含有顺序发酵或同时发酵的提取物的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种含有来自同时发酵或顺序发酵的发酵提取物的局部用组合物。当局部涂敷皮肤时，本发明的组合物可有效刺激皮肤细胞中的透明质酸、CD44和半胱天冬酶14蛋白质的产生。
【专利说明】含有顺序发酵或同时发酵的提取物的组合物
[0001]【技术领域】
[0002]本发明涉及适合用于个人护理和治疗应用的组合物，更具体地，本发明涉及含有双重发酵提取物的这种组合物。
[0003]【背景技术】
[0004]通过诸如酵母菌(Saccharomyces sp.)或乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)之类的单一微生物发酵得到的提取物是已知的并已经被用于局部用组合物。最近，美国专利申请公开第2010/0021532号表明来源于微生物与植物的多酚的发酵已经作为产生对皮肤具有有益效果的代谢物的方法公开。
[0005]已在食品工业范围内，特别是在酿酒工艺中探索了多种发酵剂培养物微生物的使用和共培养的多种微生物的构思(参见例如，Toro M.E等，World Journal ofMicrobiology and B iotechnologyl8:347 - 354.(2002)和 Herrero M.等，Journal ofIndustrial Microbiology and Biotechnology22:48 - 51 (1999))。据建议，多种发酵剂酒的味道和生化概貌可优于单一培养接种的酒的味道和生化概貌，由于在多种发酵剂微生物酿酒过程中微生物的相互作用对增强的味道起关键的影响作用，Ciani M.等，International Journal of Food Microbiologyl08:239 - 245(2006) ? 然而，不建议将多种发酵剂培养物用于个人护理产品。
[0006]最近，酵母菌及其衍生物的使用在美容应用中越来越受欢迎。这由如下事实引起:作为真核生物的酵母菌具有与人体细胞相似的细胞生物学过程，并且已知其在应激下引发有益蛋白的产生。同时还有使用酵母菌衍生物及其在局部皮肤施用中提高摄氧量的益处的大量历史证据。例如，美国专利第4，540，571号公开了酵母菌衍生物促进皮肤呼吸作用。还报道了酵母细胞衍生物刺激皮肤细胞中的胶原和弹性蛋白的生成。
[0007]最近的研究表明酵母细胞提取物能够产生刺激伤口愈合的‘生长因子’。例如，美国专利第7，217，417号公开了将酵母细胞衍生物加入用于伤口愈合的基于凝胶的制剂的方法。
[0008]本领域还没有报道同时使用发酵提取物或按顺序使用发酵提取物获得新的活性物质。
[0009]
【发明内容】
[0010]一方面，本发明提供含有从至少两种微生物的同时发酵或顺序发酵过程中取出的发酵提取物的局部用组合物。
[0011]另一方面，本发明提供一种含有从至少两种微生物的同时发酵或顺序发酵过程中取出的发酵提取物、足以对所述发酵提取物起灭菌或生物静态作用的防腐剂以及皮肤病学上可接受的载体的局部用组合物。
[0012]本发明提供的一种示例性局部用组合物含有第一微生物和第二微生物的双重发酵提取物，所述第一微生物为谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii),所述第二微生物为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
[0013]本发明提供的另一示例性局部用组合物含有第一微生物和第二微生物的双重发酵提取物，所述第一微生物为微藻，所述第二微生物为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
[0014]本发明还提供一种含有以下加工步骤的制备发酵提取物的方法:使用通过化学方法定义的第一营养培养基使第一微生物生长至对数生长后期以生成含有第一微生物和由第一微生物表达的次级代谢产物的第二营养培养基；使第二营养培养基与第二微生物接触；使第一微生物和第二微生物在第二营养培养基中同时发酵以生成含有水溶性部分和水不溶性部分的发酵混合物；从发酵混合物中分离水不溶性部分，由此隔离水溶性部分并生成双重发酵提取物。
[0015]本发明的另一方面为通过对需要用含有双重发酵提取物的局部用组合物治疗的使用者的皮肤施用局部用组合物来刺激皮肤细胞中透明质酸和CD44的产生的方法。
[0016]本发明的另一方面为通过对需要用含有双重发酵提取物的局部用组合物治疗的使用者的皮肤施用局部用组合物来刺激皮肤细胞中透明质酸和半胱天冬酶-14的产生的方法。
[0017]在阅读本发明的具体描述时，本发明的上述这些方面和其它方面将会是显而易见的。
[0018]【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是用于比较的乳杆菌科发酵提取物的GC-MS图谱。
[0020]图2是用于比较的丙酸杆菌科发酵提取物的GC-MS图谱。
[0021]图3是来自乳杆菌科和丙酸杆菌科同时发酵的双重发酵提取物的GC-MS谱。
[0022]图4表示用乳杆菌科发酵提取物、丙酸杆菌科发酵提取物和来自乳杆菌科和丙酸杆菌科同时发酵的双重发酵提取物处理的全层组织中的HASl表达。
[0023]图5表示用乳杆菌科发酵提取物、丙酸杆菌科发酵提取物和来自乳杆菌科和丙酸杆菌科同时发酵的双重发酵提取物处理的全层组织中的CD44表达。
[0024]图6A、6B和6C分别表不未经处理的体外角质层破坏模型中的透明质酸表达。
[0025]图6B表示用视黄醇处理的体外角质层破坏模型中的透明质酸表达。
[0026]图6C表示用来自乳杆菌科和微藻的同时发酵的双重发酵提取物处理的体外角质层破坏模型中的透明质酸表达。
[0027]图7A表示未经处理的处理的体外角质层破坏模型中的半胱天冬酶-14表达。
[0028]图7B表示用视黄醇处理的体外角质层破坏模型中的半胱天冬酶-14表达。
[0029]图7C表示用来自乳杆菌科和微藻的同时发酵的双重发酵提取物处理的体外角质层破坏模型中的半胱天冬酶-14表达。
[0030]图8A和SB显示施用微藻和乳杆菌科双重发酵物后，通过皮肤弹性测量仪(cutometer)对皮肤弹性的体内评价。
[0031]图9A和9B显示施用微藻和乳杆菌科双重发酵物后，对细纹和皱纹的体内评价。
[0032]图1OA和IOB显示施用微藻和乳杆菌科双重发酵物后，对眼周部位的细纹和皱纹的体内Silflo评价。
[0033]【具体实施方式】 [0034]目前本发明出乎意料地发现含有从至少两种微生物的同时发酵或顺序发酵过程中取出的发酵提取物的局部用组合物在用于个人护理和治疗用途的局部用组合物中具有有益性质。所述有益性质包括，例如，当含有所述发酵提取物的组合物局部施用于皮肤时，发现该组合物在刺激皮肤细胞中的透明质酸、CD44和半胱天冬酶14的蛋白的生成方面是有效的。
[0035]在不受任何理论束缚的条件下，相信同时发酵或顺序发酵使一种微生物可与另一微生物竞争。在存在来自第一微生物的代谢产物的条件下，第二微生物的竞争环境使第二微生物开始表达使其在该竞争环境中生长旺盛的代谢产物。具体而言，第二微生物可代谢来自第一微生物的次级代谢产物和细胞因子，反之，第一微生物也可代谢来自第二微生物的次级代谢产物和细胞因子。因此，发酵提取物变成含有独特的代谢活性物质的新组合物，而所述独特的代谢活性物质不能在上述微生物单独发酵时得到。
[0036]为了制备本发明的发酵提取物，在一种实施方式中，使第一微生物在通过化学方法定义的营养培养基中生长。如本文所使用的“通过化学方法定义的营养培养基”是指含有用于微生物生长的营养物质的特定化学来源的培养基，例如氮、碳的化学来源等。通过化学方法定义的营养培养基一般不含营养物质的生物来源，例如酵母菌或动物/植物组织营养物质。第一微生物通过表达次级代谢产物改良营养培养基。次级代谢产物包括蛋白、细胞因子、多糖、核酸等。接着，第二微生物可接种于含有第一微生物和来自第一微生物的代谢产物的改良的营养培养基中。然后，使第一微生物和第二微生物在改良的营养培养基中同时发酵以生成发酵混合物。可选地，在第一微生物发酵之后，使第二微生物在改良的营养培养基中发酵。一般而言，所述发酵会含有水溶性部分和水不溶性部分。可从发酵混合物中除去水不溶性部分，由此分离水溶性部分(本发明的发酵提取物)。本文使用的“水溶性”是指溶于I克水中的I克双重发酵提取物。所述提取物还可溶于水/有机溶剂混合物，所述水/有机溶剂混合物例如，但不限于，水性乙二醇和水性丙三醇。
[0037]如本文使用的“发酵提取物”是指来自两种或两种以上微生物的发酵的组合物。本发明的发酵提取物含有来自两种微生物的细胞质成分和细胞外成分，包括，但不限于，营养肉汤(nutrient broth)、细胞蛋白物质、细胞核物质、细胞原生质物质和/或细胞壁成分
坐寸ο
[0038]当两种微生物同时或按顺序生长时，该过程在本文中称作为“双重发酵”。来自双重发酵的发酵提取物在本文中称作为“双重发酵提取物”。如本文所述的，实例涉及用于制备双重发酵提取物的双重发酵；然而，预期额外的微生物可同时或按顺序进行发酵。[0039]一般而言，为了制备双重发酵提取物，使第一微生物在生长培养基中生长至对数生长后期。如本文使用的“对数生长后期”是指微生物培养物的指数生长的最后阶段。指数生长的特征为指数的细胞生长或加倍的细胞生长。指数生长的持续时间取决于在给定时间存在的微生物的种群数量以及培养基中营养物质的可用性。典型地，使第一微生物生长直至600nm下的光密度为至少约6。使第一微生物在规定的温度范围下生长持续规定的时间段。在无菌转移罐中收集得到的改良的营养培养基。可进一步纯化改良的营养培养基以除去第一微生物。可选地，在添加诸如乳杆菌之类的第二微生物的过程中，可使第一微生物保留在改良的培养基中。通过光密度和活菌数^OOnm下光密度至少为6 ;或者活菌数约为IO9菌落形成单位/ml)的改变监测第二微生物的生长。
[0040]基本上任何营养培养基均可用于本发明，其没有特别限制。营养培养基是本领域技术人员已知的，并且对本发明有用的营养培养基的生成没有特别限制。典型的营养培养基可在例如“Handbook of Microbiological Media，，CRC Press 出版(Boca Raton, FL)中找到。例如，用于本发明发酵过程的合适的营养培养基为通过化学方法限定的培养基，不含任何动物来源的产物，含有明确定义的且充足的碳源、氮源和磷源。
[0041]在发酵过程中，使流加培养物一般在约20至30°C下，在补充有碳源(丙三醇、乳糖)；氮源(肽和氨基酸)以及磷的营养培养基中生长。PH—般通过滴加2M NH4OH保持恒定为5.0±1.5。发酵氧条件通过可灭菌的氧探针时刻监测，发酵环境一般通过在发酵罐中以最低限度搅拌维持，所述搅拌的最大速度为介于IOOrpm至150rpm之间。氮气的进给速度一般设定为0.01至0.5VVM(体积空气/容器体积/每分钟)。可采用其它气体或可不采用其它气体，可施加额外的外部压力或者可不施加额外的外部压力，例如，使用氧化压力(stress)促进技术(例如添加臭氧或UV光)或者使用压力相关技术(例如，加热)。
[0042]发酵工艺可以在任何类型的搅拌生物反应器或波型生物反应器中实施。对本发明有用的生物反应器包括，但不限于，可获自New Brunswick Scientif ic (新泽西州爱迪生)或Applikon Biotechnology (加州福斯特城)的分批补料反应器。
[0043]第一微生物和第二微生物菌两者可在有氧条件下生长或在无氧条件下生长，或者在有氧和无氧条件下生长以刺激次级代谢产物。任选地，在发酵过程中，可将微生物暴露在压力源下，所述压力源例如，诸如过氧化氢和臭氧之类的化学品，诸如超声、UV、红外辐射或热之类的能量。
[0044]可使用本领域技术人员已知的技术对次级代谢产物进行检测。一种特别有效的技术包括与质谱结 合的色谱分析法(LC/MS或GC/MS)。检测次级代谢产物的另一有效方法为通过使用商售的微生物基因组阵列。这种阵列是本领域技术人员已知的，并且诸如酵母和乳杆菌之类的微生物的阵列可购买得到。用于检测次级代谢产物表达的其它方法可包括流式细胞术。可使用气相色谱和质谱分析(GC/MS)检测次级代谢物表达。这些仪器的实例包括来自 Skyray Instrument 公司和 Thermo-Scientific 公司的仪器。
[0045]可通过从第一微生物和第二微生物的胞外分泌物中分离生物质和提取活性成分得到发酵提取物。可选地，可通过本领域技术人员已知的方法溶解细胞得到双重发酵提取物的溶解物。在这些方法中,通过化学方式、酶解方式或物理方式或者通过这些方式的组合使细胞壁破裂。可通过本领域技术人员已知的许多方式进一步纯化双重发酵提取物，包括但不限于，色谱法、溶剂萃取、离心、倾析、过滤或活性炭处理。可通过本领域技术人员已知的任何方式进一步浓缩双重发酵提取物，包括但不限于，蒸发、喷雾干燥、低压升华干燥、带式或转鼓式干燥。
[0046]用于本发明的同时或顺序发酵的合适的微生物可包括本领域技术人员已知的各种不同的微生物科属，包括，但不限于:脉孢菌属(Neurospora),长_壳属(Ceratostomella),麦角菌属(Claviceps),炭角菌属(Xylaria),座坚壳属(Rosellinia),柔膜菌属(Helotium),核盘霉属(Sclerotinia),柄灰包属(Tulostoma),须腹菌属(Rhizopogon),耳柱干真菌类(Truncocolumella)，毛霉菌属(Mucor),根霉属菌(Rhizopus),虫霉属(Entomophthora),网柱菌属(Dictostylium),芽枝莓属(Blastocladia),壶菌属(synchytrium)，水霉属(Saprolegnia)，霜霉属(Peronospora),白锈菌属 Albugo,腐霉属(Pythium),喇卩入菌属(Craterellus),皮特瑞菌属(Pterygellus)，疫霉属(Phytophthora)，根肿菌属(Plasmodiophora)，块菌属(Tuber)，齿菌属(Hydnum)，荼溃属(Lecanora)，染料衣属(Roccella)，鸡皮衣属(Pertusaria)，松萝属(Usnea)，扁枝衣属(Evernia)，树花属(Ramalina)，树发属(Alectoria)，石蕊属(Cladonia)，梅衣属(Parmelia)，冰岛衣属(Cetraria)，伞菌属(Agaricus)，鸡油菌属(Cantharellus)，类胳燕属(Omphalotus)，鬼伞属(Coprinus)，乳燕属(Lactarius)，皮伞属(Marasmius)，侧耳属(Pleurotus)，鱗伞属(Pholiota)，红燕属(Russula)，球盖燕属(Stropharia)，粉红孢子伞菌类(Entoloma)，环柄燕科(Lepiotaceae)，伏革菌属(Corticium)，薄膜革菌属(Pellicularia)，口蘑属(Tricholoma)，台蕈属(Volvaria)，杯伞属(Clitocybe)，火燕属(Flammulina)，酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，曲霉菌属(Eurotium)，曲霉属(Aspergillus)，梭孢壳属(Thielavia)，盘菌属(Peziza)，普拉塔暗盘菌属(Plectania)，羊肚菌属(Morchella)，丛耳菌属(Wynnea)，马鞍菌属(Helvella)，鹿花菌属(Gyromitra)，鬼笔目(Phallales)，狄克提欧菌属(Dictyophera)，蛇头菌属(Mutinus)，笼头菌属(Clathrus)，三叉鬼笔属(Pseudocolus)，马勃菌属(Lycoperdon，马勃属(Calvatia)，地星属(Geastrum)，根灰包菌属(Radiigera)，阿斯特斯菌属(Astreus)，鸟巢菌属(Ni dularia)，伽氏灰燕属(Gastrocybe)，地红燕属(Macowanites)，腹牛肝菌属(Gastroboletus)，地花菌属(Albatrellus)，新香郝属(Neolentinus)，黑孔菌属(Nigroporus)，褐腐干酪属(Oligoporus)，多孔菌属(Polyporus)，牛排菌属(Fistulina)，层孔菌属(Fomes)，牛肝菌属(Boletus)，褐小牛肝菌属(Fuscoboletinus)，抚柄牛肝菌属(Leccinum)，糟孔牛肝菌属(Phylloporus)，乳牛肝菌属(Suillus)，松塔牛肝菌属(Strobilomyces)，牛肝菌(Boletellus)，银耳属(Tremella)，木耳属(Auricularia)，花耳属(Dacrymyces)，栅镑菌属(Melampsora)，柱镑菌属(Cronartium)，柄锈属(Puccinia)，胶锈菌属(Gymnosporangium)，腥黑粉菌属(Tilletia)，条黑粉菌属(Urocystis)，隔担菌属(Septobasidium)，湿伞属(Hygrocybe)，錯伞属(Hygrophorus)，湿菌髓(Hygrotrama)，新錯伞属(Neohygrophorus)，丝膜菌属(Cortinarius)，裸伞属(Gymnopilus)，发癣菌属(Trichophyton)，小孢霉属(Microsporum)，串珠霉属(Monilia)，念珠菌属(Candida)，小尾抱属(Cercosporella)，青霉菌属(Penicillium)，芽生菌属(Blastomyces)，尾孢属(Cercospora)，绿核菌属(Ustilaginoidea)，瘤座孢属(Tubercularia)，德抱菌属(Fusarium)，丝核菌(Rhizoctinia)，束丝菌属(Ozonium)，菌核属(Sclerotium)，地舌菌(Geoglossum)，或松蕈属(Armillaria);类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)，气微菌属(Aeromicrobium);弗莱德门菌属(Friedmanniella)，扑科研菌属(Kribbella)，大理石雕菌属(Marmoricola);微白霜菌属(Micropruina)，类诺卡氏菌属(Nocardioides)，脂肪肝菌属(Pimelobacter)，丙酸胞菌属(Propionicicella)，丙酸单胞菌属(Propionicimonas)，热孔菌属(Thermasporomyces)，布鲁克劳尼亚菌属 Brooklawnia，黄络球菌属(Luteococcus)，丙酸杆菌属(Propionibacterium)，微丙酸菌属(Propionimicrobium)，乳杆菌属(Lactobacillus)，夏普氏菌属(Sharpea)，两性囊霉属(Ambispora)，无梗囊霉菌属(Acaulospora)，恩氏孔菌属(Enthrophospora)，残孔菌(Abortiporus)，阿米露孔菌属(Amylocystis)，薄孔菌属(Antrodia)，似薄孔菌属(Antrodiella)，深黄孔菌属(Aurantiporus)，黄孔菌属(Auriporia)，牛舌草孔菌属Buglossoporus，錯孔菌属(Ceriporia)，拟錯菌属(Ceriporiopsis)，齿毛菌属(Cerrena)，克里欧孔菌属(Criolopsis),隐孔菌属(Cryptoporus),迷孔菌属(Daedalea),拟迷孔菌属(Daedaleopsis),丹特罗亚菌属(Dantronia), 二丝孔菌属(Diplomitoporus),董氏孔菌(Donkioporia)，拟孔菌属(Fomitopsis)，彩孔菌属(Hapalopilus)，硫色绚孔菌属(Laetiporus)，拉氏孔菌 Laeptoporus,大孔菌属(Megasporoporia),灰黑孔菌(Melanoporia),亚灰树花菌属(Meripilus),黑孔菌属(Nigroporus),少孔菌属(Oligoporus),欧式孔菌属(Ossicaulis),锐孔菌属(Oxyporus),帕氏孔菌属(Parmastomyces)，皮拉孔菌属(Pilatoporus)，剥管菌属(Piptoporus)，卧孔菌属(Poria),波斯特孔菌属(Postia),硬孔菌属(Rigidoporus),苔芝属(Taiwanofungus),红木色孔菌属(Tinctoporellus)，栓菌属(Trametes)，干酪菌属(Tyromyces),获茶菌属(Wolf iporia),古老球菌属(Palaeococcus),火球菌属(Pyrococcus),高温球菌属(Thermococcus)，丝衣霉属(Byssochlamys)，毛萨托菌属(Chaetosartorya)，克劳姆菌属(Chromocleista),双叉菌属(Dichotomomyces),埃德菌属(Edyuillia),翅抱霉属(Emericella)，艾里斯菌属(Erythrogymnotheca)，正青霉属(Eupenicillium)，散囊菌属(Eurotium),芬尼菌属(Fennellia),钩囊菌属(Hamigera),半内果菌属(Hemicarpenteles),新石座菌属(Neopetromyces),新萨托菌属(Neosartorya),拟青霉属(Penicilliopsis),石座菌属(Petromyces),西格菌属(Segenoma),裸节菌属(Talaromyces),嗜热子囊菌属(Thermoascus),特里希菌属(Thrichocoma),沃卡菌属(Warcupiella),曲菌属(Aspergillus),梅 _ 霉属(Merimbla),拟青霉(Paecilomyces),菲亚罗霉属Phialosimplex,赛捷罗霉属(Sagenomella),隔梭孢属(Septofusidium),缀霉属(Thysanophora),抚青霉(Geosmithia),乳酸杆菌科,丙酸杆菌科,放线菌目，马拉色菌属(Malasezzia),和微藻和其它类似种类。还应理解的是,原核生物、藻类细胞、植物细胞、动物细胞或昆虫细胞也可与一种或一种以上上述微生物共同发酵。上述微生物/生物(mirobe/organism)酵母属,裂殖酵母属，丙酸胞菌属，丙酸单胞菌属,热孔菌属，丙酸杆菌科，微丙酸菌属，乳酸杆菌科，彩孔菌属(Hapalopilus),革菌科(Coriolaceae),半知发菌科(Mitosporic Trichocomaceae),马拉色菌科(Malasseziaceae),乳酸杆菌科,丙酸杆菌科，放线菌目(Actinomycetales)和微藻尤其优选。
[0047]在一种实施方式中，使用属于乳酸杆菌科和丙酸杆菌科的微生物培养物制备双重发酵提取物。分别使乳酸杆菌和丙酸杆菌生长的方法是本领域技术人员已知的。典型地，属于乳酸杆菌门和丙酸杆菌门的细菌为喜欢在没有氧的条件下生长的专性厌氧菌或微嗜气的细菌。一些种类可忍受存在少量氧的条件。
[0048]为了制备双重发酵提取物，使第一微生物(例如丙酸杆菌属)在生长培养基中生长至对数生长后期。优选地，使第一微生物生长直至600nm下的光密度至少为6。在一种实施方式中，在25°C至30°C下使第一微生物生长约16小时至约18小时。在无菌的转移罐中收集得到的改良的营养培养基。可进一步纯化改良的营养培养基以除去第一微生物。可选地，可在添加诸如乳酸杆菌之类的第二微生物的过程中，使第一微生物保留在改良的培养基中。通过光密度和活菌数(600nm下光密度至少为6 ;或者活菌数为109菌落形成单位/ml)的改变监测第二微生物的生长。
[0049]在另一实施方式中，使用属于微藻科吾肯氏壶菌属(Ulkenia sp.)和乳杆菌科的培养物制备双重发酵提取物。使吾肯氏壶菌和乳杆菌分别生长的方法是本领域技术人员已知的。 典型地，属于吾肯氏壶菌和乳杆菌门的细菌为专性厌氧菌或微嗜气的细菌，并且这种细菌喜欢在含有无机盐的富营养培养基中生长。
[0050]为了制备双重发酵提取物，使第一微生物(例如微藻)在生长培养基中生长至对数生长后期。在一种实施方式中，在20°C至24°C下使第一微生物生长持续约96小时至约388小时。在无菌转移罐中收集得到的改良的营养培养基。可进一步纯化改良的营养培养基以除去第一微生物。可选地，可在添加诸如乳酸杆菌之类的第二微生物的过程中，使第一微生物保留在改良的培养基中。通过光密度和活菌数^OOnm下光密度至少为6 ;或者活菌数为IO9菌落形成单位/ml)的改变监测第二微生物的生长。
[0051]可使用本领域技术人员已知的技术封装双重发酵提取物，所述技术包括，但不限于，形成脂质体或其它脂质封装物、对双重发酵提取物进行喷雾干燥、将双重发酵提取物封装在聚合物胶囊中、将双重发酵提取物吸收或吸附在惰性基质上等。
[0052]所述双重发酵提取物可用于局部用组合物。所述局部用组合物可通过次级代谢产物的表达向皮肤细胞提供保护，所述次级代谢产物在单一微生物的发酵过程中不表达。通过施用含有双重发酵提取物的局部用组合物，其可提供抗老化、皮肤增白、皮肤细胞更新、皮肤细胞保护、皮肤屏障保护、皮肤保湿以及其它疗效的益处。
[0053]本发明的局部用组合物可含有基于所述局部用组合物的重量的约0.01wt%至高达约10wt%的发酵提取物。一般而言，所述局部用组合物可含有基于所述局部用组合物的重量的约0.1wt%至5wt%，典型地，约0.5wt%至约2￥丨％的发酵提取物。
[0054]除了发酵提取物，所述局部用组合物可优选含有防腐剂。可将防腐剂加至所述发酵提取物或局部用组合物中以保持发酵提取物的环境并保护发酵提取物不被不期望的空气传播的微生物污染。如本文使用的“防腐剂”是指使发酵提取物无菌或对不期望的微生物保持生物稳定的成分。防腐剂包括酸、醇、乙二醇、对羟基苯甲酸酯、含四氮的化合物、异噻唑啉酮、释放甲醛的化合物和卤代化合物以及酶。示例性的醇包括苯氧乙醇、异丙醇和苄醇；示例性的乙二醇包括丙二醇、丁二醇和戊二醇；示例性的对羟基苯甲酸酯(paraben或parahydroxybenzioc acid)包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯；示例性的含四氮化合物包括苯扎氯铵、季铵盐(Quaternium) 15 ;示例性的异噻唑类包括甲基异噻唑啉、甲基氯代异噻唑啉；示例性的醛释放剂包括DMDM乙内酰脲、咪唑烷基脲和双咪唑烷基脲；示例性的抗氧化剂包括丁羟甲苯、生育酚，示例性的卤代化合物包括三氯生和氯己定二葡糖酸盐。示例性的酶包括葡萄糖氧化酶和乳过氧化酶。可用于本发明的目的的防腐剂的实例可在 Steinberg, D.“Frequency of Use of Preservatives2007”.Cosmet.Toilet.117,41 - 44 (2002)和“Preservative Encyclopedia”Cosmet.Toilet.117，80 - 96 (2002)中找到。此外，诸如“Cosmetic and Drug Microbiology”, OrthDS ed., Francis&Taylor, Boca Raton, Fla.(2006)中的 Ciccognani D.的文章 CosmeticPreservation Using Enzymes中描述的那些防腐剂之类的酶防腐体系也可有效用于局部用组合物中。
[0055]一般而言，优选地，防腐剂的量至少为局部用组合物的总重量的约0.01wt%，至少为约0.lwt%，高达约10wt%。典型地，使用所需防腐剂的最小量，典型地，所述防腐剂以少于局部用组合物的重量的约5wt%存在，更典型地，所述防腐剂以基于局部用组合物的重量的约0.^^%至约2.0wt%的范围存在。[0056]局部用组合物还可含有皮肤病学上可接受的载体。如本文使用的短语“皮肤病学上可接受的载体”是指所述载体适于局部施用于具有良好的美学特性的皮肤、毛发、指甲等，与发酵提取物和任何其它成分相容，并且不会引起任何不期望的安全性问题或毒性问题。皮肤病学上可接受的载体也是一般美容和/或药学上可接受的。
[0057]所述皮肤病学上可接受的载体或“载体”可为多种不同形式的载体。例如，乳剂载体，包括，但不限于，水包油、油包水、水包油包水和硅树脂包水包油乳剂在本文中是有用的。这些乳剂可包括较大的粘性范围，所述粘性范围例如约IOOcps至约200000cps。这些乳剂也可使用机械泵容器或使用常规推进剂的加压气溶胶容器以喷雾形式递送。这些载体还可以奶油冻(mousse)的形式递送。其它合适的局部用载体包括无水液体溶剂，例如油、醇和硅树脂(例如矿物油、乙醇、异丙醇、二甲聚硅氧烷、环甲硅油等)；基于水性的单相液体溶剂(例如含氢的醇溶剂体系)；这些无水和基于水性的单相液体溶剂的增稠形式(例如，其中通过添加适当的胶、树脂、蜡、聚合物、盐等增大溶剂的粘性以形成固体或半固体)。可用于本发明的局部用载体体系的实例在以下四篇文献中描述:"Sun ProductsFormulary^Cosmetics&ToiIetries,第 105 卷，第 122 - 139 页(1990 年 12 月)；"SunProducts Formulary", Cosmetics&Toiletries,第 102 卷，第 117 - 136 页(1987 年 3 月)；美国专利第4，960，764号；和美国专利第4，254，105号。
[0058]所述载体可含有局部用组合物的重量的约50wt%至约99wt%，一般而言，所述载体的量为基于所述局部用组合物的总重量的约75wt%至约99wt%。典型地，所述载体占所述组合物的总重量的约85wt%至约95wt%。
[0059]示例性的载体包括含氢的醇体系和水包油乳剂。当所述载体为含氢的醇体系时，所述载体可含有约0%至约99%的乙醇、异丙醇或者其混合物，以及约1%至约99%的水。更优选的是含有约5%至约60%的乙醇、异丙醇或其混合物，以及约40%至约95%的水的载体。尤其优选的是含有约20%至约50%的乙醇、异丙醇或者其混合物，以及约50%至约80%的水的载体。当所述载体为水包油乳剂时，所述载体可包括用于制备这些乳剂的常规赋形剂成分中的任何一种。对合适载体的更加详细的讨论可在美国专利第5，605，894号和美国专利第5，681，852号中找到。
[0060]任选地，局部用组合物可含有其它功能性成分，例如，水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、软化剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、湿润剂、保湿剂、稳定剂、稀释剂、溶剂和芳香剂。此外，个人护理组合物还可含有活性成分，例如植物萃取物、营养素、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、留族激素、去屑止痒剂、抗痘成分、遮光剂、防腐剂等。
[0061]含有所述发酵提取物的局部用组合物可用于各种不同类型的美容制剂，包括，但不限于乳液、软膏、霜齐?、喷雾、针齐?、水性凝胶或水-醇混合物凝胶、奶油冻、贴齐?、护具、罩、湿润的面膜、擦拭巾、固体棒、清洁棒、唇膏、气溶胶霜剂、无水粉末、滑石、补剂、油、乳剂和浴盐。这些美容制剂可通过局部施加在皮肤上使用。
[0062]根据本发明的另一实施方式，本发明还提供组合物的浓缩物，所述组合物的浓缩物含有(a)发酵提取物；(b)足以对成分(a)起灭菌作用或生物静态作用的防腐剂，其中，成分(a)的量为所述组 合物的重量的约90%至约99.9%，成分(b)的量为所述组合物的重量的约0.1%至10%。一般而言，所述发酵提取物为所述组合物的重量的约98%至约99.5%，成分(b)的量为所述组合物的重量的0.5%至2%。诸如溶剂或载体之类的其它额外的成分也可存在于所述浓缩物中。
[0063]下列实施例意于举例说明本发明的范围，对本发明的范围不构成任何限制。除非另有明确说明，所有部分和百分数为重量部分和重量百分数，所有温度的单位为摄氏度。
[0064]实施例
[0065]实施例1
[0066]微生物和培养基
[0067]从乳清粉提取物中分离细菌细胞培养物。为了实现本发明的目的，特别优选属于乳杆菌科和丙酸杆菌科的微生物培养物。严格根据生长速率选择第一微生物(乳杆菌科vs.丙酸杆菌科)。丙酸杆菌科由于其具有更快的生长速率而被选择，因为理想情况是代谢并富集培养基中的大多数初级成分。为了实现本发明的目的，使两种微生物在缺氧条件下生长或在微嗜气的条件下(没有氧气或有限的氧气)生长。将原种培养物保持在含有胰蛋白胨、酵母 提取物、过滤的乳清提取物(PH7.0)和琼脂(Sigma，St.Louis, MO)的培养基中。使母种培养物在含有培养基的震荡烧瓶中生长，所述培养基包含酵母提取物10%、大豆胰蛋白胨肉汤5%、磷酸二氢钾2.5%、磷酸氢二钾1.5%、乳糖10%、丙三醇5% (SigmaSt.Louis, MO)。除了上述培养基成分，向生长培养基中添加诸如氨基酸、微生物混合物和矿物质之类的补充生长因子(Sigma，St.Louis, MO)。在整个过程中使用阻沫剂σ -乳剂B (Sigma, St.Louis, MO)。
[0068]生物反应器
[0069]在通过震荡烧瓶试验优化处理之后，将工艺按比例增加至2L和15L发酵阶段(2L:新泽西州爱迪生的New Brunswick Scientific和15L:加州福斯特城的ApplikonBiotechnology) 0使两种微生物在缺氧条件下生长，通过溶氧检测器监测氧浓度。将氮气喷入生物反应器中以控制氧的浓度并用于次级代谢产物表达。通过可灭菌的DO探针时刻监测缺氧条件，并通过在发酵罐中以最低限度搅拌保持缺氧环境，所述搅拌的最大速度为100至150rpm。氮速率设为0.01至0.5VVM (体积空气/容器体积/每分钟)。为了制备本发明的双重发酵提取物，使谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)细胞培养物在25°C至30°C下生长；最优选地，在27°C下生长。为了实现本发明的目的，使两种微生物同时在发酵罐中生长(第二微生物植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在存在第一微生物的条件下生长)。在发酵过程中，当营养培养基有限时，在特定时间点(接种第一微生物后16至18小时；600nm下光密度> 5)接种植物乳杆菌；由此引起封闭环境中对营养物质的竞争。在营养受限阶段引入第二微生物植物乳杆菌导致在两种微生物之间产生竞争性的、‘生存型’反应，尤其当生长在诸如生物反应器之类的封闭体系中时。连续监测培养基中的生长和营养消耗(通过在线监测、光密度检测)。在引入第二微生物之前，由营养限制和第一微生物对氧的消耗引起压力。
[0070]通过从双重微生物的胞外分泌物中分离生物质和提取活性成分获得最终双重发酵提取物。可通过过滤进一步纯化所述双重发酵提取物。可通过本领域技术人员已知的选择性分子量膜过滤方法进一步浓缩该双重发酵提取物。水性培养基中双重发酵提取物的最终浓缩物至少为0.01%。更优选地，双重发酵提取物的浓度至少为0.1 %。使用浓度为0.5至1.1 %的苯氧乙醇作为防腐剂(密苏里州圣路易斯的Sigma)。
[0071]两种单一微生物对照(乳杆菌科与丙酸杆菌科)在与上述相同的条件下生长。微生物对照样品的区别参数为没有第二微生物且没有诱导次级代谢产物。使用上述选择性分子量膜过滤技术纯化单一微生物的提取物。
[0072]实施例2:通过GC/MS进行代谢物分析
[0073]在实施例1中的双重发酵结束之后进行GC-MS以分析不同代谢物的表达。三种样品如下分析:
[0074]发酵对照1-乳杆菌科
[0075]发酵对照2-丙酸杆菌科
[0076]双重发酵提取物
[0077]对水性样品(1、2和3)进行特定的酸提取；其中，分离酸部分，用重氮甲烷试剂进行甲基化，对有机酸的相应甲酯进行GC-MS分析。将测试样品直接注入GC中，通过挥发性成分顶部空间分析(顶部空间GC-MS)还对低分子量酸进行分析。图1和图2为对照样品微生物I和微生物2的GC-MS分析。图3表示双重发酵提取物的GC-MS分析，说明两种微生物的竞争诱导新代谢物的表达，否则所述新代谢物不表达(如果微生物单独生长)。
[0078]实施例3人皮肤细胞微阵列分析
[0079]使用人基因组微阵列(Agilent Technologies)检测如实施例1所述制备的双重发酵产物对两种皮肤细胞系(纤维母细胞和角质细胞)的影响。用来自实施例1的1%的双重发酵物处理细胞24小时。离心得到的处理过的皮肤细胞，用RNA Later(Ambion)重悬含有细胞核物质的小粒并在4°C下保存。使用RiboPure RNA提取试剂盒(Ambion)提取来自人细胞的总RNA，随后使用Message AMP aRNA试剂盒(Ambion)扩增mRNA。对于该阵列，使用MicroMax阵列标记试剂盒(Perkin Elmer)用Cy_3或Cy_5对aRNA的样品进行突光标记。然后将标记的aRNA施加至表皮纤维母细胞和角质细胞的皮肤细胞DNA微阵列芯片并杂交过夜(Agilent Technologies)。第二天,洗漆芯片并用Axon4100A DNA微阵列扫描
仪扫描，使用Axon Genepix-Pro?软件分析。用于基因微阵列分析的方法可在美国专利申请公开第US2006/0110815号中找到。
[0080]从获自人体表皮角质细胞和人体皮肤纤维母细胞基因微阵列的感兴趣的基因中筛选与重要的特定皮肤功能有关的基因。对与多种不同的皮肤新陈代谢功能有关的几个基因的上调(与中等水平的比率> 1.3)或下调(与中等水平的比率< 0.7)进行分析。为了进行基因微阵列分析，术语“上调”是指RNA过表达的基因。术语“下调”是指RNA低表达。结果在表1中报道。
[0081]
【权利要求】
1.一种局部用组合物，所述组合物含有从至少两种微生物的同时发酵或顺序发酵中取出的发酵提取物。
2.根据权利要求1所述的局部用组合物，其中，所述发酵提取物含有第二微生物的代谢物，所述第二微生物的代谢物在存在第一微生物的代谢物的条件下生长。
3.根据权利要求2所述的局部用组合物，其中，所述第二微生物的代谢物与所述第一微生物的代谢物同时生长。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的局部用组合物，所述组合物还含有数量足以对所述发酵提取物起灭菌作用或生物静态作用的防腐剂和皮肤病学上可接受的载体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，每一微生物选自:脉孢菌属，长_壳属，麦角菌属，炭角菌属，座坚壳属，柔膜菌属，核盘霉属，柄灰包属，须腹菌属，耳柱干真菌类，毛霉菌，根霉属菌，虫霉属，网柱菌属，芽枝莓属，壶菌属，水霉属，霜霉属，白锈菌属，腐霉属，喇叭菌属，皮特瑞菌属，疫霉属，根肿菌属，块菌属，齿菌属，茶溃属，染料衣属，鸡皮衣属，松萝属，扁枝衣属，树花属，树发属，石蕊属，梅衣属，冰岛衣属，伞菌属，鸡油菌属，类脐菇属，鬼伞属，乳菇属，皮伞属，侧耳属，鳞伞属，红菇属，球盖菇属，粉红孢子伞菌类，环柄菇科，伏革菌属，薄膜革菌属，口蘑属，台蕈属，杯伞属，火菇属，酵母属，裂殖酵母属，曲霉菌属，曲霉属，梭孢壳属，盘菌属，普拉塔暗盘菌，羊肚菌属，丛耳菌属，马鞍菌属，鹿花菌属，鬼笔目，狄克提欧菌属，蛇头菌属，笼头菌属，三叉鬼笔属，马勃菌属，马勃属，地星属，根灰包菌属，阿斯特斯菌属，鸟巢菌属，伽氏灰菇属，地红菇属，腹牛肝菌属，地花菌属，新香菰属，黑孔菌属，褐腐干酪属，多孔菌属，牛排菌属，层孔菌属，牛肝菌属，褐小牛肝菌属，疣柄牛肝菌属， 褶孔牛肝菌属，乳牛肝菌属，松塔牛肝菌属，牛肝菌，银耳属，木耳属，花耳属，栅锈菌属，柱锈菌属，柄锈属，胶锈菌属，腥黑粉菌属，条黑粉菌属，隔担菌属，湿伞属，蜡伞属，湿菌髓，新蜡伞属，丝膜菌属，裸伞属，发癣菌属，小孢霉属，串珠霉属，念珠菌属，小尾孢属，青霉菌属，芽生菌属，尾孢属，绿核菌属，瘤座孢属，镰孢菌属，丝核菌，束丝菌属，菌核属，地舌菌，或松蕈属；类诺卡氏菌科，气微菌属；弗莱德门菌属，扑科研菌属，大理石雕菌属；微白霜菌属，类诺卡氏菌属，脂肪肝菌属，丙酸胞菌属，丙酸单胞菌属，热孔菌属，布鲁克劳尼亚菌属，黄络球菌属，丙酸杆菌属，微丙酸菌属，乳杆菌属，夏普氏菌属，两性囊霉属，无梗囊霉菌属，恩氏孔菌属，残孔菌属，阿米露孔菌属，薄孔菌属，似薄孔菌属，深黄孔菌属，黄孔菌属，牛舌草孔菌属，蜡孔菌属，拟蜡菌属，齿毛菌属，克里欧孔菌属，隐孔菌属，迷孔菌属，拟迷孔菌属，丹特罗亚菌属，二丝孔菌，董氏孔菌，拟孔菌属，彩孔菌属，硫色绚孔菌属，拉氏孔菌，大孔菌属，灰黑孔菌，亚灰树花菌属，黑孔菌属，少孔菌属，欧式孔菌属，锐孔菌属，帕氏孔菌属，皮拉孔菌属，剥管菌属，卧孔菌属，波斯特孔菌属，硬孔菌属，苔芝属，红木色孔菌属，栓菌属，干酪菌属，茯苓菌，古老球菌属，火球菌属，高温球菌属，丝衣霉属，毛萨托菌属，克劳姆菌属，双叉菌属，埃德菌属，翘孢霉属，艾里斯菌属，正青霉属，散囊菌属，芬尼菌属，钩囊菌属，半内果菌属，新石座菌属，新萨托菌属，拟青霉属，石座菌属，西格菌属，裸节菌属，嗜热子囊菌属，特里希菌属，沃卡菌属，曲菌属，梅丽霉属，拟青霉，菲亚罗霉属，赛捷罗霉属，隔梭孢属，缨霉属，疣青霉，乳酸杆菌科，丙酸杆菌科，放线菌目，马拉色菌属和微藻。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，每一微生物选自:酵母属，裂殖酵母属，丙酸胞菌属，丙酸单胞菌属，热孔菌属，丙酸杆菌科，微丙酸菌属，乳酸杆菌科，彩孔菌属，革菌科，半知发菌科，马拉色菌科，乳酸杆菌科，丙酸杆菌科，放线菌目和微藻。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的组合物，其中，所述第一微生物为谢氏丙酸杆菌，所述第二微生物为植物乳杆菌。
8.根据权利要求2至6中任一项所述的组合物，其中，所述第一微生物为微藻，第二微生物为植物乳杆菌。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，所述组合物还含有防腐剂，所述防腐剂选自:水杨酸、山梨酸、苯氧乙醇、苄醇、乙醇、季铵盐-15、与底物组合的葡糖氧化酶和乳过氧化物酶、及上述物质的组合。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述防腐剂含有苯氧乙醇。
11.根据权利要求9或10所述的组合物，其中，所述防腐剂的量为基于所述组合物的总重量的至少0.1wt%。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，所述组合物还含有至少一种选自以下的成分:水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、软化剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色齐?、湿润剂、保湿剂、稳定剂、稀释剂、溶剂、芳香剂、植物萃取物、营养素、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、留族激素、去屑止痒剂、抗痘成分、遮光剂、防腐剂及其组合。
13.根据权 利要求4所述的组合物，其中，所述组合物含有0.lwt%至10wt%的所述发酵提取物、0.1￥1:%至10wt%的所述防腐剂以及5(^1:%至95wt%的所述皮肤病学上可接受的载体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，所述组合物含有按重量计90.0%至99.9%的所述发酵提取物和按重量计0.1%至10.0%的所述防腐剂。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中，所述发酵提取物含有在存在植物乳杆菌的代谢物的条件下同时生长的谢氏丙酸杆菌的代谢物。
16.根据权利要求14所述的组合物，其中，成分(a)含有在存在植物乳杆菌的代谢物的条件下同时生长的微藻的代谢物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中，所述发酵提取物通过含有以下步骤的方法制备: (i)使用通过化学方法定义的第一营养培养基使第一微生物生长至对数生长后期，以制备含有所述第一微生物和由所述第一微生物表达的次级代谢物的第二营养培养基； (?)使所述第二营养培养基与第二微生物接触； (iii)在第二营养培养基中使所述第一微生物和所述第二微生物同时发酵以制备含有水溶性部分和水不溶性部分的发酵混合物；以及 (iv)从所述发酵混合物中分离所述水不溶性部分，由此隔离所述水溶性部分并制备出所述双重发酵提取物。
18.一种制备来自同时发酵的发酵提取物的方法，所述方法包括: (i)使用通过化学方法定义的第一营养培养基使第一微生物生长至对数生长后期，以制备含有所述第一微生物和由所述第一微生物表达的次级代谢物的第二营养培养基； (?)使所述第二营养培养基与第二微生物接触； (iii)在第二营养培养基中使所述第一微生物和所述第二微生物同时发酵以制备含有水溶性部分和水不溶性部分的发酵混合物；以及(iv)从所述发酵混合物中分离所述水不溶性部分，由此隔离所述水溶性部分并制备出所述双重发酵提取物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第一微生物为谢氏丙酸杆菌，所述第二微生物为植物乳杆菌。
20.根据权利要求18 所述的方法，其中，所述第一微生物为微藻吾肯氏壶菌，所述第二微生物为植物乳杆菌。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中，所述第一微生物与所述第二微生物在有氧条件下、无氧条件下或者组合条件下生长。
22.—种刺激皮肤细胞中的透明质酸和⑶44生成的方法，所述方法包括使使用者的皮肤与根据权利要求1至17中任一项所述的局部用组合物接触。
23.一种刺激皮肤细胞中的透明质酸和半胱天冬酶-14生成的方法，所述方法包括使使用者的皮肤与根据权利要求1至17中任一项所述的局部用组合物接触。
【文档编号】A61K36/02GK103957997SQ201280052827
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年10月25日 优先权日:2011年10月25日
【发明者】詹姆斯·文森特·格鲁伯, 史密瑟·拉奥 申请人:奥麒个人护理产品公司