专利名称：聚乙二醇-二肽-抗肿瘤药物复合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于化学制药领域，具体涉及聚乙二醇-二肽-抗肿瘤分子复合物及其在 肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤一直是困扰人类的严重疾病，大多数癌症目前尚无治愈的方法。化疗是 治疗恶性实体瘤的传统方法之一，在临床上占在重要地位。现在临床上应用的化疗药物存在着一些重要缺陷。其中，有的溶解度差(如紫杉 醇，多烯紫杉醇)，为解决溶解度问题，注射剂中加入了大量表面活性剂，带来了明显的副作 用等新的问题；有的半衰期太短(如肿瘤坏死因子的血浆清除半衰期为6min，体内代谢半 衰期为27min)，进入体内后很快被代谢清除，即体内稳定性差，不能充分发挥作用；大部分 的化疗药物对恶性肿瘤没有明显的选择性，这些药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常 的细胞产生杀伤作用，因此会产生严重的副作用(如阿霉素的心脏毒性比较大等)。以肿瘤坏死因子(TNF-α)为例，它是一种特异性攻击肿瘤的细胞因子，对多种 肿瘤有细胞毒作用。便由于体内稳定性差以及作用的多效性，要求连续灌输或频繁给药 才能获得理想的治疗效果，然而，高剂量的全身治疗时副作用较大，如引起发烧、血压降低 和内毒素样休克等副作用，限制了其用药剂量，临床用药一般被限制为有效抗肿瘤剂量的 1/5-1/25。关于TNF-α的基础与临床应用研究的基本结论有两条第一，TNF-α对肝癌有 确切疗效；第二，局部应用效果较好，全身用药疗效较差。加之TNF-α对环境的耐受力较 差，在体内很快失活(血浆清除半衰期为6min，体内代谢半衰期为27min)，全身用药很难在 肿瘤部位达到有效浓度，如提高剂量势必增加全身毒副反应(Creagan ET, et al =Cancer, 1988,62(12) 2467-71 ；Moritz T, et al, . Cancer Immunol Immunother，1989，29 (2) 144-50)。为了克服上述缺点，国内外许多学者进行了优化TNF-α抗肿瘤疗法的研究，包括 与其它化疗药物或细胞分子联合用药，肝动脉导管导入及在分子水平改建和TNF-α基因 疗法等。其中比较有效的手段之一是采用聚乙二醇(PEG)进行化学修饰。亲水性聚乙二醇(PEG)修饰即可解决难溶性药物溶解度问题，又可大幅度增加药 物的体内稳定性，明显延长其体内作用时间。事实上，PEG已被广泛用于某些药物分了特别 是蛋白类药物的修饰。因为PEG化后分子量增加，空间位阻增加，体内稳定性得到提高，这 样可以减缓药物特别是蛋白分子在体内的清除率，大大延长药物在体内的代谢半衰期，从 而降低给药剂量(Zalipsky S =Bioconjug Chem, 1995,6 150-165) ；PEG 化后，药物分子量 变大，Era效应(增强的渗透与滞留效应)明显增加，有利对恶性肿瘤的治疗；对蛋白药物 而言，PEG化后药物的周围有一层特殊的“壳”，可以进一步减少异源蛋白引起的抗原性和免 疫原性，降低体内蛋白酶对蛋白的降解作用(Cunningham-Rundles C，J. Immunol. Methods, 1992，152 :177-190)，并保留蛋白原有生物学活性(Harris JM, Cl in Pharmacokinet，2001， 40(7) 539-551)。 目前，已经批准上市的PEG化蛋白类药物主要有天冬酰胺酶(Oncaspar ) (1994 年)、腺苷脱氨酶(Adagen ) (1990 年)、α _2a 干扰素(Pegasys ) (2002 年)、α -2b 干扰素(PEG-Intron ) (2000 年)、G-SCF (pegfilgrastim，Neulasta ) (2002年)以及生长激 素受体激动剂(Pegvi somant，Somavert ) (2002 年)。但目前PEG修饰也存在一些重要的问题。活化的PEG与药物的特定基团反应时， 作为链状高分子的PEG不可避免地会在一定程度上破坏或遮蔽药物的活性位点，影响其体 内的生物活性。以蛋白分子为例，PEG化最常用的方法是通过胺反应，将蛋白的巯基通过 NHS的功能基团链接于PEG分子的末端，因此PEG不可避免地链接于蛋白的活性部位，导致 蛋白药物的活性不同程度的下降甚至失活。最典型的例子是，PEG化的a-干扰素Pegasys ， 其抗病毒活性仅为天然干扰素的7% (Bailon P，Bioconjug. Chem. 2001，12 =195-202)。虽 然国外一些学者通过基因工程的方法(Shibata H,Clin. Cancer Res. 2004，10 :8293_8300 ； Yoshioka Y, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004，315 :808_814)，使蛋白药物 TNF-α 活性 部位中的Lys缺失，再将PEG特异性连接于其非活性部位，其抗肿瘤活性也受PEG的大小和 结构的影响。PEG化药物的生物活性与链接PEG的分子量大小和数量多少成反相关，其关键 因素在于PEG化后的药物分子是否能在作用部位被及时地释放。目前PEG化的主要障碍在 于维持血浆半衰期与蛋白药物在作用部位的生物活性之间的平衡。组织蛋白酶B (Cath印sin B, CB)是一种溶酶体内的半胱氨酸蛋白水解酶，属于木 瓜蛋白酶家族，在PH3. 0-7. O都具有活性，其水解位点为-Arg-Arg-/-Xaa(Vit0 Τ, The Embo J, 2001, 20 (17) =4629-4633) 0在体内主要参与溶酶体内物质降解、骨重建及呈递抗原等生 理过程。在病理情况下，由于肿瘤细胞内CB的运输机制失调，不能进入溶酶体，而分泌到肿 瘤细胞夕卜(Roshy S，et al =Cancer Metastasis Rev, 2003, 22 (223) :271_286)，而正常细胞 并不分泌(Sinha AA, et al =Prostate, 2001,49 172-184) 近年来研究发现，在肝细胞癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、神经胶质瘤等多种 恶性肿瘤组织中，CB表达及CB活性均成倍甚至3-9倍高于邻近正常组织(Scorilas A， et al =Biol Chen, 2002, 383 1297-1303 ；Kayser K, et al =Anticancer Res, 2003, 23 2767-2772)。利用CB可以选择性地降解一些多肽片段的特点，可以构建CB敏感的药物输送 系统。近年来国外有一些文献报道，如利用CB敏感的Gly-Phe-Leu-Gly和Ala-Leu-Ala-Leu 两个四肽，但该四肽的天然疏水性可能会引起药物的聚集。Dubowchik φ (Dubowchik GM, et al =Bioconjugate Chem. 2002,13 855-869) 合成了一系列CB敏感的二肽用于递送阿霉素(DOX)，这些二肽包括Phe-Lys、Val-Lys, Ala-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Ile-Cit、Phe-Arg 等，用这些二肽将嵌合型单抗 BR96 与 DOX 进 行偶联，结果表明，该偶联物具有血浆稳定性，并且对肿瘤细胞表现更强的细胞毒性。最引 人注目的是，Doronina 等(Doronina S0，et al =Natur Biothech，2003，21 (7) :778_784)采 用Val-Cit将Aurstatin E和Monomethylauristaitin E两种肿瘤化疗药物与单抗进行偶 联，结果证明该偶联物在人和鼠的血浆血浆稳定性明显提高，对其它正常组织的毒副作用 明显降低(2003年发表在Nature Biotechnology杂志上)。但通过二肽偶联单抗和抗肿瘤 药物形成的偶联物，可能引起体内的免疫反应，降低偶联物的在血浆中半衰期，因此效果也 有限。基于以上背景，用组织蛋白酶B敏感的二肽将PEG和抗肿瘤药物进行偶联，即保留了 PEG修饰的优势(增加难溶性药物溶解度、提高药物的体内稳定性、增加Era效应等)，同 时又发挥了组织蛋白酶B敏感的二肽在肿瘤部位特异性降解的特点，可以克服PEG修饰对药物活性的影响，不失为一种较好的解决方案。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种聚乙二醇-二肽-抗肿瘤药物分子复合物。本发明的进一步目的在于提供上述药物分子复合物在肿瘤治疗中的用途。本发明以二肽为偶联基团，将PEG与抗肿瘤药物结合制成分子复合物。聚乙二醇_ 二肽_抗肿瘤药物分子复合物，其结构如下PEG-X-Y-R,其中，PEG为聚乙二醇及衍生物(如聚乙二醇，甲氧基化聚乙二醇，乙氧基化聚乙 二醇)，所述的聚乙二醇及其衍生物，平均分子量为1000 40000。所述的聚乙二醇及其衍 生物可按常规化学方法与二肽-X-Y-上X的氨基端共价结合。X-Y为二肽，其中X和Y为任意天然氨基酸或其衍生物，且两者以共价键结合。这 些二Jft包括 Val-Cit、Phe-Lys, Val-Lys, Ala-Lys, Val-Lys, Phe-Cit、Ile-Cit、Leu-Cit、 Trp-Cit、Phe-Arg，其中Y的羧基末端可通过常规化学方法与抗肿瘤药物共价结合。其中所述R为抑制或杀灭肿瘤细胞的抗肿瘤药物，并具有可与Y端羧基共价结合 的羟基、氨基或巯基。这些抗肿瘤药物包括TNF-α、紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素。本发明的PEG-X-Y-R分子复合物，可用常规化学方法进行制备。即选用适当方法 对某个基团进行活化，然后与另一化合物的相应基团进行联接，直到获得最后的PEG-X-Y-R 分子复合物。活化基团包括但不限于琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)、 琥珀酰亚胺丁酸酯(SBA)、琥珀酰亚胺酯(NHS)、双三氯甲基碳酸酯(BTC)和马来酰亚胺酯 (MAL)。上述所制得的PEG-X-Y-R分子复合物经凝胶过滤色谱分离得到纯化的PEG-X-Y-R 分子复合物。本发明PEG-X-Y-R分子复合物可采用药剂学上允许的赋型剂、pH调节剂、渗透压 调节剂等辅料配伍，按照药学领域的常规或用特定的生产方法制备成相应的药物组合制 齐IJ。所述药物组合制剂包括PEG-X-Y-R分子复合物的水针剂、输液、冻干粉针剂、片剂和胶 囊剂。所述药物组合制剂的给方式包括静脉注射、肿瘤内注射和口服给药。以下以聚乙二醇-X-Y-TNF-α复合物为例，通过试验说明本发明的有益效果聚乙二醇-X-Y-TNF- α复合物的血浆稳定性和CB敏感性检测采用FITC荧光标价法，检测不同时相内血浆和含CB液中的荧光强度，了解聚乙二 醇-X-Y-TNF- α复合物在血浆中的稳定情况以及对CB的敏感性。聚乙二醇-X-Y-TNF- α分子复合物的细胞毒性检测采用CCK-8法，检测聚乙二醇-X-Y-TNF- α对L929细胞的细胞毒性。聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物在模型动物体内药物动力学和药效学检测采用同位素示踪法，检测不同时相内聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物在正常 大鼠中的血浆浓度，了解其在动物体内的动力学。采用Meth-A实体瘤动物模型，分别尾 部注射P聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物、PEG-TNF- α、TNF-α和生理盐水后，在不 同时间下测定肿瘤体积大小，计算肿瘤抑制率，与原药和PEG-TNF-α比较，评价聚乙二 醇-X-Y-TNF-α分子复合物的抗肿瘤效果。
本发明所涉及的实验方法属于本领域已知方法，实验所采用的试剂为市售。经上述实验结果证实，本发明即具有常规PEG化TNF-α的优点，又具有肿瘤部位 药物特异性释放的特点。与TNF-α相比，聚乙二醇-X-Y-TNF-α复合物血浆半衰期显著延 长，与常规PEG化TNF-α相比，PEG-X_Y_TNF-α分子复合物的生物活性显著提高。此分子 复合物具有被动靶向和肿瘤细胞定位释放的双重功能，可产生高效、安全的抗肿瘤疗效。聚乙二醇-X-Y-TNF- α分子复合物一方面具有PEG化药物的优点，即可提高药物 的稳定性，延长药物的血浆半衰期，通过被动靶向肿瘤作用增加药物在肿瘤组织中的摄取 量；另一方面利用肿瘤部位高浓度表达的组织蛋白酶B作用于二肽位点，酶解并释放药物 分子，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤组织生长，同时又不损伤正常组织。实验结果表明聚乙 二醇-二肽-TNF-α分子复合物进入血液系统后，与过度表达的CB识别，TNF-α分子释放， 与原药和常规的PEG化TNF-α相比，抗肿瘤作用显著增强，毒副作用显著下降。
图1显示PEG-TNF- α和PEG-X-Y-TNF- α分别在人血浆和鼠血浆中的稳定性结 果图2显示PEG-TNF- α和PEG-X-Y-TNF- α分别对CB敏感性实验结果图3显示TNF- α、PEG-TNF- α和PEG-X-Y-TNF- α对L929细胞株的细胞毒性结 果图4显示尾静脉注射后，TNF- α、PEG-TNF- α和PEG-X-Y-TNF- α在正常大鼠体 内的药动学曲线图 5 显示尾静脉注射后，TNF- α ,PEG-TNF- α 和 PEG-X-Y-TNF- α 抑制 Meth-A 纤 维肉瘤生长曲线
具体实施例方式以下借助非限制性实施例进一步描述本发明。实施例1活化的PEG-X-Y的制备，X-Y为Val-Cit采用常规的酰胺缩合反应合成，将易购得的mPEG_NHS(PEG的平均分子量为4kD) 与二肽(Val-Cit)按投料比为2 1，加入pH7. 5的磷酸盐、HEPES或Tris-HCl等缓冲液溶 解，反应温度25°C，缓慢搅拌60分钟，加入5倍PEG摩尔量的甘氨酸结束反应。透析纯化后 冻干即得mPEG-Val-Cit分子复合物。然后采用常规的EDC和NHS试剂活化mPEG-Val_Cit 分子复合物的末端羧基，即得mPEG-Val-Cit-NHS。实施例2活化的PEG-X-Y的制备，X-Y为Ala-Lys采用常规的酰胺缩合反应合成，将易购得的mPEG-NHS与二肽(Ala-Lys)，按投料 比为2 1，加入pH7. 5的磷酸盐、HEPES或Tris-HCl等缓冲液溶解，反应温度25 V，缓慢 搅拌60分钟，加入5倍PEG摩尔量的甘氨酸结束反应。透析纯化后冻干即得mPEG-Ala-Lys 分子复合物。然后采用常规的EDC和NHS试剂活化mPEG-XX分子复合物的末端羧基，即得 mPEG-Ala-Lys-NHSo 实施例3活化的PEG-X-Y的制备，X-Y为Val-Lys
采用常规的酰胺缩合反应合成，将易购得的mPEG-NHS与二肽(Val-Lys)，按投料比为1 1，加入PH7. 5的磷酸盐、HEPES或Tris-HCl等缓冲液溶解，反应温度25°C，缓慢搅拌60分钟，加入5倍PEG摩尔量的甘氨酸结束反应。透析纯化后冻干即得mPEG-Val-Lys 分子复合物。然后采用常规的EDC和NHS试剂活化mPEG-Val-Lys分子复合物的末端羧基， 即得 mPEG-Val-Lys-NHS。实施例4制备聚乙二醇-X-Y-TNF- α分子复合物⑴其中为X为Ala，Y为Lys取PEG-Ala-Lys-NHS (PEG 的平均分子量为 40kD) 400nmol 和 20nmolTNF- α，在 ImL 的磷酸盐缓冲液(PH为7. 5)溶解，4°C下，缓慢搅拌30分钟，加入5倍PEG摩尔量的6-氨 基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集 PEG-X-Y-TNF- α组分，分别测定PEG-Y-X-Y-NHS和TNF-α的含量，得到PEG和TNF-α的摩 尔比1. 3 1，收率为31. 04%。实施例5制备聚乙二醇-X-Y-TNF- α分子复合物(II)X-Y为Phe-Cit取PEG-Phe-Cit-NHS (PEG 的平均分子量为 40kD) IOOnmol 禾Π 20nmoITNF- α，在 ImL的磷酸盐缓冲液(ρΗ为7. 5)溶解，25°C下，缓慢搅拌1小时，加入10倍PEG摩尔量的 6-氨基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收 集PEG-X-Y-TNF-α组分，分别测定PEG-X-Y-NHS和TNF-α的含量，得到PEG和TNF-α的 摩尔比2. 1 1，收率为24. 55%。实施例6制备聚乙二醇-X-Y-TNF- α分子复合物(III)X-Y为Val-Cit取PEG-Val-Cit-NHS (PEG 的平均分子量为 40kD) 800nmol 和 20nmoITNF- α，在 ImL的磷酸盐缓冲液(ρΗ为6. 5)溶解，25°C下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的 6-氨基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收 集PEG-X-Y-TNF-α组分，分别测定PEG-X-Y-NHS和TNF-α的含量，得到PEG和TNF-α的 摩尔比3.4 1，收率为30.67%。实施例7聚乙二醇-X-Y-TNF- α分子复合物(III)(具体为聚乙二 醇-Val-Cit-TNF- α )的体外血浆稳定性和CB敏感性评价1、聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(III)的体外血浆稳定性实验，取一定量的FITC标记的聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(含17 μ g的TNF-α )， 置于ImL预先孵育的新鲜提取的鼠或人血浆中，37°C孵育，每隔一定时间取样100 μ L，测荧 光强度，并折算成TNF-α的含量。结果如图1所示，PEG-TNF-α和PEG-vc-TNF-α在两种 血浆中TNF- α的释放率都很慢，120h内，在鼠血浆中TNF- α释放不到10%，而在人血浆中 TNF-α释放不到20%，说明PEG-TNF-α和聚乙二醇-Χ-Υ-TNF-α在人血浆和鼠血浆中都 比较稳定。2、聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(III)(具体为聚乙二醇-Val-Cit-TNF-α ) 对CB的敏感性实验取一定量的FITC标记的聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(含17 μ g的TNF-α )， 置于ImL预先孵育含不同浓度CB的血浆背景溶液中，37°C孵育，每隔一定时间取样100 μ L， 测荧光强度，并折算成TNF-α的含量。结果如图2所示，PEG-X-Y-TNF-α在CB的作用 下，TNF-α能够释放，并受CB抑制剂的抑制，而常规的PEG-TNF-α并不释放，说明聚乙二 醇-X-Y-TNF- α对CB具有敏感性。实施例8聚乙二醇-X-Y-TNF-α复合物(III)(具体为聚乙二醇-Val-Cit-TNF- α )的体外细胞毒性实验取对数生长期L929细胞，以2X104/孔细胞接种于96孔板，100 μ Ι/well，每组设 6个平行孔。在含10% FBS的DMEM的培养液中培养24h后(5% C02、37°C )，加入含不同浓 度的TNF- α，PEG-TNF- α，PEG-vcTNF- α的上述培养液100 μ 1，有些组加入CB溶液，继续 培养2h、24h或48h。加入CCK-8液，培养4h后，弃上清液，按照CCK-8的操作说明，微量振 荡仪振荡5min，按参考波长492nm、参比波长630nm应用酶标仪测定各孔吸光度值(A值)。 按下列公式计算细胞生长抑制率IR =[(正常对照组A值-用药组A值)/正常对照组A 值]X100%。结果如图3所示，聚乙二醇-X-Y-TNF-α的细胞毒作用远强于PEG-TNF-α ； 在CB存在的条件下，PEG-X-Y-TNF- α的细胞毒作用与TNF- α接近。实施例9聚乙二醇-X-Y-TNF- α分子复合物(III)(具体为聚乙二 醇-Val-Cit-TNF-α )在正常大鼠内的药物动力学试验SD雄性大鼠15只，随机分成3组，每组5只，将无菌条件下制备的三种125I标记的 TNF- α、PEG-TNF- α 和 PEG-vcTNF- α 制备成 7 μ g/ml 注射液，剂量 3. 5 μ g/200g 体重，静 脉给药后，分别于0. 25,0. 5、1、2、3、6、12、24和48h，眼眶取血0. 1ml，离心取血浆100 μ 1， 加0. 5ml三氯醋酸，振荡1分钟，离心(3500rpm)3min，取沉淀测定cpm。用3P87软件处理 数据，计算药动学参数。结果表明，聚乙二醇-X-Y-TNF-α和PEG-TNF-α —样，能够延长体 内的半衰期。实施例10聚乙二醇-X-Y-TNF- α分子复合物(III)(具体为聚乙二 醇-Val-Cit-TNF-α )体内抗肿瘤活性试验取于温度25 士 2°C、相对湿度75 士 5 %和自然光条件下，将饲养一周的Meth-A 实体瘤昆明种雌性小鼠肿瘤模型32只，随机分成4组，每组6只。将无菌条件下制备的 TNF-α ,PEG-TNF-α、聚乙二醇-X-Y-TNF-α主要组份用灭菌PBS (ρΗ7. 4)制成TNF-α浓度 为2. 5 μ g/ml的注射液。每组尾静脉注射1种形式的TNF- α注射液，剂量为0. 5 μ g/20g体 重。取最后1组，尾静脉注射生理盐水，0.2ml/鼠。再于首次给药后的第4，8和11天依法 各给药1次。并于首次给药的当日和预定的时间测量肿瘤的大小，按下式计算瘤体积V = (a2Xb)/2(a，肿瘤的宽度；b，肿瘤的长度)，测得的瘤体积与首次给药当日测得瘤体积的比 值，即为相对瘤体积的大小，再按t-检验法进行统计分析处理数据，并将PEG-TNF- α和对 照TNF-α的抗肿瘤效果进行比较。结果表明，聚乙二醇-X-Y-TNF-α的肿瘤抑制率分别是 TNF- α 禾口 PEG-TNF- α 的 50 倍和 10 倍。实施例IlPEG-X-Y-紫杉醇的制备，X-Y为Val-Cit取PEG-Val-Cit-NHS (PEG 的平均分子量为 4kD) 800nmol 和 20nmol 紫杉醇(PCT)， 在ImL的磷酸盐缓冲液(pH为6. 5)溶解，25°C下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量 的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化， 收集PEG-Val-Cit-PCT组分并测定其含量。
实施例12制备聚乙二醇-X-Y-PCT分子复合物(III)X-Y为Ala-Lys取PEG-Ala-Lys-NHS (PEG 的平均分子量为 4kD) 800nmol 和 20nmol 紫杉醇(PCT)， 在ImL的磷酸盐缓冲液(pH为6. 5)溶解，25°C下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量 的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化， 收集PEG-Ala-Lys-PCT组分并测定其含量。
实施例13制备聚乙二醇-X-Y-PCT分子复合物(III)X-Y为Val-Lys取PEG-Val-Lys-NHS (PEG 的平均分子量为 40kD) 800nmol 和 20nmolPCT，在ImL 的 磷酸盐缓冲液(PH为6. 5)溶解，25°C下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的6-氨 基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集 PEG-Val-Lys-PCT组分并测定其含量。实施例14制备聚乙二醇-X-Y-多烯紫杉醇分子复合物(III)X-Y为Val-Cit取PEG-Val-Cit-NHS (PEG的平均分子量为4kD) 800nmol和20nmol多烯紫杉醇 (DTX)，在ImL的磷酸盐缓冲液(pH为6. 5)溶解，25°C下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG 摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离 纯化，收集PEG-Val-Cit-DTX组分并测定含量。实施例15制备聚乙二醇-X-Y-多烯紫杉醇分子复合物(III)X-Y为Ala-Lys取PEG-Ala-Lys-NHS(PEG 的平均分子量为 40kD)800nmol 和 20nmol 多烯紫杉醇 (DTX)，在ImL的磷酸盐缓冲液(pH为6. 5)溶解，25°C下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG 摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离 纯化，收集PEG-Ala-Lys-DTX组分并测定含量。实施例16制备聚乙二醇-X-Y-多烯紫杉醇分子复合物(III)X-Y为Phe-Lys取PEG-Phe-Lys-NHS(PEG 的平均分子量为 40kD)800nmol 和 20nmol 多烯紫杉醇 (DTX)，在ImL的磷酸盐缓冲液(pH为6. 5)溶解，25°C下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG 摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离 纯化，收集PEG-Phe-Lys-DTX组分并测定含量。实施例17制备聚乙二醇-X-Y-阿霉素分子复合物(III)X-Y为Val-Cit取PEG-Val-Cit-NHS (PEG 的平均分子量为 40kD) 800nmol 和 20nmol 阿霉素(DOX)， 在ImL的磷酸盐缓冲液(pH为6. 5)溶解，25°C下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量 的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化， 收集PEG-Val-Cit-DOX组分并测定含量。实施例18制备聚乙二醇-X-Y-阿霉素分子复合物(III)X-Y为Ala-Lys取PEG-Ala-Lys-NHS (PEG 的平均分子量为 40kD) 800nmol 和 20nmol 阿霉素(DOX)， 在ImL的磷酸盐缓冲液(pH为6. 5)溶解，25°C下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量 的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化， 收集PEG-Ala-Lys-DOX组分并测定含量。实施例19制备聚乙二醇-X-Y-阿霉素分子复合物(III)X-Y为Phe-Lys取PEG-Phe-Lys-NHS (PEG 的平均分子量为 40kD) 800nmol 和 20nmol 阿霉素(DOX)， 在ImL的磷酸盐缓冲液(pH为6. 5)溶解，25°C下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量 的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0. 5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化， 收集PEG-Phe-Lys-DOX组分并测定含量。实施例20含PEG-Val-Cit-PCT组分的注射剂的制备取PEG-Val-Cit-PCT分子复合物，溶于无菌注射用水中，必要时加入相关添加剂， 按注射剂常规工艺和质量要求制备成静脉注射剂。实施例21含PEG-Val-Cit-DTX组分的注射剂的制备
取PEG-Val-Cit-DTX分子复合物，溶于无菌注射用水中，必要时加入相关添加剂， 按注射剂常规工艺和质量要求制备成静脉注射剂。实施例22含PEG-Val-Cit-DOX组分的注射剂的制备取PEG-Val-Cit-DOX分子复合物，溶于无菌注射用水中，必要时加入相关添加剂， 按注射剂常规工艺和质量要求制备成静脉注射剂。实施例23含PEG-Val-Cit-TNF- α组分的注射剂的制备取PEG-Val-Cit-TNF- α分子复合物，溶于无菌注射用水中，必要时加入相关添加 齐 ，按注射剂常规工艺和质量要求制备成静脉注射剂。实施例24含PEG-Val-Cit-PCT组分的片剂的制备取PEG-Val-Cit-PCT分子复合物，加入填充剂等相应的辅料，按片剂的常规工艺 和质量要求制备成片剂。实施例25含PEG-Val-Cit-DTX组分的胶囊剂的制备取PEG-Val-Cit-DTX分子复合物，加入填充剂等相应的辅料，按胶囊剂的常规工 艺和质量要求制备成胶囊剂。实施例26含PEG-Val-Cit-DOX组分的胶囊的制备取PEG-Val-Cit-DOX分子复合物，加入填充剂等相应的辅料，按胶囊剂的常规工 艺和质量要求制备成胶囊。
权利要求
一种具有特异性释药功能的聚乙二醇修饰的抗肿瘤药物复合物，其结构特征在于，具有如下通式PE6-X-Y-R其中，PEG为聚乙二醇或其衍生物，平均分子量为1000～40000，其中，X和Y为任意天然氨基酸或其衍生物，且两者以共价键结合形成二肽，其中，R为含有羟基、氨基或巯基结构基团的抗肿瘤药物。
2.权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物结构中含有羟基，氨基或 巯基结构。抗肿瘤药物包括TNF- a，阿霉素，紫杉醇，多烯紫杉醇。
3.按照权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的聚乙二醇及其衍生物只能与二 肽-X-Y-中X的氨基端共价结合。
4.按照权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物只能与二肽-X-Y-中 Y的羧基端共价结合。
5.按照权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的-X-Y-为Val-Cit、Phe-Lys、 Val-Lys、Ala-Lys、Val-Lys、Phe-Cit、Ile-Cit、Leu-Cit、Trp-Cit 或 Phe-Arg。
6.权利要求1所述的复合物的制备方法，其特征在于，步骤是，先制备PEG-X-Y，然后再 制备PEG-X-Y-R分子复合物。
7.一种用于肿瘤治疗药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的PEG-二肽-抗 肿瘤药物分子复合物。
8.按照权利要求8所述的组合物，其特征在于，可含有常规的药用辅料。
9.按照权利要求8所述的组合物，其特征在于，该组合物可以用常规方法制备成适当 的剂型，包括注射剂、片剂和胶囊剂。
10.按照权利要求8所述的组合物，其特征在于，可应用于肿瘤治疗。
全文摘要
本发明涉及一种聚乙二醇-二肽-抗肿瘤药物复合物及其在用途，其特征在于采用组织蛋白酶B敏感的二肽将PEG和抗肿瘤药物进行偶联，即保留了PEG修饰的优势，同时又发挥了组织蛋白酶B敏感的二肽在肿瘤部位特异性降解的特点，可以克服PEG修饰对药物活性的影响，不失为一种较好的肿瘤治疗解决方案。
文档编号A61K31/337GK101837130SQ200910119059
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者张强, 戴传云, 王坚成 申请人:北京大学