一种抗耐药性的多功能纳米粒制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗耐药性的多功能纳米粒制剂及其制备方法，包括以下步骤：将多烯紫杉醇和哌立福新以及共聚物溶于有机溶剂，作为油相，PVA溶液作为水相，在超声冰浴条件下，将油相滴加到水相中，得到混合乳液，减压蒸馏除去有机溶剂，离心处理，收集到的纳米粒子水洗后复溶，真空冷冻干燥后得到纳米粒制剂。本发明制备的多功能纳米粒制剂具有良好的粒径、包封率、载药量；能有效提高细胞毒性，细胞摄取量。
【专利说明】一种抗耐药性的多功能纳米粒制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药物制剂【技术领域】，具体涉及一种抗耐药性的多功能纳米粒制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]靶向纳米给药系统通常可分为主动靶向和被动靶向纳米给药系统。主动靶向给药系统研究的重要方向是利用受体与配基的专一性结合的原理。叶酸(Folate)是主动靶向配基中常用的一种，许多肿瘤细胞膜表面都有叶酸受体过度表达。基于这种特殊的作用，可将与叶酸结合的药物载体导入这些肿瘤细胞中。细胞穿透肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一类短肽，少于30个氨基酸，具有强的穿膜能力，可以将抗肿瘤药物、多肽、核酸或是纳米粒等运送至细胞内。将纳米给药系统与细胞穿透肽结合，可以增加细胞对纳米药物的渗透摄取。
[0003]多烯紫杉醇易溶于有机溶剂，但几乎不溶于水，为FDA批准的紫杉烷类抗癌药物，对乳腺癌、非小细胞肺癌等均有明显疗效。但是肿瘤细胞容易对其产生耐药性，使其应用受到了限制。
[0004]PI3K-Akt信号通路在促进肿瘤细胞的生长、增殖，抑制细胞凋亡，促进细胞侵袭和转移，促进血管生成等方面起到重要作用。Akt受抑制后将会抑制大部分下游分子，控制肿瘤发展和转移。哌立福新为脂类Akt抑制剂，对前列腺癌、肺癌、胰腺癌的治疗效果的临床试验正在进行中。
[0005]事实上，靶向纳米给药系统进入血液后容易被吞噬细胞吞噬，吞噬作用则是通过血液中亲脂性的调理蛋白介导的，将纳米粒直径控制在300nm以下，并用聚乙二醇(PEG)进行表面修饰，可减少吞噬细胞对纳米粒的捕获，起到“长循环”的功能。另外，聚乳酸乙醇酸(PLGA)是纳米粒制备的常用载体之一，具有良好的生物相容性，且无毒可生物降解，通过美国FDA认证并被收录美国药典，被广泛应用于制药、医用工程材料领域。
【发明内容】
[0006]为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗耐药性的多功能纳米粒制剂及其制备方法。本发明通过乳化蒸发法制备得到多功能纳米粒制剂，其制备方法简单，得到的多功能纳米粒制剂中包载有多烯紫杉醇和哌立福新，具有良好的包封率、载药量和稳定性。
[0007]本发明涉及一种抗耐药性的多功能纳米粒的制备方法，具体步骤如下:
[0008](I)将多烯紫杉醇、哌立福新以及多功能纳米粒载体溶解于有机溶剂中，得到油相；
[0009](2)配制PVA溶液，作为水相；
[0010](3)在超声冰浴条件下，将油相滴加到水相中，得到混合液；
[0011](4)上述混合液经过旋转蒸发后，离心除去游离药物，得到溶液，将溶液低温冻干，即得到抗耐药性的多功能纳米粒制剂。
[0012]本发明中，步骤(1)中所述的多功能纳米粒载体选自所述多功能纳米粒载体选自mPEG-PLGA、mPEG-PLGA-R7和mPEG-PLGA-Fol中的一种或几种；优选的，多功能纳米粒载体为PEG-PLGA-Fol和PEG-PLGA-R7混合物。所述PLGA是分子量为8000~15000的长链高分子聚乳酸-聚乙醇酸共聚物，其结构中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为50:50。
[0013]本发明中，步骤(1)中所述的多烯紫杉醇、哌立福新与所述多功能纳米粒载体的重量比为(1.0-1.5):(1.0-1.5):10o
[0014]本发明中，步骤(1)中所述的有机溶剂为二氯甲烷。
[0015]本发明中，步骤(2)中所述的PVA溶液的重量体积百分比浓度为0.6~2%。
[0016]本发明中，步骤(3)中进行超声时，将所述溶有包合物冻干粉的内水相置于超声波破碎仪的超声探头下，超声波破碎仪的工作功率为200~400W。
[0017]本发明中，步骤(4)中进行离心时，离心转速为12000~50000rpm，离心时间为30分钟。
[0018]本发明涉及一种抗耐药性的多功能纳米粒制剂，其为包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒子，呈圆球形，粒径分布集中，大小分布均匀；粒径为(141.6±7.02) nm,包封率为(92.35±6.31)%，载药量为(1.57±0.19)%。
[0019]本发明提供的上述纳米粒的应用方法为:通过将所述纳米粒的溶液放置于透析袋后置于释放介质中，经恒温摇床震荡实现药物释放。所述透析袋截留分子量为3000-10000Da ;所述恒温为37±0.5°C ;所述释放介质为磷酸盐缓冲液(PBS)。
[0020]本发明的有益效果在于:其制备方法简单，得到的多功能纳米粒制剂中包载有多烯紫杉醇和哌立福新，具有良好的抗耐药性、包封率、载药量，是一种理想的药物载体。与多烯紫杉醇溶液以及非修饰的mPEG-PLGA纳米粒相比，包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒具有良好的细胞毒性，在体内外表现出良好的性能。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1为实施例1得到的包载多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA纳米粒的粒径分布图。
[0022]图2是实施例1得到的包载多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA纳米粒的透射电镜图。
[0023]图3是各种包载多烯紫杉醇和哌立福新的纳米粒在磷酸盐缓冲液中的释放行为结果图；
[0024]图4是各种包载多烯紫杉醇和哌立福新的纳米粒对MCF-7 (A)和MCF-7/ADR⑶细胞的毒性。
[0025]图5是MCF-7和MCF-7/ADR细胞对各种包载多烯紫杉醇和哌立福新的纳米粒的摄取图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0027]原料来源
[0028]多烯紫杉醇购自上海北卡医药技术有限公司(纯度>99%)；
[0029]哌立福新购自上海瀚香生物科技有限公司(纯度>98%)；
[0030]mPEG-PLGA共聚物购自济南岱罡生物科技有限公司(化学纯)；
[0031]mPEG-PLGA-Fol 共聚物和 mPEG_PLGA-R7 共聚物参考文献(Zhang Y, WangRR, WuJ, Shen Q.Characterization and evaluation of self-microemulsifyingsustained-release pellet formulation of puerarin for oral delivery[J].Int.)制备;
[0032]其它原料为普通市售商品。
[0033]实施例1
[0034]本实施例涉及一种包载多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA纳米粒制剂的制备方法。
[0035]包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒制剂的制备，包括以下步骤:
[0036](I)多烯紫杉醇2mg，哌立福新2mg，mPEG_PLGA共聚物20mg溶于二氯甲烷中，作为油相；`
[0037](2)将PVA配成重量体积浓度为1%的溶液，作为水相；
[0038](3)在超声冰浴条件下，将油相滴加到水相中，得到混合液；
[0039](4)旋转蒸发，除去步骤(3)得到的混合液中的有机溶剂；
[0040](5)将步骤(4)得到的溶液高速离心(12000~50000rpm) 30min,除去游离药物，得到带有淡蓝色乳光的纳米粒溶液；
[0041](6)将纳米粒溶液低温冻干，即得到包载多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA纳米粒制剂NP I。
[0042]实施例2
[0043]本实施例涉及一种包载多烯紫杉醇和哌立福新的PEG-PLGA-Fol纳米粒制剂的制备方法；
[0044]包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒制剂的制备，包括以下步骤:
[0045](I)多烯紫杉醇2mg,哌立福新2mg,mPEG-PLGA-FoI共聚物20mg溶于二氯甲烧中，作为油相；
[0046](2)将PVA配成重量体积浓度为1%的溶液，作为水相；
[0047](3)在超声冰浴条件下，将油相滴加到水相中，得到混合液；
[0048](4)旋转蒸发，除去步骤(3)得到的混合液中的有机溶剂；
[0049](5)将步骤(4)得到的溶液高速离心(12000~50000rpm) 30min,除去游离药物，得到带有淡蓝色乳光的纳米粒溶液；
[0050](6)将纳米粒溶液低温冻干，即得到圆形的包载多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA-Fol 纳米粒制剂 NP2。
[0051]实施例3
[0052]本实施例涉及一种包载多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA-R7纳米粒制剂的制备方法；
[0053]包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒制剂的制备,包括以下步骤:
[0054](I)多烯紫杉醇2mg,哌立福新2mg, mPEG-PLGA-R7共聚物20mg溶于二氯甲烧中，作为油相；
[0055](2)将PVA配成重量体积浓度为1%的溶液，作为水相；
[0056](3)在超声冰浴条件下，将油相滴加到水相中，得到混合液；
[0057](4)旋转蒸发，除去步骤(3)得到的混合液中的有机溶剂；
[0058](5)将步骤(4)得到的溶液高速离心(12000~50000rpm) 30min,除去游离药物，得到带有淡蓝色乳光的纳米粒溶液；
[0059](6)将纳米粒溶液低温冻干，即得到圆形的包载多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA-R7 纳米粒制剂 NP3。
[0060]实施例4
[0061]本实施例涉及一种包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒制剂的制备方法;
[0062]包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒制剂的制备，包括以下步骤:
[0063](1)多烯紫杉醇 2mg,哌立福新 2mg,mPEG-PLGA-FoI 共聚物 IOmg,mPEG-PLGA-R7 共聚物IOmg溶于二氯甲烷中，作为油相；
[0064](2)将PVA配成重量体积浓度为1%的溶液，作为水相；
[0065](3)在超声冰浴条件下，将油相滴加到水相中，得到混合液；
[0066](4)旋转蒸发，除去步骤(3)得到的混合液中的有机溶剂；
[0067](5)将步骤(4)得到的溶液高速离心(12000~50000rpm) 30min,除去游离药物，得到带有淡蓝色乳光的纳米粒溶液；
[0068](6)将纳米粒溶液低温冻干，即得到圆形的包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒制剂NP4。
[0069]实施例(I~4)得到的纳米粒制剂，用透射电镜检测，其透射电镜结果如图2所示，呈圆形。经激光粒径仪测定，其粒径为(141.6±7.02)nm，用高效液相色谱(HPLC)测定，其载药量为(1.57±0.19)%，包封率为(92.35±6.31)%。
[0070]实施例5
[0071 ] 包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒的释放试验
[0072]称取取多烯紫杉醇Img和哌立福新lmg(DTX+perifosine_Sol)、按照本发明制备方法获得的理论含药量为Img的包载多烯紫杉醇和哌立福新的mPEG-PLGA纳米粒(DTX+perifosine-mPEG-PLGA-NPs)、理论含药量为Img的包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒(DTX+perifosine-mPEG-PLGA-Fol/R7-NPs)，加2毫升PBS缓冲液配成溶液，置于透析袋(3000-5000Da)，于体积为50ml释放介质(PBS缓冲液)中，37°C恒温摇床震荡，定时取样用高效液相色谱测定释放介质中的DTX，计算释放百分率，释放曲线如图3所示。从图3的释放曲线中可以看出，呈平稳释放特征，不存在明显的突释。
[0073]实施例6
[0074]包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒的细胞毒性实验
[0075]将不同浓度的NPl、NP2、NP3、NP4、DTX+perifosine溶液与人乳腺癌细胞共同孵化24h，然后用MTT法检测细胞存活率。存活率结果如图4所示。[0076]从图4可以看出，在相同浓度下，四种纳米粒制剂的细胞毒性均强于原药溶液，且包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒制剂NP4具有最低的细胞存活率，表现出最强的细胞毒作用。可知，包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒制剂具有良好的细胞毒性。
[0077]实施例7
[0078]包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒的细胞摄取实验
[0079]取纳米粒制剂NP1、NP2、NP3、NP4及原药用培养基溶解，配成相同浓度的纳米粒溶液。孵育MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞Ih后，用胰酶消化，流式细胞仪检测。细胞摄取的结果如图5所示。
[0080]从图5可以看出，MCF-7/ADR细胞因为其耐药性，对纳米粒的摄取明显低于MCF-7细胞。两种细胞对多功能纳米粒制剂的摄取量高于其他纳米粒制剂。
[0081]实验结果表明，MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞对原药溶液的摄取远低于对各种纳米粒制剂的摄取，其中对NP1、NP2、NP3、NP4的摄取量依次增加。另外，MCF-7/ADR细胞因为其耐药性，对原药溶液的摄取明显低于MCF-7细胞，但是对NP1、NP2、NP3、NP4的摄取仅比MCF-7细胞略低。可知，纳米粒制剂能够增加细胞对药物的摄取，包载多烯紫杉醇和哌立福新的纳米粒具有一定的抗耐药性。
[0082]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【权利要求】
1.一种抗耐药性的多功能纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将多烯紫杉醇、哌立福新以及多功能纳米粒载体溶解于有机溶剂中，得到油相； (2)配制PVA溶液，作为水相； (3)在超声冰浴条件下，将油相滴加到水相中，得到混合液； (4)上述混合液经过旋转蒸发后，离心除去游离药物，得到溶液，将溶液低温冻干，即得到抗耐药性的多功能纳米粒制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，所述多烯紫杉醇、哌立福新与多功能纳米粒载体的重量比为(1.0~1.5): (1.0~1.5) IlO0
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，所述多功能纳米粒载体选自mPEG-PLGA、mPEG-PLGA-R7和mPEG-PLGA_Fol中的一种或几种；所述PLGA是分子量为8000~15000的长链高分子聚乳酸-聚乙醇酸共聚物，其结构中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为 50:50。
4.根据权利要求1或3所 述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，所述多功能纳米粒载体为 mPEG-PLGA-Fol 和 mPEG_PLGA-R7 的混合物。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中所述有机溶剂为二氯甲烧。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述PVA溶液的重量体积百分比浓度为0.6~2%ο
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)中进行超声时，将所述水相置于超声波破碎仪的超声探头下，超声波破碎仪的工作功率为200~400W。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(4)中，所述离心时转速为12000~50000rpm，离心时间为30分钟。
9.一种抗耐药性的多功能纳米粒制剂，其特征在于:其为包载多烯紫杉醇和哌立福新的多功能纳米粒子，呈圆球形，粒径分布集中，大小分布均匀；粒径为(141.6±7.02) nm,包封率为(92.35±6.31)%，载药量为(1.57±0.19)%。
【文档编号】A61K31/337GK103494829SQ201310455018
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】沈琦, 卜祥媛, 陈晶晶 申请人:上海交通大学