新城疫病毒和鸭圆环病毒融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新城疫病毒和鸭圆环病毒融合蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的融合蛋白自氨基端至羧基端依次含有鸭源新城疫病毒的F蛋白和鸭圆环病毒的Cap蛋白；所述鸭源新城疫病毒的F蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1的第1-553位；所述鸭圆环病毒的Cap蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1的第574-829位。本发明首次将鸭圆环病毒Cap基因与鸭源NDV分离株DUNDV的F基因构建融合表达重组真核质粒pcDNA3.1-F-Cap，以此作为DNA疫苗免疫2周龄的SPF雏鸭，结果显示该DNA疫苗可有效促进SPF雏鸭产生NDV抗体和DuCV抗体。本发明为DuCV和鸭源NDV的基因疫苗的研究提供理论和实践依据。
【专利说明】新城疫病毒和鸭圆环病毒融合蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种新城疫病毒和鸭圆环病毒融合蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种由鸭源新城疫病毒F蛋白和鸭圆环病毒Cap蛋白形成的融合蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]鸭源新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起鸭的一类急性、高度接触性和致死性的传染病。早期国内外有关研究表明禽NDV从不感染水禽，强毒感染也不表现明显的临床症状。但近年来发现引起高致病性和死亡性的鸭源NDV的自然流行，不仅给养鸭业造成较大的损失，同时也对我国养鸡业造成威胁。新城疫病毒的F蛋白是病毒致病的分子基础，参与病毒囊膜与细胞的融合致病过程，还具有良好的免疫原性，是NDV主要的保护性抗原。
[0003]鸭圆环病(Duckcircovirus Disease)是由鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)引起的一种主要侵害免疫系统，致免疫功能的下降或免疫抑制的疾病。DuCV基因组中主要编码三个蛋白:R印、Cap和C3，其中Cap蛋白可能是DuCV的核衣壳的组成部分，与其致性及保护性抗原相关。
[0004]DNA疫苗作为一种新型的基因工程疫苗，具有低成本、免疫期长、生产速度快、热稳定性好、便于保存和运输等优点，倍受生物界的广泛重视，目前已经在诸多领域被进行广泛而深入的研究，并已取得丰硕的成果。针对艾滋病、流感、T淋巴细胞瘤和H型单纯孢疹病毒的DNA疫苗已进入临床试验阶段，丙型肝炎、结核病及狂犬病等的核酸疫苗正处于研发之中并取得一定进展。
[0005]目前在国内外研究于禽类的DNA疫苗主要针对同一病源，如禽流感病毒、鸡马立克氏病病毒、新城疫病毒等。但针对两种病毒的融合表达的DNA疫苗国内外均未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种新城疫病毒和鸭圆环病毒融合蛋白及其编码基因与应用。
[0007]本发明所提供的融合蛋白自氨基端至羧基端依次含有鸭源新城疫病毒的F蛋白和鸭圆环病毒的Cap蛋白。
[0008]进一步，所述鸭源新城疫病毒的F蛋白的氨基酸序列为序列表中序列I的第1-553位；所述鸭圆环病毒的Cap蛋白的氨基酸序列为序列表中序列I的第574-829位。
[0009]更加具体的，所述融合蛋白是如下(a)或(b):
[0010](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白； [0011](b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白。
[0012]其中，序列I由829个氨基酸组成，第1-553位为所述鸭源新城疫病毒的F蛋白，第574-829位为所述鸭圆环病毒的Cap蛋白，第554-573位为Linker接头。
[0013]上述(a)和(b)中的所述融合蛋白均可人工合成，也均可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0014]编码所述融合蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
[0015]进一步，所述基因为如下I) -3)中任一:
[0016]I)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017]2)与I)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且编码所述融合蛋的DNA分子；
[0018]3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交，且编码所述融合蛋的DNA分子。
[0019]上述严格条件可为用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65oC下杂交，然后用2XSSC，
0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0020]其中，序列2由2496个核苷酸组成，编码序列表中序列I所示融合蛋白。
[0021]含有所述基因的重组载体、表达盒、重组细胞或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0022]所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0023]在本发明的一个实施例中，在所述重组表达载体中，启动所述基因转录的启动子为CMV启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在pcDNA3.1 (+)载体的多克隆位点处插入所述基因后得到的重组质粒(pcDNA3.Ι-F-Cap)。所述多克隆位点具体为HindIII和EcoR1。
[0024]所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。
[0025]所述融合蛋白，或所述基因，或所述重组载体、表达盒、重组细胞或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围:
[0026](I)制备预防或/和治疗鸭源新城疫病毒或/和鸭圆环病毒的疫苗；
[0027](2)制备促进机体产生抗鸭源新城疫病毒的抗体或/和抗鸭圆环病毒的抗体的产品O
[0028]在本发明中，(2)中的所述机体具体为鸭，更加具体为2周龄SPF雏鸭。
[0029]本发明的再一个目的是提供一种预防或/和治疗鸭源新城疫病毒或/和鸭圆环病
毒的疫苗。
[0030]本发明所提供的预防或/和治疗鸭源新城疫病毒或/和鸭圆环病毒的疫苗，其活性成分为所述融合蛋白、所述基因、所述重组载体、所述表达盒、所述重组细胞或所述重组菌。
[0031]本发明利用柔性肽(linker)首次将鸭圆环病毒Cap基因与鸭源NDV分离株DUNDV的F基因串联起来，构建了融合表达重组真核质粒pcDNA3.1-F-Capt5Linker具有折叠性好、亲水性低、无抗原性、无新表位出现等优点，能保证原有蛋白的物理性质和空间构象。实验证明，以pcDNA3.1-F-Cap作为DNA疫苗对2周龄的SPF雏鸭以胸部肌肉多点注射的方式进行免疫，ELISA检测抗体水平，试验结果显示:DNA疫苗免疫组的NDV抗体和DuCV抗体水平明显高于载体空白对照组，差异显著(P〈0.05) ;二免后DNA疫苗免疫组的抗体水平随之增加。本发明为DuCV和鸭源NDV的基因疫苗的研究提供理论和实践依据。【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为鸭源NDV F基因以及DuCV Cap基因的PCR产物。其中，泳道M为DNA分子量标准D2000Maker ;泳道I为DuCV Cap基因的PCR产物；泳道2为鸭源NDVF基因的PCR产物。
[0033]图2为重组质粒pcDNA3.1-F-Cap的酶切鉴定结果。其中，泳道M为DNA分子量标准 Maker III Ladder ;泳道 I 为 pcDNA3.1-F-Cap 的 Hind II1、BamH I 和 EcoR I 的三酶切结果；泳道 2 为 pcDNA3.1-F-Cap 的 Hind III和 BamH I 双酶切结果；泳道 3 为 pcDNA3.1-F-Cap的BamH I和EcoR I双酶切结果。
[0034]图3为重组质粒pcDNA3.1-F-Cap转染Vero细胞后的瞬时表达检测结果(间接免疫荧光)。其中，A为pcDNA3.1 (+)空载体对照；B为pcDNA3.1-F-Cap。
具体实施 方式
[0035]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037]鸭源新城疫病毒(DuNDV):记载在“鸭源新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭圆环病毒三重PCR检测方法的建立.动物医学进展，2013，04:23-26 ”一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0038]鸭圆环病毒(DuCV):记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查.中国畜牧兽医，2010，37 (11): 156-158” 一文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0039]真核表达载体pcDNA3.1 (+)购自Invitrogen公司；Vero细胞购自中国典型培养物保藏中心；SPF鸭胚购自哈尔滨兽医研究所，自行孵化，负压隔离器内饲养至所需日龄。
[0040]RNA PCR Kit (AMV)、T4连接酶、LA Taq DNA聚合酶、pMD18_T载体试剂盒和限制性内切酶Hind II1、BamH 1、EcoR I购自大连宝生物公司；TIANamp血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒、无内毒素质粒大量提取试剂盒购自TIANGEN公司；玻璃奶回收试剂盒购自OMEGA 公司；TRIzol LS Reagent、Lipofectamin2000、鸭新城疫病毒抗体(NDV-Ab)ELISA 试剂盒和鸭圆环病毒抗体(DuCV-Ab)ELISA试剂盒购自Invitrogen公司；FITC标记的羊抗鸡IgG抗体，DMEM培养基购自GIBCO公司、胎牛血清购自Hyclone公司。
[0041]实施例1、重组真核表达载体pcDNA3.1-F-Cap的构建及表达鉴定
[0042]一、鸭源新城疫病毒的F基因和鸭圆环病毒的Cap基因的获得
[0043]1、引物的设计与合成
[0044]根据鸭源新城疫病毒(DuNDV)的F基因序列和鸭圆环病毒(DuCV)的Cap基因序列，设计并合成引物(表1)。其中，引物Fl、F2用于扩增鸭源NDV的F基因的0RF，引物Cl、C2用于扩增DuCV的Cap基因的ORF，四条引物分别携带Hind IILBamH I ,BamH I ,EcoR I酶切位点(斜体部分)。下划线处为linker,波浪线为kozak序列。引物由上海Invitrogen公司合成。
[0045]表1F基因和Cap基因的引物序列
[0046]
【权利要求】
1.一种融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白自氨基端至羧基端依次含有鸭源新城疫病毒的F蛋白和鸭圆环病毒的Cap蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于:所述鸭源新城疫病毒的F蛋白的氨基酸序列为序列表中序列I的第1-553位。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于:所述鸭圆环病毒的Cap蛋白的氨基酸序列为序列表中序列I的第574-829位。
4.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白。
5.编码权利要求1-4中任一所述融合蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于:所述基因为如下I)-3)中任一:1)序列表中序列2所不的DNA分子；2)与I)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且编码权利要求1-4中任一所述融合蛋的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交，且编码权利要求1-4中任一所述融合蛋的DNA分子。
7.含有权利要求5或6所述基因的重组载体、表达盒、重组细胞或重组菌。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体；或在所述重组表达载体中，启动所述基因转录的启动子为CMV启动子。
9.权利要求1-4中任一所述的融合蛋白，或权利要求5或6所述的基因，或权利要求7或8所述的重组载体、表达盒、重组细胞或重组菌在如下任一中的应用:(1)制备预防或/和治疗鸭源新城疫病毒或/和鸭圆环病毒的疫苗；(2)制备促进机体产生抗鸭源新城疫病毒的抗体或/和抗鸭圆环病毒的抗体的产品。
10.预防或/和治疗鸭源新城疫病毒或/和鸭圆环病毒的疫苗，其特征在于:所述疫苗的活性成分为权利要求1-4中任一所述的融合蛋白，或权利要求5或6所述的基因，或权利要求7或8所述的重组载体、表达盒、重组细胞或重组菌。
【文档编号】A61K39/295GK103524624SQ201310420930
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】谢芝勋, 许宗丽, 谢丽基, 刘加波, 邓显文, 谢志勤, 庞耀珊, 范晴, 罗思思 申请人:广西壮族自治区兽医研究所