专利名称：siRNA缀合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种缀合物、制备该缀合物的方法以及利用该缀合物传递SiRNA的方法，其中，在癌症和其它传染性疾病的基因疗法中用于促进siRNA传递的聚合物通过可降解键(degradable bond)或不可降解键缀合到siRNA。
背景技术：
RNA干扰是指这样一种机制，其为在基因表达过程中，双链RNA(dsRNA)通过核苷酸序列特异性方式启动基因转录后沉默，并且这种机制首先在线虫(C.elegans)中被发现，并常见于植物、果蝇和脊椎动物(Fire等，自然(Nature), 391 =806-811,1998 ； ；Novina & Sharp,自然(Nature), 430 161-164，2004)。已知以如下方式发生RNA干扰进入到细胞内的19 25bp的dsRNA与RISC(RNA_诱导的沉默复合物)结合，且仅反义(向导)链与 mRNA结合而与mRNA的核苷酸序列互补，从而通过存在于RISC的核酸内切酶结构域降解靶 mRNA(Rana, Τ. Μ. ，Nat. Rev. Mo 1. Cell Biol. ，8 :23-36,2007 ；Tomari, Y.禾口 Zamore，P. D.， Genes Dev. ，19 :517-529,2005)。当dsRNA被传递到细胞中，它特异性地结合靶基因序列以降解mRNA，因此，它被认为是一种可调控基因表达的新型工具。然而，对于人类来说，由于向人体细胞引入dsRNA会诱导抗病毒干扰素途径，因此难以获得RNAi效果。在2001年，Elbashir和Tuschl等发现向人体细胞导入21nt长度(核苷酸长度)的小dsRNA不会引起干扰素途径，但特异性地降解革巴 mRNA (Elbashir，S. M.，Harborth, J.，Lendeckel，W.，Yalcin, A.，Weber, K.，Tuschl， T.，自然(Nature)，411，494-498，2001 ； ；Elbashir, S. M.，Lendeckel，W.，Tuschl，T.，基因(Genes)& Dev.，15，188—200，2001 ； ；Elbashir, S. M.，Martinez，J. ,Patkaniowska, Α.， Lendeckel，W.，Tuschl，Τ.，EMBO J.，20，6877-6888，2001)。因此，21nt 长度的 dsRNA 已经作为一种新型的功能基因组工具引起了公众的注意，并命名为小干扰RNA(SiRNA)。自从siRNA被报道在动物细胞中抑制特定基因表达上具有极好的效果，siRNA作为一种基因治疗的药物引起了广泛关注。实际上，由于它的高活性和精确的基因选择性， 根据20年的研究结果，siRNA有望成为一种目前用作治疗药物的反义寡核苷酸(ODN)的替代治疗药物(Dana J. Gary 等，控释杂志(Journal of Controlled Release) 121 :64-73, 2007)。用于治疗的siRNA技术具有显著的优势，与其它药物相比，它易于设计并具有高目标选择性和抑制特定基因表达的性能。此外，由于RNA干扰利用生命系统中天然存在的机制抑制基因表达，所以它毒性较低。目前0ΡΚ0 Inc.开发的湿性老年黄斑变性病的治疗药物“贝伐西尼(Bevasiranib)”为一种siRNA，其可选择性地作用于血管内皮生长因子 (VEGF)，诱导新血管形成以抑制VEGF的表达，并通过了三期临床试验(Dejneka NS等，Mol Vis. ,28(14) :997-1005, 2008)。此外，目前正在研发含有靶向多种基因的siRNA的治疗药物(Ryan P. Million, Nature Reviews Drug Discovery 7:115-116,2008)。尽管各种结果表明体内通过RNA干扰诱导特异性的表达抑制，但siRNA在体内的传递还有许多问题需要解决，如在血液中被酶降解、与血液中组分的相互作用以及非特异性地传递给细胞(Shigeru Kawakami 和 Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22(3) 142-151，2007)。正在通过部分地利用抗核酸酶的核苷酸类似物或改良传递技术，尝试克服这些问题。改良的传递技术的实例包括利用病毒如腺病毒、逆转录病毒等的基因传递技术， 以及利用脂质体、阳离子脂质和阳离子聚合物的非病毒载体的基因传递技术。然而，由于传递的基因有可能整合到宿主的染色体中，从而诱导宿主基因的正常功能发生异常并激活致癌基因，因此病毒载体存在安全性方面的问题，此外，即使以较小的量连续表达病毒基因也可能引起自身免疫性疾病，或在由病毒载体诱导的修饰的病毒感染情况下，可能不会引起有效的保护性免疫。同时，非病毒载体的有效性低于病毒载体，但考虑到体内安全性和经济可行性，其具有副作用低和生产成本低的优势(Lehrman S.，自然(Nature). 401 (6753) 517-518,1999)。此外，非病毒传递方法要求有效地保护酶或非酶的降解，以便传递包括 siRNA的RNA分子，其中一种方法为利用编码短发夹RNA(shRNA)的DNA表达质粒。通过 DNA的系统的优势在于，仅当表达载体存在时进行siRNA表达。此外，目前siRNA化学修饰的研究提出一种用于改良针对核酸酶的稳定性以及低胞内摄取的方法(Shigery Kawakami 禾口 Mitsuru Hashida. Drug Metab. Parmacokinet. 22(3) 142—151，2007)。在一种siRNA的化学修饰中，作为被核酸酶降解部位的磷酸二酯键用硫代磷酸连接进行修饰，或戊糖的2’位被2' -0-meRNA、2’-脱氧_2’_氟尿嘧啶核苷或通过2’位和4’ 位连接形成的锁核酸(LNA)修饰，结果提高了血清中的稳定性((Braasch D. A.等，Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 :1139-1143,2003 ； ；Chiu Y. L.和 Rana T. M. ,RNA,9 :1034-1048,2003 ；； Amarzguioui M.等，Nucleic Acid Res. 31 :589-595,2003) 在另一种化学修饰中，官能团连接到正义(反向导)链的3’端区域，结果与对照相比，药动力学特性得到了改良，体内通过siRNA的亲水性和疏水性的平衡在施用时诱导出较高的效率(Soutschek J.等，Nature 432 :173-178 2004)。然而，上述方法在保护SiRNA免于核酸酶的消化以及改良细胞膜透性效率上仍然有许多有待改进之处。基于这一原因，发明人发现了一种缀合物，其中亲水性或疏水性聚合物通过可降解或不可降解键缀合到siRNA，改良了 siRNA的体内稳定性，并基于此完成了本发明。
发明内容
技术问题本发明的一个目的在于提供一种缀合物，其中作为生物相容性聚合物的亲水性或疏水性聚合物通过可降解或不可降解键缀合到SiRNA的正义链或反义链的末端，以提高 siRNA在细胞内传递的效率。本发明的另一个目的在于提供一种含有聚合物的固相支持物，具体地，施用到人体时稳定性得到证实的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，以及提供一种有效地制备包括RNA、 DNA.RNA-DNA嵌合体及其类似物的寡核苷酸的方法，其中，通过支持物将PEG结合到它的3’端。本发明又一目的在于提供制备siRNA缀合物的方法，以及利用siRNA缀合物传递 siRNA的方法。
技术方案为实现上述的目的，首先，本发明提供一种SiRNA-聚合物缀合物，其结构如下A-X-R-Y-B(其中，A和B独立地为亲水性聚合物或疏水性聚合物；X和Y独立地为简单的共价键或接头介导的(linker-mediated)共价键；且R为siRNA)。其次，本发明提供一种siRNA-聚合物缀合物，其结构如下A-X-R(其中，A为疏水性聚合物；X为简单的共价键或接头介导的共价键；R为siRNA)第三，本发明提供一种缀合物，其中SiRNA(R)的单链含有19 31个核苷酸。第四，本发明提供一种缀合物，其中疏水性聚合物(A)的分子量为250 1，000。第五，本发明提供一种缀合物，其中疏水性聚合物㈧为C16 C5tl烃或胆固醇。第六，本发明提供一种缀合物，其中共价键(X，Y)为不可降解键或可降解键。第七，本发明提供一种缀合物，其中不可降解键为酰胺键或磷酸键。第八，本发明提供一种缀合物，其中可降解键选自二硫键、酸裂解键、酯键、酸酐键、生物降解键和酶裂解键。第九，本发明提供一种缀合物，其中亲水性聚合物(A或B)为分子量为1，000 10,000的非离子聚合物。第十，本发明提供一种缀合物，其中亲水性聚合物选自下组聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。第十一，本发明提供一种结合聚乙二醇的固相支持物，其结构如下
权利要求
1.siRNA-聚合物缀合物，其结构如下 A-X-R-Y-B其中，A和B独立地为亲水性聚合物或疏水性聚合物；X和Y独立地为简单的共价键或接头介导的共价键；且R为siRNA。
2.siRNA-聚合物缀合物，其结构如下 A-X-R其中，A为疏水性聚合物；X为简单的共价键或接头介导的共价键；且R为siRNA。
3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中SiRNA(R)的单链含有19 31个核苷酸。
4.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述疏水性聚合物(A)的分子量为250 1，000。
5.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述疏水性聚合物(A)为C16 C5tl烃或胆固醇。
6.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述共价键(X，Y)为不可降解键或可降解键。
7.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述不可降解键为酰胺键或磷酸键。
8.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述可降解键选自二硫键、酸裂解键、酯键、酸酐键、生物降解键和酶裂解键。
9.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述亲水性聚合物(Α或B)为分子量为1，000 10,000的非离子聚合物。
10.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述亲水性聚合物选自下组聚乙二醇(PEG)、 聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。
11.结合聚乙二醇的固相支持物，其结构如下
12.根据权利要求11所述的结合聚乙二醇的固相支持物，其中所述固相支持物为可控孔度玻璃(CPG)。
13.根据权利要求12所述的结合聚乙二醇的固相支持物，其中CPG的直径为40 180 μ m，且孔径为500 A 3000 A。
14.根据权利要求11 13任一项所述的结合聚乙二醇的固相支持物，其中所述结合聚乙二醇的固相支持物为具有下述结构式IV的3' -PEG(聚乙二醇)-CPG [结构式IV]
15.制备下述结构式IV的3’ -PEG-CPG的方法，该方法包括1)将CPG与3-氨丙基三乙氧基硅烷反应，以形成长链烷基胺可控孔度玻璃 (LCAA-CPG)；2)将聚乙二醇与4，4‘ - 二甲氧基三苯甲基氯化物反应，以形成2-[双-(4- 二甲氧基三苯甲基)-聚(乙二醇)]；3)将步骤幻形成的化合物与下述化学式1的化合物反应，以形成下述结构式I的化合物；4)将形成的下述结构式I的化合物与4-硝基苯基氯甲酸酯反应，以形成下述结构式 II的化合物；5)将步骤3)形成的下述结构式I的化合物与N-琥珀酰亚胺基三氟乙酸反应，以形成下述结构式III的化合物；以及6)将步骤1)形成的LCAA-CPG化合物分别与步骤3)至幻形成的下述结构式I、II和 III的化合物反应；
16.制备权利要求1或2所述的siRNA缀合物的方法，该方法包括1)利用权利要求11所述的结合聚乙二醇的固相支持物制备针对靶基因的siRNA；以及2)通过共价键将siRNA的末端基团与聚乙二醇连接。
17.由权利要求1或2所述的siRNA缀合物组成的纳米微粒。
18.基因治疗方法，该方法包括1)制备权利要求17所述的纳米微粒；以及2)向动物的体内施用所述纳米微粒。
19.根据权利要求18所述的方法，其中通过口服给药或静脉注射向体内施用所述纳米微粒。
20.药物组合物，其含有药学有效量的权利要求1或2所述的siRNA缀合物。
21.药物组合物，其含有药学有效量的权利要求17所述的纳米微粒。
全文摘要
本发明提供一种siRNA-聚合物缀合物及其制备方法，更具体地，涉及一种通过siRNA和用于提高siRNA生物稳定性的聚合物的共价结合而形成的杂合缀合物，以及制备该杂合缀合物的方法。本发明的缀合物能提高siRNA的生物稳定性，从而实现治疗性siRNA向细胞的有效传递，且即使相对低浓度的小剂量也具有siRNA的活性。因此，该缀合物不仅可有利地用作癌症和其它传染性疾病的siRNA治疗工具，也可用作一种新型的siRNA传递系统。
文档编号A61K48/00GK102439148SQ201080021324
公开日2012年5月2日 申请日期2010年5月13日 优先权日2009年5月14日
发明者朴翰浯, 李三用, 申美湜, 韩宝蓝 申请人:株式会社百奥尼