专利名称：一种荞麦胰蛋白酶抑制剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及胰蛋白酶抑制剂，具体属于一种胰蛋白酶抑制剂的新用途，即荞麦胰蛋白酶抑制剂作为细胞自噬诱导剂的应用，荞麦胰蛋白酶抑制剂在制备抗衰老药物中的应用。
背景技术：
细胞自噬是细胞为了抵抗饥饿和外界压力而发展的一种降解机制，通过细胞自噬途径，一些长周期蛋白，胞质内聚集的蛋白和损伤的细胞器被降解，为细胞提供必要的营养，从而使细胞存活。细胞自噬在细胞发育分化到死亡的全部过程中都起着非常重要的作用。
衰老(aging，senescence)又称老化，通常是指在正常状况下生物发育成熟后，随 年龄增加，内环境稳定能力与应激能力下降，结构、组分逐步退行性变，趋向死亡的不可逆转的现象。衰老是一个持续的、动态的、缓慢渐进而复杂的过程。这个过程从生长期结束后逐渐开始，它的影响要到老年期，通过人体系统功能失调、器官功能衰退、细胞变性及蛋白质和酶分子结构变化逐渐表现出来。随着研究的不断深入，越来越多的资料表明，许多老年人的常见病，如神经退行性疾病，心肌衰老，肿瘤，免疫衰老，糖尿病，肌肉疾病等，都伴随着自曬缺乏。细胞自噬与衰老有着密切的关系。近年来的研究表明，生物体衰老过程中伴随着大量受损大分子，病变细胞器以及异常蛋白在细胞内的囤积，这些由氧化性损伤或其他因素导致的受损物质，得不到及时的清除，将促使细胞衰老过程的发展。真核细胞中存在着两类主要的蛋白质降解途径，即泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统。自噬-溶酶体系统参与了衰老的调控。自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，是指细胞通过单层或双层膜包裹待降解物质，形成自噬体，然后自噬体和溶酶体融合形成自噬溶酶体，进而溶酶体内的酶将自噬体的内容物降解，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。对防止神经退行性病变、肿瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及对防止老化、延长寿命有积极作用，在真核生物维护内环境的稳定以及应对细胞内外代谢压力起着重要的作用。这些由氧化性损伤或其他因素导致的受损物质，得不到及时的清除，将促使细胞衰老过程的发展。研究表明，在衰老细胞内和生物体内细胞的自噬水平被抑制，这些受损物质不能得到有效清除，如很多老年人皮肤上的老年斑就是脂褐素蓄积的结果。调控衰老的信号通路与自噬相互协调，负责细胞内大分子物质和细胞器的周转代谢，调节细胞的生长，分化和细胞在营养匮乏和氧化应激条件下的反应。目前，一种可以诱导细胞自噬的诱导剂雷帕霉素已经初步应用于抗衰老的研究，但是，雷帕霉素副作用较大，对免疫系统会产生毒副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荞麦胰蛋白酶抑制剂的新用途，即将荞麦胰蛋白酶抑制剂作为细胞自噬诱导剂的应用，荞麦胰蛋白酶抑制剂在制备抗衰老药物中的应用。
本发明所述的荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)，其蛋白质含有69个氨基酸残基，属于PotatoI型蛋白酶抑制剂，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1。所述的荞麦胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列已经在中国专利200510012385. 4中公开。本发明提供的一种荞麦胰蛋白酶抑制剂作为细胞自噬诱导剂的应用，蛋白酶抑制齐U，当培养基中其浓度为20-100 μ g/ml时即可显著地诱导H印G2等细胞的自噬水平升高。本发明提供的一种荞麦胰蛋白酶抑制剂在制备抗衰老药物中的应用，实验证明，荞麦胰蛋白酶抑制剂可以提高果蝇体内SOD和CAT的酶活性，在培养基中rBTI的浓度达到50 μ g/ml时培养20天后，果蝇体内SOD和CAT的活性相对于对照组，雄性提高了 33. 23%和35. 30%,雌性提高了 27. 67%, 30. 86%。由rBTI 50 μ g/ml的培养基所饲养的果蝇雌性平均寿命相对与对照组提高了 30. 5%，雄性果蝇平均寿命相对对照组提高了 35. 00%。本发明将荞麦胰蛋白酶抑制剂作为细胞自噬诱导剂，具有良好的诱导细胞自噬的功能，且无毒副作用，将荞麦胰蛋白酶抑制剂用在抗衰老，延长寿命方面也具有明显的作用。
图I激光共聚焦显微镜观察rBTI诱导H印G2细胞自噬图，其中A为对照，B为 50 μ g/mlrBTI 诱导 Hep G2 细胞 2h, C 为 50 μ g/ml rBTI 诱导 Hep G2 细胞 4h.图2流式细胞术定量检测不同浓度的rBTI诱导H印G2细胞自噬图
具体实施例方式实施例I :rBTI可以诱导H印G2细胞自噬实验LC3是可以定位于前自噬体和自噬体膜表面，是细胞自噬泡膜的通用标记物。通过构建LC3与绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物的融合蛋白，借助于荧光显微镜，我们可以很方便的观察到LC3在细胞中的定位。pCMV-GFP-LC3在E. coli.DH5a中表达，经无内毒素试剂盒提取后进行如下转染实验(I)转染前一天种板，密度为f4X105cell/ml，保证转染时细胞汇合度达到90-95%。(2)转染步骤A:4. O μ g质粒DNA用无血清DMEM稀释至250 μ 1，混合均匀。B: 10 μ I Lipofectamine TM 2000 用无血清 DMEM稀释至 250 μ I,混合均匀，室温放置5分钟。C:将步骤A和B溶液等量混合，室温放置20分钟。(3)将上述混合液加入待转染的细胞培养液中混合均匀。(4) 37°C，5%C02,饱和湿度培养24小时，转染后4_6小时更换新鲜培养液。(5)将转染好的细胞用胰酶消化后，加入到铺有盖玻片的6孔板中，过夜贴壁培养。(6)加入 50 μ g/ml rBTI,分别作用 0-4 小时。(7)取出盖玻片，干燥，加抗荧光衰减封片剂，用指甲油封避，显微镜下观察。实验结果
当转染pCMV-GFP-LC3载体的H印G2细胞，经rBTI作用后，GFP-LC3开始聚集，形成明亮的点，即可表明rBTI诱导H印G2细胞发生了自噬。当H印G2细胞未经诱导时，GFP-LC3以弥散状态存在(图1A)，当50 μ g/ml rBTI诱导H印G2细胞2小时，细胞内GFP-LC3蛋白开始聚集，形成明亮的点(图1B)。当诱导时间为4小时，GFP-LC3蛋白聚集越来越多，分布在整个细胞胞质中(图1C)。实施例2 .流式细胞术定量检测Ifep G2细胞自噬实验步骤Enzo Life Sciences自曬检测试剂盒Cyto-ID ,它可以快速,特异,定量地检测细胞自噬。人肝癌细胞株Hep G2，在37°C，5%C02的培养箱中培养，细胞不宜太过拥挤。具体实验步骤如下(I)接种细胞用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，加入合适数量的细 胞接种到6孔板，每孔体积1ml，贴壁后细胞大概汇合度为90%。(2)加入不同浓度的rBTI及阳性对照药物(Tamoxifen)，使rBTI的终浓度分别为100，50，25 和 12. 5 μ g/ml, Tamoxifen 终浓度为 5 μ m，在 37°C，5%C02 的培养箱中培养 18 小时。(3)胰酶消化，收集细胞，2000rmp离心，用试剂盒中的缓冲液重悬细胞，加入稀释好的 Cyto-ID Green Detection Reagent, 37°C暗处孵育 30 小时。(4)流式细胞仪分析样品。实验结果应用流式细胞术及细胞自噬测定试剂盒，可以检测在不同rBTI浓度作用下，HepG2细胞的自噬程度。实验结果表明，经不同浓度的rBTI诱导后，Hep G2细胞的自噬活性明显增强，而且随着rBTI浓度的增加，细胞自噬程度也越来越明显。由图2可看出，当rBTI的浓度从12. 5 μ g/ml增加到100 μ g/ml时，Hep G2细胞的荧光强度变化不太明显，但是相比对照，荧光强度有很大的增强，并且rBTI浓度为12. 5 μ g/ml时的荧光强度比阳性对照(Tamoxfen)处理组高出约60%。说明，rBTI可以诱发细胞产生很强的自噬活性。实施例3 rBTI可以明显延长果蝇寿命并刺激相关酶的表达rBTI对果蚬寿命的影响实验步骤收集4小时内新羽化的果蝇成虫，乙醚麻醉下区分雌雄，取雌、雄果蝇各240只，随机分为对照组和两个剂量组，每组雌雄各40只。对照组用对照组培养基饲养，剂量组分别用终浓度为20 μ g/ml、50 μ g/ml rBTI的加样培养基饲养。将果蚬置于生化恒温培养箱中光照黑暗交替12小时进行培养。每天记录各组果蝇的死亡数，直至全部死亡。计算半数死亡时间、平均寿命和平均最闻寿命等指标实验结果由统计结果可见，采用添加20 μ g/ml rBTI的培养基所饲养的果蝇雌性平均寿命相对与对照组提高了 19. 28%，雄性果蝇平均寿命相对对照组提高了 28.50%。并且雌性和雄性果蝇的半数死亡时间和最高寿命都有所提高。由含有50 μ g/ml的rBTI培养基所饲养的果蝇雌性平均寿命相对与对照组提高了 30. 5%，雄性果蝇平均寿命相对对照组提高了35. 00%,并且雌性和雄性果蝇的半数死亡时间和最高寿命都有所提高。(见表I)表IrBTI对果蝇寿命的影响*
组别半数死亡时间平均寿命最高寿命
~I~~I Im I^~S~
空白对照45 40 47.20 + 5.33 40.30 土 3.65 5547~
rBTI 20μ^ιη1 54 50 56.30土4.03 51.80 + 3.85 6258
rBTI 50pg/ml 60 55 61.60 + 3.72 56.90土3.57 6763*时间和寿命的单位为天数实施例4 rBTI对果蝇的SOD和CAT酶活性的影响实验步骤
收集4小时内新羽化的成虫，乙醚麻醉下区分雌雄，取雌、雄果蝇各240只，随机分为对照组和两个剂量组，每组雌雄各40只。对照组用对照组培养基饲养，剂量组分别用终浓度为20 μ g/ml>50 μ g/ml rBTI的加样培养基饲养。将果蚬置于生化恒温培养箱中光照/黑暗交替12h进行培养。在用药二十天后进行麻醉致死，称重。生理盐水洗去培养基，用吸水纸吸干，按w (g):v(ml)=l:10加磷酸缓冲(PBS)溶液，冰浴条件下用玻璃匀浆器处理果蝇。4°C条件下，8000rmp离心20min，取上清测定酶活性。SOD活性和CAT活性测定分别采用南京建成生物工程研究所的SOD试剂盒和CAT试剂盒进行。实验结果刚羽化的果蝇在用添加了 rBTI的培养基培养二十天后，其SOD和CAT的酶含量相对于对照组都有所升高，并且成剂量效应(表2)。雄性果蝇在20 μ g/ml rIBT的培养基培养20天后，SOD和CAT活性相对于对照组分别提高了 27. 08%和12. 13%，在50 μ g/ml rBTI的培养基中培养20天后，SOD和CAT活性相对于对照组分别提高了 33. 23%和35. 30%。雌性果蝇在20 μ g/mlrBTI的培养基培养20天后SOD和CAT活性相对于对照组分别提高了11. 45%，7. 10%。当雌性果蝇在培养基中rBTI的浓度达到50 μ g/ml时培养20天后，SOD和CAT的活性相对于对照组分别提高了 27. 67%，30. 86%。而生物体内的高SOD和CAT活性有助于清除各种自由基，可提高其机体的抗衰能力。表2rBTI对果蝇SOD和CAT活性的影响
组另IjSOD (U/g)CAT (U/mg)
雄性空白对照67. 8 + 4. 35481. 21 + 41. 09
雌性空白对照78. 31 + 3. 38 572.80 + 33.25
雄性 rBTI 20ug/ml 86. 16 + 3. 33 539. 60 + 53. 64雄性 rBTI 50ug/ml 90. 33 + 3. 98 651. 10 + 37. 05雌性 rBTI 20ug/ml 87. 28 + 4. 80 613. 48 + 33. 30
权利要求
1.一种荞麦胰蛋白酶抑制剂作为细胞自噬诱导剂的应用。
2.一种荞麦胰蛋白酶抑制剂在制备抗衰老药物中的应用。
3.如权利要求I或2所述的荞麦胰蛋白酶抑制剂，其氨基酸序列为SEQID N0:1。
全文摘要
本发明提供了一种荞麦胰蛋白酶抑制剂的新用途，即荞麦胰蛋白酶抑制剂作为细胞自噬诱导剂的应用，荞麦胰蛋白酶抑制剂在制备抗衰老药物中的应用。所述的荞麦胰蛋白酶抑制剂，其氨基酸序列为SEQ ID NO1。荞麦胰蛋白酶抑制剂作为细胞自噬诱导剂，具有良好的诱导细胞自噬的功能，且无毒副作用，将荞麦胰蛋白酶抑制剂用在抗衰老，延长寿命方面也具有明显的作用。
文档编号A61K38/56GK102727873SQ20121020043
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者崔晓东, 王转花 申请人:山西大学