专利名称：抑制由碱性成纤维细胞生长因子诱导的细胞增殖及血管增生的环肽的制作方法
技术领域：
本发明属于肽技术领域，具体而言，本发明涉及环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Se r-Pro-Leu-Leu-Gln )肽，其可用于抑制由bFGF诱导的细胞增殖和血管增生以及用于治疗结 肠癌等方面的应用。本发明还涉及了包含该环肽的药物组合物和制备方法等。
背景技术：
哺乳动物成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors, FGFs)家族由至 少23个结构相关的多肽(FGF1-23)组成，是一类对来源于中胚层和神经外胚层的多种类 型的细胞具有广泛的生物学活性的细胞生长因子，酸性FGF (aFGF)和碱性FGF (bFGF) 被认为是整个FGFs蛋白家族的原型。其中，bFGF是一类广泛存在于体内多种组织的多 肽生长因子，在组织修复、创伤愈合、胚胎发育、成骨分化、血管增生等方面起着重要的作 用。bFGF在体内分布广泛且具有多种重要的生物学功能，其时空表达及表达水平受到严 谨的调控。研究表明，由于bFGF具有促进多种细胞增殖及促血管增生等作用，bFGF表达 的异常上调会引发多种病变,如肿瘤等(参见Rusnati M, Presta M. Fibroblast growth factors/fibroblast growth factor receptors as targets for the development of anti-angiogenesis strategies. Curr Pharm Des, 2007, 13: 2025-2044 ；Cronauer MV, Schulz WA, Seifert HH, et al. Fibroblast growth factors and their receptors in urological cancers: basic research and clinical implications. Eur Urol, 2003, 43: 309-319 MR, Gross JL, Herblin WF, Dusak BA, et al. Effects of modulation of basic fibroblast growth factor on tumor growth in vivo. J Natl Cancer Inst, 1993， 85: 121-131)。经过长期艰苦的研究，并结合一些筛选的运气，本发明人获得了一种环肽，令人惊 讶的是，其能够有效抑制由bFGF诱导的细胞增殖，尤其是抑制由bFGF诱导的肿瘤细胞的增 殖，同时也能抗血管增生，从而可用于治疗结肠癌等肿瘤。该肽可以采用现有技术合成，成 本低，但是效果好，适用范围广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种环肽及其衍生物，其有益效果在于能够有效抑制由 bFGF诱导的细胞增殖，尤其是抑制由bFGF诱导的肿瘤细胞的增殖，同时也能抗血管增生， 从而可用于治疗结肠癌等肿瘤；另外，该肽可以采用现有技术合成，成本低，但是效果好，适 用范围广。具体而言，在第一个方面，本发明提供了环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)肽或其药学上可接受的盐或酯。本文中的环肽可以用“环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)”或 "cyclo (Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)"来互换表示，均指的是如下式所示的环肽
'-Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln-'
环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)中各氨基酸残基之间通常是通 过肽键相连的，尽管其他键相连的肽也涵盖在本发明的范围内。优选在本发明的第一方面 中，环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)是由 Ala 的氨基和 Gln 的羧基 形成肽键而环化形成的。在本发明的具体实施方式
中，环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)中任意两个相邻的氨基酸都是通过肽键相连的。本文中所使用的肽及氨基酸、氨基酸残基和化学基团的表示方法均为所属领域公 认的表示方法。其中氨基酸或氨基酸残基的缩写可参照表1中定义，这些缩写可以指L-型 的氨基酸，也可以指D-型的氨基酸。在本发明的具体实施方式
中，氨基酸或氨基酸残基指 L-型的氨基酸或氨基酸残基。表1氨基酸缩写表
对于本发明的肽，可以进行合适的修饰，如，对氨基酸残基侧链基团修饰以形成药学上 可接受的酯，环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)与高分子物质形成的 缀合物，或这些修饰的组合等。在本文中，“药学上可接受的酯”指适于与人或动物的组织接 触而且无过多的毒性、刺激或变态反应等的酯。通常，酯化修饰后能降低机体中的蛋白酶对 肽的水解。对本发明的环肽的侧链基团进行修饰可以形成药学上可接受的酯。对氨基酸侧 链基团的修饰包括但不限于苏氨酸的侧链羟基与羧酸发生的酯化反应。在本发明的具体实 施方式中，优选不对环肽的氨基酸侧链基团进行修饰。使用本领域已知的方法，环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln) 与高分子物质可以形成缀合物，其中，高分子物质通常是药学上可接受的水溶性多聚物部 分。该缀合物一般能显示出延长环肽的循环半衰期的效应。合适的水溶性多聚物包括聚 乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、单-(C1,)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚-(N-乙烯吡咯烷 酮)PEG、三甲氧基PEG、单甲氧基-PEG丙醛、PEG丙醛、二-琥珀酰亚胺碳酸PEG、丙烯乙二醇同聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物、聚氧乙烯多羟基化合物(如，甘油)、单 甲氧基-PEG 丁醛、PEG 丁醛、单甲氧基-PEG乙醛、PEG乙醛、甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丙 酸、甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丁酸、聚乙烯醇、右旋糖苷、纤维素或其他糖类的多聚物。合 适的PEG可具有约600至约60，000的分子量，包括如，5，000道尔顿，12，000道尔顿， 20，000道尔顿，30，000道尔顿，和40，000道尔顿，其可以是直链的或分支的。PEG化 可通过现有技术中已知的PEG化反应来进行(如参见，Delgado等的Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan 禾口Spreafico白勺 Clin. Pharmacokinet. 27: 290 (1994)，和 Francis 等的 Int J Hematol 68: 1 (1998))。例 如，PEG化可用反应性聚乙二醇分子由酰化反应或由烷基化反应来进行。在可选的方法中， 缀合物由缩合活化的PEG来形成，其中PEG末端的羟基或氨基被活化的接头分子替代(如 参见，Karasiewicz 等，US5382657A)。缀合物也可以是环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-S er-Pro-Leu-Leu-Gln)同其它蛋白交联形成的缀合物。所述其它蛋白优选人白蛋白、牛白蛋 白或IgG分子的Fc部分。例如，本发明的环肽可以与牛血清白蛋白交联形成肽缀合物。在本文中，“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触而且无过多的毒 性、刺激或变态反应等的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。这种盐可以在本发明多 肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制 备。代表性酸加成盐包括但不限于乙酸盐、二己酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲 酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、 己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺 酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、3-苯基丙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、 谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。能用于形成药学上可接受盐的优选的酸 是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药学上可接受的碱加成盐中的 阳离子包括但不限于碱金属或碱土金属离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝等，以及非毒性季铵阳 离子如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、 二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。优选的碱加成盐包括磷酸盐、tris和乙酸盐。这 些盐一般能够增加多肽的溶解性，而且所形成的盐基本上不改变多肽的活性。本发明的多 肽可以单独使用，也可以以药学上可接受的盐形式使用。在第二方面，本发明提供了组合物，其包括本发明第一方面所述的肽或其药学上 可接受的盐或酯，以及药学上可接受的载体。本文中使用的“药学上可接受的载体”指无毒 固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、佐剂、包裹材料或其他制剂辅料。根据本领域的公知技 术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位 剂量形式，如片剂、膜剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释放形式)、粉剂、颗粒剂、酊剂、 糖浆剂和乳液剂、消毒的注射用溶液或悬浮液、气雾剂或液体喷剂、滴剂、针剂、自动注射装 置或栓剂。例如，以片剂或胶襄的口服给药，上述活性药物组分可以与一种口服的无毒的药 物学可接受的惰性载体组合在一起，如乙醇、等渗葡萄糖溶液、甘油、生理盐水或其它组合。 组合物中还可以添加辅料，如人血清白蛋白、低分子量肽、氨基酸和金属阳离子等多肽保护 剂等。在本发明的具体实施方式
中，本发明的环肽直接用缓冲液(如，PBS )稀释成组成物。优选在本发明的第二方面中，所述组合物是药物组合物，即达到药用纯度、制剂等 要求的组合物。药物组合物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，例如
5口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药。本发明的药物组合物优选胃肠道 外给药，如皮下、肌内或静脉内注射。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对 象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由医师根据实际情况(如，病人的病情、体重 等)而方便地确定。对于一般的成人，本发明的药物组合物的剂量，以环(Ala-Thr-Leu-Gly -Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)肽计，可以是每kg成人体重Ing - IOgo对于注射给药 模式来说，优选的剂量是每kg体重IOOng - 10mg，更优选的是每kg Img - lmg，最优选的 是每 kg IOmg - IOOmg0
在第三方面，本发明提供了本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制 备抑制细胞增殖的组合物中的应用。其中所述组合物可以是药物组合物，也可以是只适于 体外应用的组合物，优选是药物组合物。优选在本发明的第三方面中，细胞增殖是由碱性成纤维细胞生长因子诱导的。本 发明人经研究发现，本发明的环肽可以特异性地抑制由碱性成纤维细胞生长因子诱导的肿 瘤细胞的增殖，因此也优选在本发明的第三方面中，细胞是肿瘤细胞，在本发明的具体实施 方式中，细胞是结肠癌细胞，如Caco2和LoVo细胞。另外，在本发明的具体实施方式
中，本发明的环肽是唯一抑制增殖活性成分，因此 也优选提供，本发明提供了本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯作为唯一 抑制增殖活性成分在制备抑制细胞(如，肿瘤细胞，更优选如结肠癌细胞)增殖的组合物中 的应用。
在第四方面，本发明提供了本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在 制备抗血管增生的药物或试剂中的应用。在本文中，如无相反指示，药物可以与药物组合物 互换使用；试剂指的是只适于体外应用的组合物。优选在本发明的第四方面中，血管是鸡胚绒毛尿囊膜血管。本发明人经研究发现， 本发明的环肽可以特异性地抑制由碱性成纤维细胞生长因子诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管 增生，而且其是作为唯一抗血管增生活性成分使用的。因此也优选提供，本发明第一方面所 述的肽或其药学上可接受的盐或酯作为唯一抗血管增生活性成分在制备抗血管(如，鸡胚 绒毛尿囊膜血管)增生的药物或试剂中的应用。
在第五方面，本发明提供了本发明第一方面所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在 制备抗肿瘤的药物中的应用。本发明人经研究发现，本发明的环肽不但能够单独抑制肿瘤 细胞本身的增殖，而且能够单独抗血管增生，从而潜在地减少肿瘤组织的供血量，因此叠加 这两方面的效应，可以用于预防和/或治疗肿瘤。优选在本发明的第五方面中，肿瘤是结肠癌。
在第六方面，本发明提供了 制备环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-G In)肽的方法，其包括，合成线性肽，然后环化。本发明第六方面的方法优选包括，合成线性 肽Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln,然后环化。通过化学方法合成已知 结构的肽对于所属领域技术人员来说都是显而易见的。详细的方案可参照以下文献所述的方法进行，如用固相法合成多肽可参考J.M. Steward和J.D. Young的《Solid Phase Peptide Synthesis》(第二版，Pierce Chemical Co. , Rockford, Illinois (1984))禾口 J. Meienhofer 的《Hormonal Proteins and Peptides》(第 2 卷，Academic Press,纽约 (1973))等；用液相法合成多肽可参考E. Schroder和K. Lubke的《The Peptides))(第1 卷，Academic Press，纽约(1965))等。目前线性肽有着很成熟的自动合成技术，如可以采 用市售的自动合成仪来合成。环肽也可以利用专门的自动合成仪来合成，如利用对_硝基 苯基甲酮肟树脂的固相合成仪。但是，本发明优选先合成线性肽，然后再环化。现有的线性 肽环化的方法包括但不限于，直接法，即在氨基和羧基端都呈游离状态的线性肽稀溶液中 加入缩合试剂，直接有效的缩合成环；活泼酯法，即用硝基苯酯、羟基琥珀酰亚胺或五氟苯 酯等将线性肽的羧基端制成反应活性酯，然后脱去N端保护基，使之成环；叠氮法，即将线 性肽的羧基端制成酰基叠氮活泼中间体，然后在稀释的碱性溶液中成环，等等。在本发明的 一个具体实施方案中，优选通过固相法先合成线性肽，然后环化。优选在本发明第六方面中，环化后的环肽优选进一步纯化，如进行HPLC纯化。本 发明的肽优选是纯化的肽，即纯化到> 80%纯度，优选> 90%纯度，更优选> 95%纯度，尤 其优选达到药物纯的状态，即纯度是大于等于98%的纯度，而且不含感染源和热源。优选本 发明的肽实质上不含有其它多肽或蛋白质，尤其是动物来源的那些肽或蛋白质。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细的描述。需要特别指出的 是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述， 本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。另外本发明引用的公 开文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的 全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施例方式实施例1环肽的合成
根据已知的固相法合成线性肽的方法和环化线性肽的方法，合成本发明的环肽。简而 言之，使用413A型自动肽合成仪(购自Perkin Elmer公司)来合成线性肽Ala-Thr-Leu-Gly -Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln，其中的氨基酸残基均为L-型的氨基酸。合成的具体过程 如下首先，保护氨基酸单体上的反应性基团氨基酸的α氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc) 保护；并对以下特定氨基酸进行侧链保护对Ser和Thr的侧链保护基为叔丁基，对Gln的 侧链保护基为三苯甲基(Trt)。然后，以N，N- 二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑作为活 化试剂，使受保护的氨基酸依次偶联，偶联每次40分钟。在15%乙二硫醇/ 二甲硫醚/茴 香醚(体积比为1 1 1)存在的情况下，肽与三氟乙酸(85%)在室温反应120分钟，从 而从聚合体支持物上切割下来。接着用无水乙醚沉淀肽，然后用无水乙醚多次洗涤，充分除 去硫醇。在水/叔丁醇(1 1)中沉淀，冷冻干燥，得到线性肽。将合成的线性肽以1 :1. 5的摩尔比与对硝基酚混合溶解在乙酸乙酯中， 加入缩合剂1，3- 二环己基碳二亚胺(DCC)，得到线性肽羧基末端硝化的肽，然后加入三氟 乙酸(85%)脱去氨基端的保护基，同时脱除侧链保护基。蒸去溶剂后，将固体产物溶于 0. IM NaHCO3和0. IM Na2CO3的二氧六环溶液中，于室温反应3小时。接着用无水乙醚沉淀
7肽，然后用无水乙醚多次洗涤，在水/叔丁醇(1 1)中沉淀，冷冻干燥，得到环肽粗品。将 环肽粗品在30分钟内以反相HPLC纯化，以37-42%乙晴/0. 9% TFA梯度进行。然后进行 浓缩、冻干，由此得到纯化的环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)肽，经 HPLC检测，其纯度> 98%。
实施例2环肽对肿瘤细胞存活率的影响
将间质干细胞HUMSC株(作为非肿瘤对照细胞株)以及结肠癌细胞株Caco2和LoVo (均 可购自ATCC)分别置于96孔板的孔中，每孔5000个细胞。其中，HUMSC、Caco2和LoVo细胞 分别在添加了 10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24小时后，弃去培养基，加入0. 4%胎牛 血清的DMEM培养基中继续培养24小时。然后，分别在各孔中等体积加入不同稀释度的实 施例1制备的环肽、20ng/ml bFGF、以及不同稀释度的实施例1制备的环肽和20ng/ml bFGF 的混合物，继续培养48小时。根据MTT法，测定细胞增殖的效应，即用噻唑兰显色检测活细 胞的数量。结果发现，当单独加入20ng/ml bFGF的时候，这两种结肠癌细胞以及对照细胞 株都有显著增殖；当单独加入不同稀释度的实施例1制备的环肽的时候，这两种结肠癌细 胞以及对照细胞株的数量都没有显著的改变，即没有显著增加，也没有显著减少；当加入不 同稀释度的实施例1制备的环肽和20ng/ml bFGF的混合物的时候，这两种结肠癌细胞受 20ng/ml bFGF影响而增殖的幅度明显减少，减少的量是呈环肽剂量依赖性的，经计算得，环 肽对20ng/ml bFGF诱导的Caco2细胞增殖的半抑制浓度(IC50)为3. 8 μ M，而对20ng/ml bFGF诱导的LoVo细胞增殖的半抑制浓度(IC50)为0. 77 μ Μ。
实施例3环肽对血管增生的影响
根据Li，X等(Cancer Letter, 2007, 256 29-32)报道的方法，测定环肽在体内对鸡 胚绒毛尿囊膜血管增生的影响。即，将56只5天大小的鸡胚随机等分成七组，通过照视， 在绒毛尿囊膜的蛋壳上锉成一个三角形裂痕，同时在气室顶部钻一小孔，除去蛋壳造成“卵 窗”，勿伤及壳膜；将卵平放，通过造成气室负压，使壳膜与尿囊膜之间形成人工气室；将等 体积(20 μ 1)的PBS (作为空白对照)、bFGF (30ng/ml)、以及bFGF (30ng/ml)和5个稀释 度(0. 05 μ Μ，0· 2 μ Μ，0· 8 μ Μ，3· 2 μ M，12. 8 μ M)的实施例1制备的环肽的混合物样品分别 置于尿囊膜上；用玻璃纸盖住卵窗，周围涂以熔化的石蜡密封，同时封闭气室小孔；将鸡胚 横卧，于37°C孵育鸡胚72小时后，观察血管密度。结果发现，相对于PBS对照，bFGF能够显 著促进血管增生；然而，如果bFGF中同时加入了不同稀释度的实施例1制备的环肽，则当环 肽浓度小于0. 8 μ M的时候，环肽呈剂量依赖性地抑制bFGF促血管增生的效应，当浓度达到 0. 8 μ M及其以上的时候，完全抑制了 bFGF促血管增生的效应，即血管增生的水平与PBS对 照组的相当。
权利要求
环(Ala Thr Leu Gly Gly Gly Ser Pro Leu Leu Gln)肽或其药学上可接受的盐或酯。
2.权利要求1所述的肽或其药学上可接受的盐或酯，其由Ala的氨基和Gln的羧基形 成肽键而环化。
3.组合物，其包括权利要求1或2所述的肽或其药学上可接受的盐或酯，以及药学上可 接受的载体。
4.权利要求1或2所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抑制细胞增殖的组合物 中的应用。
5.权利要求4所述的应用，其中细胞增殖是由碱性成纤维细胞生长因子诱导的。
6.权利要求4或5所述的应用，其中细胞是肿瘤细胞，优选是结肠癌细胞。
7.权利要求1或2所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗血管增生的药物或试 剂中的应用。
8.权利要求1或2所述的肽或其药学上可接受的盐或酯在制备抗肿瘤的药物中的应用。
9.权利要求8所述的应用，其中肿瘤是结肠癌。
10.制备环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)肽的方法，其包括，合 成线性肽 Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln,然后环化。
全文摘要
本发明公开了环(Ala-Thr-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Leu-Gln)肽，其可用于抑制由bFGF诱导的细胞增殖和血管增生以及用于治疗结肠癌等方面。本发明还公开了包含该环肽的药物组合物和制备方法等。
文档编号A61P9/00GK101974076SQ20101052595
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者吴晓萍, 李校堃 申请人:李校堃