专利名称：山芝麻提取物在制备抗肝纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药山芝麻提取物的用途，具体地说是以山芝麻水提取物、三萜类化合物为原料在制备抗肝纤维药物中的应用。
背景技术：
我国是病毒性肝炎流行的高发区，慢性肝炎患者数千万，加之某些有毒物质所致的肝损伤，都有可能发生肝纤维化，肝纤维化已成为世界范围内主要的医学难题之一。目前已公认肝脏疾病一般是由急性-慢性-肝纤维化-肝硬化到肝癌的发生发展模式，因此阻断肝纤维化的发生和发展，对防治肝硬化和肝癌具有重要意义。许多研究已证实肝纤维化是一个动态过程，属可逆性病变，如果致病因素得到及时彻底治疗，肝损伤停止发展，则肝纤维化多可逆转。抗肝纤维化的治疗，国内外虽陆续有过一些报道，但因种种原因尚未找到十分理想的药物，众多学者仍在进行有益的探索。近些年来，国内外大量研究表明天然药物和中药在治疗肝纤维化方面显示出了可靠疗效和较少不良反应的特点。因此采用现代化技术从天然药物和中药中开发抗肝纤维化新药具有重要意义。
山芝麻系梧桐科植物山芝麻(Helicteres angustifolia L.)的根，能清热解毒，主要用于感冒发热、肺热咳嗽、咽喉肿痛、麻疹等。至今，对山芝麻公开报道的研究主要集中在其化学成分的分离、鉴定方面，其药效学研究很少，抗肝纤维化的研究则未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供中药山芝麻提取物(水提取物、三萜类化合物)在制备抗肝纤维化药物中的应用，其中山芝麻水提取物是采用常规法用水提取得到的物质，而山芝麻三萜类化合物则是用乙醇提取、AB-8大孔树脂柱分离得到的三萜类化学物质的混合物，即总三萜类。
本发明的技术方案是 山芝麻水提取物在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
山芝麻三萜类化合物在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
山芝麻三萜类化合物包括医药可接受的盐。
山芝麻三萜类化合物包括药学上可接受的载体。
本发明是基于发明人的实验研究而完成的。研究分两大部分 一、山芝麻提取物的制备 1、山芝麻水提取物的制备 山芝麻药材，加10倍量水提取2次，每次1.5h，合并提取液，60℃减压恒温干燥即得山芝麻水提取物。
2、山芝麻三萜类化合物的制备 山芝麻药材，用乙醇回流提取，上AB-8大孔树脂柱分离，最后60℃减压恒温干燥即得山芝麻三萜类化合物，以齐墩果酸为对照品，以5％香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂，采用分光光度法在550nm测定样品的吸光度，测得山芝麻三萜类化合物纯度为79.8％(三萜类化合物含量测定方法参考陆震鸣，陶文沂，许泓瑜，等.樟芝菌粉三萜类化合物含量的测定，中成药[J]，2008，30(3)402-405)。
3、所述山芝麻三萜类化合物在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其山芝麻三萜类化合物包括医药可接受的盐，如山芝麻三萜类化合物钠盐。(参考发明专利“沙苑子及其提取物在制备抗肝纤维化及抗癌药物中的应用，专利号CN1251700C”) 4、所述山芝麻三萜类化合物在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其山芝麻三萜类化合物包括药学上可接受的载体。(参考同上) 二、山芝麻抗肝纤维化药效学实验 1、对肝星状细胞的影响 用HSC-T6细胞作为体外模型，研究山芝麻提取物对HSC的影响，观察山芝麻提取物对肝星状细胞的影响和对CCl4致大鼠肝纤维化的保护作用。结果表明，山芝麻水提物、三萜类化合物对HSC-T6细胞毒性很低，可显著降低细胞上清液HyP、HA和TIMP-1含量，且随着药物浓度的增加，其降低作用逐渐增强，呈现量效反应关系。提示，山芝麻水提物、三萜类化合物在体外对HSC-T6细胞有显著的抗增殖作用。
对HSC凋亡的影响的实验则发现，吖啶橙染色法、流式细胞术和电镜观察的结果显示，山芝麻水提物、三萜类化合物作用后的HSC-T6可见少量坏死细胞和许多不同程度的凋亡细胞。
用RT-PCR方法检测I、III型胶原及α-SMA mRNA的变化，结果表明，山芝麻水提物、三萜类化合物含药血清可下调HSC-T6细胞株I、III型胶原、α-SMAmRNA表达，不同浓度含药血清作用强度有所不同，呈浓度依赖性。
2、对CCl4致大鼠肝纤维化的保护作用 将SD雄性大鼠以50％CCl4油溶液诱导形成肝纤维化动物模型，观察山芝麻提取物抗肝纤维化的作用。
对肝纤维化大鼠血清学指标的影响山芝麻水提物、三萜类化合物各剂量组均可显著降低肝纤维化大鼠血清MDA、HyP、HA和TIMP-1含量(P＜0.05或P＜0.01)，且随着药物浓度的增加，其作用逐渐增强，呈现量效反应关系。
对肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响HE染色病理结果显示，正常对照组大鼠肝脏结构完整。模型对照组大鼠肝脏正常肝小叶结构被破坏，由大小不等的圆形或椭圆形肝细胞结节所构成的假小叶取代，结节周围纤维组织增生，少量炎细胞浸润。山芝麻水提物、三萜类化合物高、中剂量组大鼠肝脏肝小叶结构完整，汇管区有少量纤维组织增生；低剂量组肝细胞排列紊乱，肝小叶结构有破坏，尚完整，结节周围纤维组织增生，少量炎细胞浸润。
电镜结果显示，正常对照组大鼠肝细胞形态清晰，模型对照组大鼠肝细胞周边胶原纤维增生明显，山芝麻水提物、三萜类化合物作用后的大鼠肝纤维化组织可见较多正常，形态良好，少量肝细胞凋亡小体。
总之，本发明首次对山芝麻水提物、三萜类化合物进行了抗肝纤维化的研究，体外和体内实验表明，山芝麻水提物、三萜类化合物可作用于肝纤维化的多个环节或多个靶点，既可抑制HSC的增殖和诱导HSC凋亡，又能明显减少ECM的合成，使肝纤维化明显减轻，对防治肝纤维化具有独特优势。山芝麻水提物、三萜类化合物用于治疗肝纤维化具有非常好的研发前景。可用于生产片剂、颗粒剂、合剂等剂型的治疗肝纤维化的中药制剂。
具体实施例方式 实验例 一、山芝麻提取物的制备 1、山芝麻水提取物的制备 山芝麻1000g，加10倍量水提取2次，每次1.5h，合并提取液，60℃减压恒温干燥得268.9g山芝麻水提取物。
2、山芝麻三萜类化合物的制备 山芝麻1000g，加60％乙醇浸1h，回流提取，第1次8000ml提2h，第2次8000ml提1.5h，合并提取液，减压回收乙醇至无乙醇味，将浓缩物加蒸馏水溶解过滤。将滤液上(40mm×800mm)AB-8大孔树脂柱，用2倍量的蒸馏水洗涤树脂柱，收集流出液和水洗液，再用2倍量80％乙醇洗脱，流脱流速为50-60滴/min(约2-2.5ml/min)。收集洗脱液并减压回收乙醇，浓缩物在60℃的减压恒温干燥箱中干燥，得16.326g山芝麻三萜类化合物。树脂柱用3倍量的甲醇再生。
以齐墩果酸为对照品，以5％香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂，采用分光光度法在550nm测定样品的吸光度，测得山芝麻三萜类化合物纯度为79.8％(三萜类化合物含量测定方法参考陆震鸣，陶文沂，许泓瑜，等.樟芝菌粉三萜类化合物含量的测定，中成药[J]，2008，30(3)402-405)。
二、抗肝纤维化药效学实验 1、体外离体细胞实验山芝麻对肝星状细胞的影响 实验方案 (1)用HSC细胞作为体外模型，将山芝麻水提物、三萜类化合物原液倍比稀释成5个浓度进行实验，每个浓度设6个复孔，置CO2孵箱(37℃，5％CO2)中培养。采用MTT法检测山芝麻对细胞的毒性，计算半数细胞毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)，评价山芝麻水提物、三萜类化合物对HSC增殖的抑制作用。
(2)选择HSC细胞存活率在90％以上的药物浓度作为实验所用浓度，并分成三个浓度组。以等量的完全培养液为空白对照组，以秋水仙碱6.25μg/ml为阳性对照组。各组培养24小时后，分别吸出细胞上清液，-20℃保存备用。
(3)采用电镜观察药物对HSC细胞超微结构的影响。0.25％胰酶消化，收集细胞，采用吖啶橙染色、Annex V-FITC和PI双染结合流式细胞术检测山芝麻对HSC细胞凋亡的影响。采用ELISA法检测HSC细胞上清液Hyp、HA和TIMP-1。
(4)用RT-PCR方法检测I、III型胶原及α-SMA mRNA的变化 将HSC分为8组即空白对照组加10％对照血清的DMEM；模型对照组加10％对照血清+血小板衍生生长因子(终浓度60ng/ml)的DMEM； 山芝麻水提物低剂量组加10％低剂量水提物血清+血小板衍生生长因子(终浓度60ng/ml)的DMEM；中剂量组加10％中剂量水提物血清+血小板衍生生长因子(终浓度60ng/ml)的DMEM；高剂量组加10％高剂量水提物血清+血小板衍生生长因子(终浓度60ng/ml)的DMEM；山芝麻三萜类化合物低剂量组加10％低剂量三萜类化合物血清+血小板衍生生长因子(终浓度60ng/ml)的DMEM；中剂量组加10％中剂量三萜类化合物血清+血小板衍生生长因子(终浓度60ng/ml)的DMEM；高剂量组加10％高剂量三萜类化合物血清+血小板衍生生长因子(终浓度60ng/ml)的DMEM，分别测定肝星状细胞经外源性PDGF处理，再通过不同浓度含药血清干预后，其I、III型胶原及α-SMA mRNA的变化特点。
体外实验结果 (1)用HSC-T6细胞作为体外模型，研究山芝麻提取物对HSC的影响，结果表明，山芝麻水提取物(the Water Extract from Helicteres angustifolia，WHA)的TC50＝3.5226mg/ml，TC0＝1.2961mg/ml。山芝麻三萜类化合物(theTriterpenoids from Helicteres angustifolia，THA)的TC50＝0.2914mg/ml，TC0＝0.1022mg/ml。提示山芝麻水提取物、三萜类化合物对HSC-T6细胞毒性很低，即对HSC-T6细胞抗增殖作用并不是非特异性细胞毒性作用所致，结果见表1-1。
表1-1山芝麻提取物对HSC-T6细胞增殖的抑制作用(
n＝6)
注与空白对照组*P＜0.05，**P＜0.01；WHA山芝麻水提取物；THA山芝麻三萜类化合物 (2)ELISA法检测结果显示，与空白对照组相比较，山芝麻水提取物、三萜类化合物各浓度组均可显著降低细胞上清液HyP、HA和TIMP-1含量(P＜0.05，P＜0.01)，且随着药物浓度的增加，其降低作用逐渐增强，呈现量效反应关系，提示，山芝麻水提取物、三萜类化合物在体外对HSC-T6细胞有显著的抗增殖作用，结果见表1-2。
表1-2山芝麻提取物对HSC-T6细胞上清Hyp含量的影响(
n＝3)
注与空白对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；WHA山芝麻水提取物；THA山芝麻三萜类化合物 (3)对HSC凋亡的影响的实验则发现，吖啶橙染色法检测结果显示，随着药物剂量增大，凋亡细胞逐渐增多，胞核呈黄色深染，碎裂，核物质外溢进入胞质，与空白对照组比较，药物对HSC-T6凋亡细胞比例的影响有统计学差异(P＜0.01)。流式细胞术检测和电镜观察的结果也进一步证实，山芝麻水提取物、三萜类化合物作用后的HSC-T6可见少量坏死细胞和许多不同程度的凋亡细胞。
(4)用RT-PCR方法检测I、III型胶原及α-SMA mRNA的变化，结果表明，山芝麻水提取物、三萜类化合物含药血清可下调HSC-T6细胞株I型胶原(PCI)、III型胶原(PCIII)、α-SMA mRNA表达，不同浓度含药血清作用强度有所不同，呈浓度依赖性。
表1-2山芝麻对HSC-T6细胞PCI、PCIII、α-SMA mRNA表达的影响(
n＝6)
注与空白对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；WHA山芝麻水提取物；THA山芝麻三萜类化合物 2、动物实验对CCl4致大鼠肝纤维化的保护作用 实验方案 (1)实验动物模型的制备、分组及处理 120只SD雄性大鼠，其中15只为正常组，其余为肝纤维化造模组。造模组灌胃给予50％CCL4花生油溶液2ml/kg，正常对照组灌胃同体积的生理盐水，每周2次。分别于造模后第5周、第6周及第7周抽取2只肝纤维化大鼠及1只正常对照组大鼠，进行病理学检查，监测肝纤维化形成的情况。
病理检查证实造模成功后，将存活的肝纤维化大鼠(据以往的经验存活率约为75-80％)75只，随机分为模型组；秋水仙碱组(1mg/kg)；山芝麻水提取物高剂量(WHAH)组(8.07g/kg)、中剂量(WHAM)组(4.03g/kg)、低剂量(WHAL)组(2.02g/kg)；山芝麻三萜类化合物高剂量(THAH)组(0.49g/kg)、中剂量(THAM)组(0.25g/kg)、低剂量(THAL)组(0.13g/kg)；每组15只，加上正常组(12只)，共计9个组。秋水仙碱组、山芝麻提取物组分别灌胃给予相应的药物，给药容积为1ml/100g；模型组、正常组灌胃给予等体积生理盐水；每天1次，连续一个月。同时，在给药治疗期间，除正常组外，其余各组断续给予CCL4，每周2次，直至实验结束。
治疗30天后，在最后一次给药24小时后，经乙醚麻醉内眦采血检测各项指标，取肝左叶作生化及组织学检测。
(2)检测指标 ①肝组织病理学观察常规病理检察和电镜观察肝组织超微结构。
②超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)； ③血清轻脯氨酸(HyP)、肝组织轻脯氨酸(HyP)； ④透明质酸(HA)； ⑤金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)； ⑥免疫组化方法检测肝组织层粘连蛋白(LN)、转化生长因子β1(TGF-β1)、平滑肌动蛋白(α-SMA)表达采用SABC法，DAB显色，按照试剂盒说明书操作。光镜下观察，于切片的四个角及中央部分，分别选取5个观测视野(避开边缘效应)，并要求每个观测视野包含1个汇管区加一个肝小叶或一条纤维间隔。计数TGF-β1，阳性表达细胞数，Image-Pro图像分析系统测定LN阳性表达的面积。
⑦检测肝组织ECM成分(如I、III、IV型胶原)按照试剂盒说明书进行。
动物实验结果 (1)对肝纤维化大鼠血清学指标的影响山芝麻水提取物、三萜类化合物各剂量组均可明显提高SOD活性，显著降低肝纤维化大鼠血清MDA、HyP、HA和TIMP-1含量(P＜0.05或P＜0.01)，且随着药物浓度的增加，其作用逐渐增强，呈现量效反应关系。结果见表2-1。
表2-1 山芝麻对肝纤维化大鼠SOD、MDA、HyP、HA和TIMP-1含量的影响(
n＝10)
注与模型对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；与正常对照组比较，△P＜0.05；△△P＜0.01；WHA山芝麻水提取物；THA山芝麻三萜类化合物 (2)对肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响HE染色病理结果显示，正常对照组大鼠肝脏结构完整。模型对照组大鼠肝脏正常肝小叶结构被破坏，由大小不等的圆形或椭圆形肝细胞结节所构成的假小叶取代，结节周围纤维组织增生，少量炎细胞浸润。山芝麻水提取物、三萜类化合物高、中剂量组大鼠肝脏肝小叶结构完整，汇管区有少量纤维组织增生；山芝麻水提取物、三萜类化合物低剂量组肝细胞排列紊乱，肝小叶结构有破坏，尚完整，结节周围纤维组织增生，少量炎细胞浸润。
(3)电镜结果显示，正常对照组大鼠肝细胞形态清晰，模型对照组大鼠肝细胞周边胶原纤维增生明显，山芝麻水提取物、三萜类化合物作用后的大鼠肝纤维化组织可见较多正常，形态良好，少量肝细胞凋亡小体。
权利要求
1.山芝麻水提取物在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
2.山芝麻三萜类化合物在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
3.根据权利要求书2所述的制备治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于山芝麻三萜类化合物包括医药可接受的盐。
4.根据权利要求书2所述的制备治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于山芝麻三萜类化合物包括药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了一种中药山芝麻提取物(山芝麻水提取物、三萜类化合物)在制备抗肝纤维化的药物中的应用研究。首次对山芝麻水提取物、三萜类化合物进行了抗肝纤维化的研究，体外和体内实验表明，山芝麻水提取物、三萜类化合物可作用于肝纤维化的多个环节或多个靶点，既可抑制HSC的增殖和诱导HSC凋亡，又能明显减少ECM的合成，使肝纤维化明显减轻，对防治肝纤维化具有独特优势。山芝麻水提取物、三萜类化合物用于治疗肝纤维化具有非常好的研发前景。
文档编号A61P1/16GK101810653SQ20101015420
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者林兴, 何敏, 黄权芳, 廖明, 黄仁彬, 张士军 申请人:林兴