专利名称：全人TNFa单克隆抗体及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及TNFa结合蛋白及其应用。
背景技术：
自身免疫性疾病是继癌症和心血管疾病的第三大类疾病。类风湿性关节炎(RA) 是最常见的自身免疫病之一，我国类风湿关节炎患病率约为0. 32-0. 36%，在60岁以上人 群发病率高达30 % 40 %。面对每人每年几十万元的进口药物治疗费用，患者往往只能长 期忍受痛苦的化学治疗，却又收效甚微。RA的患病人群多，用药量大，使其治疗性药物的市场巨大，2005年全球市场达到 60亿美元。目前临床治疗RA的方案很多，首选用大剂量非留体抗炎药可控制症状，如无效， 则临床首选氨甲蝶呤等免疫抑制药治疗。约四分之一的患者首次发病后经及时治疗可终生 不再复发，约二分之一的患者经治疗后症状暂时得以缓解，但仍会反复发作，部分最终发展 为关节功能障碍；约四分之一的患者对目前所有的常规治疗均无效。肿瘤坏死因子- α (TNF-α)是类风湿性关节炎病变过程中起主要作用的细胞因 子，实验和临床结果均证实TNF是治疗该病的适合靶点。国外对RA的发病机理进行了充 分的研究，发现肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-α )在该疾病的病理 进程中起十分关键的作用，患者或动物模型病变关节腔内的TNF水平异常升高。TNFa和 TNF^是哺乳动物细胞中的一类同源分泌型蛋白质，它们相互之间具有很高的同源性，二者 都可以对许多细胞类型造成多方面的影响。这两种蛋白都可以通过与细胞膜上的受体作用 而影响细胞的生物学功能。肿瘤坏死因子TNF α能够引起肿瘤组织出血坏死并具有多方面 功能。成熟分子由157个氨基酸组成，含有两个二硫键，没有糖基化位点。其前体为233个 氨基酸组成的多肽，N-端76个氨基酸组成的多肽不是信号肽，它可以把前体固定在细胞膜 上，使成熟的分泌型保留在细胞膜上。前体的成熟mRNA长度为1.71Λ。在体内主要由单核 巨噬细胞产生。针对TNF-α的抑制剂成为迄今为止最为成功的RA治疗药物。代表药物 如 Wyeth/Amgen 公 司 Enbrel(etanercept)， Johnson & Johnson, Schering Plough/ Centocor 公 司 Remicade(infliximab), Cambridge Antibody Technology/Abbott 的 Humira(adalimumab)。Enbrel为Amgen公司开发的制剂，是TNF-α受体和Fc的融合蛋白， 不仅对风湿性关节炎有非常不错的疗效，且对牛皮癣及牛皮癣型关节炎也有明显的治疗作 用，同时在促进脊椎炎愈合的研究上，Enbrel也进入了二期临床。2004年销售额是25亿美 元，预计2008年可达34亿美元。Remicade是一种人鼠嵌合性的抗TNF-α单克隆抗体，可 特异性结合可溶性及膜结合型TNF-α，其适应症包括Crohn’病，风湿性关节炎(RA)，重症 强直性脊柱炎(AQ。在2003年和2004年全球销售额分别是22. 7亿和28. 9亿美元，是生 物医药领域的“重磅炸弹”。2002年12月Abbott公司的Humira成为第一个获准用于减轻 成人中到重度活动期RA的病征和症状及抑制关节结构损伤进展的全人单克隆抗体。由于 是全人抗体，避免了 Remicade会产生免疫反应的缺点。Humira与Remicade及Enbrel相比的另一个优势是给药方法的便利上。Humira每月只需注射两次，而Remicade和Enbrel必 须每周注射两次。Humira市场占有率正逐年提高，2003年和2004年的销售额分别是2. 8 亿和8. 5亿美元。2006年，全球三大抗TNF- α拮抗剂Humira与Remicade及Enbrel 3个 药物已近 80 亿美元，2008 年 Enbrel (64. 9)、Remicade (53. 3)、Humira (45. 2)、Cimzia 合计 为163亿美元。这三个代表药物的疗效均比较确定，并且随着大规模临床试验的不断开展，除RA 以外的克隆氏病、强直性脊柱炎、银屑病等其他自身免疫病也相继成为新的适应症，使其 市场更加庞大。这些生物产品的特异性高，靶向性好使其副作用较其他同类药物明显降 低，逐渐地与甲氨蝶呤合用作为RA的一线用药，并增强它们对目前中至重度的风湿性疾 病等其他自身免疫病市场的渗透。目前处于开发末期阶段的新药主要有UCB/Celltech 公司的⑶P-870(PEG化人源化抗TNF抗体Fab片段)和⑶P571 (人源化抗TNF单抗)， Bristol-Myers Squibb 公司的 CTLA41g(Abatac印t)，Roche 公司的 Rituxan 和 MRA 等。其 中进展最迅速的是⑶P-870，目前已经进入临床III期，⑶P-870于2006年底进入市场， ⑶P-870应用大肠杆菌进行生产，使其成本降低至其他TNF抑制剂药物的四分之一。虽然现有的TNF抗体类药物被认为较其它任何药物的效果都好，但它们也存在很 大的缺点。第一，它们均来自哺乳动物细胞表达和纯化，由于表达水平较低和生产能力有 限远远不能满足市场的需求，即便是Amgen斥资5亿美金创建了全球最大的20，000升细 胞培养生物反应器，这一问题依然存在(据2004年美国biopharma报告)；第二，这些抗体 的高昂成本使很大一部分患者被拒之门外，据估计，常规应用Enbrel、Remicade和Humira 治疗RA —年的费用分别是11400、14200和16776美金，且需反复使用(据2004年美国 biopharma报告)；第三，这些抗体所携带的Fc段具有结合补体和ADCC等活性，体内应用 会导致表达TNF的细胞的凋亡，会产生一系列副作用；第四，Remicade是人鼠嵌合性单抗， 含有1/3的鼠源蛋白成分，连续注射可以在10%以上的病人中激发人抗鼠源蛋白抗体反应 或人抗嵌合蛋白抗体反应，影响治疗效果并可能导致严重的不良反应。即将上市的CDP870 是PEG化人源化抗TNF抗体Fab段[17]，其鼠源蛋白成分下降到10%，但仍然有免疫原性。 而Humir的可变区的氨基酸序列和相应的DNA序列来自于CAT公司开发的人源抗体库，其 Fc片段的编码区来自人的IgGl。由此可见，该产品的可变区序列并非直接来自人，而是来 自起源于人B细胞的抗体库。此外，虽然人类免疫系统能够产生种类极其庞大的抗体，但是人或全人抗体技术 却遇到了瓶颈人体内产生特异性抗体的前体细胞丰度很低，即使在抗体阳性的个体中，能 够产生特异性抗体的前体细胞也远远低于人杂交瘤技术所需要的能够产生特异性抗体细 胞数量。因此，分离、纯化和富集特异性分泌抗体的B细胞成为建立全人抗体平台的关键技 术之一。
发明内容
本发明用全人抗体技术从类风湿关节炎病人体的B细胞中获得抗人TNFa单克隆 抗体，发酵、纯化后，采用聚乙二醇化(PEG化)方法体外改造和修饰，在保持其抗TNF活性 的同时，使之更适合体内应用。本发明第一方面公开了一种抗人TM^a单克隆抗体，包括重链与轻链，其轻链具有SEQ IDNO 3的氨基酸序列，其重链具有SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 6的氨基酸序列。进一步的，所述抗人TNFa单克隆抗体经PEG化修饰。本发明第二方面公开了一种多核苷酸，该多核苷酸含有编码前述抗人TM^a单克 隆抗体的重链和/或轻链的多核苷酸序列。进一步的，编码前述抗人TNi^a单克隆抗体的轻链的多核苷酸的序列为SEQ ID NO 1，编码前述抗人TNiia单克隆抗体的重链的多核苷酸的序列为SEQ I0 NO :2或SEQ ID NO 5，编码抗人TNFa单克隆全长抗体的重链和轻链的多核苷酸的序列同时含有SEQ ID NO=I 与 SEQ IDNO 2 或者同时含有 SEQ ID NO :1 与 SEQ ID NO :5。本发明第三方面公开了一种遗传工程化的宿主细胞，它被含有编码前述抗人 TM^a单克隆抗体的重链和轻链的多核苷酸的载体所转化或转导。任何适用于对表达盒 进行表达的细胞都可以作为宿主细胞。例如，酵母、昆虫、植物等的细胞。优选的，所述宿 主细胞为真核细胞，可采用不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，具体可以是中国仓鼠 的卵巢细胞CH0;幼仓鼠的肾脏细胞(BHK, ATCC CCL 10)；幼鼠的塞尔托利细胞(Sertoli cells) (TM4, Mather, Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))；猴的肾脏细胞(COS 细胞)；通过 SV40 (C0S-7,ATCC CRL 165 1)转化的猴的肾脏CVI细胞；人的胚肾细胞(HEK-293, Graham et al. J. GenVirol.36 :59(1977))；猴肾脏细胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴的肾脏细胞 (VER0-76,ATCCCRL-1587)；人的子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)等。其他细胞系在本学 科领域的文献中也比较常见。从美国模式菌种收集中心(ATCC)可以获得多种细胞系。把核酸导入细胞的方法有许多种。比较常用的方法包括电穿孔技术、粒子枪技术、 磷酸钙沉淀、直接显微注射等等。具体方法的选择一般取决于被转化的细胞类型，以及进行 转化所处的具体环境。在某些情况下，可以采用多阴离子转染脂质体和钙离子调节的细胞 质基因转化技术。本发明第四方面公开了抗人TM^a单克隆抗体的制备方法，包括下列步骤1)在适 合表达抗人TM^a单克隆抗体的条件下培养所述宿主细胞；幻分离纯化获得所述单克隆抗 体。在获得编码本发明的抗体的核酸序列后，可按照以下方法制备生产目的抗体。例 如将含有编码目标抗体的核酸的载体直接导入宿主细胞，细胞在适当的条件下进行培养， 从而诱导出被编码抗体的表达。一旦获得本发明所说的单克隆抗体，就可以采用本领域技术人员所知的常规方法 对抗体分子进行纯化。具体纯化方法包括色谱法，比如，离子交换，亲和层析，尤其与蛋白质 A的特定抗原进行亲和层析，以及尺寸柱层析、离心过滤法、差异溶解度等。在很多情况下， 细胞分泌的抗体进入培养液，并在培养液中收获。本发明第四方面对抗人TNFa单克隆抗体通过体外活性测定和动物实验研究了该 抗体在动物体内的治疗有效性，进一步公开了上述抗人TM^a单克隆抗体的制药用途。抗人 TM^a单克隆抗体可用于制备治疗与TM^a相关的炎症的药物，如制备治疗类风湿性关节炎 的药物。将本发明的抗人TNFa抗体用于治疗类风湿性关节炎等与TNFa相关的炎症时的用 法用量，可参照现有的TNFa抗体的常规用法用量。本发明第五方面，还提供了一种医药组合物，其包含治疗有效量的本发明的单克 隆抗体以及医药学上可接受的载体。可作为医药学上可接受的载体及其组分的物质包括糖类；纤维素及其衍生物；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂；多元醇；海藻酸；乳化剂；润湿剂； 着色剂；调味剂；压片剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；磷酸盐缓冲液等。药 物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水 或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组 合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制 造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明有益效果本发明采用了全人抗体技术，获得了抗人TNFa全人抗体，对该抗体的理化及生物 活性的初步分析表明，该抗体与TNF有较好的亲和力，体外能有效中和TNF对细胞的 杀伤。一方面，由于其全部氨基酸序列均与人抗体完全一致，使其对人体的免疫原性降低到 最低。其次，采用PEG化表面改性技术，以减小其被内皮系统吞噬的概率，延长在血液循环 系统中的时间，同时又实现在体内缓释的目的，避免了小分子抗体半衰期短的缺点，在保持 其抗TM^aS性的同时，使之更适合体内应用。与现有的单抗药物相比，可以大大降低用药 频率。这不但进一步降低了病人的经济负担，而且大大减少了病人注射的痛苦，减少了劳动 力损失。
具体实施例方式以下列举具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实施例并非用于限制本发明的 保护范围。实施例1抗人TNFa抗体基因的获得取活动性类风湿关节炎病人外周血5毫升，用淋巴细胞分离液分离白细胞，进行 培养，根据ELISA结果鉴定阳性克隆。1.选择血样为了获得分泌抗人TNFa的人B细胞，首先用人TNFa (购自深圳晶美公司)常规包 被96孔板，每孔用该蛋白250ng，包被过夜。然后，用5%脱脂奶粉室温封闭2小时，奶粉用 pH7. 2PBS配制。洗涤后，加入不同病人血清100微升，室温温育1小时。然后加入过氧化 物酶标记的羊抗人IgG，室温放置1小时。洗涤至少5遍后，加入含TMD或其他显色剂，室 温或37度处理20分钟。最后，加入终止液。加入的过氧化物显色底物加入10分钟后，用 50 μ IlN的硫酸终止反应，读取450nm光密度值。选取阳性且OD值高的血清作为获选血样。2.分离并富集分泌抗TNF抗体的人B-细胞3.在适当条件下对分泌抗TNF抗体的人B-细胞进行培养4.抗体-反应ELISA筛选用ELISA检测抗TNFa IgG的分泌。对人B细胞培养液上清的样品进行筛选。其 中，选择出具有最好的结合能力的两个阳性克隆，且为IgGl。取阳性克隆细胞各5000-10000个，分别用Trizol (GIBCO)分离总RNA，用MMLV反 转录酶(Promega公司产品)以获取cDNA。上述操作均按照厂家说明书进行。用下述引物 和条件进行PCR，所用扩增酶为ClonTech的Pfu以确保扩增过程中减少可能的突变。轻链上游引物GAAATTGTGCTCACACAGTC(SEQID NO 7)轻链下游引物CTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC(SEQID NO 8)
重链上游引物GAAGTCCAGCTGGTCGAGAG(SEQ ID NO 9)重链下游引物GTGAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCTC(SEQ ID NO :10) PCR条件a)反应体系的组成
权利要求
1.一种抗人TNi^a单克隆抗体，包括重链与轻链，其轻链具有SEQ ID NO 3的氨基酸序 列，其重链具有SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 6的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述抗人TNFa单克隆抗体，其特征在于，所述抗人TNFa单克隆抗体经 PEG化修饰。
3.一种多核苷酸，该多核苷酸含有编码权利要求1所述抗人TM^a单克隆抗体的重链和 /或轻链的多核苷酸序列。
4.如权利要求3所述多核苷酸，其特征在于，所述编码抗人TNFa单克隆抗体的轻链 的多核苷酸序列为SEQ ID NO :1，编码抗人TM^a单克隆抗体的重链的多核苷酸序列为SEQ IDNO :2或SEQ ID NO :5，编码抗人TNFa单克隆抗体的重链和轻链的多核苷酸序列同时含有 SEQ ID NO 1 与 SEQ ID NO 2 或者同时含有 SEQ ID NO 1 与 SEQ ID NO :5。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，它被含有编码权利要求1所述抗人TM^a单克隆抗体的 重链和轻链的多核苷酸的载体所转化或转导。
6.如权利要求5所述遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述编码抗人TNFa单克隆 抗体的重链和轻链的多核苷酸的序列同时含有SEQ ID NO :1与SEQ ID NO :2或者同时含有 SEQ ID NO :1 与 SEQ ID NO :5。
7.如权利要求5或6所述遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞。
8.如权利要求7所遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为CHO细胞。
9.一种抗人TM^a单克隆抗体的制备方法，包括下列步骤1)在适合表达抗人TM^a单 克隆抗体的条件下培养权利要求5-8任一权利要求所述宿主细胞；2)分离纯化获得所述单 克隆抗体。
10.如权利要求1或2所述抗人TNFa单克隆抗体的用途，为用于制备治疗与TNFa相关 的炎症的药物。
11.如权利要求10所述抗人TNFa单克隆抗体的用途，其特征在于，所述治疗与TNFa相 关的炎症的药物为治疗类风湿性关节炎的药物。
12.一种医药组合物，其包含权利要求1或2所述抗人TNFa单克隆抗体以及医药学上 可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种全人TNFa单克隆抗体及其制备与应用。本发明采用了全人抗体技术，获得了抗人TNFa全人抗体，对该抗体的理化及生物活性的初步分析表明，该抗体与TNF有较好的亲和力，体外能有效中和TNF对L929细胞的杀伤。本发明的全人TNFa单克隆抗体对人体的免疫原性降低到最低。采用PEG化表面改性技术，避免了小分子抗体半衰期短的缺点，在保持其抗TNFa活性的同时，使之更适合体内应用。
文档编号A61K39/395GK102127167SQ20101002284
公开日2011年7月20日 申请日期2010年1月15日 优先权日2010年1月15日
发明者倪健 申请人:苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司