专利名称：：间充质干细胞作为制备抑制血管移植后慢性排斥药物的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种血管移植后慢性排斥药物，特别是间充质干细胞作为制备抑制血管移植后慢性排斥药物的应用。
背景技术：
：在众多器官移植慢性排斥反应中，移植物血管的病变是突出而共同的损害路径，其导致管壁炎症增厚，管腔狭窄闭塞，终致移植器官失活，因此科学家正努力寻找一种可减轻血管移植后的慢性排斥反应药物，以提高器官移植的成活率。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，而提供一种可减轻血管移植后的慢性排斥反应的间充质干细胞作为制备抑制血管移植后慢性排斥药物的应用。本发明的目的是通过如下方案实现的间充质千细胞作为制备抑制血管移植后慢性排斥药物的应用。本发明的抑制血管移植后慢性排斥药物可以通过静脉滴注的方式进行。本发明的抑制血管移植后慢性排斥药物于移植前12-24小时输入受者体内。本发明的抑制血管移植后慢性排斥药物按体重1-5x1(T个/kg的用量。间充质干细胞的制备3为了更好的理解本发明的实质，下面用实用来il明间充质干细胞在作为抑制血管移植后慢性排斥药物中的应用。一间充质干细胞(MSC)分离培养及鉴定。*1、材料与方法*1.1实验动物及来源24只lewis雄鼠、24只BrownNorway雌鼠购自北京斯莱克实验动物中心，体外培养骨髓MSC来源于SD大鼠。*1.2主要试剂及仪器分离器械止血钳2支，眼科剪2把，培养mi2个(均需高压)。培养试剂胎牛血清为Hyclone公司产品，L-DMEM培养基、胰蛋白酶、青链霉素为Gibco公司产品。*1.3培养方法*80gSD大鼠用10。/。水合氯醛0.3ml腹腔麻醉，浸泡于75%酒精中20min(头露出)，于无菌条件下分离出双侧股骨和胫骨，置于无菌培^i中，移入超净台。*剪开骨干骺端，暴露骨髓腔，用无血清L-DMEM培养基反复沖洗，将沖出的骨髓细胞制成单细胞悬液。1000rmp,离心5min,去上清，加入3ml含10%FBS的L-DMEM培养基(100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素)，轻轻吹打混匀重新悬浮细胞，调整细胞浓度约5x107/ml接种在塑料培养瓶里，置于37度，5。/。C02细胞培养箱.*48-72h首次全量换液，后2-3天(培养液颜色转黄时)换液一次，当细胞生长至铺满瓶底90%以上时，用0.25%胰酶消化，1:2传代，传代后细胞生长迅速，4-5天可再次传代。*MSC流式鉴定*流式鉴定操作过程1、将细胞消化制备成单细胞悬液，每个样品约需3x105个细胞。2、离心后以流式100微升流式buffer(或PBS)重悬。3、将重悬后的细胞悬液转移至流式检测管中，加入流式抗体5微升。4、避光室温孵育30分钟。5、加入2毫升流式buffer,1000转，离心5分钟，弃上清，洗脱未结合上的流式抗体。6、加入300微升buffer,混勻送流式细胞仪检测。流式鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*移植模型分为四组，每组六只，A:对照组，不估支任何处理；B:术前3天起口服CsA(5mg/kg/day)，每周减量1次，每次减5%，5周后停用。C:术前1天尾静脉输注MSC(3x106/0.5ml)。D:术前1天起口服CsA(用法同B组)+术前1天尾静乐K输注MSC(3x106/0.5ml)术后56天取移植血管，切片，HE染色。*MSC输注后实a^结果*一般情况体重A组移植后大鼠体重下降，约术后6-7天开始回升，10天可升至术前水平。B、C、D组移植后大鼠体重约术后2-3天开始回升，一周后可升至术前水平。*精神状态A组移植后大鼠精神萎靡，出现掉毛，平均3天后可恢复正常。B、C、D组大鼠术后1天精神即可恢复，未见明显掉毛现象。*生存情况A组两只大鼠分别于术后第2、3天死亡，D组两只大鼠于术后第二天出现腹泻症状，考虑为术后腹腔感染所致，予腹腔注射庆大霉素3天(2万U/day)后腹泻症状消失，其余大鼠均存活良好直至d56处死。*血管病理结果参见图1-10。结论如图所示，注射MSC后移植鼠及注射MSC同时口服环孢素A的移植鼠血管内膜增厚程度明显低于单纯移植组及口服环孢素A移植组，而血管内膜增厚是慢性排斥反应的重要表现之一。因此，MSC具有抑制慢性排斥反应的作用，其功效甚至优于传统的免疫抑制剂。综上所述的，本发明的优点在于使用间充质干细胞作为抑制血管移植后慢性排斥药物，可使血管内膜增厚程度明显减轻，淋巴细胞浸润减少。图l是正常胸主动脉切片，HE染色x40倍图。图2是正常胸主动脉切片，HE染色xlOO倍图。图3是移植血管病理切片，HE染色A组x40倍图。图4是移植血管病理切片，HE染色A组xIOO倍图。图5是移植血管病理切片，HE染色B组x40倍图。图6是移植血管病理切片，HE染色B组xIOO倍图。图7是移植血管病理切片，HE染色C组x40倍图。图8是移植血管病理切片，HE染色C组xIOO倍图。图9是移植血管病理切片，HE染色D组x40倍图。图IO是移植血管病理切片，HE染色D组xIOO倍图。具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。实施例1间充质干细胞作为制备抑制血管移植后4曼性排斥药物的应用。间充质干细胞的制备与使用1、无菌条件局麻下抽取骨髓悬液约80100mL(自体或异体)，注入含肝素抗凝无菌离心管中，于无菌超净台离心，1OOOrmp,5min。2、弃上清，骨髓细胞沉淀用等量的含2%-5°/。同血型血浆的生理盐水稀释后加至淋巴细胞分离液上离心分离，2000rmp，20min,吸取中间毛玻璃样的单核细胞层加至含2%-5%同血型血浆的生理盐水中，离心洗涤2次，1000rpm,5min,弃上清。3、加入培养液，调整单个核细胞浓度为5xlOVml,4妻种于培养并瓦。(扩增、消化、传代方法同下大鼠MSC培养)4、传至3-4代后，收集MSC细胞，加入含10%-20%同血型血浆的生理盐水制成单细胞悬液，用带4号半针头的注射器抽取细胞悬液，注入无菌输血袋中，调整细胞密度l-3x107L,将无菌输血袋在热合机下严密封口后，送至病房备移植用，同时取少许细胞悬液滴在血培养亚中做无菌实验。5、仔细检查MSC悬液，确认无细胞团块后，通过输血器緩慢将细胞从静脉回输入患者体内，期间监测患者心电图、脉搏和血压等生命体征。全过程应在无菌条件下进行。权利要求1.间充质干细胞作为制备抑制血管移植后慢性排斥药物的应用。全文摘要本发明公开了一种间充质干细胞作为制备抑制血管移植后慢性排斥药物的应用。该产品可使血管内膜增厚程度明显减轻，淋巴细胞浸润减少。文档编号A61P37/06GK101496814SQ20091011127公开日2009年8月5日申请日期2009年3月13日优先权日2009年3月13日发明者林艳娟申请人:福建医科大学附属协和医院