专利名称：人miR-125a-5p反义核酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及一种microRNAOiiiRNA)的用途，尤 其是涉及一种用于抑制人miCr0RNA-125a-5p(miR-125a-5p)表达的反义寡聚核苷酸及其 应用。该反义寡聚核苷酸可与人miR-125a-5p互补，从而抑制人miR-125a-5p的表达而起 到抗肿瘤的作用。本发明还涉及含有该miRNA反义寡聚核苷酸的药物组合物。
背景技术：
mi RNAs是小的非编码RNA，长度为20_25bp，通常是由RNA聚合酶II(PolII) 转录的，一般最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的 pri-miRNA。这些pri_miRNA在RNase III Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成 70个核苷酸组成的pre-miRNA前体产物。RAN-GTP和exportin 5将这种前体分子输送到细 胞质中。随后，另一个RNaseIII Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的双链。这种 双链很快被引导进入(miRISC)复合体中，其中含有Argonaute蛋白，并且成熟的单链miRNA 保留在这一复合物中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过两种依赖于序列 互补性的机制负调控基因表达，与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其 表达。然而，最近也有证据表明，这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制 的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非翻译区。如果miRNA与靶位点完全互补(或者几 乎完全互补)，那么这些miRNA的结合往往引起靶分子mRNA的降解。miRNAs在物种进化中 相当保守，在动物，植物和真菌等中发现的miRNAs表达均有严格的组织特异性和时序性。目前，只有很小一部分miRNAs的生物学功能得到阐明。这些miRNAs调节细胞生 长和组织分化，与生物生长发育有关。一系列的研究表明miRNAs在细胞生长和凋亡，血细 胞分化，同源异形盒基因调节，神经元的极性，胰岛素分泌，大脑形态形成，心脏发生，胚胎 后期发育等过程中发挥重要作用。例如，miR-273参与线虫的神经系统发育过程；miR-430 参与斑马鱼的大脑发育；miR-181控制哺乳动物造血细胞分化为B细胞；miR-375调节哺乳 动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌；miR-143在脂肪细胞分化起作用；miR-196参与了哺乳动 物四肢形成，miR-1与心脏发育有关。另有研究人员发现许多神经系统的miRNAs在大脑皮 层培养中受到时序调节，表明其可能控制着区域化的mRNA翻译。miRNA表达与多种癌症相关，并且这些基因可能起到肿瘤抑制基因或是癌基因作 用。最先在B细胞慢性淋巴性白血病(CLL)中发现有miRNA表达水平的改变，随后陆续在 各种人类肿瘤中均检测到miRNA表达水平的变化。研究发现，miRNAs与肿瘤形成相关，既能 发挥肿瘤抑制基因的作用(如miR-15a和miR-16-l)，又能起到癌基因的作用(如miR-155 和miR-17-92簇)。目前认为，在肿瘤细胞中，有些miRNA成熟体或前体表达水平异常，而 表达异常的miRNA通过影响靶mRNA翻译发挥作用，参与肿瘤形成过程，并起重要作用。如 Ras原癌基因受let-7家族的调控，BCL2抗凋亡基因受miR-15a-miR-16-l簇调控，E2F1转 录因子受miR-17-92簇调控，BCL6抗凋亡基因受miR-127的调控等。miRNAs的表达下调也 和肿瘤发生有密切关系，这预示着miRNA具有癌基因的功能。例如，miR-143和miR-145在结肠癌中明显下调。有趣的是，其发夹结构的前体分子在肿瘤和正常组织中含量相似，这表 明，miRNAs的表达下调可能是由于其加工过程受到破坏。但是，miR-143和miR-145的肿瘤 抑制基因功能可能不仅仅局限于结肠癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、淋巴癌等细胞系中 其表达量也明显下调。另一个报道表明，miR-21在胶质母细胞瘤中表达增加。这个基因在 肿瘤组织中的表达量比在正常组织中高5-100倍。miRNAs是天然的反义作用因子，能够调控与真核生物生存和增殖相关的多种基 因。在肿瘤治疗方面，miRNA的应用前景光明。在利用miRNA作为治疗靶点方面，已有实验 数据支持如在吉西他滨(gemcitabine)治疗的过程中，出现miRNA表达谱的变化；调控部 分miRNA的表达水平(如使miR-21过表达)，能增进胆管癌细胞对化疗药物的敏感性。通 过引入与具有癌基因特性的miRNA互补的合成的反义寡聚核苷酸——抗miRNA寡聚核苷酸 (AMOs)——可能有效的灭活肿瘤中的miRNAs，延缓其生长。临床上，可以通过经常的或者持 续的2’ -0-甲基化或者锁核酸(LNA)等修饰的反义寡聚核苷酸给药使miRNA失活。这些 修饰使得寡核苷酸更稳定，比其他治疗手段毒性更低。使用antagomirs (与胆固醇偶联的 AMOs)，注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miRNA活性，因而可能成为一种有希望的治疗 药物。相反的，过表达那些具有肿瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7家族，也可以用于治 疗某些特定的肿瘤。反义寡聚核苷酸(Flanagan WM. Antisense comes of age. Cancer&Metastasis Reviews 1998 ;17(2) :169-76)是指一段可以与其靶基因的碱基互补的核苷酸。反义寡聚 核苷酸可以抑制相应基因的表达。人microRNA-125a (hsa-mir_125a)位于 16 号染色体，前体序列为 UGCCA⑶CUC UAG⑶CCCUGAGACCCUUUAACCUGUGAGGACAUCCAGG⑶CACAG⑶GAG⑶UCUUGGGAGCCUGGCGUCUGGC C,含有两个成熟 microRNA :hsa-miR-125a-5p (序列为 UCCCUGAGACCCUUUAACCU⑶GA)和 hsa-miR-125a-3p (序列为 ACAG⑶GAG⑶UCUUGGGAGCC)。Nam 等利用芯片技术和 northern 验 证了 20例卵巢癌组织和6例正常组织中miRNA的表达水平，发现了 mir_125a在两者中表达 有显著差异。Park等利用quantitative PCR技术比较了 50例配对的正常唾液腺组织和唾 液腺鳞状上皮细胞癌中miRNA表达水平，发现miR-125a表达水平是下降的。Magrelli等用 microarray和quantitative PCR检测了肝毒细胞瘤和肝细胞癌组织中miRNA表达水平，发 现miR-125a在肝毒细胞瘤中表达水平升高。Guo等在乳腺癌细胞株中HuR是miR-125a的靶 基因，miR-125a过表达可以抑制细胞增殖和侵袭，但HuR过表达可以恢复mir-125a的作用。 这说明了 miR_125a在乳腺癌细胞株中是一个癌基因。(Wu and Belasco 2005 ；Nam, Yoon et al. 2008 ；Cowden Dahl，Dahl et al. 2009 ；Guo, Wu et al. 2009 ；Li, Duan et al. 2009 ； Lionetti,Biasiolo et al. 2009 ；Magrelli,Azzalin et al. 2009 ；Park,Zhou et al. 2009)近三十年，尽管临床上肿瘤的综合治疗已很普遍，但以手术为主，放化疗为辅的综 合治疗对肿瘤患者的生存率提高并不明显，5年总体生存率仍然较低，徘徊在30% 55% 左右，并没有显著提高，中晚期患者的5年生存率更低，约为20%。而且这些方法都存在各 自的局限性，特别是对中晚期和复发患者疗效不佳，对伴有远处转移者疗效更差。因此，寻 找更安全有效的治疗途径是提高肿瘤患者生存率和生存质量所亟待解决的难题。
发明内容
本发明要解决的主要问题就是提供一种新的miR-125a-5p的反义核酸(抑制剂)， 用于高效、低毒或无毒地抑制miR-125a-5p的表达，进而治疗与miR-125a-5p过度表达有关 的疾病，包括各种实体肿瘤、各种白血病等。本发明要解决的另一问题就是提供上述反义核酸在制备治疗miR-125a-5p过度 表达的相关疾病(尤其是脑胶质瘤)的药物中的用途。本发明要解决的再一问题是提供一种包含上述反义核酸的药物组合物。本发明人通过广泛而深入的研究，设计并合成了一种专一性针对miR-125a-5p的 反义核酸，并在培养细胞中验证具有抑制效果的反义核酸。研究显示，这些反义核酸能够抑 制肿瘤细胞的生长和恶性增殖能力。本发明设计了一种可以特异性结合于miR-125a-5p的反义核酸分子，在培养细胞U87/ MG中，验证对miR-125a-5p表达特异性抑制的反义核酸对细胞生长能力、增殖能力的影响，反义 核酸分子长度可以包含13 24个核苷酸残基，均有不同程度的抑制人肿瘤细胞生长能力、增 殖能力的特性，其中最短的反义核酸长度为13个碱基，不同长度的反义核酸均具有良好的肿瘤 细胞生长及增殖抑制活性。因此，上述反义核酸均可用来制备抑制肿瘤细胞生长能力、增殖能 力的制剂，其中优选miR-125a-5p高表达的肿瘤细胞。在此基础上完成了本发明。本发明的第一方面，提供了一种miR-125a-5p的反义寡聚核苷酸，所述反 义寡聚核苷酸抑制人细胞内miR-125a-5p的表达。通常，所述反义寡聚核苷酸与 5 ‘ -UCCCUGAGACCCUUUAACCU⑶GA-3 ‘中连续13 24个核苷酸序列互补。在本发明的一个 优选实施例中，所述反义寡聚核苷酸的长度为18 22个核苷酸。更佳地，所述反义寡聚核 苷酸的序列为 5 ‘ -UCACAG⑶UAAAGG⑶CUCAGGGA-3 ‘。从目前来看，核酸杂交中RNA与miRNA的杂交亲和力比DNA与miRNA杂交的亲和 力要高，具有很高的药用价值。但是人工合成DNA的成本远远比合成RNA的成本低，也具有 很好的市场潜力。而且也可以采用核糖RNA单体与脱氧核糖DNA单体嵌合相连而成的反义 核酸作为药物进行开发。本发明设计的一系列反义核酸分子，既包括DNA分子，也包括RNA 分子，两种分子均具有抑制miR-125a-5p表达的活性。本发明设计的反义核酸，其序列具有特异性生物学活性，其对于某一基因互补的 位点的反义核酸所互补的长度有很大关系，如互补的长些，则生物学活性会更高些，抑制效 果也会更好一些，在增加或减少一个至数个碱基而互补与同一基因位点的反义核酸，同样 也具有不同程度的生物学活性，也可达到不同程度的抑制肿瘤细胞生长与增殖的作用，本 发明的研究表明，最短可达13个碱基仍然具有抑制miR-125a-5p表达的作用。反义核酸研 究中，各种化学修饰方法很多。本发明采用选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一 种或几种组合修饰的反义核酸，硫代、甲氧修饰方式的反义核酸的药理学、药代动力学、毒 理学等临床前研究是各种化学修饰反义核酸中研究最为全面的，修饰的反义核酸在体内可 以有效地防止人体内大量核酸外切酶对反义核酸的酶切而降解，从而避免反义核酸失去应 有的生物学活性。此外硫代反义核酸还可激发RNA酶的活性，降解与其杂交的RNA链，因此 优选这两种修饰方式的反义核酸在实验中应用。应当明确的是，任何能够增加反义核酸稳 定性和生物利用度的修饰方法都可以应用，如胆固醇修饰、PEG修饰等。优选本发明反义核 酸修饰选自硫代修饰、2’ -甲氧基修饰和胆固醇修饰中的一种或几种。最优选采用如下修饰方式进行2’ -甲氧基修饰，并且5’端两个核苷酸进行硫代修饰，3’端四个核苷酸进行 硫代修饰并且在5’或者3’端连接胆固醇。本发明的上述反义核酸具有抑制miR-125a-5p表达的效果。当将上述反义核酸转 染到表达miR-125a-5p的细胞株U87/MG中后，能够有效抑制U87/MG细胞的生长和恶性增 殖能力。本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明寡聚核苷酸以及药 学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括但不限于盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇 及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性且可被人和/或动物所接
受的量。所述“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒 性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。在本发明的第三方面，提供了本发明的反义寡聚核苷酸的用途，用于制备治疗以 下疾病的药物治疗人体与miR-125a-5p过表达有关的疾病，包括各种实体肿瘤、各种白血病等。如本文所用，“反义寡聚核苷酸”指反义的核苷酸寡聚物。反义寡聚核苷酸通过碱 基互补(A-T，A-U, G-C)配对与双链DNA形成三链(反基因)，或与单链RNA形成杂交双链 (反义)，从而阻断基因的复制、转录或转录后mRNA的加工和翻译。同时，双链RNA能被细 胞内的核糖核酸酶H(RNaseH)所降解，从而更有效地阻断靶基因的表达。由于反义核苷酸 只能与反向互补的靶序列结合，具有专一性高，副作用小的特点。本发明的反义寡核苷酸的长度没有特别限制，一般来说，为了达到杂交的专一性， 反义寡聚核苷酸需要知道13个单体组成的核苷酸。通常反义寡聚核苷酸的长度为13 35bp，对于miRNA来说，较佳的为18 24bp。
图1显示了 miR-125a-5p反义寡聚核苷酸抑制肿瘤细胞U87/MG细胞中 miR-125a-5p的表达，附图IA D中正方形、圆形、三角形线条是重复试验的结果。A为转染 miR-125a-5p 反义寡聚核苷酸(5，-UCACAG⑶UAAAGG⑶CUCAGGGA-3，)后 miR-125a_5p 的表达 情况，B为转染阴性对照反义寡聚核苷酸(5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，)后miR-125a_5p 的表达情况；C为转染miR-125a-5p反义寡聚核苷酸后内参基因TO的表达情况；D为转染阴 性对照反义寡聚核苷酸后内参基因U6的表达情况；E为miR-125a-5p在转染反义寡聚核苷 酸后抑制效果柱状图，其中转染反义核酸样品表示转染miR-125a-5p反义寡聚核苷酸后的 miR-125a-5p表达情况，阴性对照样品表示转染阴性对照后miR-125a-5p表达情况。图2显示了 miR-125a-5p反义寡聚核苷酸抑制肿瘤细胞U87/MG细胞的生长和增 殖，A，B为转染了 FAM标记的阴性对照后的U87/MG细胞；C为转染阴性对照后U87/MG细胞 状态；D为转染miR-125a-5p反义寡聚核苷酸(5，-UCACAG⑶UAAAGG⑶CUCAGGGA-3，)后U87/ MG细胞状态。
具体实施例方式本发明的反义寡聚核苷酸，其序列与5’ -UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA-3，中连续 13 24个核苷酸序列互补，并且亦不与其他基因的RNA序列互补。在本发明的一个优选实 施例中，所述反义寡聚核苷酸的序列为5' -UCACAGGUUAAAGGGUCUCAGGGA-3'。本发明提供 的反义寡聚核苷酸可以为修饰产物，它含有至少两个，通常至少4个，较佳的至少6个，更佳 的至少8个核苷酸没有毒性副作用的修饰的核苷酸，所述修饰方式包括2’位甲氧基取代、 硫代修饰等。为了增加反义寡聚核苷酸的细胞摄取率，还可以在上述修饰的基础上对反义 寡聚核苷酸进行胆固醇修饰或者PEG化修饰。上述修饰后的寡聚核苷酸能继续与靶序列有 效配对，而且比普通的未经修饰的核糖核酸或者脱氧核糖核酸在体内具有更长的半衰期。本发明具有如下优点1、反义寡聚核苷酸作用于特异性的靶位点，非特异性结合的位点很少，专一性 尚；2、本发明提供的反义寡聚核苷酸经过适当的化学修饰，具有毒性低、副作用小和 半衰期长等特点；3、本发明提供的反义寡聚核苷酸具有很好的抑制效果，对miR-125a-5p的表达的 抑制率达到40%，对肿瘤细胞生长的抑制率超过60%。实施例下面将结合实施例及附图进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实 施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。首先，由上海吉玛制药技术有限公司合成miR-125a-5p反义核酸，序列为 5’-UCACAGGUUAAAGGGUCUCAGGGA-3’。在实施例中涉及的所用序列均由上海吉玛制药技术有 限公司合成。实施例1、miR-125a_5p反义核酸抑制miR-125a_5p的表达进行实时定量荧光检测，其中涉及的寡聚核苷酸序列由上海吉玛制药技术有限公 司合成，具体实验步骤包括细胞培养U87/MG细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，10% FBS-DMEM 培养基(FBS 购自 Hyclone, DMEM 购自 Gibco)培养，37°C ,5% CO2 培养。细胞转染1)转染前一天，在24孔板中用适量不含抗生素的培养基接种培养细胞，使转染时 细胞的汇合度达到30 50% ；2)转染样品按照如下方法准备寡聚物-Lipofecta mine 2000复合物a.用50 μ 1不含血清的Opti-MEM I培养基(Gibco)分别稀释 miR-125a-5p 反义寡聚核苷酸(5，-UCACAG⑶UAAAGG⑶CUCAGGGA-3，)、阴性对照 (5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’)、FAM标记的阴性对照，终浓度为50nM，轻轻混勻，每个转 染设3个复孔；b.使用前轻轻混勻 Lipofecta mine 2000 (Invitrogen)，然后取 2 μ 1 稀释到 50 μ 1的Opti-MEM I培养基中，轻轻混勻后在室温下孵育5min ；c.孵育5min后，稀释的Lipofecta mine 2000分别与稀释的反义核苷酸及对照 混合，轻轻混勻后在室温下孵育20min，以允许复合物的形成；
3)将复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中，轻轻地前后摇动培养板混 合；4)37°C,5% CO2培养箱孵育过夜，更换含10%胎牛血清的培养基继续培养24h。总RNA 提取1)离心收集细胞，往离心管中加入500 μ 1 Ezol (Invitrogen)，将离心管上下颠倒 混勻，室温放置IOmin。2)加入200 μ 1 RNA专用的三氯甲烷(上海生工)，剧烈上下颠倒混勻，直至离心 管中的液体彻底混勻，成乳白色状。3)室温放置 5min，12000rpm 离心 15min。4)小心将上清转移至另一干净的1. 5ml离心管中，避免吸动中层蛋白相和下层有 机相。5)往上清中加入500 μ 1预冷的RNA专用的异丙醇(上海生工)，室温放置5min。 IOOOOrpm 离心 IOmin06)小心弃尽上清，加入Iml RNA专用的75%的乙醇(上海生工)洗涤沉淀， IOOOOrpm 离心 IOmin07)小心弃尽上清，置于室温晾干乙醇，每管加入20 μ 1 DEPC水(上海生工)溶解， 混勻。RNA 逆转录将上述抽提得到的RNA分别用U6和hsa-miR-125a_5p两种RNA特异逆转录引物 进行逆转录，制备cDNA模板。逆转录中所用的缓冲液和酶均为Promega公司产品。(i).逆转录体系(引物序列由上海吉玛制药技术有限公司合成)
权利要求
1.一种反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸包含与 5，-UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA-3，中连续13 M个核苷酸序列互补的序列。
2.如权利要求1所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸包含序列 5， -UCACAG⑶UAAAGG⑶CUCAGGGA-3，。
3.如权利要求1所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸为核糖核 苷酸、脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。
4.如权利要求1 3中任一项所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷 酸进一步被修饰。
5.如权利要求4所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述修饰选自核糖修饰、碱基修 饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合。
6.如权利要求5所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述修饰选自硫代修饰、2’-甲 氧基修饰和胆固醇修饰中的一种或几种。
7.如权利要求6所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所有核酸进行2’-甲氧基修饰， 并且5’端两个核苷酸进行硫代修饰，3’端四个核苷酸进行硫代修饰并且在5’或者3’端连 接胆固醇。
8.权利要求1 7中任一项所述的反义寡聚核苷酸用于制备治疗miR-12fe-5p过度表 达的相关疾病的药物的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述miR-12fe-5p过度表达的相关疾病为脑 胶质瘤。
10.一种药物组合物，其特征在于，含有治疗有效量的权利要求1 7中任一项所述的 反义寡聚核苷酸以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开一种抑制人microRNA-125a-5p表达的反义寡聚核苷酸及其应用。该反义寡聚核苷酸特异性结合于人miR-125a-5p，包含与5’-UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA-3’核苷酸序列中至少13个连续核苷酸互补的序列，特别是序列5’-UCACAGGUUAAAGGGUCUCAGGGA-3’。本发明的反义寡聚核苷酸可以为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或二者的嵌合体，并可对链中任一核苷酸进行修饰。本发明的miR-125a-5p反义寡核苷酸有效抑制人脑胶质瘤细胞中miR-125a-5p表达，抑制该细胞生长和增殖，从而有效治疗脑胶质瘤及其他miR-125a-5p高表达肿瘤。
文档编号A61P35/00GK102080084SQ20091019973
公开日2011年6月1日 申请日期2009年12月1日 优先权日2009年12月1日
发明者丁侃, 东楠, 张佩琢, 李捷, 沈孝坤 申请人:中国科学院上海药物研究所, 苏州吉玛基因药物科技有限公司