专利名称：一种低分子量pei衍生物及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种低分子量PEI衍生物及其制备方法和应用，特别涉及一种可降解含亚胺键的低分子量PEI衍生物、其制备方法和其在核酸药物(DNA和RNA)输送中的应用。
背景技术：
基因治疗，是将外源性基因物质(DNA或RNA)导入细胞，促进或者抑制特定蛋白的表达，或者取代、修复有问题的基因，从而达到疾病治疗的目的。基因治疗在其发展过程中遇到了一系列技术瓶颈，其中最重要的瓶颈之一是基因物质安全有效的体内输送。目前常用的基因 输送载体可以分为病毒载体及非病毒载体。其中，病毒载体虽然具有较高的转染效率，但由于病毒的变异会引起潜在的致病危险，并且病毒表面成分会引起人体免疫反应，同时病毒载体的制备和纯化困难且担载基因量小；而非病毒载体具有基因担载密度和担载量大、制备简单，便于化学修饰等优势。因此，非病毒基因载体被认为是更理想的基因物质输送载体。但是非病毒载体也存在着化学毒性大的缺点，例如聚乙烯亚胺(PEI)是目前研究最为广泛的非病毒载体，其中分支状分子量为25kDa的PEI转染效率最高，但是PEI25kDa同时因其烷基骨架无法降解而导致其细胞累计毒性较大。多数的国内外专家将其研究集中在可降解的PEI衍生物方面。犹他大学的Sung Wan Kim等人在《缓控释杂志》(Journal of ControlledRelease2005，103:209-219)上发表“Polyethylenimine with acid-labile linkages asa biodegradable gene carrier (用酸降解连接剂聚PEI作为基因载体)”的文章,该文章采用戊二醛作为连接剂与低分子量PEI (1800Da)交联，生成特征性的含有亚胺键连接的可降解聚乙烯亚胺类，其结构特点是:与基因形成的复合物被细胞摄取后，凝聚基因在细胞内的内吞体和溶酶体的酸性条件下，与低分子量PEI直接相连的亚胺键断开，生成无细胞毒性的低分量PEI，但是含亚胺键的聚合结构不能保证这一载体携带核酸进入细胞之前足够稳定，另外，与PEI 25 KDa对照，其转染活性也一般。Jin 等人申请一项题为 “Polycationic gene carriers formed of endogenousamino group-bearing monomers (内源性氨基基团的单体形成聚阳离子基因载体)”的PCT专利(W02009/100645A1)，该专利中采用人体内源性专职凝聚基因的小分子单体精胺分别与1，4_ 丁二醇二氯甲酸酯、1，4_ 丁二酰氯和乙二醛等三个连接剂缩合得到分别含有氨酯键、酰胺键和亚胺键等聚精胺阳离子，这些聚精胺阳离子均表现出良好的核酸输送能力，而且，聚合物通过生物响应性降解能够回归到精胺内源性单体的初始状态，具有良好的生物相容性，但该技术的缺陷在于:含有氨酯键、酰胺键的降解速率比较慢，导致核酸物质无法及时从内涵体里逃逸，影响核酸输送效率；含有亚胺键的降解速率比较快，但是载体的不稳定性致使其输送的核酸物质尚未到达胞质，便从胞外释放出来，转染效率大大降低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的上述不足，提供一种可降解含亚胺键的低分子量PEI衍生物、其制备方法及其在核酸药物(DNA和RNA)输送中的应用。本发明使用低毒而无转染活性的低分子量聚乙烯亚胺与安全性已知的药物代谢产物邻苯二甲醛或间苯二甲醛制备的可降解含亚胺键的低分子量PEI衍生物作为基因载体具有高效、低毒、可降解为起始状态小分子的优点，可以用于基因物质(DNA和RNA)的输送。本发明的技术方案如下:一种可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺(PEI)衍生物，其结构式为:
权利要求
1.一种可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，其结构式为:
2.根据权利要求1所述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物的基本构建单元为低分子量聚乙烯亚胺，所述低分子量聚乙烯亚胺选自重均分子量Mw = 800Da/数均分子量Mn = 600Da或重均分子量Mw = 1300Da/数均分子量Mn = 1200Da或重均分子量Mw = 2000Da/数均分子量Mn = 1800Da或重均分子量Mw低于2000Da的任一低分子量聚乙烯亚胺。
3.—种可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (I)将低分子量聚乙烯亚胺与邻苯二甲醛或间苯二甲醛按摩尔比为1: 1-1: 3.5的比例加到无水乙醇或氯仿溶剂中，得到反应体系； (2)在无水无氧条件下，搅拌、摇动或震荡反应体系，使低分子量聚乙烯亚胺与邻苯二甲醛或间苯二甲醛发生缩合反应，然后进行分离纯化，即得可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物。
4.根据权利要求3所述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，所述低分子量聚乙烯亚胺与邻苯二甲醛或间苯二甲醛的摩尔比优选为1: 2.5。
5.根据权利要求3所述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，所述低分子量聚乙烯亚胺选自重均分子量Mw = SOODa/数均分子量Mn =600Da或重均分子量Mw = 1300Da/数均分子量Mn = 1200Da或重均分子量Mw = 2000Da/数均分子量Mn = 1800Da或重均分子量Mw低于2000Da的任一低分子量聚乙烯亚胺。
6.根据权利要求3所述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，所述分离纯化包括以下步骤:将制备的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物用超纯水溶解后，置于活化后的透析袋中透析，所述透析袋的截留分子量为7k IOk ;透析结束后，用微孔滤膜过滤，所述微孔滤膜的孔径为0.22 0.45 μ m，最后预冻、冻干。
7.根据权利要求6所述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，所述透析的时间为12 48小时。
8.如权利要求1所述的可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物在基因物质输送中的用途。
9.一种基因物质输送复合物，其特征在于，该复合物是按照如下方法步骤制备而得:将权利要求1所述可降解含亚胺键的低分子量聚乙烯亚胺衍生物溶液加入到DNA或RNA核酸溶液中，混合均匀，然后室温下孵育，即得到该基因物质输送复合物。
10.如权利要求9所述的基因物质输送复合物，其特征在于，所述DNA或RNA核酸选自DNA 疫苗、siRNA 或 microRNA。
11.如权利要求9所述的基因物 质输送复合物，其特征在于，所述孵育的时间为20 120分钟。
全文摘要
本发明公开了一种可降解含亚胺键的低分子量PEI衍生物、其制备方法及其在核酸药物输送中的应用。所述的低分子量PEI衍生物结构式为或其中，x为1～20，y为1～20。其制备方法为将低分子量的聚乙烯亚胺与邻苯二甲醛或间苯二甲醛按摩尔比为1∶1-1∶3.5配置为无水乙醇溶液，在无水无氧环境下，室温发生醛基与氨基的缩合反应，得到低分子量PEI衍生物。该衍生物具有较高的转染活性和较低的细胞毒性，在不同的细胞中均有较好的生物活性，是一种高效、低毒的基因输送载体。
文档编号A61K48/00GK103214672SQ20131011600
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月3日 优先权日2013年4月3日
发明者袁伟恩, 吴飞, 苏靖, 徐东, 陈顺, 王一格 申请人:上海交通大学