专利名称：人miR-328反义核酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学材料技术领域和药物领域。具体地，本发明涉及一种 microRNAs(miRNA)的用途，尤其是涉及人microRNA_328 (人miR-328)反义核酸及其应用。 该反义核酸可与人互补，从而抑制人miR-328的表达而起到抗肿瘤的作用。本发明还涉及含有该miRNA反义核酸的药物组合物。
背景技术：
miRNAs是小的非编码RNA，长度为20-25bp，通常是由RNA聚合酶II(Pol II) 转录的，一般最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的 pri-miRNA。这些pri_miRNA在RNase III Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成 70个核苷酸组成的pre-miRNA前体产物。RAN-GTP和exportin 5将这种前体分子输送到细胞质中。随后，另一个RNase III Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的双链。这种双链很快被引导进入(miRISC)复合体中，其中含有Argonaute蛋白，并且成熟的单链miRNA 保留在这一复合物中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过两种依赖于序列互补性的机制负调控基因表达，与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达。然而，最近也有证据表明，这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非翻译区。如果miRNA与靶位点完全互补(或者几乎完全互补)，那么这些miRNA的结合往往引起靶分子mRNA的降解。miRNAs在物种进化中相当保守，在动物，植物和真菌等中发现的miRNAs表达均有严格的组织特异性和时序性。目前，只有很小一部分miRNAs的生物学功能得到阐明。这些miRNAs调节细胞生长和组织分化，与生物生长发育有关。一系列的研究表明miRNAs在细胞生长和凋亡，血细胞分化，同源异形盒基因调节，神经元的极性，胰岛素分泌，大脑形态形成，心脏发生，胚胎后期发育等过程中发挥重要作用。例如，miR-273参与线虫的神经系统发育过程；miR-430 参与斑马鱼的大脑发育；miR-181控制哺乳动物造血细胞分化为B细胞；miR-375调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌；miR-143在脂肪细胞分化起作用；miR-196参与了哺乳动物四肢形成，miR-1与心脏发育有关。另有研究人员发现许多神经系统的miRNAs在大脑皮层培养中受到时序调节，表明其可能控制着区域化的mRNA翻译。miRNA表达与多种癌症相关，并且这些基因可能起到肿瘤抑制基因或是癌基因作用。最先在B细胞慢性淋巴性白血病(CLL)中发现有miRNA表达水平的改变，随后陆续在各种人类肿瘤中均检测到miRNA表达水平的变化。研究发现，miRNAs与肿瘤形成相关，既能发挥肿瘤抑制基因的作用(如miR-lfe和miR-16-l)，又能起到癌基因的作用(如miR-155 和miR-17-92簇)。目前认为，在肿瘤细胞中，有些miRNA成熟体或前体表达水平异常，而表达异常的miRNA通过影响靶mRNA翻译发挥作用，参与肿瘤形成过程，并起重要作用。如 Ras原癌基因受let-7家族的调控，BCL2抗凋亡基因受miR-lfe-miR-16-l簇调控，E2F1转录因子受miR-17-92簇调控，BCL6抗凋亡基因受miR-127的调控等。miRNAs的表达下调也和肿瘤发生有密切关系，这预示着miRNA具有癌基因的功能。例如，miR-143和miR-145在结肠癌中明显下调。有趣的是，其发夹结构的前体分子在肿瘤和正常组织中含量相似，这表明，miRNAs的表达下调可能是由于其加工过程受到破坏。但是，miR-143和miR-145的肿瘤抑制基因功能可能不仅仅局限于结肠癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、淋巴癌等细胞系中其表达量也明显下调。另一个报道表明，miR-21在胶质母细胞瘤中表达增加。这个基因在肿瘤组织中的表达量比在正常组织中高5-100倍。miRNAs是天然的反义作用因子，能够调控与真核生物生存和增殖相关的多种基因。在肿瘤治疗方面，miRNA的应用前景光明。在利用miRNA作为治疗靶点方面，已有实验数据支持如在吉西他滨(gemcitabine)治疗的过程中，出现miRNA表达谱的变化；调控部分miRNA的表达水平(如使miR-21过表达)，能增进胆管癌细胞对化疗药物的敏感性。通过引入与具有癌基因特性的miRNA互补的合成的反义寡聚核苷酸——抗miRNA寡聚核苷酸 (AMOs)——可能有效的灭活肿瘤中的miRNAs，延缓其生长。临床上，可以通过经常的或者持续的2’ -0-甲基化或者锁核酸(LNA)等修饰的反义寡聚核苷酸给药使miRNA失活。这些修饰使得寡核苷酸更稳定，比其他治疗手段毒性更低。使用antagomirs (与胆固醇偶联的 AMOs)，注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miRNA活性，因而可能成为一种有希望的治疗药物。相反的，过表达那些具有肿瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7家族，也可以用于治疗某些特定的肿瘤。反义寡聚核苷酸(Flanagan WM. Antisense comes of age. Cancer & Metastasis Reviews 1998 ;17(幻169-76)是指一段可以与其靶基因的碱基互补的核苷酸。反义寡聚核苷酸可以抑制相应基因的表达。人microRNA-3^ (has-miR-328)位于 16 号染色体，前体序列为 UGGA⑶GGGGGG GCAGGAGGGGCUCAGGGAGAAAGUGCAUACAGCCCCUGGCCCUCUCUGCCCUUCC⑶CCCCUG。有 2 个成熟 microRNA :hsa-mir-328 (MIMAT0000752,序列为 UGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU)。Santarelli 等发现在74例精神分裂症/分裂情感障碍患者相对对照组miR-3^表达上调(Santarelli et al.，2010)。Lu 等利用 microarray 和 real-time PCR 发现在心房颤动风湿性心脏病患者心房组织中上调2倍以上。Li等发现多种肿瘤中(包括胶质母细胞瘤) miR-3^表达上调，且该基因与化疗密切相关，实验证明了 ABCG2是其靶标(Li et al., 2010)。Hildebrand等发现miR-328与人角质细胞分化密切相关(Hildebrand.，2010)。 Dacic 等禾Ij 用 microarray 禾口 real-time PCR 发现在 EGFR-positive, KRAS-positive 禾口 EGFR/KRAS-negative 的肺腺癌中 miR-3^ 表达上调(Dacic et al. ,2010) Eiring 等发现在急慢性粒细胞性白血病(CML-BC)中miR-3^下调，其通过与hnRNP E2和PIMl作用影响这一过程(Eiring et al. ,2010) Padgett等利用Quantitative PCR技术发现原发性胆汁性肝硬化中表达升高(Padgett et al. , 2009) 0 Sanchez等发现在膀胱疼痛综合征患者组织活检中miR-3^表达上调，同时作用于neurokinin-1 (Sanchez et al.， 2010)。Wang 等发现了 miR-328 的作用靶基因是 CD44 (Wang et al.，2008)。Malzkorn 等发现在II级弥漫性星形细胞瘤自发转化成IV级弥漫性星形细胞瘤过程中表达下调 (Malzkom et al.，2010)。但在脑胶质瘤中还没有关于miR-328的功能和表达水平的研究报道。近三十年，尽管临床上肿瘤的综合治疗已很普遍，但以手术为主，放化疗为辅的综合治疗对肿瘤患者的生存率提高并不明显，5年总体生存率仍然较低，徘徊在30% 55%
4左右，并没有显著提高，中晚期患者的5年生存率更低，约为20%。而且这些方法都存在各自的局限性，特别是对中晚期和复发患者疗效不佳，对伴有远处转移者疗效更差。因此，寻找更安全有效的治疗途径是提高肿瘤患者生存率和生存质量所亟待解决的难题。
发明内容
本发明要解决的主要问题是提供一组新的的反义核酸(抑制剂)，用于高效、低毒或无毒地抑制miR-328的表达，进而治疗由miR-3^过度表达引发的疾病，包括肿瘤，尤其为脑胶质瘤。本发明要解决的另一问题是提供上述反义寡聚核苷酸在制备治疗过度表达的相关疾病的药物中的用途。本发明要解决的再一问题是提供一种包含上述反义核酸的药物组合物。本发明人通过广泛而深入的研究，设计并合成了一系列专一性针对不同区域的长度不同的反义核酸，并在培养细胞中验证具有抑制效果的反义核酸。研究显示，这些反义核酸能够抑制肿瘤细胞的生长和恶性增殖能力。本发明设计了一系列可以结合于不同位置的反义核酸分子，在培养细胞 U87/MG中，验证对表达特异性抑制的反义核酸对细胞生长能力、增殖能力的影响， 反义核酸分子长度可以包含13 25个核苷酸残基，均有不同程度的抑制人肿瘤细胞生长能力、增殖能力的特性，其中最短的反义核酸长度为13个碱基，不同长度的反义核酸均具有良好的肿瘤细胞生长及增殖抑制活性。因此，上述反义核酸均可用来制备抑制肿瘤细胞生长能力、增殖能力的制剂，其中优选miR-328高表达的肿瘤细胞。在此基础上完成了本发明。本发明的第一方面，提供了一种miR-328的反义寡聚核苷酸，所述反义寡聚核苷酸抑制人细胞内miR-328的表达。通常，所述反义寡聚核苷酸与 5’ -CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU-3’中连续13 22个核苷酸序列互补。在本发明的一个优选实施例中，所述反义寡聚核苷酸的长度为18 22个核苷酸。更佳地，所述反义寡聚核苷酸的序列是 5，-ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3，。从目前来看，核酸杂交中RNA与miRNA的杂交亲和力比DNA与miRNA杂交的亲和力要高，具有很高的药用价值。但是人工合成DNA的成本远远比合成RNA的成本低，也具有很好的市场潜力。而且也可以采用核糖RNA单体与脱氧核糖DNA单体嵌合相连而成的反义核酸作为药物进行开发。本发明设计的一系列反义核酸分子，既包括DNA分子，也包括RNA 分子，两种分子均具有抑制miR-3^表达的活性。本发明设计的反义核酸，其序列具有特异性生物学活性，其对于某一基因互补的位点的反义核酸所互补的长度有很大关系，如互补的长些，则生物学活性会更高些，抑制效果也会更好一些，在增加或减少一个至数个碱基而互补于同一基因位点的反义核酸，同样也具有不同程度的生物学活性，也可达到不同程度的抑制肿瘤细胞生长与增殖的作用，本发明的研究表明，最短可达13个碱基仍然具有抑制表达的作用。反义核酸研究中，各种化学修饰方法很多，包括选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合等。应当明确的是，任何能够增加反义核酸稳定性和生物利用度的修饰方法都可以应用，如胆固醇修饰、PEG修饰、硫代修饰、2’ -甲氧基修饰等。本文中所述反义寡聚核苷酸经过2’甲氧基修饰。本发明的上述反义核酸具有抑制表达的效果。当将上述反义核酸转染到 miR-328高表达的细胞株U87中后，能够有效抑制肿瘤细胞的生长和恶性增殖能力。本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明寡聚核苷酸以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括但不限于盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。在本发明的第三方面，提供了本发明的反义寡聚核苷酸的用途，用于制备治疗以下疾病的药物治疗人体与miR-3^过表达有关的疾病，包括肿瘤，优选为脑胶质瘤。如本文所用，“反义寡聚核苷酸”指反义的核苷酸寡聚物。反义寡聚核苷酸通过碱基互补(A-T，A-U, G-C)配对与双链DNA形成三链(反基因)，或与单链RNA形成杂交双链 (反义)，从而阻断基因的复制、转录或转录后mRNA的加工和翻译。同时，双链RNA能被细胞内的核糖核酸酶H(RNaseH)所降解，从而更有效地阻断靶基因的表达。由于反义核苷酸只能与反向互补的靶序列结合，具有专一性高，副作用小的特点。本发明的反义寡核苷酸的长度没有特别限制，一般来说，为了达到杂交的专一性， 反义寡聚核苷酸需要至少13个单体组成的核苷酸。通常反义寡聚核苷酸的长度为13 35bp，对于miRNA成熟体来说，较佳的反义寡聚核苷酸长度为18 25bp。
图1显示了 miR-328反义寡聚核苷酸抑制肿瘤细胞U87/MG细胞的生长和增殖，A，B为转染了 FAM标记的阴性对照后的U87/MG细胞；C为转染阴性对照 (5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，)后U87/MG细胞状态；D为转染反义寡聚核苷酸 (5，-ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3，)后 U87/MG 细胞状态。
具体实施例方式本发明的反义寡聚核苷酸，其序列与5 ’ -CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU-3，中连续 13 25个核苷酸序列互补，并且亦不与其他基因的RNA序列互补。在本发明的一个优选实施例中，所述反义寡聚核苷酸的序列为5' -ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3‘。本发明提供的反义寡聚核苷酸可以为修饰产物，它含有至少两个，通常至少4个，较佳的至少6个，更佳的至少8个核苷酸没有毒性副作用的修饰的核苷酸，所述修饰方式包括2’位甲氧基取代、硫代修饰等。为了增加反义寡聚核苷酸的细胞摄取率，还可以在上述修饰的基础上对反义寡聚核苷酸进行胆固醇修饰或者PEG化修饰。上述修饰后的寡聚核苷酸能继续与靶序列有效配对，而且比普通的未经修饰的核糖核酸或者脱氧核糖核酸在体内具有更长的半衰期。本发明具有如下优点1、反义寡聚核苷酸作用于特异性的靶位点，非特异性结合的位点很少，专一性尚；2、本发明提供的反义寡聚核苷酸经过适当的化学修饰，具有毒性低、副作用小和半衰期长等特点；3、本发明提供的反义寡聚核苷酸具有很好的抑制效果，对肿瘤细胞生长的抑制率超过50%。下面将结合实施例及附图进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。实施例实施例1、miR-328反义寡聚核苷酸对人神经胶质细胞瘤细胞系U87/MG抑制活性检测首先，由上海吉玛制药技术有限公司合成miR-328反义寡聚核苷酸，序列为 5' -ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3‘。在实施例中涉及的所用序列均由上海吉玛制药技术有限公司合成。细胞培养U87/MG细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，10% FBS-DMEM培养基(FBS购自Gibco，DMEM购自Hyclone)培养，37°C，5% CO2培养。收集生长状态良好的 U87/MG细胞，离心计数，以2X IO3每孔铺于96孔板内，37°C,5% CO2培养24h。转染1)转染前一天，在96孔板中用适量不含抗生素的培养基接种培养细胞，使转染时细胞的汇合度达到30 50% ；2)转染样品按照如下方法准备寡聚物-Lipofecta mine 2000复合物a.用25μ1不含血清的Opti-MEM I培养基(Gibco)分别稀释 miR-328 反义寡聚核苷酸(5 ‘ -ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3 ‘)、阴性对照 (5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，)、FAM标记的阴性对照，加入孔内后终浓度为50nM，轻轻混勻，每个转染设3个复孔；b.使用前轻轻混勻 Lipofecta mine 2000 (Invitrogen)，然后取 0. 25 μ 1 稀释到 25 μ 1的Opti-MEM: I培养基，轻轻混勻后在室温下孵育5min ；c.孵育5min后，稀释的Lipofecta mine 2000分别与稀释的反义核苷酸及对照混合，轻轻混勻后在室温下孵育20min，以允许复合物的形成；3)将复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中，轻轻地前后摇动培养板混合；反义核苷酸及对照的终浓度为50nM。4) 37°C ,5% CO2培养箱继续孵育72小时后，显微镜观察U87/MG细胞，照相。如图1所示，转染72小时后，超过80%的U87/MG细胞成功转染了 FAM标记的阴性对照(图A，B)；转染阴性对照后，U87/MG细胞完整，透光性强(图C)；转染反义寡聚核苷酸后大部分U87/MG细胞死亡(图D)。基于MTT的细胞毒性实验向上一步骤中得到的细胞，加入配制好的MTT(Sigma)5mg/ml(用0.9%的生理盐水配制)，每孔加入20 μ 1，37°C，5% CO2孵育4小时后吸去培养基及MTT，每孔加入DMSO 100 μ 1并通过酶标仪读取0D570-0D630的吸光度值。
权利要求
1.一种反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸包含与下述核苷酸序列中 13 25个连续的核苷酸互补的序列5，-CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU-3，。
2.如权利要求1所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸序列为 5， -ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3，。
3.如权利要求1所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。
4.如权利要求1 3中任一项所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸进一步被修饰。
5.如权利要求4所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述修饰选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合。
6.如权利要求5所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述修饰选自硫代修饰、2’-甲氧基修饰和胆固醇修饰中的一种或几种。
7.如权利要求1 6中任一项所述的反义寡聚核苷酸用于制备治疗过度表达的相关疾病的药物的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸与其他治疗药物联合施用。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述miR-3^过度表达的相关疾病为肿瘤， 优选为脑胶质瘤。
10.一种药物组合物，其特征在于，含有治疗有效量的权利要求1 6中任一项所述的反义寡聚核苷酸以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开一种抑制人microRNA-328表达的反义寡聚核苷酸及其应用。该反义寡聚核苷酸特异性结合于人miR-328，包含与5’-CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU-3’核苷酸序列中至少13个连续核苷酸互补的序列，特别是序列5’-ACGGAAGGGCAGAGAGGGCCAG-3’。本发明的反义寡聚核苷酸可以为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或二者的嵌合体，并可对链中任一核苷酸进行修饰。本发明的miR-328反义寡核苷酸能够有效抑制人脑胶质瘤细胞中miR-328表达，抑制该细胞生长和增殖，从而有效治疗脑胶质瘤及其他miR-328高表达的肿瘤。
文档编号A61P35/00GK102533755SQ20101061294
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者丁侃, 张佩琢, 李捷, 段春晓, 沈孝坤 申请人:中国科学院上海药物研究所, 苏州吉玛基因股份有限公司