肥大细胞抑制剂在制备抗流感病毒感染药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了肥大细胞抑制剂在制备抗流感病毒感染药物中的应用。本发明首次证明肥大细胞在流感病毒感染中起到关键作用，利用肥大细胞抑制剂可显著地提高现有抗流感病毒药物的疗效，从而提供了一种治疗流感的药物组合物。
【专利说明】肥大细胞抑制剂在制备抗流感病毒感染药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肥大细胞抑制剂在抑制流感病毒复制和增强宿主抗病毒力的药物中的应用，以及含肥大细胞抑制剂的药物组合物及其用途。
【背景技术】
[0002]流感病毒H5N1的快速传播和高致病性给全世界范围内家禽和人类的健康造成了巨大的威胁。人类患高致病性流感H5N1死亡率超过50%，患病动物和人类出现发烧、食欲不振、脑炎、肺炎、急性呼吸窘迫综合征的并发症。患者过度的炎症反应造成的弥漫性肺泡损伤和出血是这种疾病高死亡率的主要原因。在H5N1感染早期，炎性细胞发挥着重要的作用，据报道，在H5N1感染小鼠中，肺部出现大量炎性细胞浸润现象。中性粒细胞可能是病毒复制和传播的工具。巨噬细胞分泌TNF- α和其他细胞因子，使人体感染Η5Ν1后损伤更加严重。最近研究发现，Η5Ν1假病毒颗粒会影响NK细胞的活化。研究还证实Η5Ν1感染小鼠和人体体内TNF-a、 IL-6和CC趋化因子受体2等炎性细胞因子的过度分泌，人们普遍推测“细胞因子风暴”是导致出现病理变化并最终引起死亡的主要原因。但是，抑制细胞因子(TNF-α、IL-6 和 CC 趋化因子受体 2、TNF_a 受体 1、TNF-a 受体 2、MIP_la 和 IL-1R)反应并不能保护动物免受致死性流感病毒H5N1的感染。因此，H5N1感染引起的炎性损伤机制仍存争议。很可能是人们忽略了其他一些致炎因素，诸如肥大细胞及其介质。
[0003]肥大细胞广泛分布于机体各种组织中，通过分泌大量炎性分子包括强效蛋白酶、细胞因子、趋化因子和花生四烯酸代谢产物，在免疫和炎症反应中发挥着重要的作用。近来，肥大细胞在肿瘤、寄生虫、细菌和病毒感染中的作用受到了广泛的关注。特别是已经证实肥大细胞在一些病毒如HIV-1、登革热病毒、巨细胞病毒、牛呼吸道综合征病毒的感染中发挥重要作用，但其在流感病毒感染中的作用仍不明了。因此，探讨肥大细胞在流感病毒感染中所发挥的作用，以及对肥大细胞的功能进行抑制后对治疗流感病毒感染的潜在治疗作用具有重要的临床意义和社会效益。
[0004]当前，防治流感的最有效手段之一是使用灭活流感病毒疫苗来降低流感的发病率。但由于所制备疫苗具有病毒株特异性，每年的疫苗均需使用当年可能流行的病毒株进行制备。另外，疫苗所诱导的免疫反应为IgG型，一般只能保持6个月左右(Castle，ClinicallnfectiousDiseases, 31:578-585，2000)。用于治疗流感病毒感染的另一种手段是使用抗病毒制剂。这些制剂包括:金刚烧胺(Amamtadine)、金刚乙胺(Rimatadine)、瑞乐沙(Relenza)和达菲(Tamiflu)。临床结果证明，尽管使用这些制剂对部分患者有一定的疗效，但其很容易诱导产生病毒抗性株和具有很强的副作用，特别对中枢神经系统的影响很大(Wenzel, Journal ofAmerican Medical Association, 283:1057-1059，2000)。
[0005]由此可见，人类面临的巨大挑战是寻找一种疗效高、副作用小或无副作用、不易诱导产生变异病毒株的新型抗流感病毒制剂和方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一类有效预防和治疗流感病毒感染及其症状的方法和药物组合。
[0007]本发明通过研究肥大细胞在流感病毒感染初期发挥的作用和引起的病理损伤中，发现肥大细胞主动参与流感病毒感染引起的初次免疫反应，通过释放组胺、类胰蛋白酶、IFN-Y，直接引起细胞凋亡或产生细胞因子及其介质，加重感染组织的病理损伤。利用肥大细胞抑制剂，从而提供了一种药物治疗流感的方法和组合物
[0008]本发明发现应用肥大细胞抑制剂抑制肥大细胞功能，可以有效抑制流感病毒感染。肥大细胞抑制剂通过影响肺上皮细胞的凋亡过程减轻或消除流感病毒感染造成的组织损伤，从而可显著地提高现有抗流感病毒药物的疗效。
[0009]本发明所述的肥大细胞抑制剂包括，但不限于:肥大细胞脱颗粒抑制剂、类胰蛋白酶抑制剂、抗组胺类抑制剂。
[0010]本发明的肥大细胞脱颗粒抑制剂包括两类，即以色甘酸二钠为代表的酸性脱颗粒抑制剂和以酮替芬为代表的碱性脱颗粒抑制剂。
[0011]本发明的类胰蛋白酶抑制剂，依据其作用机制可分为两类:针对酶活性中心的类胰蛋白酶抑制剂和拮抗肝素作用的类胰蛋白酶抑制。其中，针对酶活性中心的类胰蛋白酶抑制剂例如:N-(1-羟基-2-萘酰)-L-精氨酰基-L-脯氨酰胺、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(secretoryleukocyte protease inhibitor, SLPI)、β -类膜蛋白酶的有效抑制剂 TdPI(tick-derived proteaseinhibitor)和一些非肽类小分子化合物；拮抗肝素作用的类胰蛋白酶抑制剂例如乳铁蛋白等。
[0012]本发明的抗组胺抑制剂主要针对速发变态反应过程中由肥大细胞释放出的一种组胺介质，可引起毛细血管扩张及通透性增加、平滑肌痉挛、分泌活动增强等。组胺必须首先与细胞上的组胺受体或酶原物质结合才能发挥作用。组胺受体有Hl和H2两类。一般说的抗组胺药是指Hl受体拮抗剂，可拮抗组胺对毛细血管、平滑肌、呼吸道分泌腺、唾腺、泪腺的作用。H2受体拮抗剂主要抑制胃液分泌。常用的Hl受体拮抗剂包括但不限于:马来酸氯苯那敏、羟嗪、桂利嗪、非那根、赛庚啶、阿司咪唑、特非那丁、西替利嗪、氯雷他定、阿化斯丁、苯海拉明、曲吡那敏、酮替芬、特非那定、美喹他嗪、盐酸左卡巴斯汀。常用的H2受体拮抗剂包括但不限于:甲氰咪呱、雷尼替丁 (西米替丁)等。
[0013]本发明应用肥大细胞抑制剂与抗流感病毒药物的组合成药物组合物，可完全保护流感病毒感染造成的死亡。药物联合使用效果明显好于单独使用，这是由于不同药物可以作用于病毒复制过程的不同阶段或病毒致病的不同方面。在实施例中，通过联合使用脱颗粒抑制剂酮替芬(10mg/kg)和抗病毒药物达菲(10mg/kg),可以100%保护感染流感小鼠。
[0014]本发明的抗流感病毒药物包括，但不限于:金刚烷胺(Amamtadine)、金刚乙胺(Rimatadine)、瑞乐沙(Relenza)和达菲(Tamiflu)等。
[0015]本发明的抗流感病毒药物组合物可以利用小鼠感染模型进行实验验证。实验指标包括:动物存活率、组织病理改变、血清LDH水平检测、肺上皮细胞凋亡、肥大细胞激活状态，包括肥大细胞脱颗粒水平、类胰蛋白酶水平、相关细胞因子释放(IL-6、TNF-a、IFN-Y、IL-1 - β 和 IL-12 等)。
[0016]本发明首次证明肥大细胞在Η5Ν1流感病毒感染中起到关键作用，利用肥大细胞抑制剂可显著地提高现有抗流感病毒药物的疗效，从而提供了一种药物治疗流感的药物组合物和方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是H5N1流感病毒感染小鼠的病理学特征示意图。其中，A显示感染5天后肺组织的组织病理(HE或NP单克隆抗体染色):a所示为HE染色的正常肺组织；b所示为流感病毒感染5天后HE染色的肺组织，空箭头指示肺间质水肿和小血管周边的炎症细胞侵润，黑箭头指示在支气管管腔中脱落的黏膜上皮细胞和炎性细胞；(3所示为无NP阳性的正常肺组织；d所示为流感病毒感染5天后NP单克隆抗体染色的肺组织，箭头指示NP阳性细胞。B和C分别是感染小鼠在第1、3、5天处死，实时定量PCR测定肺组织中的病毒RNA水平(B)和噬斑形成实验测定病毒滴度(C)。
[0018]图2显示了 H5N1流感病毒感染鼠中肥大细胞的分布。鼻粘膜(nasal mucosa)、气管(trachea)、肺门淋巴结(hilar lymph node)、肺(lung)组织中的肥大细胞以甲苯胺兰染色识别，箭头表明肥大细胞。整个组织切面的肥大细胞数表示在右方的柱状图(n=5)。
[0019]图3显示了 H5N1流感病毒感染鼠中类胰蛋白酶和TNF- α在鼻粘膜、气管、肺门淋巴结、肺组织中的表达水平。
[0020]图4显示了 Η5Ν1流感病毒感染鼠后1、3、5天组胺在鼻粘膜和肺组织中的水平(*Ρ〈0.05)。
[0021]图5显示了小鼠传代肥大细胞系Ρ815细胞表面唾液酸受体的表达情况。
[0022]图6显示了大鼠腹腔原代肥大细胞表面唾液酸受体的表达情况。
[0023]图7显示了人肺脏原代肥大细胞表面唾液酸受体的表达情况。
[0024]图8是流式细胞术检测小鼠传代肥大细胞系Ρ815细胞表面唾液酸受体的表达情况，其中从左到右三个图SNA-FITC (异硫氰酸荧光素)和MAA-FITC的浓度分别为5 μ g/ml、10 μ g/ml和20 μ g/ml，图中曲线①，②和③分别代表未染色细胞、MAA-FITC和SNA-FITC。
[0025]图9是用H5N1、H7N2、H1N1三种亚型的A型流感病毒在小鼠传代肥大细胞P815上进行攻毒试验，攻毒后取细胞上清液测定的病毒血凝效价结果。
[0026]图10是用H5N1、H7N2、HlNl三种亚型的A型流感病毒在小鼠传代肥大细胞P815上进行攻毒试验，攻毒后进行反转录和荧光定量PCR的结果。
[0027]图11是用H5N1、H7N2、HlNl三种亚型的A型流感病毒在小鼠传代肥大细胞P815上进行攻毒试验，攻毒后取细胞上清液进行噬斑分析的结果。
[0028]图12是用H5N1、H7N2、HlNl三种亚型的A型流感病毒在小鼠传代肥大细胞P815上进行攻毒试验后，透射电镜观察结果，其中A =HlNl, B:H5N1, C:H7N2。
[0029]图13是H5N1、H7N2、HlNl三种亚型的A型流感病毒诱导小鼠传代肥大细胞P815细胞凋亡的FACS检测结果。
[0030]图14是H5N1、H7N2、HlNl三种亚型的A型流感病毒诱导小鼠传代肥大细胞P815细胞凋亡的透镜观测结果，其中A、B、C和D分别对应细胞对照、H5N1、H7N2和H1N1。
[0031]图15显示了受酮替芬处理和未处理的小鼠肺组织病理和细胞凋亡情况。A:感染5天后接受酮替芬(右)和未接受酮替芬(左)小鼠肺组织病理。B:感染1、3、5天后肺组织细胞凋亡(TUNEL染色)。
[0032]图16A至图16E显示体外H5N1流感病毒激活肥大细胞的情况。其中，图16A:使用Mast Cell Degranulation Assay Kit检测肥大细胞P815的脱颗粒水平；图16B:使用流式细胞仪检测经P815细胞上清处理的LA795和A549细胞凋亡水平；图16C:H5N1流感病毒感染诱导的P815细胞IL-6、TNF-a ,IL-1-β、IL_12表达水平；图16D:H5N1流感病毒感染诱导的P815细胞IFN- Y表达水平；图16E:经IFN- Y抗体处理的P815肥大细胞上清与LA795细胞作用，引起的细胞凋亡降低。
[0033]图17显示酮替芬单独或与抗病毒药物达菲合用对H5N1流感病毒感染小鼠的治疗作用。A:不同剂量酮替芬处理的存活实验；B:酮替芬与抗病毒药物达菲合用的存活实验；C:小鼠体重变化记录。
[0034]图18是H5N1亚型A型流感病毒对小鼠攻毒后3天和8天，取小鼠肺组织提取RNA并进行实时定量PCR检测的结果。
[0035]图19是H5N1亚型A型流感病毒对小鼠攻毒后3天和8天，取小鼠肺组织，进行噬斑形成实验测定病毒滴度的结果。
[0036]图20是H5N1亚型A型流感病毒对小鼠攻毒后3天和8天，采用实时定量PCR分别检测PBS、酮替芬组、达菲组、酮替芬+达菲组肺组织中IFN-Y水平的结果。
[0037]图21是H5N1亚型A型流感病毒对小鼠攻毒后3天和8天分别检测PBS、酮替芬组、达菲组、酮替芬+达菲组肺泡灌洗液中乳酸脱氢酶(LDH)水平的结果。
[0038]图22是H5N1亚型A型流感病毒对小鼠攻毒后8天观察各组肺组织病理学改变情况，a:PBS组，b:酮替芬组，c:达菲组，d:酮替芬+达菲组。空箭头指示水肿和炎性细胞浸润，黑箭头指示支气管内粘膜损伤及脱落的黏膜上皮细胞和炎性细胞，黑三角指示淤血、出血。
【具体实施方式】
[0039]以下通过实施例进一步详细描述本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。
[0040]实施例1:肥大细胞在流感病毒感染中的重要作用
[0041]使用H5N1感染的小鼠模型研究肥大细胞作用。这些小鼠在感染流感病毒5天后出现典型的临床症状，如精神萎靡、被毛零乱、食欲不振、体态消瘦、呼吸困难。感染小鼠肺部严重水肿，呈弥漫性出血(图lAd)。H5N1感染小鼠肺部出现间质性水肿、小血管周围炎性细胞浸润、细支气管上皮细胞剥离、肺泡壁增厚与肺泡腔中上皮细胞、红细胞及炎性细胞引起的混合水肿(图1Ab)。能够在肺部脱落的肺泡细胞和黏膜上皮细胞检测到H5N1病毒抗原(NP)的广泛存在(图1Ad)。通过real time RT-PCR方法检测发现感染后H5N1病毒复制增强(图1B)。
[0042]在感染模型中，感染后1、3、5天鼻粘膜、气管、肺门淋巴窦和肺部肥大细胞数量显著提高(P <0.05)(图2)。在感染小鼠鼻粘膜、气管中发现脱颗粒现象。之后，我们检测活化肥大细胞释放的介质水平。如图3所示，相比对照组，在感染后1、3、5天，胰蛋白酶、TNF-α在感染小鼠的鼻粘膜、气管、肺门淋巴窦和肺部的表达水平显著升高。如图4所示，感染后1、3、5天，感染小鼠鼻粘膜中组胺的水平显著升高，与鼻粘膜中肥大细胞的数目升高趋势一致。感染小鼠肺部组胺水平在感染后I天达到峰值，在感染后第2天下降，在感染后第5天降到基本水平(图4)。
[0043]以上结果表明，在流感病毒感染中，肥大细胞的数量和其释放的介质均显著升高，证明了肥大细胞在感染中的重要作用。
[0044]实施例2:肥大细胞表面表达流感病毒受体(唾液酸受体SNA&MAA)
[0045]流感病毒HA蛋白与宿主细胞表面的唾液酸受体特异性结合是流感病毒感染宿主的第一步。本实验通过唾液酸受体免疫荧光染色证明肥大细胞(小鼠传代肥大细胞P815、大鼠腹腔原代肥大细胞、人肺脏原代肥大细胞)表面存在MAA和SNA受体(图5至图7)，同时通过流式细胞术检测肥大细胞表面MAA和SNA受体荧光强度发现，SNA受体的表达高于MAA受体(图8)。
[0046]实施例3:流感病毒在肥大细胞内的活跃复制
[0047]选择H5N1、H7N2、H1N1三种亚型的A型流感病毒，在小鼠传代肥大细胞P815上进行攻毒试验。攻毒后分别进行细胞上清中病毒血凝效价的检测和噬斑分析，用荧光定量PCR技术分析了攻毒后的P815细胞中病毒RNA的复制情况。
[0048]首先，在6孔板中接种P815细胞，待细胞密度约达70%时分别接种2000PFU HlNl(A/WSN/33,简称 WSN)、H5N1 (A/chicken/Henan/1/2004,简称 H5)、H7N2 (简称 H7)三种亚型的A型流感病毒，攻毒后12h、24h和48h取细胞上清液测定病毒血凝效价，初步确定P815对三种亚型流感病毒的易感性，实验结果见图9。进一步的，P815细胞常规攻毒，分别于攻毒后不同时间点收取样品，细胞加TRIZOL提取RNA，反转录后进行荧光定量PCR分析病毒含量，结果如图10所示；同时，细胞上清液进行噬斑分析，实时监测肥大细胞内A型流感病毒的复制情况，结果如图11所示。上述实验结果显示，这三种亚型的A型流感病毒均可以在肥大细胞P815中进行复制。
[0049]同时，我们采用透 射电镜的方法，直接在感染的P815细胞中观察到了病毒粒子(图12)，电镜结果显示:攻毒后，P815细胞释放大量HlNl和H5N1亚型IAV病毒粒子(病毒粒子直径约80-90纳米)，释放少量Η7亚型IAV病毒粒子(病毒粒子直径约110-120纳米)。这一结果进一步证实了 A型流感病毒可以感染肥大细胞。
[0050]实施例4:Α型流感病毒激活肥大细胞后胞内TLR3和RIG-1的表达
[0051]将Ρ815 细胞分别用 poly1:C, polyl: C+Lip2000 (转染试剂)，H1N1、H5N1、H7N2 处理，未经处理的细胞作为对照，处理后30min、lh、2h、4h、6h、8h、12h和24h收取样品，细胞加Trizol提取RNA，荧光定量PCR分析TLR3和RIG-1的表达情况。具体结果如表I和表2所示:
[0052]表1:攻毒后P815细胞中TLR3表达的动态观察
30min Ih 2h 4h6h 12h 24h
ControliIiiiiI
polyl:C 15 26 203.29 0.4 3943.84 0 54 908.8 9.16
[0053]polyl:C+Lip2000 0.81 167.84 0.79 4654.96 6.99 502.87 17.35
HI NI0.63 5.73 Un 143.24 112.23 4.58 Un
H5N11.68 9.6 0.34 176.75 0.84 0.11 12.65
H7N21.46 2.38 0.06 1538.71 193.75 10.41 2.71
[0054]表2:攻毒后P815细胞中RIG_1表达的动态观察
[0055]
【权利要求】
1.肥大细胞抑制剂在制备预防和治疗流感病毒感染的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肥大细胞抑制剂是肥大细胞脱颗粒抑制剂、类胰蛋白酶抑制剂和/或抗组胺类抑制剂。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肥大细胞脱颗粒抑制剂是酸性脱颗粒抑制剂或碱性脱颗粒抑制剂；所述类胰蛋白酶抑制剂是针对酶活性中心的类胰蛋白酶抑制剂和/或拮抗肝素作用的类胰蛋白酶抑制；所述抗组胺抑制剂是Hl受体拮抗剂和/或H2受体拮抗剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酸性脱颗粒抑制剂是色甘酸二钠；所述碱性脱颗粒抑制剂是酮替芬；所述针对酶活性中心的类胰蛋白酶抑制剂选自下列药物中的一种或多种:N-(1-羟基-2-萘酰)-L-精氨酰基-L-脯氨酰胺、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂和β_类胰蛋白酶抑制剂TdPI ;所述拮抗肝素作用的类胰蛋白酶抑制剂是乳铁蛋白；所述Hl受体拮抗剂选自下列药物中的一种或多种:马来酸氯苯那敏、羟嗪、桂利嗪、非那根、赛庚啶、阿司咪唑、特非那丁、西替利嗪、氯雷他定、阿化斯丁、苯海拉明、曲吡那敏、酮替芬、特非那定、美喹他嗪和盐酸左卡巴斯汀；所述Η2受体拮抗剂是甲氰咪呱和/或雷尼替丁。
5.预防和治疗流感病毒感染的药物组合物，包括肥大细胞抑制剂与抗流感病毒药物。
6.如权利要求 5所述的药物组合物，其特征在于，所述肥大细胞抑制剂是肥大细胞脱颗粒抑制剂、类胰蛋白酶抑制剂和/或抗组胺类抑制剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述肥大细胞脱颗粒抑制剂是酸性脱颗粒抑制剂或碱性脱颗粒抑制剂；所述类胰蛋白酶抑制剂是针对酶活性中心的类胰蛋白酶抑制剂和/或拮抗肝素作用的类胰蛋白酶抑制；所述抗组胺抑制剂是Hl受体拮抗剂和/或Η2受体拮抗剂。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述酸性脱颗粒抑制剂是色甘酸二钠；所述碱性脱颗粒抑制剂是酮替芬；所述针对酶活性中心的类胰蛋白酶抑制剂选自下列药物中的一种或多种:Ν-(1-羟基-2-萘酰)-L-精氨酰基-L-脯氨酰胺、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂和β_类胰蛋白酶抑制剂TdPI ;所述拮抗肝素作用的类胰蛋白酶抑制剂是乳铁蛋白；所述Hl受体拮抗剂选自下列药物中的一种或多种:马来酸氯苯那敏、羟嗪、桂利嗪、非那根、赛庚啶、阿司咪唑、特非那丁、西替利嗪、氯雷他定、阿化斯丁、苯海拉明、曲吡那敏、酮替芬、特非那定、美喹他嗪和盐酸左卡巴斯汀；所述Η2受体拮抗剂是甲氰咪呱和/或雷尼替丁。
9.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述抗流感病毒药物选自下列药物中的一种或多种:金刚烷胺、金刚乙胺、瑞乐沙和达菲。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有酮替芬和达菲。
【文档编号】A61K45/00GK103446587SQ201210580079
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2011年12月28日
【发明者】汪明, 孙仑泉, 胡艳欣 申请人:汪明, 孙仑泉, 胡艳欣