专利名称：：一种琉璃草总酚酸的制备方法及其医药用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中药提取物的制备方法及其医药用途，具体涉及一种琉璃草总酚酸的制备方法及其医药用途。
背景技术：
：琉璃草为紫草科琉璃草属Cynoglossum植物，全世界约有60种，广布于世界，我国有10种，2变种，遍布于全国各省区，西南地区是其分布中心，主产于云南、四川、西藏。本属植物大部分有药效，以根、全草入药，据《中华本草》记载，其性寒，微苦，有清热解毒、利尿消肿、活血调经等功效。临床使用中内服主治急性肾炎、牙周炎、肝炎、月经不调、白带异常、水肿、下颌急性淋巴结炎及心绞痛；外用治疗疮疗痈肿、毒蛇咬伤及跌打损伤等，均具有较好疗效。目前对琉璃草的研究较少，尚无有关制剂的报道。有研究显示丹酚酸B具有抗前列腺肿瘤的作用。现有的琉璃草治疗前列腺疾病的专利(专利号ZL200610021596.9)"琉璃草的新用途"中，主要从中药粗提物方面对治疗前列腺疾病进行了阐述。前列腺疾病是困扰男性的一种常见多发病，研究显示，25%-50%的男性一生中至少患过一次慢性前列腺炎，约近半数在人生某一阶段遭受到前列腺疾病的困挠。前列腺增生和前列腺炎是男性前列腺的常见疾病。前列腺增生，是男性老年病人的常见疾病之一。随着年龄的增加，男人们或多或少都有前列腺增生的现象发生。有研究表明前列腺增生始于40岁以后，但60岁以上的老年人更为多见。前列腺增生的主要症状有排尿困难，轻者夜里起床小便次数增多，有尿不净或尿完后还有少量排出的现象；严重者出现尿流变细，甚或排不出的现象；同时常伴有腰酸腰痛、四肢无力、遗精等症状。前列腺增生严重者必须手术摘除，一般保守疗法，效果都不太满意。前列腺炎分急性和慢性两种。急性前列腺炎以膀胱刺激症状和终末血尿、会阴部疼痛为主要症状，但临床较少见。慢性前列腺炎以排尿延迟、尿后滴尿，或滴出白色前列腺液，或引起遗精、阳痿、早泄等为主要症状。慢性前列腺炎患者占男科门诊的30%-50%，其中20-40岁的患者占50%-80%。慢性前列腺炎症可促进前列腺增生并诱发前列腺癌。现有的治疗心脑血管疾病的药物中，酚酸类药物使用较多，常用的有丹参总酚酸、山楂总酚酸类，未见有琉璃草总酚酸的报道，
发明内容本发明所要解决的问题是如何提供一种琉璃草总酚酸的制备方法，以及提供一种琉璃草总酚酸在制备治疗前列腺疾病和心脑血管疾病的药物中的用途。本发明所提出的技术问题是这样解决的一种琉璃草总酚酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)琉璃草药材，切成饮片或粉碎成粗颗粒，30~90°。水或含水乙醇提取2~4次，分别加入4~12倍量，提取1~3小时，滤过；(2)将水提取液或减压浓缩至无醇味的含水乙醇提取液调节PH值至1~6,搅匀，静置112小时，滤过或离心，将滤液或离心上清液通过大孔吸附树脂柱，水洗至流出液还原糖反应呈阴性，用含水乙醇洗脱，收集洗脱液，调节PH至中性；(3)洗脱液减压回收乙醇，浓缩干燥，得琉璃草总酚酸；或洗脱液减压浓缩至无醇味，加乙醇至含醇量达70~卯％,冷藏保存224小时，滤过，滤液减压浓缩，干燥得琉璃草总酚酸。按照本发明所提供的琉璃草总酚酸的制备方法，其特征在于，步骤(l)中琉璃草药材为琉璃草的根或者琉璃草全草。按照本发明所提供的琉璃草总酚酸的制备方法，其特征在于，所得琉璃草总酚酸含量为20%90%,主要成分为丹酚酸A和丹酚酸B。按照本发明所提供的琉璃草总酚酸的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所采用的含水乙醇浓度范围为30%95%。按照本发明所提供的琉璃草总酚酸的制备方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂为非极性、弱极性或极性大孔吸附树脂，型号可以是D101,DA201,DM130,WLD-3,YPR-ll，XS,AB-8,HPD-100,HPD-400,Dx國5，NKA-9等。按照本发明所提供的制备方法所得琉璃草总酚酸在制备治疗前列腺疾病的药物中的应用。制备药物的剂型为片剂、胶嚢、口服液、颗粒剂、滴丸、栓剂、注射剂。按照本发明所提供的制备方法所得琉璃草总酚酸在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用。制备药物的剂型为片剂、胶嚢、口服液、颗粒剂、滴丸、栓剂、注射剂。本发明与现有技术比较具有以下优点1.本发明首次从琉璃草中得到了总酚酸，利用HPLC测定，其中丹酚酸B含量达到20%以上。2.本发明提供了琉璃草总酚酸的制备工艺及其在医药上的应用为治疗心脑血管疾病方面提供了一种新的用药选择；提供了琉璃草治疗前列腺疾病的有效部位琉璃草总酚酸，确切的指出了治疗疾病的活性部位。3.相对于其它的一些前列腺疾病药物或心脑血管疾病药物，琉璃草4艮或全草的原料来源充足、成本较低。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述实施例1片剂的制备称取琉璃草药材5kg,切片，6(TC水温浸提取3次，每次水的用量为药材量的8倍，每次提取lh,合并提取液，滤过，滤液调节Pf^5,搅拌均匀，静置2h,离心，上清液通过预处理好的HPD-100大孔吸附树脂柱，先用水洗至流出液还原糖反应呈阴性，再用60%乙醇(洗脱剂)洗至流出液近无色，收集洗脱液，调节PH至中性，減压浓缩成流浸膏，于70。C减压干燥，得到千浸膏0.15kg，即为琉璃草总酚酸，粉碎，过6号筛，加入可溶性淀粉0.19kg、羧甲基淀粉钠7g,混匀制粒，干燥。硬脂酸镁3g与上述颗粒混匀，压制成1000片，包薄膜衣，每片0.35g，相当于原生药5g。所制得的样品筒称LLC片。按以上方法制备的药物，出膏率为3.0。/o,经检溯'J,丹酚酸B转移率为84.3%。经含量测定，琉璃草总酚酸纯度为78.3%。5实施例2胶嚢的制备称取琉璃草药材5kg,切片，7(TC水温浸提取3次，每次水的用量为药材量的10倍，每次提取1.5h,合并提取液，滤过，滤液调节PH二4，搅拌均匀，静置2h,离心，上清液通过预处理好的D101大孔吸附树脂柱，先用水洗至流出液还原糖反应呈阴性，再用70%乙醇洗至流出液近无色，收集洗脱液，调节PH至中性，减压浓缩至无醇p未，加乙醇至含醇量达85%,冷藏保存12小时，滤过，滤液减压浓缩成流浸膏，于70。C减压干燥，得到干浸膏0.13kg,即为琉璃草总酚酸，粉碎，过6号筛，加入0.15kg微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素15g、滑石粉5g,混匀制粒，干燥，分装，制成胶嚢1000粒，每粒0.30g,相当于原生药5g。所制得的胶嚢筒称LLC胶嚢。按以上方法制备的药物，出膏率为2.6。/。。经4全测，丹酚酸B转移率为82.1%。经含量测定，琉璃草总酚酸纯度为85.7%。实施例3颗粒剂的制备称取琉璃草药材5kg，切片，60%乙醇回流提取3次，每次60%乙醇用量为药材量的6倍，每次提取2h,合并提取液，滤过，滤液减压回收至无醇味，调节PH-3,搅拌均匀，静置3h,离心，上清液通过预处理好的AB-8大孔吸附树脂柱，先用水洗至流出'液还原糖反应呈阴性，再用60%乙醇洗至流出液近无色，收集洗脱液，调节PH至中性，减压浓缩至无醇p木，加乙醇至含醇量达75°/。，冷藏保存12小时，滤过，滤液减压浓缩成流浸膏，于7(TC減压干燥，得到干浸膏0.14kg,即为琉璃草总酚酸，粉碎，过6号筛，加入可溶性淀粉0.13kg、微晶纤维素0.13kg，乳糖O.lkg,混匀制粒，干燥，用铝塑复合膜分装成500袋，每袋lg,相当于原生药10g。所制得的颗粒简称LLC颗粒。按以上方法制备的药物，出膏率为2.8%。经检测，丹酚酸B转移率为81.3%。经含量测定，琉璃草总酚酸纯度为84.6%。试验l对消疳灵所致大鼠慢性前列腺炎的影响取SD大鼠60只，随机分为空白对照组、蒸馏水组、前列通片组、LLC片组、LLC胶囊组、LLC颗粒组，每组10只。除空白对照组外其余各组大鼠用戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉，无菌条件下于下腹正中切开约1.5厘米切口，找到膀胱及两侧精嚢，暴露附于精嚢内侧的前列腺背叶，分别注入25%消痒灵注射液0.2ml,注射完毕，分层缝合肌肉、皮肤。术后第7天，各组灌胃给药，蒸馏水組10ml/kg/d,前列通片组、LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组均为5g生药/kg/d，连续30天。各组大鼠末次给药24小时断头处死，剖开腹腔，肉眼观察前列腺形态大小，与周围组织的粘连、充血、结节、硬化等情况。取前列腺作病理组织学观察，病理观察项目为前列腺组织腺体管腔大小、腺体分泌物、纤维组织增生。实验结果为①肉眼观察空白对照组前列腺周围未见粘连，表面光滑透亮，柔润，无结节无硬化；蒸馏水组前列腺与周围组织有不同程度的粘连，部分呈充血或淤血状态，部分可见有结节、硬化和水泡；给药各组与蒸馏水组相比，均有不同程度的改善，个别大鼠前列腺组织与正常组近似。②病理组织学观察结果空白对照组腺体数量较多、大小不一，腔内上皮乳头突起数量多，腔内分泌物多，未见无变性、出血、坏死，亦无炎细胞浸润。蒸馏水组该组部分組织以腺体数量增生为主，部分组织腺体数量及纤维组织均增生，见灶性水肿。前列通片组该组以灶性纤维化病变为主，较蒸馏水组病变轻，腺体数量及形态病变较轻。LLC片组、LLC胶囊组、LLC颗粒组各组腺体增生较蒸馏水组明显减轻，纤维增生较蒸馏水组减轻。与蒸馏水組比较，各给药组及前列通片组能够明显减少腺体数量增生，腺腔分泌物明显减少，明显抑制前列腺组织纤维增生，具有显著性差异。结果详见表1表2。_表1对大鼠前列腺炎病理改变的治疗作用_动腺体管腔大小n(%)管腔分泌物n(%)_纤维组织增生n(%)物组别轻度明显轻度明显减数正常多正常轻度重度缩小缩小减少少n空白对照109(90)1(10)0(0.0)10(100)0(0.0)0(0.0)10(100)0(0.0)0(0.0)7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与空白组比较，"<0.05,"P<0.01，""<0週与蒸寸留7K纟且t匕4支，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。与空白对照组比较，蒸馏水组的腺体管腔大小、管腔分泌物、纤维组织增生综合评分显著增加，有极显著性差异。与蒸馏水组比较，前列通片组及各给药组的腺体管腔大小、管腔分泌物、纤维组织增生综合评分显著降低，具有显著性差异。实验结果表明LLC片、LLC胶嚢、LLC颗粒能够明显减少&i体数量增生，明显减少腺腔分泌物，明显抑制前列腺组织纤维增生，说明LLC片、LLC胶囊、LLC颗粒对慢性前列腺炎具有较好的治疗作用。试验2对局灶性脑缺血再灌注大鼠的血清总超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的影响取SD大鼠60只，随机分为6组，分别为假手术组、模型组、复方丹参片组、LLC片组、LLC胶嚢組、LLC颗粒组，每组10只。给药方法为复方丹参片组、LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组大鼠每日剂量为5g生药/kg,假手术组和才莫型组均给予蒸馏水。各组动物均按10ml/kg灌胃，l次/d,连续7d。末次给药后lh，采用线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注损伤(MCAO—I/R)模型。10%水合氯醛(0.35g/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定、颈部备皮及消毒。采用颈部正中纵形切口，长约2cm,局部普鲁卡因浸润麻醉后钝性分离皮下组织及肌肉，暴露并分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA);用5/0丝线结扎CCA近心端，在其远心端留线备用；于颈总动脉分叉处以动脉夹夹闭，将头端圓钝经石蜡和多聚赖氨酸处理的尼龙线经颈总动脉插入颈内动脉，插入深度距分叉处18~20mm,结扎颈总动脉远心端以固定栓线，缝合。缺血2h后，再次0.2mL水合氯醛麻醉大鼠，将栓线抽出，实现再灌注，切口处注入庆大霉素后逐层缝合。假手术组不结扎，不插线，其余同上。指标才企测血清总SOD活力和MDA含量测定。所有lt据均以均凄t士标准差0土s)表示，应用SPSS12.0软件统计分析。结果为脑缺血再灌注后各给药组血清总SOD活力降低，MDA含量明显升高；表明LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组均可明显提高局灶性脑缺血再灌注大鼠的SOD活力，降低MDA含量。结果见表3。表3对局灶性脑缺血再灌注大鼠血清SOD活力和MDA含量比较(±s)(n=l0)组别剂量(g生药/kg)SOD活力(KU/L)MDA含量((omol/L)假手术组一163.45±15.79A10.37±2.16A模型组—88.16土18.47'28.67±5.39.复方丹参片5.0118.24士13.2"14.89±4.95^IXC片5.0120.15士11.36A13.35±4,82ALLC胶嚢5.0123.87±10.61A12.64±3.5"LLC颗粒5.0122.32±12.83A11.54±4.23A注与假手术组相比,'PO.01;与才莫型组相比，AP0.01。试验3对大鼠冠状动脉结扎-再灌注心肌损伤的影响取SD大鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，分别为假手术组、模型組、复方丹参片组、LLC片组、LLC胶囊组、LLC颗粒组，每组10只。给药方法为灌胃给药，复方丹参片组、LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组大鼠每日剂量为5g生药/kg,均分别用0.5。/。CMC-Na研磨混悬至相应浓度，等体积给药，假手术组和模型组均给予0.5%CMC-Na。各组动物均4务10ml/kg灌胃，1次/d,连续7d。各组动物于最后1次给药后30min,乌拉坦(10%,lml/100g),ip麻醉，固定，接动物呼吸机，同时监测心电图(肢体ll导联)，经胸骨左缘开胸，暴露心脏，撕开心包膜，在肺动脉圓锥与左心耳间的冠状静脉下，用5/0带线缝合针自左冠状动脉下穿过，在缝合线上套一个5mm长的橡胶软管(内径2mm)，将缝合线两头牵出胸腔，闭紧胸腔(排尽胸腔内空气)，自胸腔外拉紧缝合线并固定，以心电图T波显著升高作为结扎成功指标，稳定呼吸约10min左右，去除呼吸机恢复自主呼吸。结扎0.5h后，松开固定的缝合线，使再灌注。再灌注3h后，颈动脉放血，分离血清，按试剂盒说明书进行LDH、CK等生化指标测定；处死动物，耳又出心脏，将一半动物的心脏染色，进4亍缺血面积测定；另一半动物的心脏制备心肌匀浆，进行GSH-Px、ATPase等生化指标测定。各组数据均以i士s表示，组间比较采用t检验考察显著性，以P〈0.05作为显著性指标。实验数据用SPSS12.0统计软件处理。实验结果为大鼠冠状动脉结扎-再灌注3h后，心肌染色结果可见明显的梗死区，与模型组相比，LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组均可明显缩小大鼠缺血-再灌注造成的心室梗死区(PO.Ol，P<0.05)。在模型组中，心肌缺血-再灌注导致大鼠血清LDH和CK释放明显增加(P<0.01)，LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组均能使血清LDH和CK水平明显降低(PO.01，PO.05)。心肌匀浆生化检测结果显示，与假手术组相比，模型组GSH-Px、Na+-K+-ATPase、Ca2+(Mg2+)-ATPase的酶活力水平明显下降(P<0.01),表现为明显的氧化应激和脂质过氧化损伤。LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组都能明显改善心肌缺血-再灌注导致的GSH-Px、Na+-K+-ATPase、Ca2+(Mg")-ATPase水平的变化(P<0.01，PO.05)，使各指标趋向正常。复方丹参片组对上述各指标也具有明显的改善作用(PO.01,P<0.05)。结果见表4、5、6。表4.对大鼠冠脉结扎缺血-再灌注模型心肌梗死区的影响(jf±s,n=10)组别剂量(g生药/kg)心室总重量(g)梗死区心室重量(g)梗死区比率(%)假手术组0.653土0.0670±00±0模型组0.732±0.0520.154±0.03721.3士6.5"复方丹参片5.00.696±0.0380.098±0.025#14.8±4.4#LLC片5.00.690±0.0540.095±0.042#14.1±3.9#LLC胶嚢5.00.683±0.0220.094±0.036#13.8±4.7#LLC颗粒5,00.689±0.0410.086士0,029絲12.3士5,8##与々支手术组相比，"^命PO.01;与才莫型组相比，*P<0.05,##P<0.01。表5,对大鼠冠脉结扎缺血-再灌注模型血清LDH和CK的影响(jf±s,n=10)剂量LDHCK組别(g生药/kg)(U/ml)(U/ml)假手术组3.82±0.890.58士0.29模型组6.97士1.66"1.13士0.20"复方丹参片5.05.31±1.56#0.78±0.19#IXC片5.05.30±1.37#0.76±0.21#LLC胶嚢5.05.22±1.51#0.67±0.13##LLC颗粒5.05.23±1.42#0.74±0.25#与假手术组相比，"PO.01;与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。表6,对大鼠冠脉结扎缺血-再灌注模型心肌中生化指标的影响(5±s，n=10)剂量ATPase(pmolPi/mgprot/h)组别(g生药GSH-Px(U/mgprot)/kg)Na+-K+Ca2+(Mg2+)假手术组56.3±6.83廉0.394.24±0.41模型组复方丹参片IXC片LLC胶嚢LLC颗粒.0.0.0.042.8士10.4"53.1±5.6#53.7±6.4#54.2±4.5#55.3±5.2##2.71±0,22^3.15±0.42#3.19±0.26#3.35±0.31##3.37土0.43糊3.20士0.33"3.59±0.38#3.63±0.27#3.75±0.23##3.74±0.36##与H手术组相比，令令PO.01;与才莫型组相比，#P<0.05,##P<0.01。实验结果表明LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组均能明显缩小大鼠缺血-再灌注造成的心室梗死区，明显降低血清LDH和CK水平，明显改善心肌缺血-再灌注导致的GSH-Px、Na+-K+-ATPase、Ca2+(Mg"-ATPase水平的变化，说明LLC片、LLC胶嚢、LLC颗粒在治疗心脑血管疾病方面具有4艮好的作用。试验4对小鼠二曱苯耳廓胂胀试验的影响取昆明小鼠50只，随机分为5组，分别为蒸馏水组、醋酸地塞米;^组、LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组，每组10只。按组分别灌胃给予蒸馏水、0.03%醋酸地塞米松，LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组每日剂量为5g生药/kg。给药30分钟后，每只小鼠右耳滴注0.04ml二甲苯，滴二曱苯后1.5小时脱臼处死。用6mm打孔器分别在同一部位摘取小鼠双耳片，称重，求两耳片之差值，即为耳肿胀度。实验数据用SPSS12.0统计软件处理。实验结果为蒸馏水组二甲苯致炎后，右耳肺胀明显。经醋酸地塞米松、LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组治疗后，小鼠耳廓肿胀度降低。与蒸馏水组比较，醋酸地塞米松组、LLC片组、LLC胶嚢组、LLC颗粒组均有显著性差异。结果详见表7。表7对小鼠耳廓肿胀的影响(3f士s)组别动物(只)剂量(g/kg)肿胀度(mg)蒸馏水10—11.2±1.96醋酸地塞米10o扁8息2.57"12LLC片105.0g生药/kg8.30±1.70^*LLC胶嚢105.0g生药/kg7"0土2.394^LLC颗粒_^_5.0g生药/kg8.20±1.65令注与蒸镏水组比较，令P0.05,"PO.Ol。实验结果表明LLC片、LLC胶嚢、LLC颗粒能明显减轻二曱苯所致小鼠耳肿胀度，说明LLC片、LLC胶囊、LLC颗粒具有较强的抗炎作用。权利要求1、一种琉璃草总酚酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)琉璃草药材，切成饮片或粉碎成粗颗粒，30～90℃水或含水乙醇提取2～4次，分别加入4～12倍量，提取1～3小时，滤过；(2)将水提取液或减压浓缩至无醇味的含水乙醇提取液调节PH值至1～6，搅匀，静置1～12小时，滤过或离心，将滤液或离心上清液通过大孔吸附树脂柱，水洗至流出液还原糖反应呈阴性，用含水乙醇洗脱，收集洗脱液，调节PH至中性；(3)洗脱液减压回收乙醇，浓缩干燥，得琉璃草总酚酸；或洗脱液减压浓缩至无醇味，加乙醇至含醇量达70～90％，冷藏保存2～24小时，滤过，滤液减压浓缩，干燥得琉璃草总酚酸。2、根据权利要求1所述的琉璃草总酚酸的制备方法，其特征在于，步骤(1)中琉璃草药材为琉璃草的根或者琉璃草全草。3、根据权利要求1所述的琉璃草总酚酸的制备方法，其特征在于，所得琉璃草总酚酸含量为20%90%,主要成分为丹酚酸A和丹酚酸B。4、根据权利要求1所述的琉璃草总酚酸的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所采用的含水乙醇浓度范围为30%~95%。5、根据权利要求1所述的琉璃草总酚酸的制备方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂为非极性、弱极性或极性大孔吸附树脂。6、根据权利要求1~5所述的制备方法所得的琉璃草总酚酸在制备治疗前列腺疾病的药物中的应用，制备药物的剂型为片剂、胶嚢、口服液、颗粒剂、滴丸、栓剂、注射剂。7、根据权利要求1~5所述的制备方法所得的琉璃草总酚酸在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用，制备药物的剂型为片剂、胶嚢、口服液、颗粒剂、滴丸、栓剂、注射剂。全文摘要本发明公开了一种琉璃草总酚酸的制备方法，从琉璃草根或全草中提取琉璃草总酚酸，经成分分析，琉璃草总酚酸中含有丹酚酸A、丹酚酸B等酚酸类化合物。经药效研究表明，琉璃草总酚酸具有较好的治疗前列腺疾病和心脑血管疾病的作用，为临床治疗前列腺疾病和心脑血管疾病提供了一种新的用药选择。文档编号A61K36/185GK101618059SQ200910060299公开日2010年1月6日申请日期2009年8月7日优先权日2009年8月7日发明者彬刘,吴桃清,杨张,李华菊,王存林,耿福能申请人:耿福能