专利名称：药用化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及对包含雌激素受体阳性(ER+)癌细胞的癌症的治疗，特别是乳腺癌的 治疗。本发明人提供了包含药用组分和毒素组分的偶联物。所述偶联物具有靶向和消灭 ER+癌细胞的优异能力。
背景技术：
在全世界的女性中乳腺癌是最常见的癌症，也是最常见的癌症致死原因。据信乳 腺癌由各种因素导致，这些因素之一是雌激素的血浓度的升高。在雌激素受体族领域及雌 激素受体癌细胞与正常雌激素受体细胞之间的差异方面已经进行了许多研究。这些研究的 目标一直以来都针对着对可以通过抑制体内雌激素生成来治疗乳腺癌的药物的发现。
这种类型的癌症之一包含携带雌激素受体的细胞(ER+细胞)。这些细胞是带有大 量雌激素受体(通常为约200000 5000000个)的细胞。正常的非癌性雌激素受体细胞 通常会有约20000 80000个雌激素受体。由于大量雌激素受体的存在，癌细胞在雌激素 存在时响应于即便是少量的激素而具有增加的分裂速度。 Surgical Oncology 12 (2003) 277-287 (Soo Lo， St印hen R.D.Johnston)中讨论
了对乳腺癌的新型系统治疗。这些新型系统治疗包括诸如纯抗雌激素和选择性雌激素受体 调节剂(SERM)等内分泌治疗、靶向生长因子受体的单克隆抗体、小分子信号转导抑制剂、 疫苗及免疫治疗策略以及抗血管生成治疗。 已在雌激素受体阳性癌症的治疗中显示出疗效的一种药物是他莫昔芬。他莫昔芬 是选择性雌激素受体调节剂(SERM)的一个实例，其通过与细胞表面上的雌激素受体结合 和防止雌激素与细胞结合并由此抑制细胞分裂，从而起到雌激素受体阳性癌细胞的拮抗剂 的作用。虽然他莫昔芬是乳腺组织中的拮抗剂，但其充当子宫内膜上的部分激动剂，且已发 现其与某些女性的子宫内膜癌有关联。因此，子宫内膜的变化(包括癌症)是他莫昔芬的
副作用之一。 另据提出，他莫昔芬和卟啉的偶联物可能在癌细胞的光动力治疗中有效， 从而所述卟啉在暴露于红光时显示出光毒性活性，并且其与未偶联的卟啉相比对于 MCF-7乳腺癌细胞具有更强的细胞杀伤。在Bioinorganic & medicinal Chemistry 10 (2002) 3237-3243 (Swamy，James，Mohr， Hanson和Ray)中，还描述了选择性定位于雌激素 受体阳性乳腺癌细胞中的用于乳腺癌光动力治疗的雌二醇_卟啉偶联物。
其治疗癌症的有效性已得到研究的其它偶联物包括抗体毒素偶联物。British Journal of Haemotology 2000， 110， 351-361 (Bolognesi， Polito等)公开了将诸如皂草 素(s即orin)等核糖体失活蛋白与单克隆抗体连接以用于霍奇金淋巴瘤的治疗。然而，迄 今还没有已经成功通过人类试验成为许可产品的产品问世。 虽然市场上用于治疗癌症、特别是乳腺癌的现有药物和治疗确实能够减缓这些癌 细胞的分裂，但是，几年之后细胞变异使得这些药物对于这些细胞不再有效，药物变得无 用，而患者对于治疗没有响应。
因此，本发明的目的是提供一种对于ER+癌症(特别包括这种乳腺癌)的新型治 疗，所述治疗通过消灭ER+癌细胞而不是像其它SERM和治疗所做的仅仅降低这些癌细胞的 细胞分裂速度从而解决上述问题。 通过下文中概述的本发明的各个方面和实施方式解决了上述问题。
发明内容
因此，本发明提供一种化合物，所述化合物包含
(a)能与ER+细胞受体结合的第一组分；禾口
(b)第二组分； 其中，所述第二组分为核糖体失活毒素并与所述第一组分偶联。
第一组分能够与包含雌激素受体的细胞(所谓的ER+细胞)结合，换言之，能够与 ER+细胞受体或雌激素细胞受体结合。如上文所提及，在本说明书中，ER+细胞受体为雌激 素受体阳性细胞受体(ER+)。这些ER+细胞受体可以存在于许多细胞类型上，而本发明扩 展至能够与所有ER+受体结合而与细胞类型无关的组分。然而，本发明感兴趣的细胞通常 为一般具有大量的雌激素受体(通常为约200， 000 5， 000， 000个)的癌细胞。本发明特 别感兴趣的是所有类型的乳腺癌细胞。相比之下，正常的非癌性雌激素受体细胞通常有约 20， 000 80， 000个雌激素受体。 第一组分的具体身份不受特别限制，只要其符合上述标准即可。然而，在优选实施
方式中，第一组分为选择性雌激素受体调节剂(SERM)，例如雷洛昔芬化合物。 在本发明中，核糖体失活毒素通常为蛋白(核糖体抑制蛋白毒素被称为RIP毒
素)，并且优选的是，RIP为I型RIP。通常，这种蛋白通过不可逆地阻断蛋白合成和导致细
胞死亡来发挥作用。毒素的具体身份不受特别限制，只要其符合上述标准即可。在优选实
施方式中，毒素为皂草素。 在优选实施方式中，该化合物的第一组分与第二组分的化学计量比为0.5 : l N : l，其中N是第一组分在第二组分中的结合位点的总数。结合位点不受特别限制，但所 述结合位点应该能将第一组分与第二组分结合。 一般而言(不排除其它情况)，结合位点 为酪氨酸或赖氨酸。在皂草素中，存在至多14个酪氨酸结合位点和至多23个赖氨酸结合 位点，它们各自均能独立地充当第一组分的结合位点(即，N二 14、N二23或N二37，这取 决于是否仅使用酪氨酸连接点、仅使用赖氨酸连接点或同时使用酪氨酸和赖氨酸连接点)。
由此，其范围优选为o. 5 : 1 37 : i，优选为o. 5 : i 23 : i，更优选为o. 5 : l
14 : i。然而，根据哪些附着点被使用，可以采用这些范围内的任何比例。 在更特别优选的实施方式中，第一组分与第二组分的化学计量比为0.5 : l
8 : i(优选o.5 : 1 小于8 : i)，更优选为o.5 : 1 2.5 : i。化学计量比还优选为 0.5 : i 7 : i、o.5 : i 6 : i、o.5 : i 5 : i、o.5 : i 4 : i、o.5 : i 3 : i 和o. 5 : i 2 : i 。 在这方面，化学计量比既指平均化学计量比，也指分子化学计量比。例如，包含等 比例的分子化学计量比为i : i的偶联物(即，每个第二组分分子与一个第一组分分子偶 联)和分子化学计量比为3 : i的偶联物(即，每个第二组分分子与三个第一组分分子偶 联)的混合物具有2 : i的平均化学计量比。在此方式下可能出现非整数的化学计量比。
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本发明还提供了含有任何上述化合物的药用组合物。 在另一个方面，本发明提供了任何上述的化合物和组合物在医学中的应用。
本发明的另一个方面提供了将任何上述化合物或组合物用于制造用于治疗包含 ER+细胞的癌症的药剂的应用。ER+细胞癌症的类型不受特别限制，但是特别优选的是，该 癌症为乳腺癌。所述药剂适合治疗任何哺乳动物，特别优选人类受试对象。施用方法不受 特别限制，但是优选的是，药剂适于注射或输注(静脉内或其它方式)到受试对象中或者经 口服施用于受试对象。 药剂的使用剂量不受特别限制，只要提供足以满足疗效和毒性要求的剂量即可。
在本发明的优选实施方式中，药剂适于注射到受试对象中以使偶联物的峰值血药浓度达到
相当于第一组分以未偶联形式使用时的临床峰值血药浓度的1% 500%。 在本发明的进一步优选的实施方式中，药剂适于注射到受试对象中以达到第一组
分以未偶联形式使用时的临床峰值血药浓度的80 % 140 % 。 在这方面，雷洛昔芬的目标血药浓度基于雷洛昔芬在血液中的人类标准治疗峰值 浓度(即0. 5ng/ml)。 本发明还提供了任何上述化合物的制造方法，所述方法通过将第一组分与第二组 分反应以将第一组分与第二组分偶联来进行。 本发明还提供了包含ER+细胞的癌症、特别是乳腺癌的治疗方法，所述方法包括
对受试对象施用药剂，其中，所述药剂包含任何上述的化合物或组合物。 本发明人惊讶地发现，本发明的偶联化合物和组合物提供了对ER+癌细胞的有效
治疗，其使用导致每日肿瘤体积最初显著减小，并使肿瘤生长速度的减小得到加快或持续，
同时没有显著影响非癌性ER+细胞。
下面将参考以下讨论及附图，仅通过实例的方式进一步详细描述本发明，附图 中 图1显示的是暴露于浓度递减的不同皂草素雷洛昔芬(S : R)偶联物的MCF-7、
HCC-1143和0VCAR-3细胞单层的存活率。根据标准乳酸脱氢酶(LDH)释放测试来计算各细
胞系的细胞存活率(％ )，其中最小释放(存活率为0% )对应于使用50 ii g/ml的丝裂霉素
C处理的细胞，最大释放(100% )存活率对应于仅用完全培养基处理的细胞。 图2显示的是暴露于500nM雷洛昔芬皂草素为2 : 1的偶联物(S : Rl : 2偶
联物)或皂草素(500nM)、雷洛昔芬(1000nM)以及皂草素(500nM)和雷洛昔芬(1000nM)
的共混物(即，未偶联)的摩尔浓度等价物(molarconcentration equivalent)的MCF-7、
HCC-1143和0VCAR-3细胞单层的存活率。根据乳酸脱氢酶(LDH)释放测试来计算各细胞
系的细胞存活率(％ )，其中最小释放(存活率为0% )对应于使用50 ii g/ml的丝裂霉素C
处理的细胞，最大释放(100% )存活率对应于仅用完全培养基处理的细胞。 图3显示的是在使用磷酸盐缓冲盐水(PBS) 、0. 4ng/ml雷洛昔芬或0. 4nM雷洛昔
芬皂草素为2 : i的偶联物(s : r i : 2)治疗后雌性裸鼠中已建立的MCF-7肿瘤的生
长图。接种(challenge)后的第36天和第43天，使动物通过眼球后途径接受静脉治疗。
图4显示的是与对照组和未偶联的产品相比，使用偶联物治疗的肿瘤体积的百分
6比变化。 图5显示的是与对照组和未偶联的产品相比，使用偶联物治疗的体重的百分比变 化。
具体实施例方式
本发明提供包含能与ER+细胞受体结合的第一组分以及第二组分的化合物，其 中，第二组分通常为I型RIP类毒素并与第一组分偶联。 本发明的第一组分能与ER+细胞受体结合，所述第一组分不受特别限制，只要保 持其功能性即可。然而，如上所述，已经发现任何选择性雌激素受体调节剂(SERM)化合物 都特别有用。SERM的类型不受特别限制，但可以包含任何以下化合物氟维司群、他莫昔 芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、艾多昔芬和拉索昔芬。具体而言，雷洛昔芬化合物特别有用。 第二组分是核糖体失活毒素。如已说明的那样，第二组分优选为蛋白(RIP毒素)， 并且进一步优选I型RIP。特别优选的是，所述毒素自身不能进入细胞而仅作用于细胞的内 部运转。 雷洛昔芬是用于防止绝经后女性骨质疏松的510Da选择性雌激素受体调节剂 (SERM)。近期临床试验(Vogel VG ;Costantino JP等；用于"国家手术佐剂乳腺和肠项 目 (National Surgical Adjuvant Breast and BowelPro ject (NSABP)) ，，。 Effects of Tamoxifen vs Raloxifene on the Risk ofDeveloping Invasive Breast Cancer and Other Disease Outcomes :TheNSABP Study of Tamoxifen and Raloxifene(STAR)P_2 Trial. JAMA. 2006 ;295 :2727-2741)已显示，雷洛昔芬在降低雌激素受体阳性乳腺癌的发 生率方面与他莫昔芬同样有效。但是，与每日服用他莫昔芬的女性相比，每日服用雷洛昔芬 的患者的子宫癌情况要少36%，而凝血情况要少29%。子宫癌、特别是子宫内膜癌是他莫 昔芬的严重副作用。 雷洛昔芬化合物可以采取以下结构
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用于雷洛昔芬的取代基不受特别限制，可以包括任何有机基团和/或一个或多个 来自元素周期表的11IA、IVA、VA、VIA或VIIA族中的任何族的原子，例如，B、Si、N、P、0或 S原子或卤原子(例如F、Cl、Br或I)。 当取代基包含有机基团时，有机基团优选包含烃基。烃基可包含直链基团、支链基 团或环状基团。烃基可以独立地包含脂肪族或芳香族基团。此外，烃基还可以独立地包含 饱和或不饱和基团。 当烃包含不饱和基团时，可以包含一个或多个烯烃官能团和/或一个或多个炔烃 官能团。当烃包含直链或支链基团时，可以包含一个或多个伯、仲和/或叔烷基。当烃包含 环状基团时，可以包含芳香环、脂肪环、杂环基和/或这些基团的稠环衍生物。环状基团因 此可包含苯、萘、蒽、茚、荷、吡啶、喹啉、噻吩、苯并噻吩、呋喃、苯并呋喃、吡咯、喷哚、咪唑、 噻唑和/或噁唑基，以及上述基团的位置异构体。 烃基中的碳原子数不受特别限制，但是烃基优选包含1 40个C原子。因此，烃 基可为低级烃(1 6个C原子)或高级烃(7个以上C原子，例如7 40个C原子)。环 状基团的环中的原子数不受特别限制，但是环状基团的环优选包含3 10个原子，例如3、 4、5、6或7个原子。 上述包含杂原子的基团和上述任何其它基团可以包含一个或多个杂原子，所述杂 原子来自元素周期表的IIIA、 IVA、VA、VIA或VIIA族中的任何族，例如，B、Si、N、P、0或S 原子或卤原子(例如F、 Cl、 Br或I)。因此取代基可以包含有机化学中的一种或多种任何 常见官能团，例如，羟基、羧酸基、酯基、醚基、醛基、酮基、氨基、酰胺基、亚氨基、硫醇基、硫 醚基、硫酸酯基、磺酸基和磷酸酯基等。取代基还可以包含这些基团的衍生物，例如羧酸酐 和羧酸卤化物。 另外，任何取代基都可以包含两种以上上述取代基和/或官能团的组合。
当本发明的第二组分为I型RIP类毒素时，其不受特别限制。它可以是皂草素、 MOM、PAP-S、三角梅核糖体失活蛋白(bouganin)和格拉宁素(gelanin)中的任何一种，其中 特别可将皂草素用作作为本发明的化合物和药用组合物的一部分的毒素。
皂草素是由皂草植物(肥皂草)的种子获得的30kDa的I型核糖体失活蛋白 (RIP)。皂草素的N-糖苷酶活性对核糖体RNA 28S中的特定核苷酸进行脱嘌呤，由此不可 逆地阻断蛋白合成并导致细胞死亡。皂草素也可以通过重组获得，而不仅仅是来自种子。
皂草素的类型不受特别限制，但是优选的皂草素形式是称作S0-6的形式。该 皂草素形式不寻常的地方在于其对于变性剂、蛋白酶和热具有高度稳定性。此外， 与II型RIP(例如，蓖麻毒素)相反，皂草素自身缺乏细胞结合和内化机制，因此在正 常条件下被认为是安全的(Stirpe F， Gasper-Campani A， Barbieri L， Falasca A， Abbondanza A， Stevens WA(1983)Ribosome-inactivating proteins from the seeds of Saponaria officinalis L. (soapwort)of Agrostemma githago L. (corncockle)and of Asparagusofficinalis(asparagus)and from the latex of Hura crepitans L (sandbox tree). Biochem J 216 :617-625)。 第一组分和第二组分的偶联不受特别限制，但是已经发现，使用如双重氮(邻联 甲苯胺)[BDT]等化学接头进行共价偶联是有效的。接头的使用和用作接头的化合物同样 不受特别限制，但是上述具体实例已据显示能够有效地发挥作用。
在本发明的化合物中的第一组分与第二组分的化学计量比不受特别限制，其可在
0.5 : i n : i范围内，其中n是第一组分在第二组分中的结合位点的总数。在第一组 分与第二组分的化学计量比在o.5 : i i4 : i范围内而不受特别限制的偶联物中，在 o. 5 : i 8 : l范围内、优选在o. 5 : i 2.5 : i范围内的偶联物可能在治疗ER+癌细 胞方面是有效的。本发明人惊讶地发现，雷洛昔芬皂草素的比例为约2 : i时将获得治 疗乳腺癌细胞最有效的偶联物，其使用导致每日肿瘤体积最初显著减小，并使肿瘤生长速 度的减小得到加快或持续。不过，任何在o.5 : 1 小于8 : i范围内的本发明的偶联物 都可以同样有效。 包含本发明的任何化合物而不受特别限制的药用组合物也可以包含药用可接受 的载体、赋形剂和/或佐剂。 本发明的化合物和组合物虽然在应用上不受特别限制，但通常用于制造用于治疗
包含ER+细胞的癌症的药齐U，并且在治疗乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌或其它ER+癌中特别有用。 本发明的化合物和组合物的应用适于所有哺乳动物，特别是人类。 应用还可以是以下情况其中的药剂适于注射或输注并且不受任何特别限制，特
别可以通过静脉内、皮下或通过包括口服在内的其它任何方式应用。 应用还适于注射至受试对象中，以使峰值血药浓度达到第一组分以未偶联形式使 用时的临床峰值血药浓度的1% 500%中的任一值。特别是，应用可能进而适用于注射以 达到临床峰值血药浓度的1% 400%，或者进而为1% 300%，或者更特别是达到1% 200%，并且优选为80% 140%。本发明人惊讶地发现，使用雷洛昔芬皂草素为2 : 1 的偶联物而达到80% 140%的治疗可使每日肿瘤体积与对照结果相比最初显著减小，并 使肿瘤生长速度的减小得到加快或持续，而不会对非癌性ER+细胞造成明显影响。
不同于充当雌激素的拮抗竞争剂(即，它们降低细胞分裂速度)的当前癌症药物， 本发明的化合物、药用组合物和治疗对于携带大量ER受体的细胞(即，癌细胞)具有致死 作用，但对于其它ER+细胞不具致死作用。在长期暴露于拮抗竞争剂下的癌细胞中通常可 以观察到，短期治疗引起的癌细胞破坏会减小表型变化的范围，从而导致靶标细胞失去对 竞争剂的敏感性。如果癌细胞由ER+突变为ER-，则情况不利于本产品。本产品与赫赛汀 (Herc印tin)(作用于HER2/neu受体的人源化单克隆抗体，用于乳腺癌治疗)相比具有两个 优点首先，无论Her2/neu是否为阳性本产品均靶向ER+癌细胞，而赫赛汀主要靶向Her2/ neu阳性癌细胞；其次，本产品消灭癌细胞而不是仅减缓其复制。本发明的产品没有与光动 力治疗相关的缺点，因为即使无法将光源聚焦在所讨论的癌细胞上该产品仍能够靶向所述 癌细胞。此外，本产品优于免疫毒素(即，与毒素连接的单克隆抗体)之处在于，其应该具 有更低的因免疫复合物的形成而引起的血管渗漏综合征和肾毒性的风险。
另外，偶联物进入靶标细胞后，无论SERM(载体)与I型RIP(毒素)是否通过胞 内蛋白酶对接头的作用而分离，由于产品的疗效不依赖于SERM与其受体的结合或由这种 结合激活的任何细胞机理因而保持不变。即，一旦进入细胞内部，I型RIP对于核糖体具有 直接的不可逆负效应，并因此对于所有mRNA的翻译具有直接的不可逆负效应，所述mRNA或 由管家基因产生、或作为任何其它细胞受体的结合和激活所产生的剌激信号(例如，如载 体SERM与细胞受体的结合所产生的信号)的结果而诱导、或者是因任何其它环境机理或内 部机理和/或剌激而产生。
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实施例 实施例1-雷洛昔芬与皂草素的偶联 使用双重氮(邻联甲苯胺)[BDT]作为接头(此接头用于经酪氨酸进行连接)将 雷洛昔芬(Sigma)与皂草素(Sigma)偶联。该接头在酸溶液中相当稳定，但是当pH升至7 时其会极其迅速地与酪氨酸和其它芳香酚反应。基于此原因，很难对该反应进行控制。如果 不能受到适当地控制，接头将使皂草素通过其序列中的14个酪氨酸交联并破坏其完整性。 因此所用的条件非常关键。
以雷洛昔芬与皂草素之比为14 : 1、8(近似)l和2 : i来制备偶联物。
下面提供了用于2 : 1 (雷洛昔芬皂草素)偶联的方案 为进行偶联，使用相对于(皂草素中的)酪氨酸摩尔数过量10倍的BDT，并让反 应在-2(TC进行30秒 超过50秒。通过加入适当体积的摩尔氢氧化钠水溶液(M.NaOHaq) 而将pH值由2升至5之后，通过加入摩尔盐酸(M.HC1)停止反应。紫外光谱分析揭示，在 反应时间为30秒时，这导致每个皂草素分子平均与两个BDT分子反应。增加温育时间会使 每个皂草素分子平均与8和14个BDT分子反应。过量的BDT被用于增大每个BDT分子仅 会与一个酪氨酸反应的可能性。这意味着，这两个BDT分子的每一个中的第二重氮基团尚 未反应，因此还可以与结构中具有3个酚基的雷洛昔芬反应。 将混合物在M. HC1中凝胶过滤以除去过量的BDT之后，通过将pH升高至7而使
BDT-皂草素偶联物与大大过量的雷洛昔芬在50X的甲醇中反应。立即使溶液再次酸化，这 是因为雷洛昔芬在酸溶液中稳定，但在碱溶液中不稳定。使用大大过量的雷洛昔芬可确保 其将仅通过其一个酚基，经由BDT连接于皂草素上，由此仅在可能的最小程度上进行化学 修饰，从而尽可能保持其完整性。 与雷洛昔芬的反应生成棕色溶液，通过使用氯仿萃取该溶液可除去该颜色。在 4(TC真空下将灰稻草色的水层蒸发至少量，并在13000RPM离心以去除固体物质。通过在 M. HC1中的凝胶过滤纯化所获得的灰黄色溶液，以获得雷洛昔芬-BDT-皂草素偶联物的无 色溶液。 实施例2-细胞系 从一位69岁女性的乳腺癌中分离MCF-7细胞系(ECACC，目录号86012803)，该 细胞系表达雌激素受体。将该细胞系保持在补充有2mML-Gln(Sigma) 、1%非必需氨基酸 (Sigma) 、100IU青霉素、100 ii g/ml链霉素(Sigma)和作为完全培养基的10%胎牛血清 (PCS) (Sigma)的最低必需培养基(Sigma)中。 从一位52岁女性的原发性乳腺导管癌中分离HCC-1143细胞系(ATTC，目录号 CRL-2321)，该细胞系不表达雌激素受体。将该细胞系保持在补充有2mM L-Gln (Sigma)、 10mM HEPES (Sigma) 、lmM Na-Pyr (Sigma) 、 100IU青霉素、100 ii g/ml链霉素(Sigma)和作为 完全培养基的腦FCS (Sigma)的RPMI-1640 (Sigma)中。 最后，从一位60岁女性的卵巢腺癌中分离NIH:0VCAR-3细胞(ATTC，目录号 HTB-161)，该细胞表达雌激素受体。将该细胞系保持在补充有2mM L-Gln(Sigma) 、 10mM HEPES (Sigma) 、 lmM Na-Pyr (Sigma) 、0. Olmg/ml牛胰岛素、100IU青霉素、100 ii g/ml链霉素 (Sigma)和作为完全培养基的20% FCS (Sigma)的RPMI-1640 (Sigma)中。
实施例3-克隆生成试验
通过胰蛋白酶化在约80%汇合时收集MCF-7、 HCC-1143和0VCAR-3的培养物，并 在无血清培养基中洗涤一次后，将其用于接种平底96孔板(Nunc)，使每个孔在200 iU完全 培养基中有5X103个细胞。 在37t:培养48小时后，除去培养基，并代以100 y 1/孔的一式四份的测试物质 (雷洛昔芬皂草素偶联物的PBS溶液)或对照物质(皂草素、雷洛昔芬、PBS(Sigma)和最 后作为阳性对照组的Mitomycin C(Sigma))在完全培养基中的多份稀释液。
在37t:培养18小时之后，除去测试化合物，并向各孔中加入200 y 1/孔的完全培养基。 在37 °C培养96小时后，除去培养基，并向所有孔中加入100 iU/孔的室温下 0. 9%的Triton X-100 (Sigma)的PBS溶液。在37"C培养2小时后，将50 ii 1 PBS-Triton 溶液从所有孔中转移至一个新的平底96孔板中。 按照制造商的指示准备来自CytoTox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒 (Promega)的检测试齐U，并向所有孔中加入50 y1/孔的检测试齐U。在室温于黑暗中培养30 分钟后，通过向所有孔中加入50iU/孔的终止溶液(Stopsolution)来停止反应，并确定在 490nm处各孔的吸光度。
实施例4-体内抗肿瘤活性 对于三十(30)只6 8周龄的雌性裸鼠(皿/皿)，通过皮下接种与 Matrigel (Becton Dickinson)组合输送的2X 1(f个MCF-7细胞(总量为200ii 1)。每日监控 体重损失和肿瘤生长(通过进行两个垂直测量并使用公式[n X ((最小测量)/2)2乂 (最 大测量)]来计算)，直至研究结束。 当已建立的肿瘤体积达到0.3cn^时(接种后第36日)，将动物分为三(3)组，并 以以下物质对各组通过静脉内(经由眼球后途径)给药 > ioo iU的雷洛昔芬皂草素为2 : i的偶联物(s : r i : 2)的pbs溶液，以
获得0.4nM、0. 2nM和0. lnM的峰值R : S 2 : 1偶联物血药浓度，它们分别相当于0. 4ng/ m1、0. 2ng/ml和0. lng/ml的雷洛昔芬(即，三组分别是A、B和C)>再次100 ii 1的雷洛昔芬的PBS溶液，以获得0. 4ng/ml、0. 2ng/ml和0. lng/ml雷 洛昔芬的峰值偶联物血药浓度(即，三组分别是D、E和F)
> 100ii 1的PBS(即，一组G) 雷洛昔芬的目标血药浓度基于血液中雷洛昔芬的人类标准治疗峰值浓度(即，
0. 5ng/ml)。通过将各小鼠的个体体重(g)乘以0. 08(即，以ml计的小鼠的血液体积平均
为其体重的8%)再乘以期望的雷洛昔芬血药浓度(即，O. 4ng/ml、0. 2ng/ml和0. lng/ml)，
计算可达到该雷洛昔芬血药浓度的作为偶联物或纯产品输送的个体小鼠剂量。 第一次给药后七日(接种后第43日)，动物接受偶联物、纯雷洛昔芬或PBS的第二
次给药，以获得相同的最终雷洛昔芬血药浓度(即，O. 4ng/ml、0. 2ng/ml和0. lng/ml)。 统计分析 利用非参数化Ma皿-Whitney检验来计算统计差异，并认为当p < 0. 05时统计差
异显著。
结果 本研究的目的在于确定皂草素和雷洛昔芬的偶联物是否可以选择性地杀死雌激素受体(ER)阳性乳腺细胞而不杀死女性(雌性)生殖道ER阳性细胞或其它非ER阳性细
胞。基于此目的，以i4 : i、8 : l和2 : i的摩尔比(R : s)将皂草素与雷洛昔芬偶联，
并测试递增剂量的这些偶联物对于MCF-7 (ER阳性乳腺癌细胞系)、HCC-1143 (ER阴性乳腺 癌细胞系)和0VCAR-3(ER阳性卵巢癌细胞系)的细胞单层的效果。
如图i所示，雷洛昔芬皂草素为14 : i的偶联物(s : r i : 14)对于任何细
胞系都具有有限效果，当然，其对于MCF-7细胞相比于HCC-1143或OVCAR-3没有选择性致
死作用。相反，已证实雷洛昔芬皂草素为8 : i的偶联物(s : r i : 8)在浓度为500nM
以上时对于所有细胞系都是致死的。只有在浓度为250nM时，才能观察到对于MCF-7细胞 的选择性致死效果略有提高(MCF-7的存活率为33. 6±2%，相比之下，HCC-1143的存活率 为70. 8±5%、 OVCAR-3的存活率为61. 2±5. 6% )。 与8 : i的雷洛昔芬皂草素偶联物(s : r i : 8)相似，无论er为何种状态， 2 : i的雷洛昔芬皂草素偶联物(s : r i : 2)在所测试的最高偶联物浓度下都杀死了 所有细胞。然而，在较低剂量下，在所有三组受测偶联物中雷洛昔芬皂草素为2 : i的偶
联物具有最显著的选择性效果。在偶联物浓度为500nM时，雷洛昔芬皂草素为2 : i的 偶联物杀死了绝大多数MCF-7细胞(存活率为4. 9±4. 3% )，同时对于HCC_1143(存活率 为62. 8±10. 7% )和OVCAR-3 (存活率为65. 2±3. 5% )仅具有有限效果。
鉴于这些结果，选择雷洛昔芬皂草素偶联物2 : l用于更加详细的体内分析。为 此，使用500nM的雷洛昔芬皂草素2 : l并且使用皂草素(500nM)、雷洛昔芬(1000nM)以 及皂草素(500nM)和雷洛昔芬(1000nM)的共混物(S卩，未偶联)的摩尔浓度等价物来处理 MCF-7、 HCC-1143和0VCAR-3细胞单层。 图2代表两次独立实验的平均，如图2所示，雷洛昔芬对于ER阳性乳腺癌MCF-7 细胞系具有显著(P < 0. 05)的选择性效果，但对于ER阴性HCC-1143细胞系或卵巢ER阳 性0VCAR-3细胞系则不然。类似地，皂草素和雷洛昔芬共混物对于MCF-7细胞具有选择性 效果，而由于不能将显著的(p>0.05)致死效果归因于皂草素本身，故这一点最可能要追 溯至雷洛昔芬的活性。与雷洛昔芬与皂草素的简单共混物相比，雷洛昔芬与皂草素的摩尔 比为2 : 1的偶联可导致所述化合物对于MCF-7的致死效果(MCF-7存活率为51. 6 ±3. 2% (简单共混物)与16.0±6.3% (偶联物))的显著提高(p，O. 05)，但对于HCC-1143细胞 (HCC-1143的存活率为84. 3±8. 5%与72. 4±5. 7% )和0VCAR-3细胞(0VCAR-3的存活率 为104. 4±2. 5%与77. 7±4. 9% )的致死效果则仅有有限的提高。
为检测雷洛昔芬皂草素为2 : i的偶联物(s : r i : 2)控制体内肿瘤生长的
功效，对雌性裸鼠(皿/皿)在皮下接种MCF-7细胞。 一旦肿瘤已建立(第36日)，使用经
由眼球后途径的静脉推注的雷洛昔芬皂草素2 : i(s : r i : 2)治疗小鼠，以使雷洛昔
芬皂草素2 : l(S : R 1 : 2)的峰值血药浓度达到O. 4nM、0. 2nM和O. lnM。这些浓度相 当于使雷洛昔芬峰值血药浓度达到0. 4ng/ml、0. 2ng/ml和0. lng/ml所需的浓度，它们分别 构成了人体中雷洛昔芬的目标峰值临床血药浓度的80%、40%和20%。对照动物经由相同
途径接受pbs或等剂量的雷洛昔芬。在第43日，动物接受雷洛昔芬皂草素2 : i(s : r
1 : 2)、PBS或雷洛昔芬的二次给药。 由于MCF-7细胞对于雌激素生成的天然易感性，所用裸鼠模型中的每日肿瘤体积 变化在约4/5日的时段内遵循正弦模式(见图3)。此时段的持续时间与小鼠的发情周期(即，4/5日)相关。结果，为便于实验分析，图3将各实验组的肿瘤体积变化表现为每日变 化和重叠5日(即，每点重叠4日)的时段的移动平均(即趋势线)。 PBS治疗组遵循上述肿瘤生长的正弦模式。该模式的特征在于，各周期中获得的最 大肿瘤体积的自然增加趋势最终将导致致命的肿瘤尺寸。与PBS对照组相比，使用0. 2ng/ ml和O. lng/ml的雷洛昔芬的治疗没有导致任何变化。只有O. 4ng/ml雷洛昔芬组显示了随 时间推移保持或略微减小肿瘤尺寸的自然趋势，这是其作为选择性雌激素受体调节剂在临 床中的作用模式的特征。 与PBS对照组相比，使用0.2nM和0. lnM峰值血药浓度的雷洛昔芬皂草素 2 : l(S : R 1 : 2)治疗也不能引起肿瘤生长的任何变化。然而，与O. 4ng/ml雷洛昔芬组 和PBS组相比，使用0.4nM雷洛昔芬皂草素2 : 1 (S : R 1 : 2)的治疗造成每日肿瘤体 积的显著初始减小(见图3，第37日和第38日的每日肿瘤体积变化)，且与O. 4ng/ml雷洛 昔芬组相比，所述治疗加快或维持了肿瘤生长速度的减小(见图3，用于研究的移动平均趋 势线)。 实施例5-偶联物的体外活性 本研究的目的在于评价偶联物对于移植在裸鼠中的皮下ZR-75-l ( —种雌激素受 体阳性人类乳腺癌细胞系)的生长动力学的效果。 为进行此研究，并且由于ZR-75-l生长依赖于雌激素，因此在肿瘤细胞接种之前的 第3日开始，对不少于40只4 6周龄的正常雌性无胸腺裸鼠(皿/皿)每日注射5mg/kg的 雌二醇。在雌二醇处理之后，使用21G针头和注射器将处于Matrigel (Becton-Dickinson) 中的25X 106个ZR-75-l细胞(获自ATCC)对所有动物进行皮下接种。
在第一次施用测试物之后，每48小时 72小时监控体重和肿瘤体积，持续36日。 肿瘤体积利用下式确定肿瘤体积=(a2Xb/2)，其中"a"为最小直径，"b"为最大直径。
—旦已建立的肿瘤达到约75mm3 150mm3 (个体肿瘤量可为100mg 250mg)，可 将小鼠分为3个治疗组(每组n = 12)，以使七个组的平均肿瘤量在对照组的平均肿瘤重量 的10%以内。在同一日(第l日)，对动物静脉注射O. lml的(a)皂草素-雷洛昔芬偶联 物、(b)未偶联的皂草素和雷洛昔芬的混合物或者(c)仅雷洛昔芬。每72小时重复一次该 治疗，总共进行五次(第1、3、6、9和12日)。 在所有三个组中，每个动物所注射的净雷洛昔芬量都相同，并且被设计为在血液 中提供处于临床中的雷洛昔芬血药浓度范围之内的0.7ng/ml的峰值雷洛昔芬浓度。那些 还注射有皂草素(其或者未与雷洛昔芬偶联，或者已与雷洛昔芬偶联)的动物接受了以皂 草素雷洛昔芬摩尔比为l:2计算的相同量的皂草素。 在植入之后的15日继续进行雌二醇给药，以培养皮下肿瘤的正常生长。 若发现动物濒临死亡或者体重降至低于14g，则对其实施安乐死(通过(A窒息)。
若个体肿瘤体积达到3， OOOmm3或肿瘤发生溃烂，则也执行安乐死。在研究过程中，不得不
将B组(未偶联的皂草素和雷洛昔芬)中的一只动物排除于研究之外。 本研究的结果表明，与单独施用雷洛昔芬或施用未偶联的雷洛昔芬和皂草
素相比，施用皂草素-雷洛昔芬偶联物获得了峰值肿瘤体积的显著减小(p <0.05，
Mann-Whitney)(第5日)。 此外，与其它两个实验组相比，在治疗(12日)结束时和直至第36日，以皂草素-雷洛昔芬偶联物给药的动物通常显示出持续降低的肿瘤体积(见图4)。 可以通过在研究过程中观察动物的体重而获得动物的一般健康状况指标。因此，
在整个研究期间，每隔48 72小时对各组的小鼠称重。结果清楚地显示，与仅以雷洛昔芬
给药或以未偶联的雷洛昔芬和皂草素给药的动物相比，以皂草素_雷洛昔芬偶联物给药的
动物具有明显更好的增重情况(参见图5)。 实施例6-雷洛昔芬与皂草素的进一步偶联 实验A 使用双重氮(邻联甲苯胺)[BDT]作为接头将雷洛昔芬(Sigma)与皂草素(Sigma) 偶联。该接头在酸溶液中相当稳定，但是当pH升至7时其会极其迅速地与酪氨酸和其它芳 香酚反应。基于此原因，很难对该反应进行控制。如果不能充分控制，所述接头将通过皂草 素序列中的14个酪氨酸而与皂草素交联并破坏其完整性。因此所用的条件非常重要。
以雷洛昔芬与皂草素为2 : l的比例制备偶联物。
以下提供用于2 : l(雷洛昔芬皂草素)偶联的方案轻度超声
为进行偶联，将1. 2mg冻干的皂草素(Sigma)溶解在0. 6ml水中。向该溶液中加 入0. 4ml DMS0 (Sigma)和0. 01ml的1M HC1并进行混合。对所得蛋白溶液进行轻度超声之 后，向该溶液中加入0.4mg lmg雷洛昔芬，然后加入相对每摩尔(皂草素中的)酪氨酸过 量1摩尔的BDT。通过加入适当体积的摩尔氢氧化钠水溶液(M. NaOHaq)将所得溶液的pH 升高至6. 5，并使反应在室温进行22分钟 34分钟。反应结束时，向该溶液中加入磷酸直 至最终浓度约为9并进行混合。使用30. 4%匿SO和9. 1%磷酸的水溶液作为洗脱液，通过 经Biogel P2柱(BioRad)洗脱而从粗偶联物溶液中除去过量的BDT。通过紫外分光光度法
确定含有皂草素和雷洛昔芬的组分，并在使用前在水中透析。
实验B 以质量比2 : l(雷洛昔芬DSC)将雷洛昔芬-HCl和DSC(二 (N-琥珀酰亚氨基) 碳酸酯——该接头可用于经赖氨酸的结合)溶解在0.2ml DMF(二甲基甲酰胺)中。将三 乙胺(O.Olml)加入吡啶(0. 13ml)中，并在15分钟期间将该制剂的等分试样(0. Olml)依 次加入雷洛昔芬/DSC混合物中。在2rC并于恒速搅拌下进行该过程。在40% DMF于15mM pH7. 4的磷酸钠缓冲液中的混合物中制备皂草素(0. 6mg/ml)溶液，并加入0. Olml雷洛昔 芬/DSC溶液。首先通过涡旋混合所得制剂，随后进行声波处理直至获得胶体外观，然后在 2rC进行30分钟的偶联反应。以13000rpm离心所得产物3分钟，直接使用澄清的上清液， 或者使其通过0. 1HC1中的S印hadexGlO柱、冷冻干燥并在PBS中重悬然后使用。
实验C 将皂草素溶解在含有2mg/ml葡萄糖的p朋.0的10mM磷酸盐缓冲液中，并在恒速 搅拌下向所得溶液中加入0. lml摩尔HC1从而将pH降低至3. 7。在2rC于恒速搅拌下，向 该制剂中加入lml雷洛昔芬-HC1的DMSO溶液(3mg/ml)，然后加入0. 005ml BDT试剂。向 连续搅拌的皂草素_雷洛昔芬-BDT制剂中依次加入少量等分试样的0. 1M NaOH(O. Olml) 从而将PH升至6. 8，在该pH值使反应继续进行60分钟。将所得产物首先在水中透析过夜， 然后在含有2mg/ml葡萄糖的PBS中透析。收集该过程中产生的棕色沉淀，并通过超声和剧 烈涡旋将其重溶于水中。通过离心而澄清后，将上清液等分以供使用。
1权利要求
一种化合物，所述化合物包含(a)能与ER+细胞受体结合的第一组分；和(b)第二组分；其中，所述第二组分为核糖体失活毒素并与所述第一组分偶联。
2. 如权利要求1所述的化合物，其中，所述毒素为皂草素、MOM、PAP-S、三角梅核糖体失 活蛋白和格拉宁素中的任意一种。
3. 如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，所述毒素为皂草素。
4. 如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，所述第一组分为雷洛昔芬化合物。
5. 如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，所述第一组分与所述第二组分共价 偶联。
6. 如权利要求5所述的化合物，其中，用化学接头将所述第一组分与所述第二组分偶联。
7. 如权利要求6所述的化合物，其中，所述接头为双重氮(邻联甲苯胺)[BDT]。
8. 如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，所述第一组分与所述第二组分的化 学计量比为0.5 : 1 N : l，其中N是所述第一组分在所述第二组分中的可能连接点的总 数。
9. 如权利要求8所述的化合物，其中，所述第一组分与所述第二组分的化学计量比为o. 5 : i 2.5 : i。
10. —种药用组合物，所述药用组合物包含如前述权利要求中任一项所述的化合物和 药用可接受的载体、赋形剂和/或佐剂。
11. 如前述权利要求中任一项所述的化合物或组合物在医学中的应用。
12. 如权利要求1 10中任一项所述的化合物或组合物用于制造用于治疗包含ER+癌 细胞的癌症的药剂的应用。
13. 如权利要求12所述的应用，其中，所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌或其它￡尺+癌。
14. 如权利要求12 13中任一项所述的应用，其中，所述药剂适用于治疗哺乳动物。
15. 如权利要求14所述的应用，其中，所述哺乳动物为人类。
16. 如权利要求12 15中任一项所述的应用，其中，所述药剂适用于注射或输注(静 脉内或其它方式)到受试对象中或者经口服施用于受试对象。
17. 如权利要求16所述的应用，其中，所述药剂适于注射到受试对象中而使所述偶联 物的峰值血药浓度达到相当于所述第一组分以未偶联形式使用时的临床峰值血药浓度的 1% 500%。
18. 如权利要求17所述的应用，其中，所述药剂适于注射到受试对象中而使所述偶联 物的峰值血药浓度达到相当于所述第一组分以未偶联形式使用时的临床峰值血药浓度的 80% 140%。
19. 如权利要求1 9中任一项所述的化合物的制造方法，其中，所述方法包括将所述 第一组分与所述第二组分反应以将所述第一组分与所述第二组分偶联。
20. 如权利要求19所述的方法，所述方法包括在偶联过程中控制所述第一组分和所述 第二组分的pH值。
21. —种包含ER+细胞的癌症的治疗方法，所述方法包括对受试对象施用药剂，其中，所述药剂包含权利要求1 10中任一项所述的化合物或组合物。
22. 如权利要求21所述的治疗方法，其中，所述癌症为乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌或其它ER+癌。
23. 如权利要求21 22中任一项所述的治疗方法，其中，所述受试对象是哺乳动物。
24. 如权利要求23所述的治疗方法，其中所述哺乳动物是人类。
25. 如权利要求21 24中任一项所述的治疗方法，其中，将所述药剂通过静脉内或其它方式注射或输注到受试对象中，或者经口服施用于受试对象。
26. 如权利要求25所述的治疗方法，其中，将所述药剂注射或输注到受试对象中以使所述偶联物的峰值血药浓度达到相当于所述第一组分以未偶联形式使用时的临床峰值血药浓度的1% 500%。
27. 如权利要求26所述的治疗方法，其中，将所述药剂注射或输注到受试对象中以使所述偶联物的峰值血药浓度达到相当于所述第一组分以未偶联形式使用时的临床峰值血药浓度的80% 140%。
全文摘要
本发明提供了一种化合物，所述化合物包含(a)能与ER+细胞受体结合的第一组分；和(b)第二组分；其中，所述第二组分为核糖体失活毒素并与所述第一组分偶联。
文档编号A61P35/00GK101795712SQ200880105602
公开日2010年8月4日 申请日期2008年9月11日 优先权日2007年9月14日
发明者威尔逊·罗梅罗·卡帕罗斯-万德雷, 格雷戈里·艾伦·斯特洛夫 申请人:派特塞尔有限公司