专利名称：抗c-Met人源化抗体及含其的预防或治疗癌症用的药物组合物的制作方法
技术领域：
本公开内容涉及抗C-Met人源化抗体及包括其的用于预防和治疗癌症的药物组合物。
背景技术：
c-Met是肝细胞生长因子(HGF)的受体，且HGF是与c_Met受体酪氨酸激酶的胞外区结合以诱发在多种正常细胞和肿瘤细胞中的有丝分裂发生、运动(movement)、形态发生和血管发生的一类细胞因子。c-Met是存在于细胞表面上的代表性的受体酪氨酸激酶，本身是原癌基因，且有时涉及与癌症相关的多种机制如癌症发生(development)、转移、迁移、侵入和血管发生，与配体HGF无关。因此，c-Met近来形成为新的用于抗癌治疗的靶。特别地，已知c-Met涉及诱发对常用抗癌药物的耐药性，且因此被认为对于个人化的治疗是重要的。靶向表皮生长因子受体(EGFR) (ERBBl)的代表性的抗癌治疗药物即Erbitux或Tarceva通过阻断涉及癌症发生机制的信号的转导而起作用。另外,公知作为乳腺癌治疗药物的Herceptin靶向ERBB2 (HER2)并通过阻断细胞增殖所必需的信号的转导而起作用。但是，近来的报道是，在对上述药物有耐药性的患者中，抗癌药物由于c-Met蛋白质的过表达而不起作用和诱发细胞增殖的其它信号的转导机制被激活。因此，对于许多药物公司，c-Met已形成为抗癌药物的祀分子。相关技术公开了抑制C-Met作用的抗体治疗药物。但是，在该相关技术中，具有原始结构的所述抗体诱发c-Met分子的二聚，由此导致癌症。在公开了抑制c-Met作用的抗体治疗药物的另一相关技术中，所述抗体能够抑制c-Met与HGF (其为c-Met配体)的结合,但是所述抗体与c_Met的结合诱发c_Met的二聚，与所述配体无关。结果，所述抗体作为诱发致癌信号的转导的激动剂。另一相关技术公开了，为了防止c-Met的二聚,c-Met的单臂(one-armed)拮抗抗体(其通过修饰激动剂而制备)、和使用遗传重组方法的双臂(two-armed)抗体、及在临床试验中的产品开发目前正在进行中。但是，即使在该相关技术中，所述抗体仅在与化学治疗一起进行治疗时起作用，且当所述抗体独立地治疗时，抗癌治疗效果被证明是低的。因此，仍需要开发抑制c-Met作用的用于预防和治疗癌症的新的药物组合物。
发明内容
提供抗C-Met人源化抗体。提供用于预防和治疗癌症的包括抗C-Met人源化抗体的药物组合物。
由结合附图考虑的实施方式的以下 描述，这些和/或其它方面将变得明晰和更容易理解，其中
图1说明根据实施方式证实嵌合抗体chAbF46及3种类型人源化抗体huAbF46-II1、huAbF46-II2 和 huAbF46_II4 是否识别抗原的结果；图2说明根据实施方式证实人源化抗体的激动副作用程度的结果；图3说明根据实施方式使用BrdU测定证实具有修饰的铰链区的chAbF46的激动副作用程度的结果；图4说明根据实施方式通过测量Akt磷酸化程度证实具有修饰的铰链区的chAbF46的激动副作用程度的结果；图5说明根据实施方式在体外进行的具有修饰的铰链区的chAbF46的细胞增殖分析的结果的图；图6说明根据实施方式在体内进行的在胃癌小鼠异种移植物模型中具有修饰的铰链区的chAbF46的抗癌分析的结果的图；图7说明根据实施方式使用BrdU测定证实具有修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46的激动副作用程度的结果；图8说明根据实施方式在体外进行的具有修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46的细胞增殖分析的结果的图；和图9说明根据实施方式在体内进行的在胃癌小鼠异种移植物模型中具有修饰的铰链区的人源化抗体huAbF46的抗癌分析的结果的图。
具体实施例方式现在将详细介绍实施方式，其实例说明在附图中，其中相同的附图标记始终是指相同的元件。在这点上，本实施方式可具有不同的形式，且不应解释为限于本文中阐述的描述。因此，以下仅通过参考附图描述实施方式以解释本描述的各方面。如本文中使用的术语“和/或”包括相关所列项目的一个或多个的任何和全部组合。根据本发明的一方面，提供抗c-Met人源化抗体，其包括具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的轻链可变区。根据本发明的另一方面，提供抗c-Met人源化抗体，其包括具有SEQ ID N0:3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO :4的氨基酸序列的轻链可变区。术语“c-Met”或“c-Met蛋白质”是指与肝细胞生长因子(HGF)结合的受体酪氨酸激酶。c-Met蛋白质包括通过确定为GenBank登录号匪000245的核苷酸序列编码的多肽，通过确定为GenBank登录号匪000236的核苷酸序列编码的蛋白质，和/或其胞外区。受体酪氨酸激酶c-Met参与多种机制如癌症发生、转移、迁移、侵入和血管发生。所述c-Met可衍生自选自人、猴子、小鼠和大鼠的c_Met。通过用所需抗原使非免疫性动物免疫产生的动物衍生的抗体当为了医疗向人注射时通常引起免疫原性，因此已开发嵌合抗体以抑制这样的免疫原性。嵌合抗体通过如下制备通过遗传工程用人抗体的恒定区置换导致抗-同种型反应的动物衍生的抗体的恒定区。与动物衍生的抗体相比，嵌合抗体在抗-同种型反应方面显著改善，但是动物衍生的氨基酸仍存在于可变区中，因此嵌合抗体具有关于潜在的抗独特型基因型(ant1-1diotypic)反应的副作用。开发人源化抗体以减少这样的副作用。人源化抗体通过如下产生将在嵌合抗体的可变区中抗原结合方面起重要作用的互补决定区(CDR)移植到人抗体框架。
在CDR移植以产生人源化抗体中最重要的事情是选择最优化的人抗体以接受动物衍生的抗体的CDR，且因此采用抗体数据库的使用、晶体结构的分析和分子模型化的技术。但是，即使当动物衍生的抗体的CDR移植到最优化的人抗体框架时，也存在影响抗原结合的位于动物衍生的抗体的框架中的氨基酸。因此，在许多情况下，抗原结合力未保持，且因此应用另外的抗体工程技术以恢复所述抗原结合力是必需的。所述c-Met的人源化抗体是使c_Met小鼠抗体的免疫原性最小化的人源化抗体，其包括具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列的轻链可变区。根据实施方式，所述抗体可为单克隆抗体。完整抗体包括两个全长轻链和两个全长重链，其中各轻链通过二硫键与所述重链连接。所述抗体具有重链恒定区和轻链恒定区。所述重链恒定区为伽马(Y)、谬(U)、阿尔法(a )、德尔塔(S )或厄普西隆(￡ )型，其可进一步分类为伽马I ( Y I)、伽马2 ( Y 2)、伽马3 ( Y 3)、伽马4 ( Y 4)、阿尔法I ( a I)或阿尔法2 ( a 2)。所述轻链恒定区为卡帕(k )或拉姆达U)型。 术语“重链”是指全长重链、及其片段，包括可变区Vh和三个恒定区的域CH1、CH2、CH3、以及铰链，所述可变区Vh包括其存在是抗原结合所必需的CDR的氨基酸序列。术语“轻链”是指全长轻链、及其片段，包括可变区\和恒定区Q，所述可变区\包括其存在是抗原结合所必需的CDR的氨基酸序列。在本文中使用的术语“互补决定区(CDR) ”是指抗体可变域的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的。特别地，它们存在于免疫球蛋白的重链和轻链的高变区。各可变域典型地具有三个⑶R，确定为⑶Rl (⑶RH1&CDRL1)、⑶R2(⑶RH2&CDRL2)和CDR3(CDRH3&CDRL3)。CDR可提供在抗体与抗原或表位的结合中起主要作用的接触残基。另夕卜，术语“特异性结合”或“特异性识别”是本领域技术人员公知的，且表明抗体和抗原彼此特异性相互作用以产生免疫学活性。根据本发明的实施方式，所述抗体可为选自scFv、(scFv)2、Fab、Fab’和F(ab’ )2的抗原结合片段。本文中使用的术语“抗原结合片段”是指包括完整抗体的具有抗原结合区的部分的片段。例如，所述抗原结合片段可为scFv、(ScFv)2, Fab, Fab^或F(ab’)2，但不限于此。Fab片段包含所述轻链的可变和恒定域以及所述重链的可变域和第一恒定域(Cm)。Fab片段具有一个抗原结合位点。Fab’片段与Fab片段的不同在于Fab’具有在Cm的C-末端的拥有至少一个半胱氨酸残基的铰链区。F(ab’)2片段包括一对Fab片段，所述一对Fab片段通常通过在它们之间的铰链半胱氨酸残基经由在它们的羧基末端附近的二硫键共价连接。Fv片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区由紧密联合的一个重和一个轻链可变区的二聚体组成，且用于产生Fv片段的重组技术是本领域公知的。Fv片段可具有其中所述重链和轻链可变区通过非共价键连接的结构。单链Fv(ScFv)片段通常可具有其中重链和轻链可变区经由肽接头共价结合的二聚体结构，而二硫连接的(ScFv)2片段可具有其中两个scFv片段经由肽接头在C-末端彼此直接连接的结构。所述抗原结合片段可使用蛋白酶获得，如使用木瓜蛋白酶以获得Fab片段和使用胃蛋白酶以获得F(ab’)2片段，且可通过遗传重组技术制备。
根据本发明的实施方式，所述抗体可包括具有通过缺失、插入或取代一个或多个氨基酸的修饰的氨基酸序列的铰链区。例如，所述抗体可包括具有SEQ ID NO :5或SEQ IDNO 6的氨基酸序列的铰链区。术语“铰链区”是指抗体的重链中包含的区，其存在于C01和Ch2区之间，并用于向所述抗体中的抗原结合位点提供柔性。当动物衍生的抗体经历嵌合(chimerization)过程时,动物衍生的IgGl铰链用人IgGl铰链置换，但是动物衍生的IgGl铰链的长度比人IgGl铰链的长度短，且在两个重链之间的二硫键由3个减少至2个，且因此铰链的刚性可具有不同的效果。因此，铰链区的修饰可增加人源化抗体的抗原结合效率。用于修饰所述铰链区的氨基酸序列的缺失、插入或取代氨基酸的方法是本领域技术人员公知的。根据本发明的另一实施方式，提供包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列的抗c_Met人源化抗体的重链可变区和包括SEQ ID NO :2的氨基酸序列的抗c-Met人源化抗体的轻链可变区。根据本发明的另一实施方式，提供包括SEQ ID NO 3的氨基酸序列的抗c_Met人源化抗体的重链可变区和包括SEQ ID NO :4的氨基酸序列的抗c-Met人源化抗体的轻链可变区。
根据本发明的另一实施方式，提供用于预防或治疗癌症的药物组合物。所述药物组合物包括药物有效量的抗c-Met人源化抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂，所述抗c-Met人源化抗体包括具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的轻链可变区，或所述抗c-Met人源化抗体包括具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列的轻链可变区。根据实施方式，所述癌症可为选自如下的一种鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球中的黑素瘤、直肠癌、肛门附近的癌、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肝瘤(hepatoma)、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺瘤、乳腺癌(breast cancer)、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、夕卜阴癌、甲状腺癌、和头颈癌。根据本发明的实施方式，所述抗体可包括具有通过缺失、插入或取代一个或多个氨基酸的修饰的氨基酸序列的铰链区。例如，所述抗体可包括具有SEQ ID NO :5或SEQ IDNO 6的氨基酸序列的铰链区。当所述组合物制造为用于预防或治疗癌症的药物组合物时，所述组合物可包括可药用载体。所述组合物中包括的可药用载体可包括常用的乳糖、葡萄糖(右旋糖)、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。所述药物组合物可进一步包括润滑剂、润湿剂、增甜剂、增香剂、乳化齐U、悬浮剂和防腐剂。所述用于预防或治疗癌症的药物组合物可口服或胃肠外施用(给药)。所述胃肠外施用可包括静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、和直肠施用。由于口服施用导致蛋白质或肽的消化，因此活性组分必须包覆或配制在所述药物组合物中以防止消化。另外，所述药物组合物可具有靶向能力以在施用时追踪特定细胞。所述用于预防或治疗癌症的药物组合物的合适剂量可取决于许多因素，如配制方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别、病理情况、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度和反应敏感性。对于成年人，所述药物组合物的合乎需要的剂量可在约0. OOl-lOOmg/kg的范围内。本文中使用的术语“药物有效量”是指在预防或治疗癌症和/或血管发生相关的疾病中使用的足够量。所述药物组合物与可药用载体和/或添加剂可通过本领域中公知的方法配制为单位或多剂量形式。在这点上，所述配制物可为在油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆、乳化溶液、浸膏(extract)、粉末、颗粒、片剂、或胶囊，且可进一步包括分散或稳定剂。另外，所述药物组合物可作为单独的药物施用、或与其它药物一起施用，且可与先前存在的药物顺序或同时施用。所述药物组合物包括所述抗体或其抗原结合片段，且因此可配制为免疫脂质体。包含所述抗体的脂质体可使用本领域中公知的方法制备。所述免疫脂质体为包括磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，且可通过反相蒸发法制备。例如，Fab’片段可通过硫醇-二硫化物交换附着到所述脂质体。化学药物如多柔比星(doxorubicin)也可包括在所述脂质体中。根据本发明的实施方式，所述抗体可用作针对C-Met蛋白质的拮抗剂。术语“拮抗剂”理解为包括部分或完全地将它们的目标(即c-Met)的至少一种生物学活性阻断、抑制和/或中和(neutralize)的所有分子。例如，术语“拮抗性抗体”是指抑制或降低抗体结合的抗原(例如c-Met)的生物学活性的抗体。拮抗剂可由于结合受体至配体而减少受体磷酸化，或可使由配体活化的细胞无能力或破坏。而且，拮抗剂可完全阻断受体和配体之间的相互作用，或可由于所述受体的三级结构变化或减量调节而实际上减少所述相互作用。根据本发明的另一实施方式，提供向受验者(subject)施用用于预防或治疗癌症的药物组合物的方法。所述药物组合物包括药物有效量的抗c-Met人源化抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂，所述抗c-Met人源化抗体包括具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的轻链可变区，或者所述抗c-Met人源化抗体包括具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO :4的氨基酸序列的轻链可变区。所述用于预防或治疗癌症的药物组合物的详细描述和其施用方法已在上面提供。所述用于预防或治疗癌症的药物组合物向其施用的受验者包括动物。例如，所述动物可为人、犬、猫或小鼠。现在将参考以下实施例进一步详细描述本发明的一个或多个实施方式。但是，这些实施例仅用于说明的目的，而不意图限制本发明的范围。实施例1 :针对c-Met的小鼠抗体AbF46的制备(1)小鼠的免疫为了得到对于建立杂交瘤细胞系所必需的经免疫的小鼠,将100 μg人c-Met/Fc融合蛋白(R&D Systems)和相同量的完全弗氏佐剂混合，并将混合物经由腹膜内注射向五只4-6周大的BALB/c小鼠(Japan SLC, Inc.)的每一只施用。在两周后，使用与上述相同的方法将所述抗原(先前注射量的一半)与不完全弗氏佐剂混合，并将混合物经由腹膜内注射向每一只小鼠施用。在一周后，进行最终的加强(boosting)，并在三天后从每一只小鼠的尾巴收集血液以得到血清。然后，将血清用PBS以1/1000稀释，并进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以分析识别c-Met的抗体的滴定度是否增加。之后，选择其中得到足够量抗体的小鼠，并对所选择的小鼠进行细胞融合过程。(2)细胞融合和杂交瘤细胞的制备在细胞融合实验前的三天，将50 ii g PBS和人c-Met/Fc融合蛋白的混合物经由腹膜内注射向每一只小鼠施用。使每一只经免疫的小鼠麻醉，且然后将其位于身体左侧的脾取出并用网(mesh)磨碎以分离细胞，所述细胞然后与培养基(DMEM)混合以制备脾细胞悬浮液。将所述悬浮液离心以收集细胞层。将得到的IxlO8个脾细胞与IxlO8个骨髓瘤细胞(Sp2/0)混合，并将混合物离心以使细胞沉淀。将所述沉淀缓慢分散，用Iml在DMEM中的45%聚乙二醇(PEG)处理，并在添加Iml DMEM前保持在37°C —分钟。在引入另外IOmlDMEM I分钟后，将所得物保持在37°C的水浴中5分钟。通过添加DMEM使其总量达到50ml，并将所得物离心。将所得细胞沉淀以I X IO5个细胞/ml-2 X IO5个细胞/ml的浓度再悬浮在分离培养基(HAT培养基)中。然后，将所得物分布至96-孔板(0.1ml/孔)，所述96-孔板置于37°C的二氧化碳温育器中以制备杂交瘤细胞。(3)产生针对c-Met蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤细胞的选择为了从(2)中制备的杂交瘤细胞中选择与c-Met特异性结合的杂交瘤细胞，进行ELISA以筛选产生针对人c-Met/Fc融合蛋白 和人Fe蛋白有活性的抗体的细胞。将50 ill (2 ii g/ml)人c-Met/Fc融合蛋白包被(coat)在微量滴定板的各孔中，并通过洗涤除去未反应的抗原。为了排除与Fe结合但不与c-Met结合的抗体，使用如上相同的方法在不同的微量滴定板的各孔中包被人Fe蛋白质。接着，将50 Ul杂交瘤细胞悬浮液添加到所述微量滴定板的各孔中以反应I小时。然后，将微孔板用磷酸盐缓冲液-吐温20 (TBST)溶液洗涤。向其添加山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(IgG-HRP)，并容许反应在室温下发生I小时，且用所述TBST溶液进行洗涤以除去未反应的抗体。随后，向各孔添加过氧化物酶的底物溶液(OPD)，并通过使用ELISA读取器测量在450nm的吸收评价反应度。通过该方法，重复地选择产生对人c-Met蛋白质且不对人Fe蛋白质高度特异性的抗体的杂交瘤细胞系。对获得的杂交瘤细胞系进行有限稀释以获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系的单克隆(single clone)。所选择的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系以登记号KCLRF-BP-00220 登记在韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)中。(4)单克隆抗体的产生和纯化将以上(3)中获得的杂交瘤细胞在无血清培养基中培养以产生和纯化单克隆抗体。首先，将在50ml具有10%FBS的培养基(DMEM)中培养的杂交瘤细胞离心以获得细胞沉淀，其用20ml PBS洗涤超过两次以除去FBS。然后，引入50ml DMEM以使所述细胞沉淀再悬浮，并将所得物在37°C的二氧化碳温育器中温育3天。在离心以除去产生抗体的细胞后，将包括所述抗体的细胞培养物分离并在4°C储存，或直接使用。使用配有亲和柱(蛋白质G琼脂糖柱；Pharmacia，USA)的AKTA纯化设备(GE Health)从50_300ml所述培养物纯化抗体,并通过使用用于蛋白质聚集的过滤器(Amicon)以PBS置换上清液而储存纯化的抗体。实施例2 :制备针对c-Met的嵌合抗体chAbF46通常，当为了医疗的目的将小鼠抗体注射到人中时，可经常发生免疫原性。因此，为了减少这样的反应，由在实施例1中制备的小鼠抗体AbF46制备嵌合抗体chAbF46，其中除了抗原结合所涉及的可变区之外的恒定区被人IgGl抗体的序列代替。合成多核苷酸以具有各自设计有如下的结构，即对应于重链的序列的EcoR1-信号序列-VH-Nhel-CH-TGA-Xhol (SEQ ID NO: 7)和对应于轻链的序列的EcoR1-信号序列-VL-BsiW1-CL-TGA-XhoI (SEQ ID N0:8)。然后，通过如下构建用于嵌合抗体表达的载体通过分别使用限制酶EcoRI (NEB，R0101S)和XhoI (NEB，R0146S)将具有所述对应于重链的序列的DNA片段(SEQ ID NO: 7)克隆入pOptiVEC -由Invitrogen制造的OptiCHO AntibodyExpress Kit (Cat no. 12762-019)中包括的 TOPO TA Cloning Kit 和将具有所述对应于轻链的序列的 DNA 片段(SEQ ID N0:8)克隆入 pcDNA 3. 3-T0P0 TACloning Kit (Catno. 8300-01)。使用Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)扩增所构建的载体,并将包括所述重链的载体和包括所述轻链的载体用360 u I 2M CaCl2以约4:1 (约80 y g: 20 y g)的比添加到293T细胞(2. 5xl07)且转染。接着，将混合物在添加有10%FBS的DMEM培养基中在37°C在5%C02条件下培养5小时，然后在没有FBS的DMEM培养基中在37°C在5%C02条件下培养48小时。通过将培养的细胞分离获得各IOOml上清液，并使用AKTA Prime (GEHealthcare)纯化。蛋白质A柱(GE Healthcare, 17-0405-03)置于AKTA Prime中，且使培养的溶液以5ml/分钟的流速流动并用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific, 21004)洗脱。将所述缓冲液用PBS缓冲液置换，且因此纯化最终的嵌合抗体(下文中chAbF46)。 实施例3 由嵌合抗体制备人源化抗体huAbF46(I)重链人源化对于Hl-重和H3-重的2种类型的设计，首先使用Ig Blast (http ://www. ncb1.nlm. nih. rov/ifiblast/)分析与小鼠抗体AbF46的VH基因最同源的人种系基因。结果,证实VH3-71在氨基酸水平具有83%同源性，且小鼠抗体AbF46的⑶R-Hl、⑶R-H2和⑶R-H3使用Kabat编号方式进行编号，并设计使得小鼠抗体AbF46的CDR部分引入VH3-71的框架中。No.30(S —T)、No.48(V —L)、No.73(D —N)和 No. 78 (T — L)的氨基酸回复突变为原始小鼠AbF46抗体的氨基酸序列。然后，在Hl-重中，No. 83 (R — K)和No. 84 (A — T)的氨基酸额外地突变，由此完成Hl-重(SEQ ID NO:9)和H3-重(SEQ ID NO: 10)的构建。对于H4-重的设计，得到人抗体的框架序列，且使用已知为具有与小鼠AbF46抗体框架序列类似的序列且常规已知为最稳定的VH3亚型以引入如Kabat编号方式限定的小鼠抗体 AbF46 的 CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3。(2)轻链人源化对于Hl-轻(SEQ ID NO: 12)和H2-轻(SEQ ID NO: 13)的2种类型的设计，使用Ig Blast (http://www. ncb1. nlm. nih. gov/igblast/)分析与小鼠抗体 AbF46 的 VL 基因最同源的人种系基因。结果，证实VK4-1在氨基酸水平具有75%同源性，且小鼠抗体AbF46的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3使用Kabat编号方式进行编号，并设计使得小鼠抗体AbF46的⑶R部分引入 VK4-1 的框架中。在 Hl-轻中，No.36(Y —H)、No.46(L —M)和 No. 49 (Y—I)的3个氨基酸回复突变，且在H2-轻中，仅No. 49 (Y — I)的I个氨基酸回复突变。对于H3-轻(SEQ ID NO: 14)的设计，使用 Ig Blast (http://www. ncb1. nlm. nih.gov/igblast/)分析与小鼠抗体AbF46的VL基因最同源的人种系基因。结果,选择VK2-40和上述VK4-1。证实小鼠抗体AbF46VL和VK2-40在氨基酸水平具有61%同源性，且小鼠抗体AbF46的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3使用Kabat编号方式进行编号，并设计使得小鼠抗体AbF46的CDR部分可引入VK4-1的框架中。H3-轻回复突变No. 36 (Y — H)、No. 46 (L — M)和No. 49 (Y— I)的3个氨基酸。对于H4-轻(SEQ ID NO: 15)的设计，得到人抗体的框架序列，且使用常规已知为最稳定的Vkl亚型以引入使用Kabat编号方式进行编号的小鼠抗体AbF46的⑶R-L1、CDR-L2 和 CDR-L3。在 H4-轻中，No. 36 (Y — H)、No. 46 (L — M)和 No. 49 (Y — I)的 3 个氨
基酸额外地回复突变。·然后，用于人源化抗体表达的载体通过如下构建通过分别使用限制性内切酶EcoRI(NEB，R0101S)和XhoI (NEB，R0146S)将具有所述对应于重链的序列的DNA片段(Hl-重SEQ ID NO: 16，H3-重SEQ ID NO: 17，和 H4-重SEQ ID NO: 18)克隆入pOptiVEC -由 Invitrogen 制造的 0ptiCH0 Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)中包括的TOPO TA Cloning Kit和将具有所述对应于轻链的序列的DNA片段(Hl-轻SEQID NO: 19，H2-轻SEQ ID NO: 20，H3-轻SEQ ID NO: 21，和 H4-轻SEQ ID NO:22)克隆入pcDNA 3. 3-T0P0 TA Cloning Kit (Cat no.8300-01)。使用Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)扩增所构建的载体,并将包括所述重链的载体和包括所述轻链的载体用360 u I 2M CaCl2以约4:1 (约80 y g: 20 y g)的比添加到293T细胞(2. 5x IO7)且转染。接着，将混合物在添加有10%FBS的DMEM培养基中在37°C在5%C02条件下培养5小时，然后在没有FBS的DMEM培养基中在37°C在5%C02条件下培养48小时。通过将培养的细胞离心获得各IOOml上清液，并使用AKTA Prime (GEhealthcare)纯化。蛋白质A柱(GE healthcare, 17-0405-03)置于AKTA Prime中，且使培养的溶液以5ml/分钟的流速流动并用IgG洗脱缓冲液(ThermoScientific, 21004)洗脱。将所述缓冲液用PBS缓冲液置换，且因此纯化最终的人源化抗体(下文中huAbF46)。实施例4 :具有修饰的铰链区的嵌合抗体和人源化抗体的制备人IgGl的铰链具有‘EPKSCDKTHTCPPCP’的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)。所述铰链分别用具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的U7-HC6铰链、具有SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的U3-HC9铰链、具有SEQ ID NO: 25的氨基酸序列的U6-HC8铰链、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的U6-HC7铰链和具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的U8-HC5铰链置换。对于所述置换，合成包括各铰链序列的多核苷酸(SEQ ID N0:27-SEQ ID NO:31)编码基因(Bioneer，Inc.)，并将所得物通过使用限制酶KasI (NEB, R0544S)和BsrGI (NEB, R0575S)在实施例2或3中制备的包括chAbF46抗体或huAbF46抗体的重链区的载体上克隆。使用Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)各自扩增所述包括具有修饰的铰链区的重链区的载体和包括chAbF46或huAbF46的轻链区的载体，并将包括所述重链的载体和包括所述轻链的载体用360 ill 2M CaCl2以约4:1(约80ii g:20ii g)的比添加到293T细胞(2. 5x IO7)且转染。接着，将混合物在添加有10%FBS的DMEM培养基中在37°C在5%C02条件下培养5小时，然后在没有FBS的DMEM培养基中在37°C在5%C02条件下培养48小时。
通过将培养的细胞离心获得各IOOml上清液，并使用AKTA Prime (GEhealthcare) 纯化。蛋白质A柱(GE healthcare, 17-0405-03)置于AKTA Prime中，且使培养的溶液以 5ml/分钟的流速流动并用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific, 21004)洗脱。将所述缓冲液用PBS缓冲液置换，且因此最终纯化具有修饰的铰链区的嵌合抗体和具有修饰的铰链区的人源化抗体(下文中以在chAbF46或huAbF46后的铰链名称表示)。
实施例5 :对于C-Met的chAbF46抗体和huAbF46抗体反应性的证实
使用ELISA分析在实施例2和3中制备的chAbF46抗体和huAbF46抗体是否识别鼠C-Met抗原。在当前实施方式中使用的人源化抗体为4种类型，且所述重链和轻链组合的每一种如表I中所示。
〈表1>
权利要求
1.抗C-Met人源化抗体，包括具有SEQID NO :1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQID NO 2的氨基酸序列的轻链可变区。
2.抗c-Met人源化抗体，包括具有SEQID NO :3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQID NO 4的氨基酸序列的轻链可变区。
3.权利要求1或2的抗c-Met人源化抗体，其中所述c-Met衍生自选自人、猴子、小鼠和大鼠的c-Met。
4.权利要求1或2的抗c-Met人源化抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
5.权利要求1或2的抗c-Met人源化抗体,其中所述抗体为选自scFv、(scFv)2、Fab、Fab，和F(ab’ )2的抗原结合片段。
6.权利要求1或2的抗c-Met人源化抗体，其中所述抗体包括具有通过缺失、插入或取代一个或多个氨基酸而修饰的氨基酸序列的铰链区。
7.权利要求1或2的抗c-Met人源化抗体，其中所述抗体包括具有SEQID NO :5或SEQID NO 6的氨基酸序列的铰链区。
8.抗c-Met人源化抗体的重链可变区，具有SEQID NO 1的氨基酸序列。
9.抗c-Met人源化抗体的轻链可变区，具有SEQID NO :2的氨基酸序列。
10.抗c-Met人源化抗体的重链可变区，具有SEQID NO :3的氨基酸序列。
11.抗C-Met人源化抗体的轻链可变区，具有SEQID NO :4的氨基酸序列。
12.用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包括药物有效量的根据权利要求1-7中任一项的抗c-Met人源化抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
13.权利要求12的药物组合物，其中所述癌症为选自如下的一种鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球中的黑素瘤、直肠癌、肛门附近的癌、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肝瘤、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺瘤、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、和头颈癌。
14.权利要求12的药物组合物，其中所述抗体用作针对c-Met的拮抗剂。
15.治疗癌症的方法，所述方法包括向受验者施用用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包括药物有效量的根据权利要求1-7中任一项的抗c-Met人源化抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
16.根据权利要求1-7中任一项的抗c-Met人源化抗体在制造用于预防或治疗癌症的药物组合物或药物中的用途，所述药物组合物或药物包括药物有效量的所述抗c-Met人源化抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
全文摘要
抗c-Met人源化抗体及包括其的用于预防或治疗癌症的药物组合物。所述抗c-Met人源化抗体包括具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的轻链可变区，或者包括具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的轻链可变区。根据所述抗c-Met人源化抗体及包括其的用于预防或治疗癌症的药物组合物，可有效地预防或治疗癌症。
文档编号A61P35/02GK103030695SQ20121036505
公开日2013年4月10日 申请日期2012年9月27日 优先权日2011年10月5日
发明者郑光鎬, 李承炫, 金健雄, 金敬儿, 吴永美, 李 S-b, 郑收砚, 郑闰宙, 赵恩彻, 韩荣奎 申请人:三星电子株式会社