专利名称：口服施用的短干扰核糖核酸(siRNA)的制作方法
口服施用的短干扰核糖核酸(S i RNA)本申请是发明人于2007年5月2日提交的题为“ 口服施用的短干扰核糖核酸(siRNA) ”的中国专利申请200780016167.5的分案申请。
背景技术：
作为转录后基因沉默(PTGS)而最初发现于植物中的RNA干扰，是由双链RNA(dsRNA)引起的高度保守的机制，并能够下调与dsRNA1同源的基因的转录。该dsRNA首先由Dicer加工成21-23核苷酸的短双链体，其称为短干扰RNA(siRNA)2。合并入RNA诱导的沉默复合体(RISC)后，它们能够通过由Argonaute2(RISC3的组件)在同源区域的中心切割靶mRNA从而介导基因沉默。2001年，Elbashir等人4证实在果蝇以及哺乳细胞中直接引入合成的siRNA将介导RNA干扰基因沉默。从那时起，siRNA介导的基因沉默已成为靶标鉴定和靶标确认研究中强大且广泛使用的分子生物学工具。在动物研究中使用siRNA进行基因沉默已在有限量的动物模型中有所描述。将未修饰的siRNA在眼中局部递送、在中枢神经系统中向鞘内或脑内递送、以及鼻内递送用于抑制呼吸病毒7。未修饰的s iRNA的静脉内波浪传播尾静脉注射(intravenous hydrodynamic tailvein injection)也已有所研究。该方法允许快速递送，主要是向肝脏8。很少研究报道过未修饰siRNA的全身施用。Duxbury等人9经静脉将靶向黏着斑激酶的未修饰siRNA施用于原位肿瘤异种移植小鼠模型，并观察肿瘤生长抑制以及对吉西他滨的化学敏感性。Soutscheck等人报道了全身使用高度化学修饰的siRNA用于内源沉默脱脂载脂蛋白B。以50mg/kg的高剂量腹膜内施用大多数抗ApoB siRNA降低了 ApoB蛋白质水平和脂蛋白浓度。尽管有这些例子，在体内基于全身递送的siRNA使用仍需要改进以便使该技术可广泛应用于靶标确认或治疗应用。实际上，未修饰的siRNA主要是通过血流中丰富的核酸酶来进行酶消化。为了加强siRNA的药物特性，几个小组研究了这些试剂的化学修饰。而所描述的方法之间大相径庭并且仍未进行全身性研究，这些结果的概述允许确定siRNA对化学修饰的耐受性。几种化学修饰例如硫代磷酸酯类11或bOranOp hOSphates12、2’-0-甲基13、2’_0_烯丙基14、2’-甲氧乙基(MOE)和2’ -脱氧氟代核苷酸类(2’ -deoxyfluoronucleotides)15或锁定核酸(LNA)16已有所研究。这些研究突出显示对修饰的耐受性不仅是化学依赖性的，而且是位置依赖性的。本发明提供了具有改进的药物特性的最低程度修饰的siRNA。这些最低程度修饰的siRNA是19bp双链RNA，其在每条链的3’ -末端经修饰以防止3’ -外切核酸酶消化:21-nt siRNA的3’ -双脱氧核苷酸突出端已由通用的3’ -羟丙基磷酸二酯部分所替代，且每条链的3’ -末端前两个碱基配对核苷酸的修饰进一步增强了血清稳定性。经腹膜内或口服施用于成年小鼠后，修饰的siRNA在生长因子诱导的血管发生模型中显示出更高的效力，这与其增加的血清稳定性相关。发明概述在一方面，本发明提供了用于口服施用的短干扰核糖核酸(siRNA)，所述siRNA包含两条单独的RNA链，它们在至少15个核苷酸上是互补的，其中每条链有49个核苷酸或更少，并且其中至少一条链含有至少一个化学修饰。
在一项实施方案中，siRNA包含至少一个修饰的核苷酸。在另一实施方案中，siRNA包含至少一个3’末端帽。在另一实施方案中，所述修饰的核酸选自2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸、锁定核酸核糖核苷酸(LNA)、2’ -氟代核糖核苷酸、吗啉代核苷酸。在另一实施方案中，所述修饰的核苷酸选自具有修饰的核苷间键合的核苷酸，所述核苷间键合选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、硼烷膦酸酯(boranophosphonoate)和酸胺键合。在另一实施方案中，所述两条RNA链彼此间是完全互补的。在另一实施方案中，所述siRNA在5’末端或3’末端中至少一端上包含I至6个核苷酸突出端。在另一是实施方案中，siRNA含有至少一个3’帽，其为经3’碳连接至3’末端的化学部分，且为选自式I的化合物:
权利要求
1.短干扰核糖核酸siRNA，所述SiRNA包含两条单独的RNA链，它们在至少15个核苷酸上是互补的，其中每条链有49个核苷酸或更少的核苷酸，并且其中至少一条链含有至少一个化学修饰，其中所述修饰在至少一条链的3’ -末端且包含3’末端帽，所述3’末端帽为经3’碳连接至3’末端的化学部分，其中所述部分选自以下:
2.根据权利要求1的siRNA，其中所述修饰是:
3.根据权利要求1的siRNA，其中所述修饰是:
4.根据权利要求1的siRNA，其中所述修饰是:
5.根据权利要求1的SiRNA，其中所述修饰是:
6.根据权利要求1的SiRNA，其中所述修饰是:
7.根据权利要求1的siRNA，其中所述修饰是:
8.根据权利要求1的siRNA，其中所述修饰是:
9.根据权利要求1的SiRNA，其中所述修饰是:
10.根据权利要求1-9中任一项的SiRNA，其中所述SiRNA每条链的3’-末端前两个碱基配对核苷酸是修饰的。
11.根据权利要求1-9中任一项的siRNA，其中所述SiRNA每条链的3，-末端前两个碱基配对核苷酸是修饰的，其中每个修饰的核苷酸选自具有修饰的核苷酸间键合的核苷酸，所述修饰的核苷酸间键合选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、硼烷膦酸酯和酰胺键合。
12.根据权利要求1-9中任一项的siRNA，其中所述siRNA每条链的3’-末端前两个碱基配对核苷酸是2’ -甲氧基乙基核糖核苷酸残基。
13.根据权利要求1-9中任一项的siRNA，其中所述siRNA每条链的总长度是19个核苷酸。
14.根据权利要求1-9中任一项的siRNA，其中所述siRNA每条链的总长度是19个核苷酸且其中所述siRNA是平端的。
15.根据权利要求1-9中任一项的siRNA，其中至少一个其他的核苷酸是修饰的。
16.根据权利要求1的siRNA，其在5’末端或3’末端中至少一端上包含I至6个核苷Ife关出立而。
17.根据权利要求1的siRNA，其中所述siRNA的一个末端是平端的。
18.根据权利要求1的siRNA，其中所述siRNA的两个末端是平端的。
19.根据权利要求1-9中任一项的siRNA，其具有在标准胃酸试验中高于具有相同核苷酸序列的未修饰siRNA的稳定性。
20.根据权利要求1-9中任一项的siRNA，其具有在标准胃酸试验中暴露30分钟后大于或等于50%的稳定性。
21.根据权利要求1-9中任一项的siRNA，其具有在标准血清试验中高于具有相同核苷酸序列的未修饰siRNA的稳定性。
22.根据权利要求1-9中任一项的siRNA，其具有在标准血清试验中暴露30分钟后大于或等于50%的稳定性。
23.权利要求1-9中任一项的siRNA，其具有在标准肠道灌洗试验中高于具有相同核苷酸序列的未修饰siRNA的稳定性。
24.根据权利要求1-9中任一项的siRNA,其具有与相同核苷酸序列的未修饰siRNA相比提高的口服生物利用率。
25.药物组合物，其包含根据权利要求1-24中任一项的siRNA。
26.根据权利要求1-24中任一项的siRNA，其用作药物。
27.根据权利要求1-24中任一项的siRNA在制备药物中的用途。
28.根据权利要求27的用途，其中siRNA所靶向的基因表达于内皮细胞。
全文摘要
用于口服施用的短干扰核糖核酸(siRNA)，所述siRNA包含两条单独的RNA链，它们在至少15个核苷酸上是互补的，其中每条链有49个核苷酸或更少的核苷酸，并且其中至少一条链含有至少一个化学修饰。
文档编号A61P11/06GK103224934SQ20131014697
公开日2013年7月31日 申请日期2007年5月2日 优先权日2006年5月4日
发明者F·J-C·纳特 申请人:诺瓦提斯公司