合蛋白。
靶向部分可以是多价的和/或多特异性的。"多价的"是指靶向部分可以同时结合多于一个靶标，所述靶标可具有相同或不同的结构。"多特异性的"是指该试剂可同时结合具有不同结构的至少两种靶标。例如，具有两种不同特异性的靶向部分可以被认为是多价的和多特异性的，因为其能够同时结合两个结构不同的靶标。另一方面，具有结合相同靶标而无其他特异性的两个或更多特异性臂的分子应是多价的而不是多特异性的。
在一些实施方案中，靶向部分是干细胞特异性表面抗体。在一个实施方案中，抗体或其片段与间充质干细胞特异性的CD90、 CD105或CD73上的表位特异性结合。在一个实施方案中，抗体或其片段与存在于神经干细胞上的CD3、 CD5、 CD7、 CDIO、 CDllb、 CD13、 CD14、CD16、 CD19、 CD20、 CD22、 CD23、 CD25、 CD31、 CD33、 CD41、CD45、 CD54、 CD80、 CD83、 CD86、 TAPA-1、 CD15、 CD95、 CD9、CD8、 CD34、 CD38、 CD56、 CD81、 CD152、 CD133、 CD117、 CD154上的表位特异性结合。在一个实施方案中，抗体或其片段与存在于胚胎干细胞上的CD9、 CD29、 CD34、 CD44、 CD45、 CD49e、 CD54、 CD71、CD90、 CD105、 CD106、 CD120a、 CD124、 CD166、 Sca-l、 SH2、 SH3的表位特异性结合。
E、经修饰干细胞的标志物
经修饰的干细胞也可以用一种或多种阳性标志物进行标记，所述阳性标志物可用于随时间监测受试者或培养物中修饰干细胞的数量或浓度。预计修饰干细胞的总数在最初施用后会随时间减少。因此，由一个或多个阳性标志物监测信号可能是合适的。目前存在若干种由食品和药物管理局批准用于人类用途的荧光化合物，包括但不限于荧光素、吲哚
青绿和罗丹明B。例如，可以用异硫氰酸荧光素(FITC; Bratosin等，Q;to附"o; 46:351-356 (2001))特异性标记干细胞。
其它染料可用于在人类及非人类的循环中追踪修饰的干细胞。大量试剂可用于标记干细胞。例如可以4吏用VivoTag 680(VT680; VisEnMedical, Woburn, MA， USA)体内追踪细胞。VT680是近红外荧光染料，其具有670 ± 5 nm的峰激发波长和688 ± 5 nm的峰发射波长。VT680还含有胺反应性NHS酯，这使其能够与蛋白质和肽交联。这样，可以用VT680标记细胞表面(参阅如Swirski,等，(2007) PloS ONE 10:el075 )。例如，将4 x 1(^个细胞/ml与完全培养基中稀释至0.3到300 pg/ml终浓度的VT680在37"C下孵育30分钟。标记后用完全培养基将细胞洗涤两次。可以基于修饰干细胞表面上表达的蛋白质来非特异地标记细胞。或者可以用VT680标记特定的蛋白质。在一些情况下，可以使用针对与干细胞相关的特定蛋白质的抗体来选择性地标记细胞。在其它情况下，可以用VT680在离体情况下直接标记蛋白质或肽，随后附着在细胞表面或整合进细胞内部。
或者，可以用其它红色和/或近红外染料标记干细胞，所述染料包括例如花青染料如Cy5、Cy5.5和Cy7 (Amersham Biosciences, Piscataway,NJ, USA)和/或多种Alexa Fluor染料，包括Alexa Fluor 633 、 Alexa Fluor635、 Alexa Fluor 647、 Alexa Fluor 660 、 Alexa Fluor 680、 Alexa Fluor700和Alexa Fluor 750 (Molecular Probes画Invitrogen， Carlsbad， CA，USA),其它荧光团包括IRD41和IRD700 (LI画COR， Lincoln, Nebraska,USA)、 NIR國l和lC5画OSu (Dejindo， Kumamotot， Japan)、 LaJolla蓝(Diatron， Miami, FL, USA)、 FAR蓝、FAR绿1和FAR绿2 (Innosense，Giacosa, Italy) 、 ADS 790-NS和ADS 821-NS (American Dye Source,Montreal, CA)。可使用多种发射/激发特性的量子点(Qdot)A标记细胞(参阅如Jaiswal等,A^i/re及V tecA. 21:47-51 (2003))。许多这些荧光团可作为商品购得，其与第一抗体或第二抗体结合或者作为胺反应性的琥珀酰亚胺酯或单琥珀酰亚胺酯，例如易于同干细胞表面或内部的蛋白质缀合的形式。可使用磁性纳米颗粒通过高分辨率MRI(Montet-Abou等，Mo/ecw/"f/附化,Vfg 4:165-171 (2005))在体内追踪细胞。磁性颗粒可以通过多种机制内化。磁性颗粒可通过流动相胞饮作用或吞噬作用被细胞吸收。或者，可以修饰磁性颗粒使其含有促进内化的表面物质，例如使HIV tat肽易位的膜。在一些情况下，磁性纳米颗粒如经FDA许可的磁共振对比试剂Feridex IV⑧可以与转染剂一起内化进造血细胞中，所述转染剂例如硫酸鱼精蛋白(PRO)、多聚赖氨酸(PLL)和脂转染胺(lipofectamine，LFA)。
F、制备修饰的干细胞
在一个实施方案中，从受控释放的运载体的悬液(如聚合物纳米颗粒的胶体悬液)开始装配修饰的干细胞。纳米颗粒核心可以由任何固体材料构成，所述固体材料具有(或可被给予)表面电荷，并可在壳层形成后溶解而不破坏分层的壳包衣。核心材料包括但不限于三聚氰胺甲醛、乳酸-赖氨酸共聚物、氨基和羧基取代的聚碳酸酯、聚酯、聚缩醛、聚丙烯酸酯和聚苯乙烯及其多种共聚物，以及无机核心材料如胶体二氧化硅、二氧化钛或氧化锆，或者金属氧化物和碳酸盐的微粒，如MnC03微晶。例如，可购得的单分散聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或三聚氰胺曱醛颗粒可作为核心用于形成中空纳米壳。如果需要的话，在将颗粒用作纳米壳构建的核心之前，通过适当的手段减小颗粒尺寸，例如通过部分溶解、分解或腐蚀。如果核心中尚不存在表面电荷，则可以通过本领域已知的方法引入，例如通过涂覆带电聚合物层，或通过表面氧化和/或带电化学部分的偶联。参阅如5W/"/flce-CVw^iY //^/ 7Vfl"仍oi/e/w/Ti^/r"^^/"-^^""/^//^/"/^ K. E. Gonsalves等编辑，1998， MaterialsResearch Society (Warrendale， Pa.)和分/i幼esis, F"""i'o""//zaftVm5""z/flce rmi加e"f 6>/ iVfl"o/;flW/c/es， M.画I. Baraton编辑，2003， AmericanScientific Publishers (Stevenson Ranch, Calif.)。
在一些实施方案中，最外层的壳还包含靶向部分如蛋白质、肽、配体和抗体。乾向部分包括但不限于例如肽如归巢肽(homing peptide)、蛋白质、受体特异性配体和干细胞特异性抗体(例如CD卯)。可以通过本领域已知的任何把向药物递送方法将把向部分掺入外壳中。所述方法包括但不限于例如将靶向部分与最外层壳中的一种或多种组分共价结合(直接或通过接头)、将生物素化的靶向部分与外层壳上结合的亲和 素或链霉亲和素分子结合，以及静电结合带有适当电荷的分子(如下文
实施例中的抗体)。这些方法和其它方法是本领域公知的，参阅如A. Coombes等，1997.必1VwifltenV1/s 18:1153-1161。
对共价结合而言，可以通过本领域已知的手段将靶向部分上的化学 反应性基团与受控释放运载体(例如纳米颗粒)外层上的化学反应性基 团偶联。例如，明胶中赖氨酸基团提供的氨基可以与活化的靶向部分偶
联(例如使用碳二亚胺作为羧基激活剂时)，使其对氨基具有反应性a 在备选的实施方案中，亲和素或链霉亲和素可以与纳米壳的外表面共价
结合，然后生物素化的乾向部分可以与纳米壳表面有效偶联(Wilchek, 等，fw^w/.， 184:5-13， (19卯))。类似地，A蛋白可以整合进纳米球 的外壳中，并用于结合免疫球蛋白靶向部分。
受控释放的运载体和乾向部分可以直接缀合或通过连接组件缀合。 例如，含有羧基的分子可以通过预先形成的反应性酯(如N-羟基琥珀 酰亚胺酯)或是通过碳二亚胺所介导的反应原位缀合的酯而与耙多肽中 赖氨酸的氨基接合。这同样适用于含有磺酸基的分子，其中磺酸基可以 转化为与氨基反应的磺酰基氯化物。具有羧基的分子可以通过原位碳二 亚胺方法与氨基(如多肽上的氨基)接合。分子也可以附着在丝氨酸或 苏氨酸残基的羟基上，或者附着在半胱氨酸残基的巯基上。
接合组分时可以使用异双功能交联试剂。这些试剂使一条链中的 官能团与另一条链中的不同官能团结合。这些官能团包括氨基、羧基、 巯基和醛。有许多适当部分的排列组合可以与这些基团及不同结构反 应，以将其缀合在一起(参阅Merrifield等，C访a i^imrf &附/>. 186: 5-20 (1994))。
用于制备本文所公开缀合物的反应基团和反应类型一般是生物缀 合物化学领域中共知的。反应类型包括在相对温和的条件下进行的反 应。它们包括担不限于例如亲核取代(例如胺和醇与酰卣、活性酯的反 应)、亲电取代(例如烯胺反应)和对碳-碳和碳-杂原子重键的加成(例 如Michael反应)。这些反应和其它有用的反应在例如Morrison等， Ore附is^，第四版，Allyn and Bacon, Inc. (1983)和Hermanson， 说V cw(/"，e 7^cA/i/《《^s， Academic Press, San Diego(1996)中有所讨论。例如，有用的反应官能团包括(a)羧基及其多种衍生物，包括担不限于N-幾基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰基卣、酰基咪唑、疏酯、对硝基苯基酯、烷基、链烯基、炔基和芳香酯；(b)羟基，其可以转化为酯、醚、醛等；(c)卣代烷基，其中所述由化物在之后可被亲核基团例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、负碳离子或醇盐离子所取代，从而导致新基团共价附着在卣素原子的位点上；(d)能够参与Diels-Alder反应的亲双烯体基团，例如马来酰亚胺(maleimido)基团；(e)羰基，以使得有可能通过形成羰基衍生物(例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟)或通过如Grignard加成或烷基锂加成等机制进行随后的衍生；(f)用于随后与胺反应例如形成磺酰胺类的磺酰基；(g)巯基，其可以转化为二硫化物或与酰卣反应；(h)胺基或巯基，其可以被例如酰化、烷基化或氧化；(i)烯烃，其可以进行例如环加成、酰化、Michael加成等等；(j)环氧化物，其可以与例如胺和羟基化合物反应；以及(k)亚磷酰胺和适用于核酸合成中的其它标准官能团。
在一个实施方案中，受控释放的运栽体与干细胞接触，由此通过胞吞作用或胞饮作用进入干细胞，或通过乾向部分与相应的结合配偶体的特异性结合而附着在干细胞表面上。然后将修饰的干细胞引入受试者。
在另一个实施方案中，受控释放的运载体通过共价附着而附着在干细胞上。例如，可以使用含有亲电基团的偶联化合物将靶向部分衍生化并与干细胞结合，所述亲电基团会与干细胞上的亲核物质反应形成键间关系(interbonded relationship)。这些亲电子基团的代表是a、卩不饱和羰基、烷基卣化物和巯基试剂，如取代的马来酰亚胺。另外，偶联化合物可以通过靶向部分中的一个或多个官能团(如氨基、羧基和酪氨酸基团)与靶向部分偶联。为此，偶联化合物应当含有游离的羧基、游离的氨基、芳香氨基以及和能够与酶官能团反应的其它基团。也可以制备高度带电的靶向部分衍生物，用于通过静电键合固定在干细胞上。这些衍生物的实例包括多聚赖氨酰基和多聚谷氨酰基的酶。
对衍生物中所包含反应基团的选择取决于将亲电物质与干细胞上的亲核基团偶联以进行固定时所使用的反应条件。 一个因素是在偶联通过与干细胞结合而被固定的靶向部分之前不要使偶联剂失活.
30这类偶联固定反应可以以多种方式进行。偶联剂可用于在大分子 与干细胞之间形成桥。在该情况下，偶联剂应当具有能够与靶向部分反 应的官能团，如羧基。制备大分子衍生物的一个途径包括在偶联剂中使 用羧基，以形成与靶向部分反应的混合酸酐，其中使用能够形成混合酸 酐的活化剂。这类活化剂的代表是异丁基氯甲酸酯或与偶联剂(如
5，5，-(二硫代双(2_硝基苯甲酸)(DTNB)、对氯汞苯甲酸(CMB)或间马来 酰亚胺苯甲酸(MBA))产生混合酸酐的其它氯甲酸酯。偶联剂的混合酸 酐与耙向部分反应产生反应性衍生物，所述反应性衍生物随后可与干细 胞上的亲核基团反应，以固定大分子。
可以用碳二亚胺和类似的活化剂来活化靶向部分上的官能团，如 羧基。相应地，桥接剂上的官能团如氨基会与靶向部分上被活化的基团 形成反应性衍生物。另外，偶联剂应当具有第二反应基团，它会与干细 胞上适当的亲核基团反应形成桥。典型的这类反应基团是烷化剂如碘乙 酸、ou p不饱和羰基化合物如丙烯酸等、巯基试剂如汞制剂、取代的 马来酰亚胺等等。
或者，可以活化靶向部分上的官能团，从而与干细胞上的亲核物 质直接反应，以避免对成桥化合物的需要。为此，使用活化剂如 Woodward's试剂K或类似的试剂，所述试剂4吏把向部分中的羧基形成 烯醇酯类，与混合酸酐不同。靶向部分的烯醇酯类衍生物会随后与干细 胞上的亲核基团反应，以实现大分子的固定。
药物组合物的配方
修饰的干细胞可以掺入适于施用的药物组合物中。药物组合物通 常以适合施用于受试者的形式包含基本纯化的修饰干细胞和可药用栽 体。可药用载体部分由所施用的具体组合物以及用于施用该组合物的具 体方法来决定。因此，有多种药物组合物的合适配方可用于施用修饰的 干细胞(参阅如/ eiw/rtgtow，s i^flf附flceMft'cfl/ Sc/ewces, Mack Publishing Co.， Easton， PA第18版.(19卯))。可药用组合物通常配制为无菌的、基 本等渗的，并完全符合美国食品及药物管理局的所有质量管理规范 (Good Manufacturing Practice, GMP)的规定。
当涉及组合物、载体、稀释剂和试剂时，术语"可药用"、"生理可耐受的"及其语法上的变形可互换使用，表示材料能够施用于受试者，而不产生程度会阻止施用该组合物的不想要的生理作用。例如，"可药用赋形剂"表示适用于制备药物组合物的赋形剂，其通常是安全、无毒和理想的，并包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。这类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或对于气溶胶组合物的情况是气态的。本领域常规技术人员能够确定施用具体药物和组合物的适当时间、顺序和剂量。
这类载体或稀释剂的实例包括担不限于水、盐水、林格液、葡萄
糖溶液和5 %人血清白蛋白。这类介质和化合物用于药物活性物质的用途是本领域共知的。除了在任何常规介质或化合物与修饰干细胞不相容的情况以外，其在组合物中的用途均考虑在内。也可以向组合物中掺入补充性活性化合物。
将药物组合物配制成与其期望的给药途径相容。修饰干细胞可以通过肠胃外、局部、静脉内、经口、皮下、动脉内、真皮内、透皮、直肠、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内、肌内途径给药，或作为吸入剂给药。修饰的干细胞可任选地与在治疗多种疾病中至少部分有效的其它药剂组合施用。
在一个实施方案中，收获细胞后，通过短暂离心浓缩修饰的细胞。可进一步洗涤细胞并重悬于最终的临床可用溶液中，如盐水、緩冲盐水中，或者重悬于储存或休眠溶液中。或者，可以将细胞重悬于冷冻介质(如添加了二曱亚砜或任何其它合适的抗冻剂的介质)中并冷冻保存。
将溶液配制成在延长的时间中维持活细胞的生存力。在一个实施方案中，储存溶液可以适用于以即用型制剂的形式将活细胞运送至移植手术地点立刻使用。将活细胞运送至远方地点的合适条件也包括隔热设
备，所述隔热设备能够将约ox:和约20"c之间的合适温度范围维持至少
24小时。在约O匸和约81C之间储存约24小时到约48小时的活细胞可植入用于治疗疾病或状况。
在一个实施方案中，将细胞浓缩在溶液中，如上文所述的临床可用溶液。在一个实施方案中，将细胞浓缩至与施用细胞时的细胞密度相同或不同的适当细胞密度。在一个实施方案中，用于施用的细胞密度可
32以为每微升约l，OOO个细胞至每微升约l，OOO，OOO个细胞，这取决于下述
因素，如注射部位、注射部位的神经变性状态、有益效果所需的最小剂量和毒副作用方面的考虑。在一个实施方案中，本文公开的方法包括以
每微升约5,000到约50,000个细胞的细胞密度来注射细胞。
用于悬浮扩增细胞以递送至治疗区域的培养基体积在本文中可以称作注射体积。注射体积取决于注射部位和组织状态。更特别地，注射体积的下限可以通过高细胞密度的粘稠悬液的实际液体操作以及细胞聚集的趋势来确定。注射体积的上限可以通过注射体积所施加的避免伤害宿主组织所需压力界限以及实际的手术时间来确定。
可以通过将修饰的干细胞以需要的量掺入适当的介质中来制备无菌注射液，所述介质中根据需要含有上述成分之一或其组合。 一般地，
通过将修饰的干细胞掺入无菌运栽体中来制备分散系，所述无菌运栽体中含有基本分散介质和必需的上述其它成分。可以以允许活性成分持续
释放或脉冲式释放的方式配制而成的储库注射(depot injection)或植入物制剂的形式施用修饰的干细胞。
在一个实施方案中，将修饰的干细胞会保护修饰的干细胞不被身体快速清除的载体制备在一起，例如受控释放的配方，包括植入物和微嚢剂递送系统。
方法
本部分将对修饰干细胞组合物之使用方法的一些实施方案进行一般性描述。之后的部分中描述具体应用的更多细节。
在一个方面中，本发明提供使用修饰的干细胞来负载抗肿瘤剂并在乾细胞(例如胶质瘤细胞)附近释放的方法。因此，使用干细胞对胶质瘤细胞的趋向性将抗肿瘤剂递送给肺瘤。在一个实施方案中，可将修饰的干细胞施用给手术后的受试者。在一个实施方案中，可将修饰的干细胞施用给由于一种或多种原因而没有和/或不能进行手术或常规放射疗法或化学疗法的受试者。
坏胶质瘤细胞。例如，修饰的干细胞可包含负栽有一种或多种治疗剂(例如抗肿瘤剂)的干细胞，所述治疗剂在想要的位置从修饰的干细胞上释 放。这样，使得赘生细胞与相对高浓度的试剂紧密接触。如上所述，修 饰的干细胞可以负载一种或多种化学治疗剂，用于将其靶向递送至赘生 细胞。
本发明提供了对受试者施用或移植修饰干细胞的方法。当修饰的 干细胞从容器中转移至患者时，称其被施用于受试者。施用可以包括分 离干细胞和将干细胞移植至受试者的步骤。移植可包括通过以下方法将
干细胞转移进入受试者将细胞悬液注射进受试者、将细胞量(cell mass) 手术植入受试者的组织或器官、或用细胞悬液灌注组织或器官。转移干 细胞或移植的途径将根据具体组织或器官中对细胞居留的需求来确定， 以及根据细胞寻找预期靶組织或器官并被其固定的能力来确定。在移植 的细胞要在特定位置居留的情况下，可将其手术置入组织或器官中，或 如果细胞具有迁移至目的靶器官的能力时简单地注射进血流中。
例如，可如下治疗需要本文所述的修饰干细胞的受试者。可以通 过注射或任何其它方法，将修饰的干细胞施用于受试者，例如在生物相 容的溶液中或在药物可用的递送运载体中施用。 一个实施方案是注射进 受试者的颅骨中。施用的剂量在患者之间有所不同、"治疗有效剂量" 可以通过例如但不限于肿瘤尺寸或体积减小的水平来确定。通常，包含 干细胞的组合物会在每kg体重105-108个细胞或每kg体重106-107个细 胞的范围内以单剂量施用，该剂量可以每天、每周、每月、每年重复， 或按照治疗医生认为合适的方式重复给药。也可以从患者中取出细胞群 或以其它方式提供细胞群；离体扩增；与含抗肿瘤剂的受控释放运载体 接触；然后再次引入患者中。
在一个方面中，本发明提供一种或多种修饰干细胞的方法，包括 将干细胞与一种或多种受控释放的运栽体接触。在一些实施方案中，受 控释放运载体的靶向部分被设计成识别一种或多种干细胞。
具体实施例方式
本发明通过以下的实施例进一步进行说明，这些实施例不应认为 是以任何方式进行限制。实施例1-制备负栽有抗肿瘤剂的硅酸盐纳米颗粒
浙务*^^介^二真必磁承#力秀浙遽逸系鍵。通过如Li等， "Hollow spheres of mesoporous aluminosilicate with a three-dimensional pore network and extraordinarily high hydrothermal stability." TVa/io丄饥 3:609-612 (2003)中所述的方法制备中空的介孔二氧化硅(hollow mesoporous silica, HMS)球。如Vallet-Regi等，C7^附.她,w 13:308-311 (2001); Mufioz等，CAe附.A/afer 15:500—503 (2003)以及Horcajada等， JWiVro/wra"s A/^o/;www 3f"fer 68:105-109 (2004)中所述采取药物储存模 式。
逸合戎伴^劲^颖在。用2-羧乙基磷酸修饰纳米颗粒的表面，形 成带有-COOH基团作为侧基的颗粒。通过纳米颗粒的羧基(-COOH)与 抗体的氨基(-NH2)之间的酰胺化将这些经羧基官能化的颗粒与抗体偶 联，所述酰胺化通过2,2-(亚乙二氧基)双乙胺(使用碳二亚胺的一种亲 水接头)来实现。纳米颗粒和抗体的修饰和缀合描述于Mohapatra等, TVflwotec^wo/o^ 18:385102 (2007)中。
实施例2-负载有抗肿瘤剂的SiO^纳米颗粒在体外杀伤胶质瘤细胞
如实施例1所述制备硅酸盐(Si02)纳米颗粒，其用CD90抗体标记 并负载有阿霉素。体外测试该材料对C6胶质瘤细胞的作用。向细胞培 养基中添加负载有阿霉素的用抗-CD90标记的Si02纳米颗粒，持续24 小时。然后向培养基中添加C6肺瘤细胞。24和48小时后在显微镜下 监测细胞的状况。细胞最初表现正常(图1A)，但是从24小时(图1B) 到48小时(图1C)细胞越来越丧失生存力。因此，负载有阿霉素的用 抗-CD卯标记的Si02纳米颗粒在体外可有效杀伤胶质瘤细胞。
使用磺酰罗丹明B(sulforhodamine B， SRB)蛋白质测定法来评估 细胞的生存力或生长。SRB测试显示，48小时处C6细胞的细胞生存力 为接触负载有抗肺瘤剂的Si02纳米颗粒的对照组的近20%。这些结果 表明，装栽有抗肿瘤剂的Si02纳米颗粒适用于治疗胶质瘤的方法中， 所述方法中使这些纳米颗粒与胶质瘤细胞接触。
实施例3 —使用以CD卯标记的SiO，纳米颗粒来靶向干细胞将抗CD90和FITC与Si02纳米颗粒组合，使该纳米颗粒能够在 荧光显微镜下显现。洗涤抗CD90-FITC-SiO2纳米颗粒并使用0.22 jim 滤器过滤。Si02纳米颗粒直径是250-300 nm，园此被滤器捕获。
分庠人M9C。从健康的人供体(28-46岁)收集骨髄样品。根据 先前报道的方法分离和培养人MSC (Haynesworth等，5卵e， 13:81-87 (1992); Lennon等/" F^y CW/ 及V /, 32:602-607 (1996); Pittenger等 及V /CW/， 7:305-309 (1996))。简言之，将来自骨髄抽吸物的细胞收集 在肝素中，并用1.073 g/ml Percoll溶液(Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.)分级。接着在界面上收集单个核细胞并以每个185 112瓶中3 xi(T个 细胞的密度铺在Dulbecco改良的Eagles培养基-低葡萄糖(DMEM-LG) (Invitrogen, Grand Island, N.Y.)中。人MSC培养基由补充了 10%胎牛 血清(FBS)的DMEM组成。成纤维细胞样细胞贴壁并生长，在最初铺板 后约5-7天产生可见的对称集落。在随后的培养基更换中，洗去爭》散附 着或未贴壁的细胞，包括最初存在于分离的Percoll级分中的造血谦系。 当培养物达到卯％汇合时，使用胰蛋白酶-EDTA (Life Technologies)将 细胞传代，并以每个185 112瓶中lxl(^个细胞的密度再铺板。这些细 胞扩增并仍保持为单层，并在第11-14天进行常规传代。
炎"f勿應》我戎琳韵^颖在。通过紫外光或75%乙醇对纳米颗粒 灭菌，所述纳米颗粒在使用之前是黑色的细粉。接着将颗粒放入细胞培 养基中并涡旋。使用20 pm滤器过滤不溶材料。将来自人骨髓的MSC 以l-2xl0"cm2铺在25 112瓶中。当细胞约90 %汇合时，将它们在含有 纳米颗粒的培养基中培养24小时。用HBSS或D-PBS将细胞洗涤3-5 次，以去除未结合干细胞的残留纳米颗粒。
如上所述将MSC与抗CD卯-FITC-SK)2纳米颗粒接触，并使用荧 光显微术成像。结果显示在图2中。图2A和图2D分别显示低倍镜和 高倍镜下的MSC。图2B和2E显示图A和D中细胞的FITC荧光。图 2C显示图A和B的叠加图像。图2F显示图D和E的叠加图像。这些 结果表明，抗CDM-FITC-Si02纳米颗粒在体外被MSC有效吸收。
实施例4-制备用于移植的修饰干细胞
在如实施例3中所述进行培养后，在第3和6代收集负栽有纳米颗粒的干细胞。用胰蛋白酶使细胞分开并用胰蛋白酶抑制剂处理，以终
止消化。收集细胞并以IOO，OOO个细胞/fil的密度重悬在无菌PBS中0.6 %葡萄糖中含有2 % B27补充剂的移植培养基(Leibowitz, L-15; Sigma) 中至。细胞在移植操作过程中维持在41C。
实施例5-使用修饰的干细胞在灵长类模型中治疗胶质瘤
在本实施例中，使用修饰的干细胞在疾病动物模型中治疗胶质瘤 (例如癌症)。在一种情况下，将带有受控释放运载体与抗肿瘤剂的修 饰干细胞靶向至受试动物体内已知或怀疑存在的胶质瘤。将修饰的干细 胞肠胃外给药，或者在胶质瘤位点附近直接注射进受试者的颅骨内。例 如，根据先前描述的方案，灵长类受试者可接受注射带有纳米颗粒的干 细胞(Kordower等5We/ice 2卯:767- 773 (2000))。
抗肿瘤剂从受控释放的运栽体中释放，并与一个或多个胶质瘤细 胞接触，从而损伤或破坏细胞.通过以下来评价疗效赘生细胞数减少 或赘生细胞消失、肿瘤尺寸减小、抑制肺瘤转移(即在一定程度上延緩 以及优选地终止转移)、在一定程度上抑制胂瘤生长、提高减轻的时长， 和/或在一定程度上緩和一种或多种与癌症相关的症状。
实施例6-使用修饰的干细胞在人受试者中治疗胶质瘤
在本实施例中，将<务饰的干细胞用于治疗胶质瘤(如癌症)。在一 种情况下，将带有受控释放运栽体与抗肺瘤剂的修饰干细胞靶向至受试 者体内已知或怀疑存在的胶质瘤。修饰的干细胞可肠胃外给药，或者在 胶质瘤位点附近直接注射进受试者的颅骨内。
抗肿瘤剂从受控释放的运载体中释放，并与一个或多个胶质瘤细 胞接触，从而损伤或破坏细胞。通过以下评价疗效赘生细胞数减少或 赘生细胞消失、肺瘤尺寸减小、抑制肿瘤转移(即在一定程度上延緩以 及优选地终止转移)、在一定程度上抑制肺瘤生长、提高减轻的时长， 和/或在一定程度上緩和一种或多种与癌症相关的症状。
等同方案
本发明不仅限于本申请中所述的具体实施方案，这些实施方案仅
37旨在阐述本发明的单个方面。对于本领域技术人员而言显而易见的是， 可以进行许多修改和改变，而不偏离其构思和范围。结合上文的描述， 本发明范围内除本文所列举以外的功能等同的方法和组合物对于本领 域技术人员而言将是很明显的。这些修改和改变旨在与权利要求书所述 等同方案的完整范围 一起落入权利要求书的范围内。本发明仅受限于所 附的权利要求书以及这些权利要求中所述等同方案的完整范围。应当理 解，本发明不受限于具体的方法、试剂、化合物组合物或生物体系，它 们当然是可以变化的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体的 实施方案，而不旨在限制。
另外，当以马库什组的形式描述本发明的特征或方面时，本领域 技术人员会明白，本文也涵盖了该马库什组的任何个体成员或成员亚组 而言的描述。
就像本领域技术人员可以理解的那样，对于任何及全部目的，特别 是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还包括任何及全部可能的小 范围及其小范围的组合。任何列出的范围可以4^易地认为是对同 一范围 分成相等的至少两部分、三部分、四部分、五部分、十部分等而进行了描 述。作为非限制性的实例，本文讨论过的每个范围可以容易地分为前三分 之一、中间三分之一和后三分之一等。本领域技术人员还会理解，词语例 如"多至"、"至少"、"多于"、"少于"等包括所提到的数值，并指可以如 上所述分成小范围的范围。最后，本领域技术人员会理解，范围包括每个
个体成员。因此，例如，含有1-3个细胞的组是指含有1个、2个或3个 细胞的组。类似的，含有1-5个细胞的组是指含有1个、2个、3个、4个 或5个细胞的组，依此类推。
尽管本文公开了多个方面和实施方案，但其他方面和实施方案对于 本领域技术人员来说也是显而易见的。本文公开的多个方面和实施方案仅 用于说明目的而非限制，真正的范围和构思由以下的权利要求进行说明。
权利要求
1.修饰的干细胞，其包含干细胞和至少一种受控释放的运载体，其中所述至少一种受控释放的运载体包含至少一种抗肿瘤剂和至少一个靶向部分，且其中所述修饰的干细胞的特征是能够靶向一种或多种胶质瘤细胞。
2. 权利要求l的修饰的干细胞，其中所述至少一种受控释放的运 载体选自纳米颗粒、生物相容性聚合物、聚合物基质、脂质体和脂质球。
3. 权利要求1到2中任一项的修饰的干细胞，其中所述至少一种受 控释放的运载体包含至少一种纳米颗粒。
4. 权利要求3的修饰的干细胞，其中所述纳米颗粒具有约IO到约 600腿的直径。
5. 权利要求3的修饰的干细胞，其中所述纳米颗粒具有约200到约 400腿的直径。
6. 权利要求3的修饰的干细胞，其中所述纳米颗粒是硅酸盐纳米壳。
7. 权利要求6的修饰的干细胞，其中所述硅酸盐纳米壳中载有所 述至少一种抗肿瘤剂。
8. 权利要求1到7中任一项的修饰的干细胞，其中所述受控释放的 运栽体具有受控的释放速率。
9. 权利要求8的修饰的干细胞，其中所述受控的释放速率是约5 天到约31天。
10. 权利要求1到9中任一项的修饰的干细胞，其中所述干细胞选 自间充质干细胞、神经干细胞和胚胎干细胞。
11. 权利要求1到10中任一项的修饰的干细胞，其中所述至少一个 靶向部分与所述受控释放运载体的表面缀合。
12. 根据权利要求1到11中任一项的修饰的干细胞，其中所述至少 一个靶向部分是抗体或其片段。
13. 权利要求12的修饰的干细胞，其中所述抗体是单克隆抗体或多 克隆抗体或其片段。
14. 权利要求1到13中任一项的修饰的干细胞，其中所述至少一个靶向部分与干细胞上的表面抗原特异性结合。
15. 权利要求14的修饰的干细胞，其中所述表面抗原选自CD105 (SH2)、 CD73(SH3/4)、 CD44、 CD90 (Thy-1)、 CD71、 Stro隱l、 CD106 和CD166。
16. 权利要求14的修饰的干细胞，其中所述表面抗原是CD90。
17. 权利要求1到16中任一项的修饰的干细胞，其中所述至少一种 抗肿瘤剂选自化学治疗剂、基于蛋白质的药物和基于核酸的药物。
18. 权利要求1到17中任一项的修饰的干细胞，其中所述至少一种 抗肿瘤剂选自天冬酰胺酶、阿霉素、生物碱、烷化剂、六甲蜜胺、安吖 啶、抗代谢物化合物、抗肿瘤抗生素、硫唑喋呤、硫酸博来霉素、白消 安、喜树碱、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰 胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、多西紫杉醇、盐酸 多柔比星、表鬼臼霉素、盐酸表柔比星、雌莫司汀磷酸钠、依托泊苷、 磷酸依托泊苷、非那雄胺、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、促性腺素释放激 素激动剂(GnRH)、戈舍瑞林、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、 伊立替康、洛莫司汀、马立马司他、氮芥、盐酸氮芥、美法仑、巯嘌呤、 甲氨喋呤钠、丝裂霉素、米托坦、盐酸米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、 鬼臼毒素、卟吩姆钠、盐酸丙卡巴阱、放射性治疗剂、链佐星、苏拉明、 他莫昔芬、紫杉烷、泰素、替尼泊苷萜类、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替 派、TNP470、拓朴异构酶抑制剂、托泊替康、维A酸(全反式视黄酸)、 长春碱、硫酸长春碱、长春花生物碱、长春新碱、硫酸长春新碱、长春 地辛、硫酸长春地辛和酒石酸长春瑞滨。
19. 权利要求1到18中任一项的修饰的干细胞，其中所述纳米颗粒 还包含标记部分。
20. 权利要求19的修饰的干细胞，其中所述标记部分是异硫氰酸荧 光素(FITC)。
21. 药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项的修饰的干细胞以 及可药用载体。
22. 用于治疗胶质瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施 用治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的修饰的干细胞。
23. 权利要求22的方法，其中所述施用是全身性施用。
24. 权利要求22的方法，其中所述施用是局部施用。
25. 权利要求24的方法，其中所述局部施用包括注射进受试者的烦内。
26. 延緩胶质瘤生长或降低胶质瘤体积的方法，所述方法包括向有 此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的修饰 的干细胞。
27. 权利要求1-20中任一项的修饰的干细胞用于制造治疗胶质瘤 的药物的用途。
28. 用于治疗胶质瘤的药盒，所述药盒包含权利要求1-20中任一项 的一种或多种修饰的干细胞，以及所述一种或多种修饰的干细胞的使用 说明。
29. 产生修饰的干细胞的方法，所述方法包括将干细胞与至少一 种受控释放的运载体接触，所述受控释放的运载体具有至少一种抗肿瘤 剂和至少一个靶向部分。
全文摘要
本发明涉及抗肿瘤药物的干细胞递送。本发明提供修饰的干细胞，其包含干细胞和至少一种受控释放的运载体，其中所述至少一种受控释放的运载体包含至少一种抗肿瘤剂和至少一个靶向部分，其中所述修饰干细胞的特征是能够靶向一种或多种胶质瘤细胞。本发明还提供药物组合物、药盒以及通过施用治疗有效量的修饰干细胞来治疗胶质瘤、延缓胶质瘤生长或降低胶质瘤体积的方法。
文档编号A61K35/28GK101658533SQ200810146798
公开日2010年3月3日 申请日期2008年8月29日 优先权日2008年8月29日
发明者关云谦, 愚 张, 凌 陈 申请人:首都医科大学宣武医院