专利名称：亚甲蓝光化学病毒灭活方法制备的病毒疫苗的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗领域，具体涉及亚甲蓝光化学病毒灭活方法制备的病毒疫苗的应用。
背景技术：
病毒感染引发的疾病，例如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等一直是危害人类健康的重要杀手，每年用于治疗的费用高达万亿元。但由于病毒的严格细胞内寄生特性及病毒复制时依赖于宿主细胞的许多功能，使得具有能抑制病毒复制而不影响细胞功能的安全、特异、有效的抗病毒药物非常缺乏。已有研究表明特异性细胞免疫应答在清除病毒感染中发挥重要作用。因此特异性细胞免疫成为治疗病毒感染的一种重要策略。治疗性疫苗通过将病原体的抗原成分或相应组分接种机体，从而激发、增强和调控机体抗病原的特异性免疫应答，进而达到治疗的目的。开发治疗性疫苗的研究将具有重大的理论意义及潜在巨大的经济及社会效益，已经受到世界范围的广泛关注。现有技术的改造抗原、组建新的免疫原、改变抗原呈递及加工过程，诱导生机体有效的免疫应答的治疗性疫苗的研究，在抗病毒治疗中备受推崇。但疫苗从生产开始就已经有了固定的抗原表位， 病毒持续性感染机制之一是出现编码其中和性抗原决定簇的基因变异株，由于变异株能够逃逸原有病毒已诱导的体液或细胞免疫，因此病毒的变异株不能被清除，从而使病毒持续存在，导致疾病的无法根治。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种亚甲蓝光化学病毒灭活方法制备的病毒疫苗在制备诱导Thl型细胞免疫反应并刺激淋巴细胞分泌细胞因子的制剂中的应用。较优的，所述细胞因子为肿瘤坏死因子(TNF-α)和干扰素(IFN-γ)，本发明的病毒疫苗能刺激淋巴细胞分泌细胞因子，提高患者体内TNF-α和IFN-Y的含量。较优的，所述病毒疫苗是采用亚甲蓝光化学病毒灭活方法灭活含病毒的血浆后获得的。更优的，所述含病毒的血浆来源于患者。较优的，所述病毒选自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型、人类免疫缺陷病毒2型、巨细胞病毒、疱疹病毒或T淋巴细胞白血病病毒等多种RNA和DNA病较优的，本发明的病毒疫苗的使用方法选自以下任一方法一应用血浆单采仪，分离血浆并对血浆进行亚甲蓝光化学病毒灭活处理，将处理后的血浆回输给患者，为一次疗程。更优的，该方法一个过程可针对全部血液循环中的血浆进行灭活，处理血浆中的亚甲蓝可以滤除也可以不滤除。可以根据实际需要，在不同时间点再次进行灭活，以巩固、加强治疗效果。方法二 1)首次分离血浆200 400ml，并进行亚甲蓝光化学病毒灭活处理，灭活处理结束后滤除亚甲蓝，冷冻保存；2)1 4周后再次分离血浆，所分离的血浆量为上次分离血浆量的1 2倍，血浆的处理方法与首次分离的血浆方法相同，同时将上次病毒灭活处理后保存的血浆进行回输；幻重复步骤幻，直至置换血浆量为观00 3200ml，即全部血浆
量，为一次疗程。更优的，方法二的冷冻保存温度为-20°C。较优的，所述亚甲蓝光化学病毒灭活方法为向5 IOOOml含病毒的血浆或溶液中加入亚甲蓝并调整终浓度为ι. O lOOymol/L，密封条件下，4 37°C震荡，30000 35000Lux可见光照射处理30 45min。本发明的病毒疫苗通过亚甲蓝光化学病毒灭活方法灭活含病毒的血浆，并且含病毒的血浆在进行前述亚甲蓝光化学病毒灭活前，要加入常用剂量的抗凝剂，防止灭活过程中血液的凝固。本发明的病毒疫苗的抗原物质来源于患者体内的病毒，因此本发明的疫苗具有针对于不同患者的特异性和针对性，这要优于由固定抗原、抗体构成的疫苗。疫苗由亚甲蓝光化学灭活方法制备获得后，具有抗原性和免疫原性，可有效刺激细胞免疫应答，促进与抗病毒作用密切相关的Thl型细胞因子的产生，有着良好的抗病毒应用前景。亚甲蓝光化学病毒灭活技术，可对多种DNA和RNA病毒都具有灭活作用。因此由亚甲蓝等光化学灭活方法制备的疫苗可用于乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(HCMV)、人嗜T细胞病毒(HTLV)等多种病毒性疾病患者的治疗。本发明的有益效果为亚甲蓝光化学灭活技术在很多血站已广为应用，该方法操作简单、安全、不需要昂贵的药物，若结合单采血浆技术，即能一次实现全部外周血中的病毒灭活，可产生大量被灭活的病毒，而该项操作可反复进行，不断加强、巩固免疫效果，临床治疗实践中可针对每个患者体内不同的病毒株，发挥特异性免疫调节作用，有着良好的抗病毒应用前景。
图1乙型肝炎病毒表面抗原含量的变化
图2对共刺激分子mRNA水平表达的影响
图3对细胞间粘附分子mRNA水平表达的影响
图4对淋巴细胞TNF- α分泌水平的影响
图5对淋巴细胞IFN-γ分泌水平的影响
图6对淋巴细胞IL-2分泌水平的影响
图7对淋巴细胞IL-4分泌水平的影响
图8对淋巴细胞IL-10分泌水平的影响
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。实施例1病毒疫苗的制备(1)向含有乙型肝炎病毒的血浆IOOOml中加入亚甲蓝并调整终浓度为50μπιΟ1/L，密封条件下，4°C震荡，用32000LUX可见光照射处理45min，制备得到病毒疫苗。(2)向含有乙型肝炎病毒的血浆500ml中加入亚甲蓝并调整终浓度为1. Oymol/ L，密封条件下，37°C震荡，用30000LUX可见光照射处理30min，制备得到病毒疫苗。(3)向含有乙型肝炎病毒的血浆5m中加入亚甲蓝并调整终浓度为lOOymol/L，密封条件下，20°C震荡，用35000LUX可见光照射处理35min，制备成病毒疫苗。(4)向含有丙型肝炎病毒的血浆300ml中，加入亚甲蓝调整终浓度为60. Oymol/ L，密封条件下，4°C震荡，用31000LUX可见光照射30min，制备得到病毒疫苗。(5)向含人类免疫缺陷病毒1型的病毒血浆600ml中，加入亚甲蓝调整终浓度为 40μπκ)1/1，密封条件下37°C震荡，用35000LUX可见光照射32min，制备成病毒疫苗。实施例2病毒疫苗的抗原性实验1.按照实施例1，实验(1)方法制备亚甲蓝光化学灭活处理的乙型肝炎病毒疫苗。2.检测制备的乙型肝炎病毒疫苗的抗原性，实验方法如下1)制备淋巴细胞随机选取采集后Mi内的6份健康献血者的A⑶全血，制备浓缩白细胞，应用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法参照产品操作手册，分离淋巴细胞。用 PBS (含0. 25mM EDTA)洗涤2次，再用RPMI1640培养基洗涤1次，弃尽上清后，将细胞重悬于细胞培养液(90% RPMI1640培养基和10%胎牛血清)中，调整细胞浓度为IlXlO6个细胞/ml。2)抗原性检测取浓度为11 X IO6个细胞/ml的淋巴细胞2700 μ 1接种于6孔细胞培养板。取含HBV的血浆和灭活处理之后的病毒疫苗各300μ 1，分别接种于培养细胞中；其中，未经灭活处理的含HBV的血浆与淋巴细胞共孵育组设为阳性对照组，亚甲蓝灭活处理的病毒疫苗与淋巴细胞共孵育组设为实验组。每组设3个复孔。将细胞培养板置于37°C， 5% CO2培养箱中，分别培养Mh、72h。利用ELISA试剂盒(购自北京万泰生物药业股份有限公司)检测血浆灭活之前和灭活之后0、对、7池上清中HBsAg。3.实验结论通过阳性对照组和实验组的HBsAg含量分别与未处理的原血浆中HBsAg含量的比值，得到乙型肝炎病毒表面抗原的变化，实验结果见说明书附1，结果显示无显著性差异(P > 0. 05)，并且疫苗在孵育24h、7 i进行ELISA检测时，HBsAg也并没有随着孵育时间的延长而发生显著变化(P >0.05)。数值为重复三次检测结果的平均值，证明疫苗具有良好的抗原性。实施例3病毒疫苗的抗原递呈性实验1.按照实施例1，实验(2)方法制备亚甲蓝光化学灭活处理的乙型肝炎病毒疫苗。2.检测制备的乙型肝炎病毒疫苗抗原的递呈性，实验方法如下1)制备淋巴细胞随机选取采集后Mi内的6份健康献血者的A⑶全血，制备浓缩白细胞，应用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法参照产品操作手册，分离淋巴细胞。用 PBS (含0. 25mM EDTA)洗涤2次，再用RPMI1640培养基洗涤1次，弃尽上清后，将细胞重悬于细胞培养液(90% RPMI1640培养基和10%胎牛血清)中，调整细胞浓度为1. IX IO6个细胞/ml。检测淋巴细胞活化相关共刺激分子⑶80、⑶86和细胞粘附分子ICAM2、ICAM3、 LFA3的mRNA水平的表达取浓度为1. 1 X IO6个细胞/ml的淋巴细胞2700 μ 1接种于6孔细胞培养板。取含HBV的血浆和灭活处理之后的病毒疫苗各300μ 1，分别接种于培养细胞中， 未经灭活处理的HBV与淋巴细胞共孵育组设为阳性对照组，亚甲蓝灭活处理的病毒疫苗与淋巴细胞共孵育组分别设为实验组，不加任何刺激的淋巴细胞设为阴性对照组，GAPDH选自看家基因，作为RT-PCR扩增反应的内参，每组设3个复孔。将细胞培养板置于37°C，5% CO2 培养箱中，培养24h。200(^，511^11离心收集淋巴细胞，淋巴细胞中加入30(^1111^201，应用 RT-PCR方法检测细胞内相关因子的mRNA表达水平，具体步骤如下1)抽提 RNA离心收集淋巴细胞，加入300ul Trizol试剂，用漩涡振荡仪，强烈振荡混勻15s， 充分混勻，室温静置5分钟后，按下述方法操作A.加入氯仿80ml，强烈振荡15s，充分混勻，室温静置5分钟。B. 40C, 12000rpm,离心 15min。C.离心结束后，溶液分层，小心吸取上层水相200ul，加入等体积异丙醇。D.颠倒混勻10次后，室温10分钟。E. 40C, 14000rpm,离心 15min。F.弃上清，75%预冷酒精，400ul洗涤，颠倒1次。G. 40C, 14000rpm,离心 5min。H.弃上清，4°C，14000rpm，离心5min，用吸管小心吸弃剩余少量上清，自然挥发干
ο2)逆转录A.去除基因组DNA
权利要求
1.一种亚甲蓝光化学病毒灭活方法制备的病毒疫苗在制备诱导Thl型细胞免疫反应并刺激淋巴细胞分泌细胞因子的制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞因子为肿瘤坏死因子和干扰素。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒疫苗是采用亚甲蓝光化学病毒灭活方法灭活含病毒的血浆后获得的。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含病毒的血浆来源于患者。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒选自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型、人类免疫缺陷病毒2型、巨细胞病毒、疱疹病毒或T淋巴细胞白血病病毒。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒疫苗的使用方法选自以下两种方法任一方法一应用血浆单采仪，分离血浆并对血浆进行亚甲蓝光化学病毒灭活处理，将处理后的血浆回输给患者，为一次疗程；方法二 1)首次分离血浆200 400ml，并进行亚甲蓝光化学病毒灭活处理，灭活处理结束后滤除亚甲蓝，冷冻保存；2) 1 4周后再次分离血浆，所分离的血浆量为上次分离血浆量的1 2倍，血浆的处理方法与首次分离的血浆方法相同，同时将上次病毒灭活处理后保存的血浆进行回输；幻重复步骤2、，直至置换血浆量为观00 3200ml，为一次疗程。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，方法一的一次疗程针对全部血液循环中的血浆进行灭活。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，方法一中经过亚甲蓝光化学病毒灭活处理的血浆中的亚甲蓝在回输给患者前滤除或者不滤除。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，方法二中所述的冷冻保存温度为-20°C。
10.如权利要求1-9任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述亚甲蓝光化学病毒灭活方法为向5 IOOOml含病毒的血浆或溶液中加入亚甲蓝并调整终浓度为1. 0 100μ mol/L，密封条件下，4 37°C震荡，30000 35000Lux可见光照射处理30 45min。
全文摘要
本发明公开了一种亚甲蓝光化学病毒灭活方法制备的病毒疫苗在制备诱导Th1型细胞免疫反应并刺激淋巴细胞分泌细胞因子的制剂中的应用；本发明的有益效果为该病毒疫苗能有效调节在抗病毒中发挥重要免疫调节活性的细胞因子的产生，提高患者体内肿瘤坏死因子和干扰素的含量，并且由于制备病毒疫苗的抗原物质来源于患者体内，因此本发明的病毒疫苗具有针对于不同患者的特异性和针对性的优点，优于现有的由固定抗原、抗体构成的疫苗。
文档编号A61K39/21GK102397538SQ20111033224
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者刘晓颖, 张敬敬, 邵俊杰, 钱开诚, 黄宇闻 申请人:上海市血液中心