专利名称：治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，具体地说，涉及一种治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂。
背景技术：
鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物具有广泛的耐药性，这使得鲍曼不动杆菌的治疗变得日益困难。碳青霉烯类抗生素被认为是目前临床治疗鲍曼不动杆菌感染最有效的药物之一。近年来感染耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌比例逐年增高，一旦细菌对碳青霉烯类抗生素耐药，则对其他抗生素亦基本耐药，患者往往死于无药可 选。研究者将抗感染治疗的目光开始转向噬菌体的研究。噬菌体是一类细菌依赖性病毒，又称细菌病毒，能在菌体内快速增殖并最终裂解细菌从而达到抗菌作用。但是，活噬菌体制剂治疗细菌感染所面临的最主要障碍是宿主专一性太强，宿主谱太窄。自然分离的噬菌体具有高度专一的宿主选择性，往往只能感染单一的细菌分离株，而不能感染同一种细菌的其他分离株。这种高度专一的宿主选择性使噬菌体的应用受到极大限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种耐药率低，杀菌谱宽的治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂。本发明的技术方案如下一种治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂，其关键是所述生物试剂为噬菌体AB3裂解酶的蛋白质溶液，该噬菌体AB3裂解酶的蛋白质序列为MILTKDGFGI IRNELFGGKLDQNQVDAINFI IEKSTESGLTYPEAAYLLATIYHETGLPSGYRTMRPIKEAGSDSYLRSKKYYPY I GYGYVQLTffKDNYER I GKL I G I DLVKNPEKALEPL I A I Q I A I KGMLNGffFTGVGFRRKRPVSKYNKQQYIAARNI INGKDKAELIAKYAI IFERALRSL SEQ NOl ；所述合成噬菌体AB3裂解酶的基因序列为5， -ATGATTCTGACTAAAGATGGGTTTGGTATTATCCGTAATGAGTTATTCGGAGGTAAGTTAGATCAAAATCAAGTAGATGCAATAAACTTTATTATTGAGAAATCTACTGAGTCTGGTCTAACTTATCCAGAGGCAGCATATTTACTAGCTACCATTTATCATGAGACTGGTTTACCAAGTGGTTATCGAACTATGCGACCAATTAAGGAAGCTGGCTCTGATAGCTACCTTCGATCTAAGAAGTACTACCCTTACATCGGTTATGGTTATGTACAATTAACTTGGAAGGATAACTATGAACGTATCGGTAAACTTATTGGAATTGATCTGGTCAAGAATCCTGAGAAAGCCCTAGAACCATTAATTGCTATTCAAATTGCTATCAAAGGTATGTTGAATGGTTGGTTCACAGGTGTTGGGTTCCGACGTAAACGTCCAGTTAGTAAATACAACAAACAACAGTACATAGCTGCTCGTAATATCATTAATGGGAAGGATAAGGCTGAGCTTATAGCGAAGTACGCTATTATCTTTGAACGTGCTCTACGGAGCTTATAG-3’ SEQ N02。来源于噬菌体AB3的裂解酶为治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆感染提供了另一种途径。噬菌体AB3的裂解酶水解细菌肽聚糖破坏细胞壁以释放子代噬菌体，作为潜在的新型杀菌物质，具有活噬菌体制剂和抗生素无法比拟的优势，细菌对噬菌体裂解酶产生耐药性的几率小于抗生素，噬菌体AB3裂解酶的杀菌谱比噬菌体相对较宽。一种噬菌体AB3裂解酶的制备方法，按照如下步骤完成A、噬菌体AB3的分离与纯化取医院污水适量，将处于早期对数生长期的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌悬液和B50ml加入到污水中37°C 24h。离心后过滤除菌。10 μ I处理后的污水与200 μ I宿主菌混合20min后，与2ml顶层琼脂混匀铺板。单个噬斑经过5次反复纯化后即可得到均一的噬菌体；B、提取噬菌体AB3的DNA (I)挑单个细菌菌落接种于200mL液体LB培养基中，37°C振荡培养6h，至早期对数生长期；(2)挑噬菌体AB3单个噬斑分别接种到对应宿主菌悬液中，37°C振荡培养16h ；(3)培养物加 DNase I 及 RNase A 至终浓度各 I μ g/m，37°C X Ih ；(4)按5. 84g/100mL加入NaCl，混匀溶解，冰浴lh，离心IOOOOgX lOmin，收集上清；(5)加入固体PEG8000至终浓度10% (w/v)，充分振荡溶解，冰浴3h，使噬菌体颗粒形成沉淀，4 离心12000gX IOmin,弃尽上清；(6)用2mLTM液混悬沉淀；(7)加等体积氯仿,振荡30sec,离心5000gX IOmin,收集上层水相；(8)加 DNase I 至终浓度 5 μ g/m, RNase A 至终浓度 I μ g/mL, 37°C温育 Ih ； (9)然后加入 EDTA (ρΗ8· O)至终浓度 20mmol/L ；(10)加蛋白酶K至终浓度50 μ g/m，加SDS至终浓度0.5%，混勻，56°C Xlh ；(11)等体积平衡酚(pH8. O)抽提，离心5000gX IOmin,收集上层水相；(12)等体积氯仿再抽提一次，离心5000gX IOmin,收集上层水相；(13)加入1/10体积3mol/L NaAc (pH5. 2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，_20°C过夜，4°C离心12000gX IOmin ;沉淀用70%乙醇和无水乙醇各洗涤一次，去乙醇，空气中干燥沉淀；(14)用适量TE (pH8. O)混悬沉淀，在核酸定量仪上粗略定量，_20°C保存；C、噬菌体AB3DNA的酶切分析取上述得到的噬菌体核酸溶液，常规进行酶切。于O. 8%琼脂糖凝胶中电泳，90V电压 lh。使用限制性内切酶 Hind I.BamH I,EcoR I,Pst I,XbaI,Xho I,BglI,Aat I.DraI、Nhe I、Sac I和Sa I分别消化噬菌体核酸；D、噬菌体AB3衣壳蛋白SDS-PAGE分析；灌注10%分离胶，聚合后再灌注5%积层胶。用5X SDS-PAGE上样缓冲液混合样品，100°C IOmin后立即移至冰上冷却。离心后逐孔加样，最后将I X SDS-PAGE的上样缓冲液加入剩余孔。给予8V/cm电压，待染料前端进入分离胶后，15V/cm电压继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部； E、噬菌体AB3裂解酶基因的PCR反应扩增；PCR反应扩增的引物正向引物5’ -TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3 ’ SEQN03
反向引物5’-GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3> SEQ N04I)试管编号(N) =N=样本编号数量+1个阴性对照2) PCR反应体系
权利要求
1.一种治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂，其特征在于所述生物试剂为噬菌体AB3裂解酶的蛋白质溶液，该噬菌体AB3裂解酶的氨基酸序列为MILTKDGFGIIRNELFGGKLDQNQVDAINFIIEKSTESGLTYPEAAYLLATIYHETGLPSGYRTMRPIKEAGSDSYLRSKKYYPYIGYGYVQLTWKDNYERIGKLIGIDLVKNPEKALEPLIAIQIAIKGMLNGWFTGVGFRRKRPVSKYNKQQYIAARNIINGKDKAELIAKYAIIFERALRSL SEQ NOl ;所述合成噬菌体 AB3 裂解酶的基因序列为5’ -ATGATTCTGACTAAAGATGGGTTTGGTATTATCCGTAATGAGTTATTCGGAGGTAAGTTAGATCAAAATCAAGTAGATGCAATAAACTTTATTATTGAGAAATCTACTGAGTCTGGTCTAACTTATCCAGAGGCAGCATATTTACTAGCTACCATTTATCATGAGACTGGTTTACCAAGTGGTTATCGAACTATGCGACCAATTAAGGAAGCTGGCTCTGATAGCTACCTTCGATCTAAGAAGTACTACCCTTACATCGGTTATGGTTATGTACAATTAACTTGGAAGGATAACTATGAACGTATCGGTAAACTTATTGGAATTGATCTGGTCAAGAATCCTGAGAAAGCCCTAGAACCATTAATTGCTATTCAAATTGCTATCAAAGGTATGTTGAATGGTTGGTTCACAGGTGTTGGGTTCCGACGTAAACGTCCAGTTAGTAAATACAACAAACAACAGTACATAGCTGCTCGTAATATCATTAATGGGAAGGATAAGGCTGAGCTTATAGCGAAGTACGCTATTATCTTTGAACGTGCTCTACGGAGCTTATAG-3’ SEQ N02。
2.一种如权利要求I所述噬菌体AB3裂解酶的制备方法，其特征在于，按照如下步骤完成 A、噬菌体AB3的分离与纯化 取医院污水适量，将处于早期对数生长期的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌悬液和LB50ml加入到污水中37°C，24h。离心后过滤除菌。10 μ I处理后的污水与200 μ I宿主菌混合20min后，与2ml顶层琼脂混匀铺板。单个噬斑经过5次反复纯化后即可得到均匀的噬菌体； B、提取噬菌体AB3的DNA (1)挑单个细菌菌落接种于200mL液体LB培养基中，37°C振荡培养6h，至早期对数生长期； (2)挑噬菌体AB3单个噬斑分别接种到对应宿主菌悬液中，37°C振荡培养16h； (3)培养物加DNaseI及RNase A至终浓度各I μ g/mL, 37 °C X Ih ； (4)按5.84g/100mL加入NaCl，混匀溶解，冰浴lh，离心IOOOOgX lOmin，收集上清； (5)加入固体PEG8000至终浓度10% (w/v)，充分振荡溶解，冰浴3h，使噬菌体颗粒形成沉淀，4°C离心12000gX IOmin,弃尽上清； (6)用2mLTM液混悬沉淀； (7)加等体积氯仿，振荡30sec,离心5000gXIOmin,收集上层水相；(8)加DNase I 至终浓度 5 μ g/mL, RNase A 至终浓度 I μ g/mL, 37°C温育 Ih ； (9)然后加入EDTA(ρΗ8· O)至终浓度20mmol/L ； (10)加蛋白酶K至终浓度SOygAiLjPSDS至终浓度0.5%，混匀，56°C Xlh ； (11)等体积平衡酚(PH8.0)抽提，离心5000gXIOmin，收集上层水相； (12)等体积氯仿再抽提一次,离心5000gXIOmin,收集上层水相； (13)加入1/10体积3mol/LNaAc (pH5. 2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，_20°C过夜，4°C离心12000gX IOmin ;沉淀用70%乙醇和无水乙醇各洗涤一次，去乙醇，空气中干燥沉淀；(14)用适量TE(pH8.0)混悬沉淀，在核酸定量仪上粗略定量，_20°C保存； C、噬菌体AB3DNA的酶切分析 取上述得到的噬菌体核酸溶液，常规进行酶切。于O. 8%琼脂糖凝胶中电泳，90V电压Ih0 使用限制性内切酶 Hind III、BamH I、EcoR I、Pst I, XbaI, Xho I、Bg III、Aat II、Dra I、Nhe I、Sac I和Sa II分别消化噬菌体核酸； D、噬菌体AB3衣壳蛋白SDS-PAGE分析； 灌注10%分离胶，聚合后再灌注5%积层胶。用5XSDS-PAGE上样缓冲液混合样品，IOO0C IOmin后立即移至冰上冷却。离心后逐孔加样，最后将I X SDS-PAGE的上样缓冲液加入剩余孔。给予8V/cm电压，待染料前端进入分离胶后，15V/cm电压继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部； E、噬菌体AB3裂解酶基因的PCR反应扩增； PCR反应扩增的引物正向引物5’ -TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3> SEQ N03反向引物5’ -GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3> SEQ N04 1)试管编号(N):N=样本编号数量+1个阴性对照 2)PCR反应体系......在..『以..竹中混介下列液体:ddH2030. Oμ I IOX Rcaclion Buffer5μ I 25mM MgSOI4μ I dNTP Mixture (10 IiM each, final concentration0.2 mM) Iμ 鳥__ Ι)ΝΛ(!()-5(M1W)Iμ I 正向弓丨物(5 pmoi/ μ I final concentration 0.4μ Μ) 4μ I 反['1J')I物(5 pmoI/ μ I f IπηI concentralion 0.4μ Μ) 4μ I Kod plus DNA PoIymerase (III/ρ I)IpI to La I νο I ume50Ii I 3)PCR循环体系 (I )预变性 iir2mln (2)变ft9..rC15s (3)IM火 51TC30κ (4)延伸72140s (5)_少骤(2)至步骤(4)$g30循环_ 4)I. 5%琼脂糖凝胶检测 在I. 5%琼脂糖凝胶上电泳，检测条带的是否存在； F、原核表达载体的构建；噬菌体AB3裂解酶基因以Nco I和Xho I酶切位点装入pET28a载体中，在蛋白C端引A6His tag作为亲和纯化标签。经测序验证正确后，在大肠杆菌中表达； G、噬菌体AB3裂解酶基因的表达及纯化； 将噬菌体AB3表达质粒转化到表达菌株BL21(DE3)中，第二天挑单克隆到200ml LB培养基中，37°C培养至0D600 = O. 6，加入ImM IPTG分别于25°C诱导表达20h，37°C诱导表达6h。诱导后，离心收集菌体。PBS溶液悬起菌体，超声波破碎菌体，4°C冷冻离心，上清部分用Ni柱纯化，以含50mM咪唑PBS溶液洗涤杂蛋白，以含500mM咪唑的PBS溶液洗脱。并取样SDS-PAGE 检测。
3.根据权利要求I所述的治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂，其特征在于所述的噬菌体AB3裂解酶基因序列的长度为558bp，噬菌体AB3裂解酶的基因序列全部表达，合成的蛋白质长度为185aa。
4.根据权利要求I所述的治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂，其特征在于所述生物制剂治疗的最佳给药途径是滴鼻途径。
5.根据权利要求2所述的噬菌体AB3裂解酶的制备方法，其特征在于所述步骤A中噬菌体浓度的确定采用双层琼脂法。
6.根据权利要求2所述的噬菌体AB3裂解酶的制备方法，其特征在于所述步骤E中所设计用于PCR反应扩增的引物是 正向引物5’ -TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3> SEQ N03 反向引物5’ -GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3> SEQ N04 其中基因序列是SEQ N03的画线部分为Nco I酶切位点，SEQ N04的画线部分为Xho I酶切位点。
全文摘要
本发明公开了一种可用于治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂。试剂为噬菌体AB3裂解酶的蛋白质溶液。制备方法包括噬菌体AB3的分离与纯化、噬菌体AB3基因组的提取、噬菌体AB3DNA的酶切分析、噬菌体AB3衣壳蛋白SDS-PAGE分析、噬菌体AB3裂解酶基因的扩增、原核表达载体的构建，以及裂解酶基因的表达及纯化。这种通过构建原核表达载体对噬菌体AB3裂解酶基因表达及纯化的方法，可用于临床上对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的治疗，具有特异性高，见效快等特点，作为新型的抗菌药物具有独特的优势和良好的应用前景。
文档编号A61P31/04GK102861324SQ20121039600
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者张劼, 李秀娟 申请人:重庆市第三人民医院